本文 - J

2015 年 10 月
347
ミニレビュー
日歯保存誌 58（5）
：347∼355，2015
幹細胞由来高純度象牙芽細胞を用いた
歯髄炎モデルにおける MMP 3 の新規知見
尾 関 伸 明 長 谷 奈央子
茂 木 眞希雄＊ 中 田 和 彦
愛知学院大学歯学部歯内治療学講座
＊
愛知学院大学薬学部生体機能化学講座
New Findings of MMP-3: Application of Purified Odontoblasts
Derived from Stem Cells as an
Pulpitis Model
OZEKI Nobuaki, HASE Naoko,
MOGI Makio＊ and NAKATA Kazuhiko
Department of Endodontics, School of Dentistry, Aichi Gakuin University
＊
Department of Medicinal Biochemistry, School of Pharmacy, Aichi Gakuin University
キーワード：マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）
，炎症性サイトカイン，幹細胞，象牙芽細胞，細胞増殖
カインやそのレセプターの活性制御，結合組織のリモデ
は じ め に
リングや創傷治癒，血管新生促進など多岐にわたる2,3）．
歯科領域での歯髄ならびに根尖歯周組織での炎症や創傷
マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metallopro-
治癒に関与が報告されている代表的な MMPs として，コ
teinase：MMPs）は，種々の細胞外基質成分（Extracel-
ラゲナーゼの MMP 1， 8， 134,5），ストロメライシンの
lular matrix：ECM）を分解できるエンドペプチダーゼ
MMP 36 8），ならびにゼラチナーゼの MMP 2， 99）があ
ファミリーである1）．MMPs は構造ならびに基質の特異
る．
性から，マトリライシン（MMP 7，26）
，コラゲナーゼ
そのなかでも MMP 3 は，細胞の遊走の促進10），乳腺
（MMP 1，8，13）
，ストロメライシン（MMP 3，10，
上皮細胞の抗アポトーシスと分化促進11
，細胞増殖因
13）
12）
，ゼラチナーゼ（MMP 2，9）
，膜型 MMPs（MMP
子の遊離 ，Caspase 1 を介した炎症への関与15），腫瘍
14，15，16，17，24，25）の少なくとも 5 つのグループ
細胞浸潤の促進16）など多彩な作用が知られている．ま
14）
に分類される．これらは活性部位に亜鉛イオンの結合部
た，MMP 3 欠損マウスでは創傷治癒が障害されるとい
位があり，活性化には二価のカルシウムイオンが必要で
う報告もあり17），MMP 3 が炎症の進行および組織破壊
ある．また，チモーゲン（潜在型もしくは不活性型酵素）
に関連する一方で，創傷治癒にも深く関与すると考えら
として産生され，自分自身あるいはほかのペプチダーゼ
れている．これまでに筆者ら7,18
で切断されることにより活性化される
．
2,3）
もラット歯髄細胞を
20）
用いて，MMP 3 が歯髄炎に伴う歯髄細胞の増殖と抗ア
MMPs は生体内において多様な機能をもつことが知
ポトーシス作用を有することで，創傷治癒に積極的にか
られており，幹細胞や血管内皮前駆細胞の遊走，サイト
かわることを報告した．
本ミニレビューは，平成 27 年度学術賞受賞者へ依頼したものである．
DOI：10.11471/shikahozon.58.347
日 本 歯 科 保 存 学 雑 誌
348
第 58 巻 第 5 号
MMPs の活性調節機構は，内在性阻害因子 Tissue
して望まれる薬剤ではない．本来，歯髄組織はう
inhibitor of metalloproteinases（TIMPs）
，遺伝子発現調
復処置などの化学的あるいは物理的な刺激により，象牙
節，ペプチダーゼの限定分解による酵素活性化など厳密
質を再生することができる潜在能力を有している．しか
に制御されている一方で，炎症性サイトカインや成長因
も近年，歯髄前駆体細胞あるいは歯髄幹細胞の存在が明
子，癌遺伝子産物の多くが MMPs の発現誘導を示す
らかになり，これらが象牙芽細胞に分化後に象牙質の再
．
1,21）
や修
Interleukin（IL）1βや Tumor necrosis factor（TNF）
生に関与することが示唆された29）．したがって，象牙芽
αは，定常状態ではほとんど検出されない MMPs の遺伝
細胞への分化能を有する幹細胞を用いた細胞導入治療法
子ならびにタンパク質発現を誘導する22,23）．代表的な炎
が，従来のう
治療法や覆髄法に代わる有効な手段とな
症性サイトカインの一つである IL 1βは，細胞に対し高
る可能性がある．よって，
濃度ではアポトーシスを惹起する一方，低濃度では栄養
分化，増殖ならびに，細胞内機構のより詳細な解明が必
因子様作用，すなわち細胞増殖能を示すことが知られて
要不可欠である．その一方で，臨床応用上の問題は，象
いる ．歯髄が傷害を受けた場合，早期には IL 1βに曝
牙芽細胞の生体内での存在量はきわめて微量で，Nogu-
され，MMP 3 の産生誘導を導くことはよく知られてい
chi ら30）のラット KN 3 細胞を除いて，市販培養細胞も含
24）
での象牙芽細胞への
るが，MMP 3 が本来もつ細胞組織の破壊的側面ばかり
め入手可能な培養細胞系はほとんどないことである．ま
が着目されており，ほかの生理的意義については，いま
た，象牙芽細胞の分化あるいは性状に着目した研究の大
だ不明な点が多い．
半は，組織レベルのアプローチであり，象牙質再生のメ
本稿では，筆者ら25
が新たに確立した 3 種の幹細胞
カニズムに着目した研究はいまだ少ない．そのため，こ
27）
から分化誘導した象牙芽細胞をセルソーターにて 98％
の現状を打破する新しい技術として，幹細胞から象牙芽
以上に高純度化し，炎症性サイトカインを添加すること
細胞への安全かつ効率的な分化誘導法の確立が望まれて
で
きた．
歯髄炎モデルを作製し，炎症性サイトカイン
添加で誘導される MMP 3 の象牙芽細胞に対する新規な
筆者ら25
生理的役割について，Small interfering RNA（siRNA）
葉といわれている神経堤細胞への分化機構の解析に有用
は外胚葉・中胚葉・内胚葉そして第 4 の胚
27）
を用いて検討を行った最近の研究を中心に，オーバー
なマウス ES 細胞，マウスの体細胞を初期胚細胞の状態
ビューを行う．
に初期化したマウス iPS 細胞，および移植時の免疫性の
幹細胞を用いた象牙芽細胞への 分化誘導法の確立
問題や，ES 細胞の使用に比べ，倫理的な問題が少ないと
される組織性幹細胞（体性幹細胞）であるα7 integrin 陽
性ヒト骨格筋幹細胞を用いて，後述する上皮 間葉相互
作用を介さない象牙芽細胞への分化誘導法を初めて確立
現在，再生医療の核となるのは 胚性幹細胞
（ES 細胞：
した．
Embryonic stem cell）あるいは人工多能性幹細胞（iPS
マウス ES 細胞（B6G 2，Riken Bioresource Center，
細胞：Induced pluripotent stem cell）であり，倫理的問
E14Tg2a；カリフォルニア大学サンフランシスコ校歯学
題，癌化の問題を抱えながらも，それを解消すべく研究
部 Randall H. Kramer 教授より供与）を通法31,32）に従い
が盛んに行われている．近年，注目を集めているヒト歯
培養した後，筆者ら25）が確立した分化誘導法により象牙
髄幹細胞は，そのソースとして抜去歯が想定されている
芽細胞への分化誘導を行った（Fig. 1）
．103cells/10μ の
が，採取量がごく微量であること，また，抜去歯そのも
割合で 2 日間，hanging drop 法33）を用いて胚葉体様の細
のが採取できない場合においては，代替細胞ソースとし
胞塊を形成した．その後，6 cm Petri dish
（Sumilon dish，
てほかの組織性幹細胞，ES 細胞や iPS 細胞などの幹細胞
Sumitomo Bakelite）上で，10−7mol/ の レチノイン酸
の使用が必須となる．
歯髄細胞群は象牙芽細胞，線維芽細胞，血管細胞，神
（Retinoic acid：RA，Sigma Aldrich，USA）存在下で 3
日間，浮遊培養を行い神経堤細胞への分化誘導を行った
経細胞などからなるが，特徴的な点として象牙芽細胞の
後，無血清の Glasgow modification of Eagle medium
存在比がきわめて高い28）．象牙芽細胞は直接覆髄処置に
（GMEM，Invitrogen Gibco，USA）培地を用いた 10％
おいて，露髄面に誘導され象牙質を形成することが期待
のⅠ型コラーゲン・スキャホルド（PureCol Collagen，
される細胞である．近年，直接覆髄剤として高頻度に用
Advanced BioMatrix）処理を施した 10 cm dish（BD
いられる水酸化カルシウムは，高い pH（12.4）により接
Falcon Labware，USA）上に細胞を 1.5×105cells/cm2の
触した歯髄表層を壊死させ，歯髄の治癒機転により象牙
密度で播種した．Bone morphogenetic protein（BMP）
芽細胞を創傷面に誘導する．しかし，その成功率は必ず
4（100 ng/m ，PeproTech，USA）を 15％ Fetal bovine
しも高いものではなく，生体親和性から考えた場合，決
serum（FBS，Invitrogen Gibco）含有の GMEM に添加
2015 年 10 月
炎症性サイトカイン誘導 MMP 3 は歯髄創傷治癒を制御する
し，7 日間，37℃，5％ CO2条件下で培養を行い，象牙芽
細胞への分化誘導を行った．培養液は 2 日ごとに交換を
349
幹細胞由来象牙芽細胞はα1 integrin の高発現が観察さ
れたため，FACStar cell sorter（Becton Dickinson and
行い，BMP 4 を添加した．細胞は Phosphate buffered
Co.，USA）を用いてα2 およびα1 integrin 陽性細胞を 2
saline（PBS，Invitrogen Gibco）で希釈した 3 mmol/ の
回分取した後，回収した．このα2 およびα1 integrin 陽
Ethylenediaminetetraacetic acid（EDTA）にて剝離後，
性細胞率は 98.56％（B6G 2 ES 細胞），98.64％（E14Tg2a
回収し，再度播種したものを実験に使用した．
ES 細胞），98.45％（iPS 細胞）または 98.32％（ヒト骨格
マウス iPS 細胞（iPS MEF Ng 20D 17，Riken Biore-
筋幹細胞由来象牙芽細胞）
（N＝3）で，石灰化能やアル
source Center）を通法34,35）に従い培養した後，前述の筆
カリホスタファーゼ活性など象牙芽細胞の分化マーカー
者ら が確立した ES 細胞からの分化誘導法の変法によ
の発現が培養 21 日まで観察され，ほぼ共通の分化誘導法
り，象牙芽細胞への分化誘導を行った（Fig. 2）
．103cells/
にて，マウス ES，iPS ならびにヒト骨格筋幹細胞から象
10μ の割合で 2 日間，hanging drop 法 を用いて胚葉
牙芽細胞を，効率的かつ高純度に入手できることを確認
体様の細胞塊を形成した．その後，6 cm Petri dish 上で，
した（Table 1）
．
26）
33）
10−7mol/ の RA 存在下で 3 日間，浮遊培養を行い神経
In vitro 歯髄炎モデルと高純度象牙芽細胞を 用いた MMP—3 の細胞増殖能の検討
堤細胞への分化誘導を行った後，無血清の Dulbecco s
modified Eagle s medium（DMEM，Invitrogen Gibco）
培地を用いた 10％のⅠ型コラーゲン・スキャホルド
（PureCol Collagen）処理を施したトランスウェル遊走用
歯髄組織に炎症が惹起されると，多くの炎症性サイト
チャンバー（8μm ポアサイズ，PET track etched mem-
カインの誘導とともに MMPs が産生され，ECM を分解
brane；BD Falcon Labware，USA）上に細胞を 1.5×
することで歯髄組織を破壊することが知られている．炎
10 cells/cm の密度で播種した．培養液は 2 日ごとに交換
症性サイトカインにより誘導される MMPs のなかでも，
を行い，BMP 4 を添加し，遊走用チャンバーのメンブレ
MMP 3 は主にコラーゲンを分解し，骨様組織の破壊に
ン下面に遊走してきた細胞を PBS で希釈した 3 mmol/
深く関与していると報告されている37
の EDTA にて剝離後，回収し，再度播種したものを実験
に，MMP 3 は分解基質が多岐にわたることで，ほかの
に使用した．
多くの MMPs を活性化し，組織破壊を進行させる40,41）．
5
2
．興味深いこと
39）
α7 integrin 陽性ヒト骨格筋幹細胞（カリフォルニア大
これまでの研究から MMP 3 の生理的意義は，主に ECM
学サンフランシスコ校歯学部 Randall H. Kramer 教授よ
の分解にかかわるとされる一方，関節リウマチや歯周病
り供与）を通法36）に従い培養した後，筆者ら27）が確立し
などの骨破壊疾患では病態の進行に深く関与することが
た分化誘導法により象牙芽細胞への分化誘導を行った
示唆されている24,42）．筆者ら7,18
も，歯髄傷害に伴う創
20）
（Fig. 3）．10 cells/10μ の割合で 2 日間，hanging drop
傷治癒に MMP 3 が積極的にかかわることを報告してき
法33）を用いて胚葉体様の細胞塊を形成した．その後，6
た．そこで前述の純化した幹細胞由来高純度象牙芽細胞
3
−7
cm Petri dish 上で，10 mol/ の RA 存在下で 3 日間，
を用いた
浮遊培養を行い神経堤細胞への分化誘導を行った後，無
態を再現するため，サイトカインミクスチャー
（cytokine
歯髄炎モデルとして，人工的な炎症状
血清の Ham s F 10 medium（Invitrogen Gibco）培地を
mixture（CM）
；IL 1β，TNF αおよび interferon（IFN）
用いた 15％の Gelatin（Sigma Aldrich）コート処理を施
γの混合物）処理することで，
したトランスウェル遊走用チャンバー（8μm ポアサイ
成した．
ズ，PET track etched membrane；BD Falcon Lab-
ware）上に，細胞を 1.5×105cells/cm2の密度で播種し
ウスおよびヒト・リコンビナント IL 1β，TNF αおよ
歯髄炎モデルを作
歯髄炎モデルとして，生理活性を保持したマ
た．培養液は 2 日ごとに交換を行い，BMP 4 を添加し，
び IFN γは，PeproTech（USA）のものを使用した．本
遊走用チャンバーのメンブレン下面に遊走してきた細胞
実験では 1 U 当たり，おのおの 1 ng/m の IL 1β，TNF
を PBS で希釈した 3 mmol/ の EDTA にて剝離後，回収
α，IFN γからなる CM を使用した．その濃度はこれま
し，再度播種したものを実験に使用した．本ヒト骨格筋
でに筆者ら43）の研究に使用したものと同一とした．マウ
幹細胞を用いた研究は，カリフォルニア大学サンフラン
スおよびヒト・リコンビナント MMP 3 は R & D Sys-
シスコ校生命倫理規定と愛知学院大学歯学部倫理委員会
tems（USA）のものを使用した．
の認可（承認番号 82）の下行われた．
3 種の幹細胞由来象牙芽細胞の高純度化は，通法25
3 種の幹細胞由来高純度象牙芽細胞に炎症性 CM を 1
27）
U または 3 U ずつ添加し，1 時間および 3 時間反応させ
に従い行った．マウス ES および iPS 細胞由来象牙芽細
たところ，高純度象牙芽細胞には MMP 3 遺伝子および
胞はα2 integrin の高発現，α7 integrin 陽性ヒト骨格筋
タンパク質発現がみられた19,44）．その一方で，CM 5 U 添
日 本 歯 科 保 存 学 雑 誌
350
第 58 巻 第 5 号
ES cells culture condition
Common
Hanging drop
culture （EB formation）
0
2
Day
5
7
12
Adherent culture with
collagen type−Ⅰ scaffold
Suspension culure
RA
BMP−4
Fig.　1 Schematic of the experimental protocol for odontogenic differentiation of mouse ES cells
Retinoic acid was applied at a concentration of 1×10−7 mol/ during EB formation at days 2 5, which was determined to be
optimal for neural crest differentiation. Cultures were maintained at 37℃ in a humidified 5％ CO2 incubator, and the medium
was changed every 2 days. EB：embryoid body；RA：retinoic acid.
iPS cells culture condition
Day
Common
culture
0
Hanging
drop
2
5
Transwell
culture
7
12
Adherent culture with
collagen type−Ⅰ scaffold
Suspension culure
EB formation
RA
BMP−4
Fig.　2 Schematic of the experimental protocol for odontogenic differentiation of mouse iPS cells
Retinoic acid was applied at a concentration of 1×10−7 mol/ during EB formation at days 2 5, which was determined to be
optimal for neural crest differentiation. At the end of day 7, cells in the lower chamber were harvested by detachment with 3
mmol/ EDTA in PBS, and collagen type Ⅰ/BMP 4 was applied at the optimal concentration determined for odontoblast differentiation at days 7 12. EB：embryoid body；RA：retinoic acid.
α7＋ human skeletal muscle stem cells culture condition
Day
Common
culture
0
Hanging
drop
2
5
Suspension culure
7
12
Adherent culture with
gelatin scaffold
EB formation
RA
BMP−4
＋
Fig.　3 Schematic of the experimental protocol for odontogenic differentiation of α7 human skeletal muscle stem cells
Retinoic acid was applied at a concentration of 1×10−7 mol/ during EB formation at days 2 5, which was determined to be
optimal for neural crest differentiation. At the end of day 7, cells in the lower chamber were harvested by detachment with 3
mmol/ EDTA in PBS, and gelatin scaffold/BMP 4 was applied at the optimal concentration determined for odontoblast differentiation at days 7 12. EB：embryoid body；RA：retinoic acid.
2015 年 10 月
炎症性サイトカイン誘導 MMP 3 は歯髄創傷治癒を制御する
Table　1 Flow cytometric analysis of differentiation
induced changes in the expression of α2 and
α1 integrins
Flow cytometric analysis showed that the proportions of odontoblast like cells were 98.56％（B6G 2 ES
cell derived； ＝3）, 98.64％
（E14Tg2a ES cell derived；
＝3）
, 98.45±0.45％（iPS cell derived； ＝3）, and
9 8 . 3 2％（α7＋ h u m a n s k e l e t a l m u s c l e s t e m c e l l
351
Table　2 Induction of MMP 3, TIMP 1, and
TIMP 2 mRNA and protein expression in purified odontoblasts by the
cytokine cocktail
derived； ＝3）.
加群では MMP 3 遺伝子およびタンパク質発現がみられ
なかった19,44）．さらに，内因性の MMP 阻害因子である
TIMP 1 および TIMP 2 の遺伝子ならびにタンパク質発
現の恒常的発現を見いだしたが，CM 添加による発現変
動はみられなかった19,44）
（Table 2）
．
CM を 1 U または 3 U 添加後，24 時間の反応におい
て，高純度象牙芽細胞の増殖が統計的有意にみられ
た19,44）．その一方で，炎症性 CM 5 U 添加群では細胞増
Table　3 Effect of the cytokine cocktail on cell
proliferation, MMP 3 activity, and
apoptosis of purified odontoblasts
殖がみられなかった19,44）．CM を 1 U および 3 U 添加 24
時間の反応において，高純度象牙芽細胞のアポトーシス
ことから，本実験結果で見いだされた MMP 3 の活性変
はみられなかったが，CM 5 U 添加群ではアポトーシス
動は，アポトーシスの結果，細胞外に放出された MMP
が統計的有意に観察された
3 を観察したものではないことが示唆された．
．さらに，CM を 1 U お
19,44）
よび 3 U 添加後 24 時間の反応において，高純度象牙芽細
胞の MMP 3 活性は統計的有意な上昇を認めたが，CM
5 U 添加群ではコントロールとほぼ同値であった19,44）
（Table 3）．
考察と今後の展望
本研究において，筆者らの CM を用いた
歯髄
MMP の 活 性 調 節 機 構 は， 内 因 性 阻 害 因 子 で あ る
炎モデルの有効性が明らかとなった．本実験系は 3 つの
TIMP，遺伝子発現調節，ペプチダーゼによる限定分解
代表的な炎症性サイトカインを混合することで細胞応答
など厳密に制御されている
．特に TIMP は MMP と
を検討する実験系であり，高純度象牙芽細胞に CM 処理
1：1 で結合し，MMP を介した細胞応答に対しカウン
と MMP 3 siRNA を併用することで，MMP 3 の新規な
ターパートナーとして強力に酵素活性抑制効果を示
作用を初めて明らかにした．象牙芽細胞はその存在量の
す3）．MMP 3 の主な阻害因子である TIMP 1 およびサ
少なさから，これまでは組織学的検討しかされていな
1,21）
イトカイン誘導型 TIMP 2 の遺伝子，ならびにタンパク
かったなかで，筆者らの分化誘導法ならびにセルソー
質の発現について検討したところ，恒常的発現を見いだ
ターによる純化システムは，98％を超える精製度の象牙
したが，CM 処理によりいずれの TIMP にも発現変動は
芽細胞の分離・回収を初めて可能とし，実験的炎症下に
認められなかった．さらに筆者らは，培養上清中ならび
おける本細胞の応答性を明示できた．本実験では 1 U 当
に細胞中の MMP 3 活性が MMP 3 mRNA の変動と完全
たりおのおの 1 ng/m の IL 1β，TNF α，IFN γから
に相関を示すことを確認しており（データ未発表），この
成るサイトカイン混合物を使用した．使用した濃度は，
日 本 歯 科 保 存 学 雑 誌
352
これまでにマウス MC3T3 E1 細胞を用いた研究で報告
された用量に基づいている
第 58 巻 第 5 号
Proinflammatory cytokine
．一般的に，サイトカ
43,45 48）
インの単独使用と比較してサイトカイン混合物は，相加
Odontoblast derived
from mouse ES cells
Wnt5
的あるいは相乗的作用により高い細胞反応性を示し，結
果として低濃度での応答性を検討できることが知られて
Lrp5/Fzd9
いる47）．サイトカイン単独使用の例として，筆者らはこ
れまでに IL 1βを使用してラット歯髄細胞7）ならびにマ
MMP−3
ウス ES および iPS 細胞由来象牙芽細胞において18），同
様の細胞反応性を示すデータを得ている．したがって，
3 種のサイトカイン混合物のなかでも，特に IL 1βが本
実験結果で示された細胞応答性に深く関与していると考
えられる．
CM（1 U）と MMP 3 siRNA 添加によりに惹起された
アポトーシスは，リコンビナント MMP 3 の添加（5∼30
ng/m ）により濃度依存的かつ統計的有意に抑制され（p
Cell proliferation
Fig.　4 Schematic illustrating the putative signaling
pathway by which proinflammatory cytokines
stimulate MMP 3 activity to induce cell proliferation in ES cell derived odontoblast like cells
＜0.01），30 ng/m の微量なレベルで，ほぼコントロール
レベルまで回復された18,19,44）．一方，比較的低濃度の
ナル伝達経路として，β カテニンを介したカノニカル経
MMP 3（5∼30 ng/m ）の添加が，CM 添加と MMP 3
路，PCP 経路（Wnt/JNK 経路）
，Wnt/Ca2＋経路の 3 種
siRNA 併用投与により惹起されたアポトーシスを回復
類が知られている．Kobayashi ら49）は，破骨細胞分化に
することを明示した．これらの結果は，炎症の場である
Wnt5 が関与することを報告し，また筆者ら50）は，本実
微小環境下で微量な MMP 3 が細胞増殖を制御しうるこ
験系でのサイトカイン誘導による細胞増殖が Wnt5 を介
とを示唆した．
することを確認している（Fig 4）．さらに，MMP 3 は，
高濃度の CM がアポトーシスを惹起する一方，低濃度
細胞周囲に存在し，象牙芽細胞自身が生成する ECM タ
の CM は MMP 3 の発現亢進とともに細胞増殖を誘導し
ンパク質であるコラーゲンタイプⅡ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅸおよび
た．しかし，MMP 3 は恒常的には遺伝子ならびにタン
Ⅹやプロテオグリカン，フィブロネクチン，ラミニン，
パク質レベルにおいて発現していない．したがって，本
エ ラ ス チ ン を 分 解 で き る51
研究結果から，早期の炎症の場（低濃度の CM）では
MMP 3 による ECM 分解の結果，細胞間の接触阻害か
MMP 3 は組織破壊というよりはむしろ，抗アポトーシ
ら開放されることで細胞増殖へ向かう可能性，あるいは
スならびに細胞増殖を誘導することで創傷治癒を促進す
ECM 分解産物の一部が，細胞増殖活性を担う可能性が
る可能性が高いことが示唆された．
ある．現在，これらの課題について引き続きに検討を
さらに興味深い知見として，炎症性 CM 添加に対し，
行っている．
マウス ES，iPS 由来高純度象牙芽細胞，ヒト骨格筋幹細
． こ れ ら の こ と か ら，
53）
お わ り に
胞由来高純度象牙芽細胞が，ほぼ同じ細胞応答性を示し
た点が挙げられる．一般的に，マウスに比べヒト幹細胞
の培養は煩雑を極め，慎重な扱いが必須である．さらに，
筆者らが新たに確立した 3 種の幹細胞由来象牙芽細胞
マウス iPS 細胞に比べ ES 細胞は高い生物学的活性なら
を高純度化し，炎症性サイトカインミクスチャー（CM）
びに細胞応答性を有することから，本実験結果はあらか
を添加することで得られた
じめ pilot run にてマウス ES 細胞由来高純度象牙芽細胞
て，炎症性 CM 誘導 MMP 3 の象牙芽細胞に対する新規
の応答性を確認することで，ヒト象牙芽細胞の応答性を
な生理的役割を明らかにするため，MMP 3 siRNA を用
かなりの高確度で予測できることを示唆する．
いて検討を行った結果をまとめると以下のとおりとなる．
サイトカインで誘導された MMP 3 がどのような機構
1．炎症性 CM 添加に対し，筆者らが新規に確立した
で象牙芽細胞の細胞増殖を導くかは，現時点では不明で
マウス ES，iPS 細胞由来高純度象牙芽細胞は，ヒト骨格
ある．しかし，部分的ではあるがシグナルカスケードが
筋幹細胞由来高純度象牙芽細胞とほぼ同じ細胞応答性を
歯髄炎モデルにおい
解明されつつあり，そのなかでも近年，外分泌性タンパ
示し，
ク質である Wnt シグナル伝達経路が注目されている．
胞内機構を解明できる細胞であることが確認された．
Wnt シグナル伝達経路は胚発生，形態形成や癌などに関
2．炎症性 CM 1 U および 3 U 添加群において，幹細胞
連するタンパク質ネットワークで，Wnt の関与するシグ
由来高純度象牙芽細胞には，MMP 3 遺伝子およびタン
での象牙芽細胞の分化，増殖ならびに細
2015 年 10 月
炎症性サイトカイン誘導 MMP 3 は歯髄創傷治癒を制御する
パク質発現がみられ，同時に MMP 3 活性がみられた．
一方，高濃度の CM 5 U 添加群では，MMP 3 遺伝子お
よびタンパク質発現，さらに MMP 3 活性がみられな
かった．
3．CM 1 U および 3 U 添加群において，幹細胞由来高
純度象牙芽細胞には細胞の増殖がみられた．その一方
で，CM 5 U 添加群では増殖がみられなかった．
4．CM 1 U および 3 U 添加群において，幹細胞由来高
純度象牙芽細胞のアポトーシスはみられない一方で，
CM 5 U 添加群ではアポトーシスがみられた．
5．MMP 3 siRNA を用いた MMP 3 遺伝子のノック
ダウンにより，CM 1 U および 3 U 添加群においてみら
れた幹細胞由来高純度象牙芽細胞の増殖が，統計学的有
意に抑制され，アポトーシスが引き起こされることが明
らかとなった．
6．IL 1β，TNF αおよび IFN γの CM は，1 U の低
濃度では細胞増殖の亢進，高濃度ではアポトーシス細胞
死を誘導した．つまり MMP 3 は歯髄の炎症時における
象牙芽細胞の増殖と抗アポトーシス作用を制御すること
で，歯髄創傷治癒に関与する可能性が示唆された．
本研究の一部は平成 26 年度日本学術振興会科学研究費補
助金基盤研究（A）
（研究課題番号：25253103）により行った．
文　献
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