タンパク質の微量定量法の改良についての試行錯誤 実験装置を自作

実験装置を自作しよう！（２）
タンパク質の微量定量法の改良についての試行錯誤
既存のタンパク質定量法
Lowry!法：生理・生化学分野では一般的である
試料中の共存物質の影響を受けやすい
Kjeldahl!法：原理的にはすばらしい！
操作が煩雑で、熟練を要する
共存する非タンパク性窒素化合物を除去しなければならない
硫酸分解やアンモニアの捕捉が必要である
Biuret!法
紫外線吸光スペクトル法
特別な機器や器具類が必要であり、取り扱いが面倒である
試料中の共存物質の影響を受けやすい
!
!
!
!
!
!
だ
測定に時間がを要し、熟練が必要である
だ
メ
倒
ダ
特別な器具・機材が必要である
面
た
ま
試料・試薬を大量に消費する
タンパク質のアミノ基と結合する
酸性色素や蛍光色素による呈色法の開発
Neuhoff!らは、酸性色素!Amide!Black!10B!
を用いた微量定量法を開発した
それに改良を加え、精度と簡易性に重点を置き、
セルロースアセテート膜と簡単な装置を用いる方法を開発した
Up!and!down
Holder!(Drummond)
Silicone
Cellulose!acetate!strip!
!!!(Separax;!1!x!1-cm)
Microtube!(Drummond;!0.5,!1,!2!μl)
Slide!glass
Apparatus!used!for!
the!application!of!samples!on!the!cellulose!acetate!strip
アセテート膜面に対して垂直に、
ゆっくりと、一定の圧力で、
触れるように塗布する
サンプル（血清、尿など）1!μl
サンプルはアセテート膜に
!均一に拡散する
Fixation!and!staining：2!min
0.5%!Amide!Black!10B!／
methanol!-!acetic!acid!(9:1)
Destaining：5!min!x!3!times
Methanol!-!acetic!acid!(9:1)
The!absorbance!was!measured!
spectrophotometrically!at!the
wavelength!of!630!nm
The!acetate!strip!containing!
the!stained!spot!was!completely!
dissolved!in!1!ml!DMSO
y!=!0.0664x!+!0.0300
r2!=!0.9996
Absorbance!(630!nm)
0.6
2.0!μl
y!=!0.0317x!+!0.0385
r2!=!0.9994
0.4
1.0!μl
0.5!μl
0.2
y!=!0.0166x!+!0.0378
r2!=!0.9984
0
2
4
6
8
10
Protein!concentration!(mg/ml)
Relationship!between!proten!concentration!(BSA)!
and!the!absorbance!after!Amido!Black!staining.
The!Amodo!Black!method
(Absorbance!at!500!nm)
y!=!0.4517x!−!0.0216
r2!=!0.9918
0.4
0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
The!method!of!Lowry!et!al.
(Absorbance!at!500!nm)
Relationship!between!the!Amido!Black!method!and
the!method!of!Lowry!et!al.!for!the!determination!of!
proten!concentrations!(BSA)!.!!The!curve!was!calculated
on!the!basis!of!12!evaluated!spots.