アストロサイトにおける代謝型 GABAB 受容体の発現と GABA 輸送体と

A01-5
公募
神経伝達物質を介したグリア−ニューロン相互調節機構に関する研究
アストロサイトにおける代謝型 GABAB 受容体の発現と
GABA 輸送体との機能的連関
藤田卓也 *、和田美由紀、岡 美智子
京都薬科大学薬学部、* 現所属：立命館大学薬学部
神経細胞の機能維持にグリア細胞、特にアストロサイトの
皮質アストロサイトに GABAB 受容体が発現していること
関与が示唆され、グリア細胞においても神経伝達物質受容体
が確認でき、これまで機能的にはほとんど報告がなされてい
の存在が次々と報告されるにつれて、その情報伝達系や生理
なかったアストロサイトでの GABAB 受容体の発現を明ら
的な役割の解明が望まれている。本研究では、ラット大脳皮
かに出来た (Oka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
質アストロサイト初代培養細胞に発現する代謝型 GABAB
341, 874 – 881 (2006))。
受容体の機能発現解析、および GABA トランスポーターの
新規輸送活性調節機構を中心に検討を進めた。
我々が用いたラットアストロサイト初代培養の系ではこれ
までに報告されている 3 種の GABA トランスポーターのう
ラット大脳皮質アストロサイトにおいては、これまで 9
ち、主として GAT2 が発現していることが確認された。輸
種の isoforms が報告されている adenylylcyclase (AC1–9)
送の親和性を示す Kt 値は 9.3 ± 2.8 μ M、capacity を示す
Vmax 値は 0.12 ± 0.01 nmol/mg protein/min であった。こ
れらの結果は、GABA トランスポーター (GAT1–3) 各々に
のうち AC1 と AC8 を除く 7 種の AC が発現していることが
RT-PCR により示され、抑制性 Gi タンパク質と couple して
いる AC5 と AC6 の機能的な発現も 1µM forskolin で上昇し
た cAMP の 生 成 が 、 GABAB 受 容 体 の agonist で あ る
baclofen により濃度依存的に抑制されたことから明らかと
なった。この抑制は、GABAB 受容体の選択的な antagonist
により濃度依存的に reverse された。さらに、RT-PCR およ
び Western blotting、蛍光免疫染色によってもラット大脳
対する選択的な阻害剤を用いた検討結果からも支持されると
ともに、Western blotting や 免疫組織染色によっても確認
できた。また、非常に興味深いことにラットアストロサイト
での GABA の輸送は Zn2+ によって濃度依存的に阻害され、
その Ki 値は 5.6 ± 1.7 μ M であった (Wu et al., Brain
Res. 1075, 99 – 108 (2006))。
図 本検討より同定されたグリアーニューロンにおけるトランスポーター
68
最終研究成果報告書
一方、ニューロンはグルタミン酸や GABA などの神経伝
達物質の細胞内プールにおける再生産を細胞外に存在するク
エン酸回路中間体を利用して行っている。α−ケトグルタル
酸やリンゴ酸などのクエン酸回路中間体はアストロサイトで
合成された後、神経伝達物質の前駆体としてニューロンへ輸
送される。そこでラット新生児大脳皮質より単離したアスト
ロサイト初代培養系を用いて、ラットアストロサイトにおけ
る Na+ 依存性 TCA 回路中間体の輸送特性を精査すること
により、この輸送に関与するトランスポーターの同定を試み
た。種々の輸送実験により、ラットアストロサイトにおける
succinate の取り込みは Na+ 依存性、Cl- 非依存性を示し、
succinate と Na+ の輸送の化学量論比が 1:3 であること、
Na+ 依存的な succinate 輸送は生理的条件下 2 価の状態で存
在する C4 − C5 のジカルボン酸およびトリカルボン酸によ
り有意に阻害されること、および succinate に高親和性、
citrate に低親和性の輸送性を示すことがわかった。また
Na+ 依存的な succinate の輸送は succinate および citrate に
より濃度依存的に阻害され、その Ki 値はそれぞれ 18 µM、
900 µM であり、これらの Ki 値は Na+ 依存的な succinate
輸送、citrate 輸送の Kt 値とほぼ同じ値であったことから、
succinate と citrate が同一の輸送系を介してアストロサイ
トに取り込まれていることが速度論的に明らかとなった。さ
らに RT-PCR 解析、Western blot 解析および蛍光免疫染色
法によりラットアストロサイトにおける NaDC3 の発現を
確認した。以上の速度論的解析および発現解析結果より、
TCA 回路中間体は NaDC3 を介してラットアストロサイト
内へ輸送されることが示され、ラットアストロサイトにおい
て NaDC3 が機能発現していることが明らかとなった。さ
らにニューロン初代培養系を用いた場合におけるクエン酸回
路中間体の細胞内輸送系の同定も試み、ニューロンにおいて
は NaDC3 と異なる Na+-依存性ジカルボン酸トランスポー
ター NaCT を発現していることを明らかにすることができ
た (Fujita et al., J. Neurochem. 93, 706 – 714 (2005),
Yodoya et al., J. Neurochem. 97, 162 – 173 (2006),
Wada et al., Brain Res. 1081, 92 – 100 (2006))。
【文献】
1) Oka M, Itoh Y, Wada M, Yamamoto A, Fujita T* A comparison of Ca2+
channel blocking mode between gabapentin and verapamil:
Implication for protection against hypoxic injury in rat cerebrocortical
slices. Br J Pharmacol. 139:435 - 443 (2003)
2) Oka M, Itoh Y, Wada M, Yamamoto A, Fujita T* Gabapentin blocks Ltype and P/Q-type Ca2+ channels involved in depolarization-stimulated
nitric oxide synthase activity in primary culture of neurons from mouse
cerebral cortex. Pharm Res. 20:897 - 899 (2003)
3) Fujita T*, Kishida T, Wada M, Okada N, Yamamoto A, Leibach FH,
Ganapathy V Functional characterization of brain peptide transporter
in rat cerebral cortex: Identification of the high affinity type H+/peptide
transporter PEPT2. Brain Res. 997:52 - 61 (2004)
4) Oka M, Wada M, Yamamoto A, Itoh Y, Fujita T* Functional expression
of constitutive nitric oxide synthase regulated by voltage-gated Na+and Ca2+-channels in cultured human astrocytes. Glia 46:53 - 62
(2004).
5) Tanaka K, Yamamoto A, Fujita T* Functional characterization and
adaptive regulation of Na+-dependent neutral amino acid transporter
SNAT2/ATA2 in normal human astrocytes under amino acid starved
condition. Neurosci Lett. 378:70 - 75 (2005)
6) Fujita T*, Katsukawa H, Yodoya E, Wada M, Shimada A, Okada N,
Yamamoto A, Ganapathy V Transport characteristics of N-acetyl-Laspartate in rat astrocytes: Involvement of sodium-coupled high affinity
carboxylate transporter NaC3/NaDC3 mediated transport system. J
Neurochem. 93: 706 - 714 (2005)
7) Wada M, Miyamawa M, Shimada A, Okada N, Yamamoto A, Fujita T*
Functional linkage of H+/peptide transporter PEPT2 and Na+/H+
exchanger in primary cultures of astrocytes from mouse cerebral cortex.
Brain Res. 1044:33 - 41 (2005)
8) Shimada A, Nakagawa Y, Morishige H, Yamamoto A, Fujita T*
Functional characteristics of H+-dependent nicotinic acid transport in
primary cultures of astrocytes from rat cerebral cortex. Neurosci Lett.
392:207 - 212 (2006)
9) Fujita T*, Shimada A, Okada N, Yamamoto A Functional characterization of Na+-independent choline transport in primary cultures of neurons
from mouse cerebral cortex. Neurosci Lett. 393:216 - 221 (2006)
10) Oka M, Wada M, Wu Q, Yamamoto A, Fujita T* Functional expression
of metabotropic γ-aminobutyric acid GABAB receptor in primary culture
of astrocytes from rat cerebral cortex. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 341:874 - 881 (2006)
11) Wu Q, Wada M, Shimada A, Okada N, Yamamoto A, Fujita T*
Functional characterization of Zn2+-sensitive GABA transporter
expressed in primary cultures of astrocytes from rat astrocytes. Brain
Res. 1075:99 - 108 (2006)
12) Yodoya E, Wada M, Shimada A, Katsukawa H, Okada N, Yamamoto A,
Ganapathy V, Fujita T* Functional and molecular identification of
sodium-coupled dicarboxylate transporters in primary cultured cerebrocortical astrocytes and neurons. J Neurochem. 97:162 - 173 (2006)
13) Wada M, Shimada A, Fujita T* Functional characterization of Na+-coupled citrate transporter NaC2/NaCT expressed in primary cultures of
neurons from mouse cerebral cortex. Brain Res. 1081, 92 - 100 (2006)
14) Fujita T*, Shimada A, Wada M, Miyakawa S, Yamamoto A Functional
expression of taurine transporter and its up-regulation in developing
neurons from mouse cerebral cortex. Pharm Res. 23:689 - 696 (2006)
15) Ogihara T*, Kamiya M, Ozawa M, Fujita T, Yamamoto A, Yamashita S,
Ohnishi S, Isomura Y What kinds of substrates show P-glycoproteindependent intestinal absorption? Comparison of verapamil with vinblastine. Drug Metab Pharmacokinet. 21:238 - 244 (2006)
16) Morimoto K, Nakakariya M, Shirasaka Y, Kakinuma C, Fujita T, Tamai I,
Ogihara T* Oseltamivir (Tamiflu™) efflux transport at the blood-brain
barrier via P-glycoprotein. Drug Metab Dispos. 36:6 - 9 (2008)
17) Ose A, Kusuhara K, Yamatsugu K, Kanai M, Shibasaki M, Fujita T,
Yamamoto A, Sugiyama Y* P-glycoprotein restricts the penetration of
oseltamivir across the blood-brain barrier. Drug Metab Dispos. 36:427 434 (2008)
18) Uchiyama T, Fujita T, Gukasyan HJ, Kim K-J, Borok Z, Crandall ED, Lee
VHL* Functional characterization and cloning of amino acid transporter
B0,+ (ATB0,+) in primary cultured rat pneumocytes. J Cell Physiol. 214:645 654 (2008)
別
項
１
別
項
２
別
項
３
別
項
４
別
項
５
別
項
６
別
項
７
別
項
８
別
項
９
別
項
10
69