タンパク質の分離・精製

タンパク質の分離・精製
生体材料
タンパク質の抽出
・ホモジネート
・遠心分離
分別沈殿（塩析）
脱塩
・クロマトグラフィー
・電気泳動
・限外ろ過
生体材料
・動物臓器
・動物培養細胞
・植物組織
・微生物
微生物
培養
前培養
大量培養
集菌
ホモジネート、破砕
機械破砕
超音波破砕
加圧減圧処理
タンパク質の定量
ビウレット法
タンパク質（アルカリ溶液）
+ CuSO4
錯体形成
紫紅、青紫を呈色
540から560 nmの吸光度を測定
フェノール試薬法（Lowry法）
リンモリブデン酸
タンパク質
（還元性基）
リンモリブデンブルー
500から750 nmの吸光度を測定
フェノール類と反応して青色を示すフェノール試薬
（リンモリブデン酸）を用いる。
タンパク質（還元性基）
チロシン、システイン、
トリプトファンなど
・比較的感度が高い。
・特定のアミノ酸残基に依存する。
・還元性物質の影響を受ける。
紫外吸収法
１．280 nmの吸光度
トリプトファン ε 278 = 5550 M-1cm-1
チロシン ε 275 = 1340 M-1cm-1
フェニルアラニン
２．215, 225 nmの吸光度の差
タンパク質のペプチド結合（190-230
nm）
R
３．280, 205 nmの吸光度の比
R
R = H CBB R-250
R = CH3 CBB G-250
C2H5
C
H2
色素結合法
N
C
N+
C2H5
H2C
-
O3 S
クマシーブリリアントブルー
SO3-
陽イオン型
470 nm（赤）
中性型
650 nm（緑）
陰イオン型
NH
595 nm（青）
タンパク質と結合すると陰イオン型になる。
OC2H5
クロマトグラフィー
Vr
tr
二相間の分配に基づく分離法
V0
t0
移動相
固定相
時間または容量
タンパク質の分離には液体クロマト
グラフィーを用いる。
試料注入
V0 ：ボイド容量
カラムに保持されずに出てくる
溶出容量
tr
：保持時間
Vr ：保持容量
f ：流速
Vr = tr × f
Vr B
tr B
Vr A
tr A
V0
t0
A
B
時間または容量
試料注入
理論段数
tr 2
W=4σ
N= σ
tr 2
N = 16
W
tr 2
N = 5.54
W1 / 2
W1 / 2 ：半値幅
保持される度合い
容量比（Capacity factor）
k'
Vr – V0
tr – t0
k' =
= t
V0
0
分離係数（Separation factor） α
k'(A)
α=
k'(B)
液体クロマトグラフィーの種類
１．イオン交換クロマトグラフィー
静電的結合
２．ゲルろ過クロマトグラフィー
分子ふるい
３．疎水性クロマトグラフィー
疎水的相互作用
４．吸着クロマトグラフィー
水素結合、ファンデル
（ヒドロキシアパタイト）
ワールス力
５．逆相クロマトグラフィー
疎水的相互作用
６．アフィニティークロマトグラフィー
特異的親和性
１．イオン交換クロマトグラフィー
pHの平衡化
試料の添加
陽イオン交換樹脂
陰イオン性物質
陽イオン性物質
イオン強度：低
高
分取目的タンパク質の必要な基本情報
・等電点
・安定性
タンパク質の電荷とpHの関係
+
電
荷
例えばこの場合
pH 5 陽イオン交換体を使用
pH 8 陰イオン交換体を使用
等電点
4
6
8
10
タンパク質が安定なpH領域
pH
緩衝溶液
緩衝成分がイオン交換体に吸着されれば、ｐＨのずれを
生じるので、そのような組み合わせはさける。
従って、
+
+
陰イオン交換体には、 型
BH
B+H
+
陽イオン交換体には、 型
AH
A +H
を用いる。
２．ゲルろ過クロマトグラフィー
分子ふるい
平衡化
試料の添加
一定の緩衝液による溶出
多孔性樹脂
高分子量物質
低分子量物質
利点
固定相への吸着がないため、タンパク質が変性しにくい。
ｐＨやイオン強度に影響されにくい。
３．疎水性クロマトグラフィー
タンパク質の疎水性相互作用を利用する。
疎水性アミノ酸 Ｗ，Ｉ，Ｐ，Ｆ，Ｌ，Ｖ などが含まれるため。
平衡化
疎水性樹脂
親水性物質
疎水性物質
試料の添加
塩強度：高
塩濃度の違いによる溶出
低
吸着脱離に関する要因
ａ．温度
疎水結合の強度は温度変化に大きく依存する。
ｂ．イオン
疎水結合はイオンの種類や濃度によって大きく影響される。
アニオン 疎水結合を弱める 疎水結合を強める
SCN ->I->CLO4->NO3->Br->Cl->CH3COO->F->SO42 カチオン
Ba 2+>Ca2+>Mg2+>Li+>Cs+>Na+>K+>Rb+>NH4+
高濃度硫安(NH
ｃ．界面活性剤
4)2SO4によって疎水結合は強められる。
４．吸着クロマトグラフィー
（ヒドロキシアパタイト）
Ca10(PO4)6(OH)2
六角柱結晶
a面：酸性タンパク質が主に吸着
c面：塩基性タンパク質が主に吸着
a、c面の溶出：リン酸緩衝溶液
c面の溶出：KCl, NaCl, CaCl2, MgCl2
c面
a面（b面は等価）
ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー
平衡化
試料の添加
KCl濃度：
低
ｃ面の溶出
ヒドロキシアパタイト担体
塩基性タンパク質
酸性タンパク質
高
リン酸イオン濃度：
低
高
a、ｃ面の溶出
５．逆相クロマトグラフィー
有機溶媒濃度の違いによる溶出
平衡化
試料の添加
有機溶媒濃度：低
疎水性担体
親水性物質
疎水性物質
固定相：オクタデシルシラン（ＯＤＳ）など
移動相：水溶液、水溶液・有機溶媒混合溶液
疎水性有機化合物、ペプチド、核酸」の分離
高
６．アフィニティークロマトグラフィー
生化学的な特異的親和性を利用
試料添加
目的タンパク質の
吸着
吸着体固定化カラム
目的タンパク質
不純物
目的タンパク質の
溶出