中村学園大学薬膳科学研究所研究紀要第3号目次

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中村学園大学薬膳科学研究所研究紀要第3号目次

中村学園大学薬膳科学研究所
研究紀要
目
第３号
次
〈分子栄養学部門〉
…………………………………………………
● Review
編集責任者：内山
文昭
Article
Challenge in protein-small molecule Interactions
Recent advances in protein chemical modification.
高齢者のうつに対する社会的サポートの課題
…………………………
1
………………………
7
……………………………… 33
〈生体応答部門〉
…………………………………………………
● Original
編集責任者：吉岡
慶子
Article
The masticatory score and the occlusal force based on
the textural properties of food for infants
…………………………… 39
〈栄養疫学部門〉
…………………………………………………
編集責任者：徳井
教孝
● 総説論文
…………………………………………
腸内環境からみた子どもの食と健康
47
〈開発・教育部門〉
……………………………………………………
編集責任者：三成
由美
● 原著論文
福岡県児童における食育推進のための
魚介類摂取の意識・嗜好の地域差
…………………………………………
51
Review Article
Challenge in protein-small molecule Interactions
Fumiaki Uchiyama
Department of Molecular Biosciences, Institute of Preventive and Medicinal Dietetics,
Nakamura-Gakuen University, 5-7-1 Befu, Jounan-Ku, Fukuoka, 814-0198, Japan
Corresponding author. E-mail: [email protected]
Phone: +81-(0)92-851-2598
fax: +81-(0)92-841-7762
Key words: conformational change, torsion strain, protein-protein interaction, protein binding surface areas, tumor necrosis factor,
TNFR
(Received April 1, 2010)
Abstract
The potential for driving force in protein-ligand binding are discussed in this review. The conformational
change in protein-ligand interaction is dependent on characteristics of proteins. Proteins which do not change conformation before ligand binding compose of constraint binding site residues. The conformation of ligand-binding
sites of these proteins adopts disallowed Ramachandran angels. Conformational changes in protein-ligand binding
result to adopt energetically unfavorable or disallowed Ramachandran angels. These findings show that an
element of driving forces in protein-ligand binding may be the generation of torsion-angle strain.
and assisting medical treatments, needs to clarify the
Introduction
physiological efficacy of public herbs in physiological
conditions by novel approaches such as omicstechnologies and studies for protein-small moleule inter-
Foods in diet contain numerous chemical small
compounds, which have some bioactivities in human.
action.
Protein-small
molecule
interaction
is
an
Enormous tests of food chemicals in vitro are not
important and confronted problem because all physio-
always linked to detect physiological activity in human
logical actions are based on protein-ligand interaction.
body and also can not rationally explain the efficacy of
Protein-ligand interaction has been advanced to de-
traditional Chinese medical herbs except some com-
termine 3D structures by X-ray crystallography,
pounds with strong activity. The efficacy of chemical
nuclear magnetic resonance spectroscopy, fluorescence,
compounds extracted from traditional Chinese medical
Raman spectroscopy and their combination. Although
herbs may be explained by either assembly in combina-
static structures are known for many proteins, the
tion of compounds or little reaction of single compounds
dynamic change of proteins in reactions is unknown.
in the present biological evaluation. The interaction
Proteins are dynamic molecules and often undergo con-
between proteins and small compounds has been
formational change upon ligand binding. Flexible loop
studied in medicinal chemistry but poorly in food chem-
regions in proteins are believed to have a critical func-
istry because of their different business values in
tional role in protein-ligand binding. Rigid regions in
success. Nevertheless, the use of herbs and supple-
proteins also are related to hot spots in protein-protein
ments is prevalently popular in Japan. Yakuzen-
interaction. Therefore, there may be some patterns for
Dietetics, which defines as diets contributed for
protein dynamism in protein-protein interaction. In this
prevention of diseases, delivery of nutritional elements
review, I discuss studies related to conformation and
−1−
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
torsion strains in protein-ligand interaction and present
Proteins which do not change conformation before
the interaction between small compounds and TNF-
ligand binding compose of constraint binding site
TNFR system as a challenging example in protein-
residues. Interestingly, the conformation of ligand-
ligand binding.
binding sites of these proteins also adopts disallowed
Ramachandran angels４ . The state having disallowed
Ramachandran angels in ligand binding sites locally
Conformation and torsion strains in
protein-ligand interaction
generates torsion-angle strain clusters. These findings
show that one of the binding potential in proteins may
prerequisite the generation of torsion-angle strain
The process of ligand-receptor binding often
structures.
clusters rather than conformational changes. The
Conformational change includes both backbone and side
release of torsion-angle strain may produce enough
contains
conformational
changes
in
１
chain movements . The conformation in backbone
energy to form transition state of complex. In protein
structures changes domain motion such as hinge motion
dynamics, energy landscape generally represented as
and loop structure around rigid structures. Side chain
the hierarchy of protein dynamics and energy barrire
conformational changes are often in flexible loop struc-
r５,６. For ligand-protein binding, the energy landscape
ture on rigid structures. Conformational changes may
is the free energy determined such as bond vibration,
perform in the range of own protein flexibility, which
side chain rotation, loop motion, domain motion and
accompanies free energy changes. To consider driving
solvation.
force of conformational changes, proteins with metal
changing conformations of ligands and/or receptors. In
binding sites is exampled. Metal binding in proteins con-
fact, comparisons of 3D structures between bound and
tributes structural stability and acts as cofactors to
unbound structures in PDB show ligand-induced
function catalysis and protein binding. In the compari-
protein conformational changes in backbone structures
sons of 3D structures between unbound state and metal
as well as binding sites７. Nevertheless, the relationship
bound state in the Protein Data Bank (PDB), more than
between protein conformations and driving forces in
40% of the binding sites revealed rearrangements of
ligand-protein binding is unclear. The torsion-angle
２
Entropy
changes
may
compensate
by
conformation including the backbones . Metal ion inter-
strain is one of the candidates for critical driving force
acts with ionic residues such as aspartate, glutamate,
in protein-ligand binding. In designing torsion-angle
cystein and histidine to make conformation change.
strain clusters, the presence of glycine residues in func-
Since metal ion has concrete structure, the driving force
tional loops may be important because glycine residues
of the conformational change is electrostatic energy of
are the highest occurrence in loops to comply with the
metal-ionic residue interaction. The electrostatic inter-
geometrical constraints. Since the glycine residue
action provides energy to exceed transition state for the
provides large allowed conformational space or is not re-
conformational change. In other driving force of confor-
stricted to the regions of Ramachandran plot appropri-
mational changes, hydrogen bonds, hydrophobic inter-
ate to the other amino acids with side chains, the
actions
to
presence of glycine residue may be rational for
conformational change as a result of comparison of
adequate energy landscape. In fact, the relative fre-
structures between bound state and unbound state.
quency of glycine in loops is shown to correlate to the
Conformational changes often accompany to change
number of state having disallowed Ramachandran
protein strain energies because ligands binding to
angels by analyzing a bank of loops from three to eight
proteins induce deformation. The intra-molecular elec-
residues long from PDB８ . These findings indicate that
trostatic
histidine-containig
target regions in proteins for discovery of ligands may
phosphocarrier protein (HPr) induces a conformational
be in turns with glycine residues with disallowed
change to form the active center in the sequence of His-
Ramachandran angels.
and
van
der
interaction
Waals
in
packing
relate
３
Ala-Arg . The conformation of HPr active center adopts
energetically unfavorable or disallowed Ramachandran
angels. Conformational changes in protein-ligand interaction are dependent on characteristics of proteins.
−2−
Challenge in protein-small molecular Interactions
chemical libraries or mimetics of interfaces of protein by
Functional conformation and interfaces in
protein-ligand binding
fragmentation. These approaches seem to be technically
independent each other, but have a common basic
In the search of protein interfaces, the selection of
element. HTS must make libraries invest a lot of con-
loop motifs is important for designing peptides because
cept-based compounds with potentials to raise confor-
binding site residues adopting disallowed conformations
mational change or binding energy. Equally, fragment
are classified as gamma-turn and beta-turn conforma-
mimics must not extract the only sequences of inter-
tions. Loop structures are often present in the interface
faces in complex but the potentials of conformational
of protein-ligand binding and can change their confor-
change or binding energy. In the behind, both ap-
mations. Although loops were originally described as
proaches are introduced with tumor necrosis factor
random coil, the increased loops in 3D structures could
(TNF) and its receptor.
be structurally classified by loop geometry, three angles
and one distance between connected secondary struc-
Energy landscape and binding active sites
in proteins
tures and Ramachandran pattern. The loop between
connected secondary structures occupies 80% of short
loops with less than 10 amino acids. The loops are func-
The pathway of protein-ligand binding is two
tionally separated into two groups. The one is just to
mechanisms９,10 , which are named as conventional in-
contribute globular formation of proteins to stabilize
duced-fit and population-shift11 (conformational selec-
and prefers to the shortest loops broken alpha-helices or
tion). Both mechanisms perform in the dependence on
beta-sheets. The other is functional loops which
protein concentration10 as well as types of proteins. The
generate interfaces for protein-ligand binding and
common element is conformational change before or
binding pockets. Functional loops often make conforma-
after ligand binding. The motion of functional conforma-
tion change in protein-ligand binding. The areas of
tions accompanies to increase free energy of a protein in
contact surface is broad from 100 Å to 3000 Å in
the unbound protein. Steric strain energy, which arises
protein-ligand binding and is dependent on the
from rotation around disallowed torsion angles, is con-
molecular size of ligands. The small ligands such as
tributed to the increase of free energy in protein
enzymes, G-protein-coupled receptors and allosteric
binding and is released to form a complex12. This finding
pockets have been designed to be generated in medici-
agrees with the active sites of proteins with or without
nal chemistry. The large contact surfaces in protein-
changing conformation often exist the state having dis-
ligand binding have never been designed because of
allowed Ramachandran angels. Therefore, steric strains
little example to know how to begin study on this case.
may be necessary in designing ligands.
Consequently, there is an interesting problem for understanding energy landscape in protein-protein inter-
Interaction between TNF and TNF receptor
families
action as well as an enormous therapeutic potential in
challenging to design large contact surface in protein interaction. One of the approaches is used for antibodies
Tumor necrosis factor (TNF) was identified as
which have been developed for humanization from
products of lymphocytes and macrophages and caused
mouse monoclonal antibodies, preparing from human
the lysis of certain types of cells, especially tumor cells.
peripheral lymphocytes, protein engineering for phar-
At the same time, TNF was cloned to be found identical
maceutics and cell culture for antibody production, but
to cachectin, mediator of cachexia. Then, several studies
the concept of antibody still remains in large contact
have demonstrated important roles in the field of in-
surface interaction to oblige higher cost and time
flammatory such as rheumatoid arthritis, Crohn's
consume. Challenging approaches are now underway to
disease and septic shock. Moreover, TNF was a
understand the element of large contact surface interac-
member of adipocytokines related to diabetes13 ,
tion and to create small molecules bound or disrupted
atherosclerosis14 and bone metabolism15 . The DNA
protein-protein binding to large contact surface. The
cloning of TNF receptors led to discovery of TNF re-
practice is either high throughput screening (HTS) for
ceptor-related superfamily proteins (TNFR SFPs)16 ,
−3−
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
Fig. 1 The structure of mouse tumour-necrosis factor alpha (mTNF). The structures of mTNF and human
TNF are very similar.
which related to host defense, inflammation, apoptosis,
structure of the complex22 is shown as a monomeric
autoimmunity, and organogenesis. Since TNF is an im-
view in Figure 2.
portant role in trigger of inflammatory pathway, the inhibition
of
TNF
has
been
investigated
In the complex of TNF beta-TNFR p55, the flexible
as
loop structure of TNF beta interacts with the longer
pharmacological target. The production or action of
face consisted of the sequence of HCLSCSKSRKEMGQ
TNF was inhibited by TNF soluble receptor17−20 ,
and the short loop with the sequence of FTASEN in
glucocorticoids,
anti-
TNFR. The static interface of the two sequences in
inflammatory cytokines (IL-10 and IL-4), cholinergic
TNFR provide the design of cyclic peptides, but TNF
anti-inflammatory pathway, inhibitors of NF κ B,
inhibition of their peptides were little activities23. On the
metalloprotease
other hand, beta-turn structure with the sequence of
phosphodiesterase
inhibitors,
inhibitors,
thalidomide
and
p38
mitogen-activated protein kinase inhibitors.
WSENL in TNFR, which is located near the interface of
TNF is expressed as a membrane-embedded form,
complex, was successful to peptidomimetics with
in which TNF is cleavaged to form soluble mature and
is released as active trimers. The 17,350-dalton monomer forms an elongated, antiparallel beta-pleated sheet
sandwich with a jelly-roll" topology. Three monomers
associate intimately about a 3-fold axis of symmetry to
form a compact bell-shaped trimer (Fig. 1)21.
The TNF ligand family, TNF-beta (LT alpha) and
TNF-alpha (LT beta) interact in a complex fashion of
cross-binding to their receptors (TNFR p55, TNFR p75,
and TNFR-RP). Two soluble TNF-binding proteins are
derived from the extracellular domains of the p55 and
p75 TNF receptors. The extracellular domains of the
two receptors each contain four similar cysteine-rich
repeats of about 40 amino acids, in common with several
other cell surface proteins including the p75 nervegrowth-factor receptor and the CD40 and Fas antigens.
Fig. 2
The complex with TNF ligand and TNFR is considered
to form TNF trimers covered with TNFR trimers. The
−4−
The structure of the complex of the extracellular
domain of the human 55 kd tumor necrosis factor
(TNF) receptor with human TNF beta.
Challenge in protein-small molecular Interactions
interaction.
moderate TNF inhibitory activity (IC50 =5 μM in
receptor binding assay)23 . These findings indicate that
the important dynamic region of TNFR to interact with
References
TNF may be also present near the static interface
regions. The region of WSENL sequence in TNFR may
１. Betts, M.J. & Sternberg, M.J. An analysis of conformational
induce conformational changes in forming the complex
changes on protein-protein association: implications for
predictive docking. Protein Eng 12, 271-283 (1999).
of TNF-TNFR24 . Therefore, the discovery of a key
２. Babor, M., Greenblatt, H.M., Edelman, M. & Sobolev, V.
region for diriving force of conformational change may
Flexibility of metal binding sites in proteins on a database
be important for designing ligands. On the other hand,
scale. Proteins 59, 221-230 (2005).
HTS provided to discover non-peptidic small compound
３. Jia, Z., Vandonselaar, M., Quail, J.W. & Delbaere, L.T.
to inhibit TNF-alpha TNFR binding with KD=13 μM25.
Active-centre torsion-angle strain revealed in 1.6 A-
The mechanism of this compound is to disrupt the
resolution structure of histidine-containing phosphocarrier
protein. Nature 361, 94-97 (1993).
trimer of TNF-alpha. This research indicates that there
４. Gunasekaran, K. & Nussinov, R. How different are struc-
is a wedge-driven region to disrupt the trimer mainte-
turally flexible and rigid binding sites? Sequence and
nance. Both compounds revealed the same order of in-
structural features discriminating proteins that do and do
hibitory activity. Although two approaches are different
not undergo conformational change upon ligand binding. J
technology, the potentials of the compounds was equiva-
Mol Biol 365, 257-273 (2007).
lent in the inhibition of TNF bound TNFR. The drug
５. Henzler-Wildman, K. & Kern, D. Dynamic personalities of
proteins. Nature 450, 964-972 (2007).
candidates for targets with small contact surface will
６. Gutteridge, A. & Thornton, J. Conformational change in
make their biological activities improve by normal lead
substrate binding, catalysis and product release: an open
optimization, but the candidates with large contact
and shut case? FEBS Lett 567, 67-73 (2004).
surface provide no guarantee for lead optimization in
７. Najmanovich, R., Kuttner, J., Sobolev, V. & Edelman, M.
conventional approach because of no precedents. Even
Side-chain flexibility in proteins upon ligand binding.
lead optimization as well as discovery of leads for
Proteins 39, 261-268 (2000).
８. Kwasigroch, J.M., Chomilier, J. & Mornon, J.P. A global
targets with large contact interface is a challenging
task. In this way, the most advanced research just
taxonomy of loops in globular proteins. J Mol Biol 259, 855-
launches to elucidate protein-small-molecule binding.
872 (1996).
９. Okazaki, K. & Takada, S. Dynamic energy landscape view
We will be encouraged to understand protein-small
of coupled binding and protein conformational change: in-
molecule binding by integrated information such as 3D
duced-fit versus population-shift mechanisms. Proc Natl
structure and energy landscape in protein-protein inter-
Acad Sci U S A 105, 11182-11187 (2008).
action, identification of driving force for conformational
10. Hammes, G.G., Chang, Y.C. & Oas, T.G. Conformational selection or induced fit: a flux description of reaction mecha-
changes and discovery of potential compounds.
nism. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 13737-13741 (2009).
11. Mourant, J.R. et al. Ligand binding to heme proteins: II.
Perspective in the future
Transitions in the heme pocket of myoglobin. Biophys J
65, 1496-1507 (1993).
Targets with large contact surface in protein-ligand
12. Shim, J.Y. & Howlett, A.C. Steric trigger as a mechanism
binding such as growth factors and cytokines has been
for CB1 cannabinoid receptor activation. J Chem Inf
Comput Sci 44, 1466-1476 (2004).
buried in fantasy. 3D structures in PDB provide the
comparisons of protein-ligand complexes and their
13. Flyvbjerg, A. Diabetic angiopathy, the complement
ligand-free proteins to understand the critical relation
system and the tumor necrosis factor superfamily. Nat
Rev Endocrinol 6, 94-101.
between loops and glycine residues with disallowed
14. McKellar, G.E., McCarey, D.W., Sattar, N. & McInnes, I.B.
Ramachandran angels. Moreover, inhibitory compounds
Role
against targets with large contact surface have discov-
for
TNF
in
atherosclerosis?
Lessons
from
autoimmune disease. Nat Rev Cardiol 6, 410-417 (2009).
ered. The protein-ligand interactions related to large
15. Kearns, A.E., Khosla, S. & Kostenuik, P.J. Receptor activa-
contact surface will be an important therapeutics with
tor of nuclear factor kappaB ligand and osteoprotegerin
advance on understanding energy landscape, especially
regulation of bone remodeling in health and disease.
Endocr Rev 29, 155-192 (2008).
steric strain energy in conformation, in protein-protein
−5−
薬膳科学研究所研究紀要
16. Locksley, R.M., Killeen, N. & Lenardo, M.J. The TNF and
第３号
urine. Evidence for immunological cross-reactivity with
TNF receptor superfamilies: integrating mammalian
cell surface tumor necrosis factor receptors. J Biol Chem
biology. Cell 104, 487-501 (2001).
265, 1531-1536 (1990).
17. Seckinger, P., Zhang, J.H., Hauptmann, B. & Dayer, J.M.
21. Eck, M.J. & Sprang, S.R. The structure of tumor necrosis
Characterization of a tumor necrosis factor alpha (TNF-
factor-alpha at 2.6 A resolution. Implications for receptor
alpha)
inhibitor:
evidence
of
immunological
binding. J Biol Chem 264, 17595-17605 (1989).
cross-
reactivity with the TNF receptor. Proc Natl Acad Sci U S
22. Banner, D.W. et al. Crystal structure of the soluble human
A 87, 5188-5192 (1990).
M., Gullberg, U., Nilsson, E. & Olsson, I.
Characterization in vitro of a human tumor necrosis factor-binding protein. A soluble form of a tumor necrosis
factor receptor. J Clin Invest 86, 1396-1402 (1990).
19. Gatanaga, T. et al. Purification and characterization of an
inhibitor (soluble tumor necrosis factor receptor) for
tumor necrosis factor and lymphotoxin obtained from the
serum ultrafiltrates of human cancer patients. Proc Natl
Acad Sci U S A 87, 8781-8784 (1990).
20. Engelmann, H., Novick, D. & Wallach, D. Two tumor
necrosis factor-binding proteins purified from human
55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation. Cell 73, 431-445 (1993).
18. Lantz,
23. Takasaki, W., Kajino, Y., Kajino, K., Murali, R. & Greene,
M.I. Structure-based design and characterization of
exocyclic peptidomimetics that inhibit TNF alpha binding
to its receptor. Nat Biotechnol 15, 1266-1270 (1997).
24. Murali, R. et al. Disabling TNF receptor signaling by
induced conformational perturbation of tryptophan-107.
Proc Natl Acad Sci U S A 102, 10970-10975 (2005).
25. He, M.M. et al. Small-molecule inhibition of TNF-alpha.
Science 310, 1022-1025 (2005).
−6−
Review Article
Recent advances in protein chemical modification.
Tamaki Jikyo
Department of Molecular Biosciences, Institute of Preventive and Medicinal Dietetics, Nakamura Gakuen University
(Received April 1, 2010)
Abstract
Chemical modification of protein is an arduous but fruitful task. Many chemical methods have been developed for structure determination, protein engineering and proteomics technology by carefully balancing reactivity
and selectivity. We have in hand an arsenal of tools from which we can select a relevant reaction to tackle their
problems. Identification and quantification of multiple proteins from complex mixtures is a central theme in postgenomic biology. Chemical modification reactions are available in various protocols for mass-spectrometry-based
proteome analysis. In this review, I will present the most popular and effective methods employing chemical
modifications of proteins.
タンパク質の化学修飾法―最近の進歩―
治京
玉記
中村学園大学薬膳科学研究所分子栄養学部門
キーワード
化学修飾法､プロテオーム解析､安定同位体標識法
(2010年４月１日受理)
これらの突然変異は主にこのタンパク質の安定性を低下
緒
言
させている３｡酵素と受容体はよく薬物の標的となるが､
このような薬物によって機能が回復したり､感染性病原
タンパク質は､生命体の主要な機能性分子であり､そ
体や癌が破壊されたりする｡タンパク質科学の究極の目
の性質は､治療薬､触媒あるいは材料として用いられる
的は､タンパク質の構造と活性､そうして､それがどの
ほど大変有用である｡多くの病気がタンパク質の機能を
ようにリガンドと結合するかを初めから予測できるよう
消失させる突然変異に由来している｡例えば､フェニル
になることである｡これが成し遂げられたとき､新規な
ケトン症では､触媒活性が損なわれ､そのため代謝経路
触媒や材料､そうして､病気を除去して不健康状態を最
が変わり､筋ジストロフィーのように構造特性が損なわ
小限にとどめる薬剤を設計し合成することが可能になる｡
れ､物理的機能の喪失がもたらされる例もある｡クロイ
現在のタンパク質研究では､直接の観測結果が試薬の
ツフェルト・ヤコブ病やその他の伝染性脳症は､タンパ
構造上の変化と結び付けられてきており､酵素と安定反
ク質がその形を変え､重合体を形成した結果もたらされ
応中間体の構造をＸ線結晶解析によって直接観測したり､
ている１｡同様に､アミロイド症に起因する病気では､
過度的中間体を速度論的分光法によって特徴づけたり､
タンパク質は徐々にβシート重合体の長い鎖に変わり､
遷移状態の構造を直接の速度論的測定から推論されてい
沈殿して繊維を形成する２｡多くの癌がタンパク質の突
る｡さらに､基質の構造を化学合成あるいは化学修飾を
然変異に由来しており､ヒトの癌の約50％は腫瘍抑制タ
用いて変えたり､酵素の構造をタンパク質工学を用いて
ンパク質 p53の突然変異によって引き起こされているが､
変えたりすることによって､構造と活性の相互作用を直
−7−
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
クチン繊維のような複雑なシステムの自発的アセンブリ
接研究するこが可能となっている｡
本稿では､タンパク質の機能と構造､タンパク質中の
(組み立て) を可能にしている｡構造タンパク質はまた､
アミノ酸残基の化学修飾法についての一般的所見から最
絹､コラーゲン､ケラチンといったバイオマテリアル
先端技術として化学修飾法を利用したプロテオーム解析
(医用生体材料) の重要な供給源でもある｡
タンパク質は､ DNA ポリメラーゼや遺伝子調整タン
について概説する｡
パク質が DNA に結合する場合のように､タンパク質以
タンパク質の機能と構造
４−６
外の生体高分子に結合することもあるが､輸送体や､シ
グナル伝達分子を結合する受容体の場合には､タンパク
タンパク質は､最も多目的に用いられている細胞の構
質に結合する｡この結合機能はタンパク質表面の示す構
成高分子であり､タンパク質の機能とは､タンパク質分
造的かつ化学的な多様性によるもので､そのためタンパ
子が単独で示す生化学的機能であり､また他のタンパク
ク質はその他のタンパク質分子と高度に特異的に相互作
質分子との会合体もしくは複合体の一部として果たす細
用することが可能となる｡タンパク質の触媒作用には､
胞機能や､細胞もしくは生物内で生じる表現型を意味す
基質や場合によっては調整タンパク質分子に対する特異
ることもある｡タンパク質の生化学的機能の主な例は､
的な結合だけでなく､特異的な化学反応性もまた必要で
①結合形成､ ②触媒作用､ ③分子スイッチ機能､ ④細胞
ある｡調整を受ける酵素や分子スイッチ､例えばシグナ
や生物の構造体としての機能がある｡
ル伝達のためのＧタンパク質 (GTP の加水分解を触媒
①結合形成：結合相手となる分子を特異的に認識する
する酵素) では､構造の安定性と柔軟性との微妙なバラ
ことは､タンパク質機能の中心であり､タンパク質に結
ンスの影響を受ける大規模なコンフォメーション変化が
合する分子 (リガンド) は､ミオグロビンのヘム基に配
必要である｡構造タンパク質には､絹のように優れた強
位する酸素分子のような低分子のこともあるが､
度や､毛髪､角､羽毛の構造タンパク質であるケラチン
TATA 結合タンパク質が結合することによって歪めら
のように強靭さと耐久性を示すものがある｡もしくはア
れる特定の DNA 配列 (TATA ボックス) のような高
クチンやチューブリンのように､ヌクレオチドの加水分
分子のこともある｡特異的な結合形成は､形状の相補性
解による複雑な動力学的特性をもつこともある｡タンパ
および水素結合などの極性作用により決定される｡
ク質が示す､この並外れた機能上の多様性と多目的性は､
②触媒作用：生体細胞における化学反応は基本的には
構成アミノ酸側鎖の化学的多様性､ポリペプチド鎖の柔
例外なく触媒作用により起こり､触媒の大半はタンパク
軟性､さらに､様々なアミノ酸配列のポリペプチドがと
質からなる酵素である｡酵素の触媒効率は際立っており､
るきわめて多彩な折りたたまれ方から生じている｡
17
反応系は単純な緩衝作用による触媒反応の10 倍にも加
タンパク質の主要成分は枝分かれのないポリペプチド
速される｡多くの構造的特性が酵素の触媒能に影響を与
鎖であり､１つの残基のα-カルボキシル基が次の残基
え､反応基が化学反応に都合のよい向きにまとまって存
のα-アミノ基とアミド結合によってつなげられた L-α-
在する (近接性)､化学反応が基底状態にある複合体に
アミノ酸より構成されている｡ポリペプチド鎖の生合成
比べて遷移状態の場合に､より強固に結合する (遷移状
後に共有結合的修飾を受けることはあるが､通常､ 20種
態安定化)､酸塩基触媒反応などが見られる｡
類のアミノ酸だけで構成されている (図１)｡
③分子スイッチ機能：タンパク質は柔軟性のある分子
タンパク質は､図２に示すとおりペプチド結合でつな
であり､その立体構造は pH 変化やリガンドの結合に応
がったアミノ酸の鎖である｡それぞれの Cα原子の周り
じて変化しうる｡このような構造変化は､細胞内プロセ
で鎖が回転するため､鎖は多数のコンフォメーションを
スを制御する分子スイッチとして作用する｡例えば､多
とりうる｡タンパク質の三次元構造の違いをもたらすの
くの癌でのきわめて重要な分子スイッチは低分子量
は､これらのコンフォメーションの変化である｡鎖中の
GTP 結合タンパク質である Ras の GTP が GDP に加水
各アミノ酸は極性を帯びている｡つまり､正と負に電荷
分解された際に生じる構造変化である｡ GTP 結合型
した領域が分離しており､それらは､水素結合の受容基
Ras は ON (活性化) 状態で､細胞を増殖させるシグナ
として働きうる化学的に自由な C=O 基と水素結合の供
ルを伝達する｡ GDP 結合型は OFF (不活性化) 状態で
与基として働きうる NH 基である｡これらの基が､タ
シグナルを伝達しない｡
ンパク質構造の中で相互作用する｡タンパク質中に見つ
④構造タンパク質：タンパク質は生体システムの主要
かる20種類のアミノ酸は､それらの R 基 (側鎖) の化
な構成要素の一部として機能し､この機能は､タンパク
学的性質に従って分類される｡Ｒ側鎖は構造的に重要な
質のサブユニット同士､および他種タンパク質､糖質な
役割を果たしており､グリシンとシステインは特別な役
どとの特異的会合の影響を受けている｡このことが､ア
割を果たしている｡グリシンは側鎖をもっておらず､し
−8−
Recent advances in protein chemical modification.
たがって､構造上の柔軟性を局在的に高めうる｡システ
造の種類は､多いとはいえ限られていると考えられる｡
インは､もう１つのシステインと反応して､タンパク質
フォールドの種類がさほど多くないことが､安定なフォー
構造を安定化する架橋を形成する｡
ルド数に対する物理的な制約を示しているのか､単に､
タンパク質のコアの大部分は､三次元の配置へと折り
既存の安定なフォールドからの分岐進化上の都合のため
たたまれたαヘリックスとβシートという基本的な二次
であるかは明らかにされていない｡しかしこれは実用面
構造からなる｡二次構造中では､隣接するアミノ酸の間
での重要な問題であり､自然状態ではありえない安定な
に水素結合の規則的なパターンが形成される｡そして､
フォールドが多数あるとすれば､産業上の利用や医療用
それらのアミノ酸は一定のΦ､ Ψ角を持っており､これ
の目的で全く新規のタンパク質を作製することが可能に
らの構造が形成されることにより､各アミノ酸の極性は
なることになる｡
アミノ酸側鎖 (図１) は､側鎖間や水分子との相互作
中和される｡こうした二次構造は､タンパク質コア中に
きつく詰め合されて疎水性の環境に置かれている｡各ア
用に際して多様な性質をもつ｡アミノ酸側鎖の違いは､
ミノ酸の側鎖が占める事でできる体積は限られており､
タンパク質の安定性や機能に大きく影響を及ぼす｡
疎水性アミノ酸残基間にはファンデルワールス相互作
また､他の近くの側鎖との可能な相互作用の数も限られ
用のみが働き､水分子との接触を避けて互いに密着しよ
ている｡
ポリペプチドがタンパク質として機能するには､通常､
うとする疎水性残基の性質により､疎水性相互作用が生
生理的条件下で安定な三次元構造 (フォールド) を形づ
じる｡アラニンやロイシンはヘリックス構造を非常に形
くることが可能でなければならない｡その反面､タンパ
成しやすい残基であるが､プロリンがヘリックスに含ま
ク質が機能するには､折りたたまれたタンパク質が適度
れることはまれである｡これは､プロリンではペプチド
に柔軟であることが求められている｡おそらくこの制約
骨格を形成する窒素原子において､ヘリックス構造に必
のために､タンパク質がとることのできる折りたたみ構
要な水素結合が形成されないためである｡フェニルアラ
ニンの芳香族側鎖は､場合によっては､弱い極性相互作
⇹᳓ᕈ
用に寄与する｡
O
O
H 2N
CH C
OH
H 2N
OH
H 2N
CH CH 3
CH 3
CH C
C
OH
OH
H 2N
CH 2
HN
CH 3
Ala
O
O
O
CH C
Val
Pro
Phe
CH C
O
OH
H 2N
CH C
CH 2
CH CH 2
CH CH 3
CH 2
CH 3
CH 2
Leu
Ile
親水性アミノ酸残基は､相互に､またペプチド骨格､
OH
極性有機分子､水分子と水素結合を形成することができ
る｡この親水性とういう性質がその関与する相互作用を
ⷫ᳓ᕈ
O
H 2N
O
O
CH C
OH
H 2N
CH C
H 2N
OH
CH C
H 2N
CH C
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
C
CH 2
OH
OH
C
Ser
Asp
OH
CH 2
NH
C
NH
NH 2
O
決定づけている｡親水性残基のいくつかは､ pH や微小
O
OH
CH 2
O
OH
環境に応じて電荷状態を変化させ､アスパラギン酸やグ
ルタミン酸は､水溶液中での p Ka 値が５に近いため､
通常ははプロトン化されることなく､ pH7では負に荷電
Glu
Arg
している｡ところが､タンパク質分子の疎水性内部環境
O
H 2N
O
O
CH C
OH
H 2N
CH C
H 2N
OH
CH C
H 2N
CH C
CH OH
CH 2
CH 2
CH 2
CH 3
SH
C
CH 2
Cys
Thr
O
O
OH
O
OH
H 2N
CH C
では両アミノ酸の p Ka 値が７､もしくはそれ以上とな
OH
CH 2
NH 2
C
Asn
NH 2
るので､生理的な pH 条件ではプロトン供与体として機
N
O
NH
Gln
能する｡全く同じ考察がリシンの挙動にも当てはまり､
His
ਔⷫᇦᕈ
リシンは水溶液中での p Ka が10より大きく､そのため
O
H 2N
CH C
H 2N
CH 2
CH C
H 2N
OH
CH C
H 2N
OH
CH C
通常では正に荷電している｡ところが､非極性の環境下､
OH
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
もしくは正に荷電した分子が近在している場合､リシン
CH 2
CH 2
S
CH 2
CH 3
NH 2
O
O
O
OH
OH
Lys
Tyr
NH
Met
の p Ka 値は６以下となり､その結果として生じる中性
Trp
分子種はプロトン受容体となりうる｡ヒスチジンはこの
図１アミノ酸の構造とアミノ酸側鎖の化学的特性
点ではおそらく､すべてのアミノ酸のうち最も多機能な
アミノ酸残基であり､この事実はヒスチジン残基が酵素
の活性中心に最もよく見られる残基である理由を説明す
R
I
CD
N
H
\
N
O
る｡ヒスチジンは２つの滴定可能な NH 基を持ち､ p Ka
C
値はそれぞれ６である｡ところが NH 基の片方がプロ
C
CD
トンを失うと､もう一方の p Ka 値は10をはるかに上回
O
R
るようになる｡両方の NH 基がプロトン化されると､
H
H
ヒスチジンは全体として正に荷電する｡また､タンパク
図２ポリペプチド鎖中の２つのアミノ酸の構造
質の主鎖から遠い方の NH 基がプロトン化されると､
−9−
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
側鎖は荷電することなく､プロトンの供与体にも受容体
修飾を受ける残基が機能に関わる解離基であれば､修飾
にもなりうる｡完全に脱プロトン化されるとヒスチジン
に伴う失活速度の pH 依存性を調べ､みかけの解離定数
側鎖は負に荷電するが､この状態になることはめったに
を求めることができ､その解離基の反応における役割を
ない｡アルギニンは､ pH が中性である場合は常に完
解析することができる｡アミノ酸側鎖官能基に対する特
全にプロトン化されており､正の荷電はグアニジノ基
異性を異にする種々の試薬を用いて修飾を行ったり､同
[-NHC(=NH)NH２]の炭素原子に主として局在している｡
じ官能基の修飾試薬であっても分子構造やイオン的性質
セリン､トレオニン､グルタミン､アスパラギンは中性
などの異なる試薬を用いた反応の解析を行うことで､機
条件下でイオン化していないが､水素結合の供与と受容
能に関与する部位の官能基の配置および機能発現機作な
を同時に行うことができる｡システインはヒスチジンと
どについての知見を得ることができる｡さらに､ 2008年
同じく､酵素活性部位に高頻度で見つかっており､チオ
１月の時点で､ 44,742のタンパク質構造がタンパク質デー
ラート型アニオンは天然アミノ酸に由来する最も強力な
タバンク(Protein Data Bank；PDB)に登録されており､
求核剤である｡
その多くのタンパク質配列エントリーが SwissProt タン
両親媒性残基は､極性と非極性の双方の性質をもち､
パク質配列データベース中にあった｡タンパク質配列の
境界面形成にきわめて適している｡リシンの荷電側鎖を
数は､さらに多数の配列が決定されることが見込まれ､
両親媒性とみなすことは意外のようだが､その長い疎水
明らかになる配列と構造が増えるにつれて､より合理的
性領域はしばしば疎水性側鎖とのファンデルワールス相
な考察が可能となっている｡
互作用に関わっている｡チロシンは生理的な pH 条件で
また､高次構造におけるアミノ酸残基の存在状態の識
は通常はイオン化しないが (p Ka はおよそ９)､ある種
別にも化学修飾が利用される｡同種のアミノ酸側鎖のう
の酵素活性部位においては環境により p Ka 値が低下す
ちどれが分子表面に位置し､どれが分子内部に埋もれて
ることがあるため､酸塩基反応に関与する可能性がある｡
いるかなどを､特定の試薬に対する反応性の差から識別
水酸基 (OH) は水素結合の供与体でも受容体でもあり､
することができる｡また､周囲の環境因子を鋭敏に反映
芳香環は弱い極性作用をもつことがある｡トリプトファ
する蛍光基や特別の吸収帯をもつ原子団を特定の部位に
ンもチロシンと類似した挙動をするが､インドール環の
特異的に導入することにより､これらの情報基のスペク
NH 基はイオン化されない｡メチオニンは極性の最も低
トルからそのおかれている環境をすることができ､さら
い両親媒性アミノ酸であるが､チオエーテルの硫黄原子
にはこれをプローブとしてさまざまな条件下でのタンパ
の多くは金属イオンに対する優れたリガンドである｡
ク質分子の動的状態を推測することができる｡
化学修飾法によりタンパク質の構造と機能との相関､
タンパク質の化学修飾
７−９
アミノ酸残基の存在状態および特定の局所環境について
研究を行う場合には､その修飾ではタンパク質の高次構
タンパク質は､ 20種類の異なるアミノ酸がペプチド結
造がほとんど変化しないとういうことが前提となる｡た
合で連結されたポリマーであり､それぞれ固有のアミノ
とえば構造と機能との相関を調べている場合に､修飾に
酸配列､分子量およびアミノ酸配列で規定される立体構
よる機能 (活性) の消失 (減少) が機能に関与するアミ
造をもち､多くのものは固有の生理機能をもつ｡酵素タ
ノ酸側鎖の修飾に基づくものであると判定を下す前に､
ンパク質であれば､生体触媒としての反応特異性および
タンパク質の立体構造の変化がないことを確かめる必要
基質特異性を示すとともに､エフェクターとの相互作用
がある｡修飾による官能基の構造変化や性質の変化が周
により触媒機能の調整を受けるものも多い｡これらタン
囲の原子団に影響を与えることは否めない｡局所的な構
パク質の機能の本質を知るためには､その分子構造を解
造変化ができるだけ小さいことが望ましいが､少なくと
明し､機能 (触媒能､分子識別能､調節能､抗体との結
も分子全体の立体構造に殆ど影響がないことを確かめる
合能など) の由来する仕組みを解明する必要がある｡タ
必要がある｡
ンパク質分子中で特に触媒機能に関わるアミノ酸残基の
化学修飾法は上に述べた目的以外にも用いられており､
官能基は､その環境により他の同種の残基とは異なった
例えば､塩基性基や酸性基の置換によるイオン的性質の
異常な反応性を賦与されており､化学試薬による特異的
改変や放射標識に利用されている｡また､分子内架橋に
な反応が可能である｡
よるタンパク質分子の安定化や酵素抗体法における異種
タンパク質の化学修飾の主要な目的の１つは､タンパ
生理活性タンパク質間の架橋反応においては､２価性試
ク質の分子機能に関与するアミノ酸残基を同定すること
薬が用いられている｡これらの修飾においては､それほ
である｡特定の残基が化学修飾を受けて機能が消失すれ
どの厳密性は要求されないが､試薬はできるだけ穏和な
ば､その残基は機能に関与することの一応の基準となる｡
条件で修飾を行える反応性基をもち､特異的に架橋反応
− 10 −
Recent advances in protein chemical modification.
できることが必要である｡架橋試薬はサブユニットから
えることによってその求核性を上げることも下げること
形成されたタンパク質 (リボソームやウイルスを含む)
も可能である｡つまりアミノ基の反応 pH をコントロー
の空間配置の解析に用いられている｡
ルすることによって解離か非解離の電子状態にすること
タンパク質の化学修飾試薬は､構造的立場から２つの
が可能であり､反応の pH を p Ka より高くすればアミ
タイプに分類することができる｡１つはこれまでに述べ
ノ基の求核性が高まり､一般により多くの試薬に対して
たアミノ酸側鎖特異性試薬､２つ目はタンパク質の特定
反応する｡したがって､ α-アミノ基の p Ka とε-アミノ
部位に反応する親和性標識試薬である｡前者は特定の官
基の p Ka が､それぞれ約６∼８と８∼10の間にあるこ
能基に高い反応性を示す試薬であるのに対して､後者は､
とを考えると､アミノ基の少ないペプチドホルモンなど
対象とするタンパク質の機能部位と特異的に相互作用し
ではα-アミノ基に対してε-アミノ基よりもより選択的
うる構造をもった物質､すなわち親和性リガンドに修飾
に修飾することも可能であるが､アミノ基の数が多くな
反応に直接関与する反応基を導入したもので､タンパク
るに従ってε-アミノ基の局所環境の多様性が増加し､
質とリガンドが複合体を形成した後に修飾反応が起こる｡
p Ka も広い範囲にわたるために選択的な反応を行うこ
タンパク質分子の特定の部位と試薬分子の配向や反応に
とが困難となる｡また､アミノ基はタンパク質中に数が
関与する官能基間の近接効果を考慮するもので､特定の
多いことから､
残基が修飾される確立が高い｡本稿では､主にアミノ酸
光試薬を用いた蛍光標識の部位をして推奨される残基で
側鎖特異性試薬による修飾反応について述べる｡
ある｡アミノ基を14C や３H で標識したのもは､チロシン
14
C や３H を用いた放射標識､あるいは蛍
残基を125 I や131 I によって標識したものよりは半減期が長
アミノ酸残基の化学修飾法
７−９
く安定な点で有利である｡さらに､残基数が多いことは､
たとえば N 末端のように抗原性などに無関係なものが
タンパク質に存在する官能基と反応する化学試薬は多
いが､それぞれの官能基に選択的に反応する試薬は必ず
多く抗原性をそこなうことなく標識したい場合には有用
であると考えられる｡
しも多くない｡タンパク質の化学修飾は､原則として特
アミノ基の正の電荷をそのままに温存し､なおかつ比
定の官能基に対する選択的な修飾反応が大切であり､修
較的かさの低い修飾を行いたい場合の方法の１つにグア
飾の目的に合った試薬を選び､反応条件を設定して修飾
ニジル化がある｡これは､ O-アルキルイソ尿素を用い
を行う｡そこで､ ①アミノ基､ ②カルボキシル基をはじ
てアミノ基を修飾する方法である｡一般によく用いられ
め③グアニジノ基 (アルギン残基)､ ④イミダゾール基
るのは､ O-メチルイソ尿素である｡この反応の反応性
(ヒスチジン残基)､ ⑤インドール基 (トリプトファン残
は比較的高く､特異性も比較的によい｡しかし､反応の
基)､ ⑥フェノール基 (チロシン残基)､ ⑦チオエーテル
pH が高い (pH10.5) ので制約がある｡また､得られた
(メチオニン残基)､ ⑧水酸基 (セリン残基) および⑨チ
グアニジノ基は､アミノ基より p Ka が２∼３高くなる
オール基 (システイン残基) の修飾法について以下述べ
(Scheme 1)｡
る｡
H2N
①アミノ基：アミノ基はタンパク質分子内の官能基の
P
NH2
NH2
NH2
pH10.5
P
+
OMe
うちでも､生理的条件下で正の電荷を担い､主として表
N
H
+
MeOH
NH2
P: Protein
面に露出している｡正の電荷のためにタンパク質の水溶
Scheme 1 1
Scheme
液中での安定性に寄与しており､また､場合によっては
O-メチルイソ尿素を用いるグアニジル化反応と類似
の反応で､イミドエステル (多くはメチルまたはエチル
エステル) を用いて行うのがアミジン化である｡アミジ
ン化反応は､グアニジル化より穏やかな条件
(pH7∼10) で､しかも速く進むが､ pH 依存性が極めて
強い｡したがって､適当な pH を選ぶことによってアミ
ジン化の反応速度をコントロールし､目的に合った修飾
を行うことが可能である (Scheme 2)｡
酵素やインヒビターなどの活性発現部位として､あるい
はアロステリック部位として重要な役割をもっているこ
とが知られている｡そのため､化学修飾の対象としても
種々の試薬によって古くからよく研究されている｡タン
パク質の機能性解析のために化学修飾としては､電荷を
そのままにする修飾としてグアニジル化､あるいは逆転
させる修飾としてスクシニル化など多様性に富んだ手法
がある｡タンパク質分子内のアミノ基 (-NH２ ) は２種
類あり､１つは N 末端のα-アミノ基であり､もう１つ
は分子内に比較的多いリシンのε-アミノ基である｡そ
れらは反応性の高い求核性であるので､多くの修飾試薬
を用いることができる｡また､アミノ基の電子状態を変
− 11 −
Me
H
P
+
N
H
NH2
Me
pH7-10
P
O
R
R= Me, Et
Scheme 2 2
Scheme
N
H
+
NH2
ROH
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
性から弱塩基性で比較的穏和な条件で進行するので有用
還元アルキル化は､タンパク質のアミノ基にアルデヒ
である｡この試薬は水に難溶で､容易に分解して酢酸と
ドを作用させ､水素化ホウ素ナトリウムによって-NH-
なるので低温で数回に分けて過剰に加え､反応させる｡
CH２-R を生成する反応である10｡反応試薬には脂肪族ア
その際､無水酢酸の過剰量を一度に加えるとタンパク質
ルデヒド､カルボニルを含むケトンなどが使われるが､
の変性が起こることに留意しなければならない
アミノ基の修飾にはホルムアルデヒドが最もよく用いら
(Scheme 5)｡
れている｡生成物は主に N,N-ジメチル誘導体となり､
O
6M HCl 加水分解後､アミノ酸分析計でジメチルリジン
P
NH 2
Me
+
くないのは利点であるが､反応の収率はあまりよくない｡
この反応は pH 依存性が強く､ pH6ではまったく反応が
進行せず､通常 pH8以上で行う必要がある (Scheme 3)｡
pH9
P
NH 2
+
P
2 OHC-R
N
CHR
MeCOO -
+
+
H+
Scheme 5
N-アセチルスクシンイミド(1)､あるいは N-ヒドロキ
シスクシンインミドアセテート(2)13 では､中性付近の
pH で反応性が高く､その分解は緩やかに起こり､リシ
ンに対する選択性も高い｡しかしながら､類似の試薬
N-アセチルイミダゾール(3)はチロシンに対する反応性
が高く､アミノ基の修飾には不向きである (図３)｡
H 2O
+
O
N
H
Me
O
Scheme 5
[H+]
P
N
H
O
導体の p Ka は､もとのアミノ基より0.6∼0.6程度低く
る｡さらに､メチル基そのもののサイズがそれほど大き
P
Me
として定量することができる｡生じたジメチルアミノ誘
なるが､他の方法よりも p Ka の変動が少なく有利であ
pH7
O
O
O
O
(CH 2-R) 1-2
N
Scheme 3
N
O
N
O
O
1
シアナートイオンはタンパク質中の多くの官能基と反
N
Me
Me
Scheme 3
Me
O
2
3
図３スクシンイミドの構造
応するが､とりわけ中性付近でプロトン化していないア
ミノ基と反応して安定な化合物を与える11｡反応にはカ
ルボキシル基を有する緩衝液は用いず､ホウ酸緩衝液が
スクシニル化はアセチル化の１つであるが､多くのタ
よく用いられる｡通常用いられるシアン酸カリウム
ンパク質について､しばしば有用である｡この反応は通
(KNCO) は水に極めて溶けやすく便利である｡その濃
常用いられる無水コハク酸は固体の結晶物で､比較的安
度が0.2M 以上ではチオール､イミダゾール､フェノキ
定で､反応条件は非常に緩和で､操作も簡単である｡ア
シおよびカルボキシル基とも反応するが､それらの多く
ミノ基に対する特異性も高いが､チオール基､イミダゾー
は比較的不安定な化合物を生じるため分離精製の途中に
ル基､水酸基との反応も知られている｡反応は弱塩基性
中性∼弱塩基性で外れてしまう｡露出した遊離アミノ基
で進行し､アミノ基との反応の結果､正の電荷が逆転し
に対する反応速度は､そのアミノ基の p Ka と log k =
て負の電荷が付加する｡すなわち､アミノ基１個につき
−1
−1
7.94 - 0.71 p Ka ( k は２次反応速度定数､ M min ) の
見かけ上２個の正の電荷が減少する｡したがって､修飾
ような関係があることが知られている12｡したがって､
されたタンパク質の等電点は､より酸性に移行する｡修
p Ka で２単位の差は約100倍の差となり､アミノ基のう
飾を受けたタンパク質の溶解度は､アセチル化物よりも
ちでもα-アミノ基の方がε-アミノ基よりもはるかに反
高い｡負の電荷が増加するため陰性電荷同士が反発し､
応性が高く､ pH7以上で100倍の差が見られる｡ pH5前
タンパク質分子全体は見かけ上膨張する｡その結果とし
後ではカルボキシル基と混合酸無水物を生じ､それらが
て､サブユニットが会合してできているタンパク質では
さらに重合物を生成する可能性があるが､ pH7∼8では
サブユニットの解離が生じる14,15 ｡また､膜タンパク質
そのような副反応は起こらない｡このアミノ基の修飾法
などのように疎水性が強く水に難溶なものの場合は､可
は､さらに発展してアミノ末端の分析みの応用されてい
溶化の手段として有用である｡この様な場合､タンパク
る (Scheme 4)｡
質全体のコンフォメーションの変化などを伴ったも
の16, 17とそうでないもの18,19がある｡アミノ基以外でチオー
pH7-8
P
NH 2
+
P
HNCO
N
H
NH 2
ル基が会合に関与しているような場合には､静電的な反
O
発以外に､ S-スクシニル化の解離のために重要になるこ
Scheme44
Scheme
次に､古くから用いられている方法として､アセチル
とが考えられる｡また､タンパク質のアミノ酸配列の決
化がある｡本反応の結果､アミノ基の極性は失われ電荷
定などに際しては､スクシニル化の別の有用性が挙げら
はゼロとなる｡無水酢酸との反応では､反応は pH が中
れる｡すなわち､多くの場合､トリプシンによる限定分
− 12 −
Recent advances in protein chemical modification.
解を行い､トリプシンペプチドを与えるが､このときリ
解度も上がる (Scheme 6)｡
シンのε-アミノ基をブロックすることによってアルギ
O
O
> pH8
ニン残基のところでのみ切断したペプチドを得ることが
P
NH 2
+
O
P
HO
O
できる｡その時､リシンをアセチル化した場合は溶解度
が低くなるが､スクシニル化した場合は溶解度が高く好
+
NH
H+
O
O
> pH5
都合のことが多い｡一般に､スクシニル化したタンパク
+ H+
質は､ pH7以上で可溶である (図４)｡
P
NH 2
+
O
O
Scheme
Scheme
6 6
マレイル化以外にジケテン(4)によってアミノ基のア
2HN
(D)
N
SH
セトアセチルカ化を行い､さらにヒドロキシアミンによっ
OH
OH
NH
NH 2
て脱アセチル行うことが報告されている21｡また､ 2-メ
OH
(H)
トキシ-5-ニトロトロポロン(5)は緩和な条件でアミノ基
O
O
O
にほぼ特異的に反応し､しかもチオール基とは反応せず､
, pH7-10
1∼2M のヒドラジンによって pH8.5∼9で脱ニトロトロ
ポニルが出来る点が有用である22,23(図５)｡
HN
N
O
N
O
O
O
O 2N
H2C
O
NH
CO 2H
O
S
O
O
O
O
O
O
CO 2H
CO 2H
CO 2H
CO 2H
O
4
CO 2H
OMe
5
CO 2H
図５ジケテンと2-メトキシ-5-ニトロトロポロン
NH 2OH or >pH8
アミノ基の脱アミノ化反応は古くから亜硝酸を用いて
HN
N
O
SH
OH
行われていたが､その反応がα-アミノ基に対して比較
OH
的特異性が高いことが見出され､トリプシン24､エラス
N
O
NH
CO 2H
OH
O
ターゼ25､キモトリプシン26､ペプシン27､ネオカルチス
CO 2H
タン28 ､インスリン29 などに応用されている｡さらにカ
図４無水コハク酸によるアミノ基のスクシニル化とそれ
に伴う各種アミノ酸側鎖との副反応
ルボニル化合物との反応は自然界でタンパク質のアミノ
CO 2H
基が最もよく遭遇している反応であり､その実用的な応
用もホルムアルデヒドなどについていえば､タンパク質
アミノ基を反応性と選択性の高いマレイル化試薬によっ
化学以前から知られていたものである｡また､タンパク
て反応させて保護したのち､他の残基を別の試薬で修飾
質にジニトロフェニル (DNF) 基またはトリニトロフェ
し､その後､アミノ基について保護基を可逆的に脱離さ
ニル (TNP) 基を結合させることにより､そのタンパ
せることができる｡例えば､トリプシンの特異的な切断
ク質の抗原性を高めたり､あるいは DNP 基または TNP
部位であるリシン残基とアルギニン残基のうち､リシン
基対する抗体を作ることがあり､これは免疫学的な観点
残基をマレイル基で保護し､得られたε-マレイル化リ
からは有用である｡また､ TNP 化はアミノ基の定量法
シンを含むペプチド結合はトリプシンに対して安定で､
としても重要である｡さらに､ TNP 化に基づくアミノ
基質とならず分解を受けない｡これにトリプシンを作用
基の定量法で､ニンヒドリン法などよりも反応が穏やか
させるとアルギニン部位でのみ切断が起こり､ C 末端に
で､分離操作も加熱も不要な方法としてトリニトロベン
アルギニンを持つマレイル化リシンを含むペプチドを単
ゼンスルホン酸によるアミノ基の定量がある｡
離することができる｡次いで､マレイル保護基を脱離さ
②カルボキシル基：タンパク質中のカルボキシル基に
せたのち､このものをさらにトリプシン消化することで
は､アスパラギン酸残基のβ-カルボキシル基､グルタ
リシンの C 末端で切断する利用法が可能である｡この
ミン酸残基のγ-カルボキシル基､さらに C 末端アミノ
ように可逆的に保護基の脱離とアミノ基の再生が容易で
酸のα-カルボキシル基の３種類がある｡これらのカル
20
あることは､構造活性相関や構造解析に有用である｡
ボキシル基は､タンパク質に陰性電荷を付与し､極性を
スクシニル化と同様､マレイル化によって電荷は逆転す
高めて水溶液への溶解度を大きくするのに寄与している
るので､イオン交換クロマトグラフィーや電気泳動での
一方､基質との結合や触媒作用の発現に関わるなど､タ
分離は容易である｡また､スクシニル化合物と同様､溶
ンパク質の立体構造の保持や機能発現のために重要な官
− 13 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
能基の１つである｡カルボキシル基の修飾法の主要なも
パパインの例では､基質の競合阻害剤であるベンズアミ
としては､アミド化､エステル化､還元アルコール化の
ドアセトニトリル存在下の修飾では活性中心のチオール
３つに分けられる｡いずれの方法も､条件を選べばカル
基と本来修飾されるべき２個のカルボキシル基の修飾は
ボキシル基の完全な修飾を行うことができる｡
保護された結果が得られている｡
まず､アミド化の方法として､タンパク質のカルボキ
酵素の基質特異性で正の電荷を好む性質を有する場合
シル基の修飾は､ 1945年にはじめて Fraenkel-Conrat ら
(例えば､トリプシンなど)､多くはカルボキシル基がそ
によって報告されたが､その方法は乾燥した塩化水素−
の酵素活性に関わっていることが示唆されるが､その活
メタノール中でタンパク質のエステル化を行うものであっ
性に関与するカルボキシル基を選択的に修飾することは
た｡この方法は収量もよく反応性も高く､手近に行える
容易ではない｡そのような中で､イソオキサゾリウムは
という利点はあるが､高濃度のメタノールと塩化水素の
正の電荷を有しており､実際に pH3∼5の範囲で他の残
存在下で行うため､多くの生理活性を有する安定性の低
基を修飾することなくトリプシン活性中心のカルボキシ
いタンパク質にとっては過酷な条件であった｡さらに､
ル基を修飾することができる｡ Woodward 試薬を含む
不溶化するタンパク質が多いことに加えて､非水溶媒に
いくつかのイソオキサゾリウム塩 (６∼９) を用いて検
よる変性と酵素などの不活性化､脱アミド化と部分的エ
討され成功している (図６)｡
ステル化反応 (Asn→Asp-OMe, Gln→Glu-OMe など)､
セリン､スレオニン残基における N→O 転移反応など
O
が起こる可能性があったため､広範な応用には限界があっ
た｡
+ Me
N
BF 4-
6
1966年に Hoare と Koshland らは､カルボジイミド30
BF 4-
7
O 3S
O
O
31
に行うことを検討し､実用的な方法を開発した｡この
方法では､水溶性カルボジイミド (例えば､ 1-エチル-3てカルボキシル基を活性化し､任意のアミン成分 (例え
+ Et
N
-
を用いてカルボキシル基の修飾をより緩和にかつ系統的
ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩) によっ
O
+ Et
N
8
+
N
Me
BF 4-
9
図６カルボキシル基の修飾に用いられるイソオキサゾリ
ウム塩
ば､塩化アンモニウム､グリシンアミド､グリシンメチ
ルエステル､アミノメタンスルホン酸など) と pH4.7前
これらの試薬による修飾速度は経時的に低下すること
後で水溶液中で反応させる｡反応を中止させるには1M
が知られており､その理由としては､試薬の水溶液中で
酢酸などを反応液に加える (Scheme 7)｡
の安定性が悪く､分解するためと考えられている34｡
N
P
CO 2H
R1
O
H+
C
+
HN
+
その他のアミド化の方法として､液体アンモニアを用
+
N
R1
いる方法がある｡これは､あらかじめエステル化したタ
HN
R2
ンパク質を液体アンモニア中で加アンモニア分解するか､
P
O
R2
P
+
HN
あるいは液体アンモニア中で直接エステル化とアミド化
NHR 1
O
H2N-R
H+
を行う方法である｡
O
+
NHR 2
R
次に､エステル化の方法として､ 1945年に FraenkelScheme
Scheme 7 7
Conrat と Olcott らによって開発された塩化水素−メタ
カルボジイミド法は､副反応が少ないと考えられてい
ノール法には､前述したように､脱アミド反応､ペプチ
るが､パパインに修飾を応用した場合､カルボキシル基
ド結合の N→O 転移､非可逆的変性など､いくつかの
以外の残基との予想外の反応が見出されている
32,33
｡こ
問題があるが､生理活性や酵素活性をあまり問題にしな
れは､活性中心にある Cys25のチオール基とカルボジイ
い場合で､完全にメチル化を行いたい場合や､高濃度の
ミドとが付加反応を起こし､非可逆的に不活性化されて
塩化水素とメタノールでも安定なタンパク質であれば､
いた (Scheme 8)｡
最も簡単に行えるカルボキシル基の修飾方法である｡本
N
P
SH
+
R1
P
C
N
R2
N
R1
HN
R2
法の特徴はほとんどすべてのカルボキシル基が定量的に
エステル化されうるということであり､この点では､他
S
の方法よりは信頼性があり､よく用いられている｡しか
Scheme
Scheme 8 8
しながら､コンンフォメーションは当然変化することが
また､ 19個のうち９個のチロシンの水酸基にも､グリ
予想される (Scheme 9)｡
シル化が進行したが､ヒスチジンとは反応しなかった｡
− 14 −
Recent advances in protein chemical modification.
P
の多くは､反応収率が低いか､副反応､あるいは分子内
HOR
COOH
P
(0.1N HCl)
OR
H 2O
+
架橋などの問題がある｡このような問題点を解決するた
O
めに Atrassi と Rosenthal らは､カルボキシル基のジボ
Scheme99
Scheme
ジアゾ酢酸類は､タンパク質のカルボキシル基をエス
ランによる還元的修飾反応をより発展させ､タンパク質
テル化できるが､その中でもジアゾ酢酸メチル､ジアゾ
への応用を試みた41｡カルボキシル基が本法で還元され
アセトアミド､およびアゾアセチルグリシンアミドがよ
るためには､プロトン化していることが必須の条件であ
く知られており､特に後２者が好まれている (Scheme
り､ −10∼０℃で注意深く行えば､ペプチド結合やカル
10)｡これらの試薬を用いるに当たっての注意点は､イ
バミド残基の還元は起こらず､比較的限定されたカルボ
オン化および非イオン化状態のカルボキシル基のみなら
キシル基が反応することができる｡室温より過酷な条件
ず､その他多くの負の電荷をもつ無機イオンとも反応す
では､ヒスチジン､アルギニンおよびプロリンが修飾を
る点である｡たとえば､塩素イオンは反応してクロロア
受け､もちろん､シスチンの S-S 結合は開裂された｡応
セチル化物となる｡しかし､過塩素酸イオンは反応せず､
用例としては､ γ-カルボキシグルタミン酸 (Gla) の同
そのため反応溶液に用いる事ができる｡また､ジアゾ酢
定や､ガストリンアナログおよびウシ IgG における N
酸類は水分子と反応してグリコールを生成するので､カ
末端のピログルタミン酸の同定がある42,43｡
ルボキシル基のエステル化の程度を高めたいときは､高
側鎖に塩基性の強いグアニジノ基 (p Ka>12) をもち､
濃度の試薬を用いる必要がある｡
O
O
P
P
NH-R
OH
O
ca, pH5
N2CH
+
③グアニジノ基 (アルギン残基)：アルギニン残基は
生理的条件では常にプロトン化型で存在している｡この
H
N
O
R
残基は一般にタンパク質分子の表面に存在しており､グ
O
アニジノ基は溶媒の水分子に接しうる状態にあると考え
Scheme
Scheme10
10
ジアゾ酢酸類と同様に､ジアゾメタンもカルボキシル
られている｡そのため､アルギニン残基の修飾は緩和な
基のエステル化に用いられる｡ジアゾメタンの反応性は
条件で行う事ができ､しかも用いられる修飾試薬も無差
一般に緩和であり､収率は低い｡応用例としては､キモ
別にアルギニン残基と反応するほど強力でないので､適
トリプシノーゲンＡ35 ､リボヌクレアーゼ36 ､およびウ
当な条件下では､反応しやすい限られた残基だけを修飾
37
サギ IgG などがあり､試薬を0.4∼0.8mol/l 消費した
することが可能である｡特に､アルギニン残基はヌクレ
場合に上記のタンパク質はそれぞれ pH5.5, 4.5, 5.5
オチドなどリン酸イオンを含む物質と相互作用するタン
において､カルボキシル基は約16％, 25％, 20％のエス
パク質においては､リン酸イオンと結合に関与すると推
テル化が進行した｡
定されており､この残基の限定的な修飾がこれからのタ
トリエチルオキソニウムフルオロボレート[(C２H５)３
O＋BF−４]によるカルボキシル基のエチルエステル化はよ
ンパク質の機能に大きな役割をおよぼす可能性が示唆さ
れる｡
38
く知られているが､この試薬の特徴は､カルボキシル
アルギニン残基の修飾試薬としては､ 2,3-ブタンジオ
基の p Ka 値が低いほど反応性が高いことである｡その
ン(ジアセチル)､ 1,2-シクロヘキサンジオンなどα-ジ
理由としては､オキソニウムイオンが未解離のカルボキ
ケトン類やフェニルグリオキサールなどのα-ケトアル
シル基よりもイオン化したカルボキシル基に対しての方
デヒドが用いられており､弱塩基性条件下でタンパク質
が電気的な親和性が強いためと考えられている｡もちろ
と反応させる｡これらのα-ジカルボニル化合物のグア
ん､局所の立体障害によって左右されることは十分考え
ニジノ基との反応性はそれほど大きくなく､修飾反応に
られるが､特定のカルボキシル基の選択的化学修飾の目
おいて大過剰の試薬を用いてもすべてのアルギニン残基
的のためには有効である｡本法は､ pH2∼7の緩和な条
が反応することはまれである｡
件下で進行するが､ pH は高めの方がよく進行する｡副
アルギニン残基は､フェニルグリオキサール(10)によ
反応としては､非特異的なメチオニンのエチルスルホニ
り pH8∼9において修飾される｡その際､アルギニン残
ウムの生成およびヒスチジンのエチルイミダゾリウム塩
基１個当り２分子の試薬が反応する｡修飾生成物として
の生成が知られている｡応用例としては､トリプシン39
２種類の化合物 (12､ 13) が推定されされるが､ 12の可
40
能性が大きい｡この試薬による修飾では14C 標準試薬が
およびペプシンなどがある｡
これまで記した方法によるカルボキシル基のアミド化
容易に使用でき､修飾生成物も塩基性に長時間さらされ
あるいはエステル化は､いずれも酸や塩基に不安定であ
ないかぎり安定であるので､修飾残基の同定を行いやす
り､親水性が低下して溶解度に変化をきたすことや､エ
い｡しかし､修飾の結果､アルギニン残基に２つのベン
ステル基などがかさばって立体的に障害を起こす可能性
ゼン環が導入されるので､修飾残基近傍の構造が局所的
が考えられる｡また､アミド化あるいはエステル化反応
にかなり影響を受けるのはまぬがれない (Scheme 11)｡
− 15 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
この反応では中間体として N ８−(1,2-ジヒドロキクロ
COCHO
O
O
H 2N
N
H
+
H
H 2N
O
H
N
N
HO
HO
N
ヘキシレン-1,2)アルギニン(15)が生成するが､ホウ酸
N
H
R
イオンが存在するとその cis-グリコール部分がホウ酸付
12
H
N
pH8-9
R
O
O
N
H
加物(16)を生成して安定化すると考えられている｡
COCHO
R
H
10
Patthy と Smith は､この安定化を利用し､ pH8∼9でア
11
HO
ルギニン残基だけを選択的に修飾する方法を確立し
O
N
HO
HO H
N
N
H
た49,50｡
R
次に､ Yankeelov は､アルギニン残基の2,3-ブタンジ
13
Scheme 1111
Scheme
フェニルグリオキサールによる修飾を緩和な条件で行
オンによる修飾には､試薬として単量体より反応性の大
う限りでは､タンパク質中のアルギニン残基だけが反応
きい三量体や二量体が有効であること明らかにし51,52 ､
するが､試薬濃度を大きくするなど条件を過酷にすると
リボヌクレアーゼ A やウシ血漿アルブミンの修飾に用
アミノ末端の脱アミノ反応を起こしやすい｡その結果､
いたが､この方法ではリシン残基への副反応やアルギニ
アミノ末端はα-ケト酸残基に変化する (Scheme 12)｡
ン残基の修飾生成物が単一でないなど満足すべき結果で
R1
R1
O
H
N
H 2N
はなかった｡その後､ Riordan は､ 2,3-ブタンジオンの
O
H
N
単量体(18)を弱塩基性のホウ酸緩衝液中で直接カルボキ
O
O
O
R2
シペプチターゼ A と反応させてアルギニン残基を修飾
R2
Scheme 12
12
Scheme
すると酵素活性が変化することを見出した53｡ホウ素イ
リボヌクレアーゼＡのアミノ末端リシン残基は､ 1.5
％フェニルグリオキサールと pH8.0､ 25℃で反応し､ 60
44
オンは1,2-シクロヘキサンイオンによる修飾と同じく､
試薬とグアニジノ基との反応により生成する4,5-ジヒド
分後には殆ど全部が脱アミノ化される｡同様に､ジス
ロキシ-4,5-ジメチルイミダゾリン誘導体(19)の cis-グリ
ルフィド結合を還元後 S-カルボキシメチル化したイン
コール部分と錯体(20)を生成して19を安定化して修飾反
スリン B 鎖の末端フェニルアラニン残基､ α-キモトリ
応を促進すると考えられている (Scheme 14)｡
プシン C 鎖の末端アラニン残基もこの試薬と反応する
O
Me
が､トリプトファンやα-キモトリプシン中のイオン対
H 2N
+
O
Me
を作っているイソロイシン残基のα-アミノ残基は反応
H 2N
pH7.5-9.5
N
H
Me
OH H
N
R
Me
N
OH
18
H3BO 3
N
H
HO
R
O
Me H
N
B
HO
O
N
N
H
R
Me
19
20
Scheme 14
45
しない｡フェニルグリオキサールは､このほかリシン
Scheme 14
やシステインとも反応するが､普通用いられる条件では
したがって､ジヒドロキシイミダゾリン誘導体(19)が
これらの残基への顕著な修飾はほとんど報告されていな
主生成物である反応段階で修飾を停止するためにホウ素
い｡たとえば､クレアチンキナーゼの１残基のシステイ
イオンを系外に除くと､ホウ素錯体(20)は分解してもと
ンは一般のチオール試薬と反応するが､フェニルグリオ
のアルギニン残基を再生する｡いいかえると､修飾反応
キサールにより修飾はされない46｡しかし､ロダネーゼ
が短時間に行われるときには､アルギニン残基の2,3-ブ
の Cys247は KCN 存在下 pH7.8で小過剰のフェニルグ
タンジオンによる修飾を可逆的に行うことができる｡
④イミダゾール基 (ヒスチジン残基)：ヒスチジン残
リオキサールと反応させるとき､近傍のチオール基とジ
47
スルフィド結合を生成する｡この際､ Cys247と架橋す
基は､タンパク質の機能に直接関与する残基として最も
る残基は Cys263である｡
代表的なものであり､タンパク質の機能に関わる官能基
次に､ 1,2-シクロヘキサンジオン(14)は､強塩基性で
を明らかにしようとするときには､この残基の側鎖のイ
アルギニン残基のグアニジノ基と反応して N - (4-オキソ-
ミダゾール基が化学修飾の対象となることが多い｡イミ
1,3-ジアザスピロ[4,4]ノニリデン-2)オルニチン残基
ダゾール基は中性付近に解離平衡をもち､酸化や還元に
(17) を生成する48(Scheme 13)｡
対して抵抗性を示す安定なヘテロ環である｡ヒスチジン
O
H 2N
R
N
H
+
O
残基の修飾法として､ジエチルピロマルボネートによる
OH H
N
H 2N
N
N
H
R
N
H
R
OH
14
15
B
HO
O
H
N
HO
O
O
N
N
H
16
R
H
N
N
17
N-エトキシホルミル化､光増感酸化､ヨード酢酸によ
る N-アルキル化､ジアゾテトラゾールによる C-ジアゾ
化などが報告されている｡
タンパク質の機能発現にヒスチジン残基が直接関与す
る例として､ Schneider は約80種の酵素やタンパク質を
挙げており54､この事は､酵素の活性部位には中性付近
の解離定数をもつヒスチジン残基が存在する割合が多い
Scheme 13 13
Scheme
− 16 −
Recent advances in protein chemical modification.
ことを示唆している｡ヒスチジン残基のもつこのような
感剤として中性から塩基性においてタンパク質の光酸化
特性は､この残基には他の残基とは異なった修飾法が適
を行うと､ヒスチジン残基が優先的に酸化される場合が
用できることを示しており､タンパク質との特別の親和
多い (図７)｡このような選択性は､ヒスチジン残基の
性をもつ試薬による親和性標識を利用できることを表し
イミダゾール基が分子の表面に露出しているときには､
ている｡しかし､この修飾法においても親和性をどのよ
このアミノ酸がメチオニン､トリプトファン､チロシン
うに利用するかは修飾試薬の構造に左右され､基質とほ
に比べて酸化速度が大きいため生じたと考えられてい
とんど同じ構造をもつ試薬をつかって酵素の活性部位の
る59−61｡
限られた位置の官能基を修飾できるほか､基質の一部と
類似の構造をもつ試薬によりことなった位置の官能基の
Cl
Cl
Cl
Cl
COOR
修飾も可能である｡
ヒスチジン残基の一般的な修飾法として､ジエチルピ
ロカルボネート (DEP,22) によるイミダゾール基の N-
Me
N
O
N
N
I
Cl -
R= Na or K
RO
O
N
O
+
CO 2
+
O
Me
I
24
COOEt
+
NH
S
Me
R
N
I
Me
エトキシホルミル化(23)反応がある (Scheme 15)｡
R
+
N
I
25
図７増感剤の化学構造
EtOH
COOEt
OEt
21
22
23
⑤インドール基 (トリプトファン残基)：各種タンパ
Scheme
15
Scheme 15
この反応では､ DEP がプロトン化していない側鎖の
ク質のアミノ酸組成をみると､トリプトファンの含有率
イミダゾール基(21)と反応するので塩基性で修飾を行う
はメチオニンと同様に最も低い部類に属する｡トリプト
のが有利であるが､試薬や生成する N-エトキシホルミ
ファン残基は､かさばったインドール環に基づく相互作
ル基が塩基性で不安定であるため､通常､反応は室温､
用によりタンパク質の高次構造維持に貢献しているもの
pH6.0∼6.5で行われる｡また DEP は加水分解されやす
と考えられている｡また､基質結合部位にあって､基質
いのでヒスチジン残基量より過剰の試薬が用いられ､多
との結合に重要な役割を果たしているものもあり､パパ
くの場合､イミダゾール基のエトキシホルミル化反応は
イン62の Trp69および177､キモトリプシン63の Trp215､
速く､実際には修飾反応の時間としては､数分∼１時間
リゾチーム64の Trp62､ブタ膵臓ホスホリパーゼ A２65の
で行う｡この様な条件のもとでは DEP はタンパク質中
Trp3などがある｡
の一部のヒスチジン残基を修飾するだけであり､ヒスチ
N-ブロモスクシンイミド (NBS) は２つのカルボニ
ル基の電子吸引性に基づいて､臭素陽イオンを放出し､
酸化反応を行う (Scheme 16)｡
ジン残基全部の修飾には尿素や SDS でタンパク質を変
性させた状態で反応を行う必要がある｡
DEP は修飾試薬としては求核性基と反応するごく一
O
般的なアシル化剤であり､試薬自身がイミダゾール基に
N
特異的な親和性や反応性をもつ試薬ではない｡そのため､
O
N-
Br
O
ヒスチジン残基に優先的に反応させるため､弱酸性で低
+
Br +
O
Scheme16
16
Scheme
濃度の試薬を限られた量だけ用いて､リシン､チロシン､
NBS によるタンパク質の修飾の目的は２つあり､第
システインの各残基への修飾を相対的に抑えるように条
一はトリプトファン含有の定量であり､第二はトリプト
件を設定して､タンパク質と反応させる｡多くの場合､
ファン残基の修飾と活性の相関を調べて､トリプトファ
タンパク質中のイミダゾール基の反応性が低分子のイミ
ン残基のそのタンパク質機能への寄与を調べることであ
ダゾール化合物より高く､ヒスチジン残基の優先的な
る｡トリプトファン残基のタンパク質機能への寄与につ
N-エトキシホルミル化が行われるが､タンパク質によっ
いては､酸化トリプトファン残基数との活性相関が知れ
ては､ヒスチジン以外の残基の部分的な修飾が避けられ
ばよい｡タンパク質1mol 当り1mol のトリプトファンが
ないことがある｡さらに極端な場合では､目的とするヒ
修飾を受けて活性が消失すれば､特定のトリプトファン
スチジン残基がまったく修飾されず､他の残基だけが修
残基の特異的修飾の可能性を示唆する｡
飾されることがある｡ペプシンのα-アミノ基55､ホスホ
56
NBS によるトリプトファンの修飾は､ Patchornik
66,67
リパーゼ A２のε-アミノ基やキモトリプシンの Ser195
ら
の水酸基55などがその例である｡その他､まれにトリプ
と同時に､トリプトファン残基のカルボニル基が関与す
トファン57やアルギニン58も修飾される｡
るペプチド結合の切断に関するものであった｡この化学
また､メチレンブルー(24)やローズベンガル(25)を増
により紹介されたが､トリプトファン含量の滴定
的切断は長鎖ペプチドとしては最初にアミノ酸29個より
− 17 −
薬膳科学研究所研究紀要
なるグルカゴンに対して試みられ､ pH4.0で3.5∼5倍 mol
第３号
Br
+
CH 2
CH 2
CH 2
の過剰量の NBS を使用したとき､開裂率は６∼14％で
あった｡その後かなりの数のタンパク質について開裂が
+
OH
OH
O2 N
O2 N
O2 N
OH
図８カルボニウムイオンの安定化
調べられたが､収率が満足できるものは殆どなく､現在
では開裂を目的とした NBS の反応は殆ど行われていな
い｡ NBS によるタンパク質の修飾反応は､主として酸
この試薬は､したかって水とも反応し､ 2-ヒドロキシ-
性 pH 条件で行われ､オキシトリプトファンが生成され
5-ニトロベンジルアルコールを与える｡トリプトファン
る｡ pH を上げると反応効率が落ちるが68 ､中性近くで
残基との反応では､ HNB-Br がまずインドールの３位を
は少量の NBS による選択的修飾も可能である｡弱塩基
攻撃して中間体インドレニン誘導体(26)を生成し､これ
性溶液で N-アセチル-L-トリプトファンメチルエステル
が種々の転移反応をおこし27∼29のモノ置換体を与え､
を１当量の NBS で酸化すると､好収率でしかも瞬時に
さらにジ置換体(30)も生成する (Scheme 18)｡
69
2,3-ジヒドロピロ[2,3-b]インドール誘導体を与える｡
O 2N
CONH 2
この反応はα-アミノ基の関与するペプチド結合に回転
+
HN
OH
COMe
N
H
の自由度がある時に限られており､短いペプチドに限ら
Br
れた反応である (Scheme 17)｡
COO CO 2Me
N
H
pH9
HN
O
Me
O2 N
H+
NBS
N
H
CO 2Me
N
O
N
H
O
NH 3+
OH
M
Me
CONH 2
Scheme 17 17
Scheme
HN
N
NBS の関連化合物として､濃厚尿素溶液に NBS を作
COMe
26
用させる in situ 合成で得られる N-ブロモ尿素が､トリ
プトファンペプチドのより穏やかでより選択性開裂試薬
O2 N
H2NOC
として報告されている70 ｡ N-ブロモアセトアミド66 は､
COMe
OH
NO 2
NBS に比べると作用力が弱い｡トリブロモクレゾール
や N-クロロベンゾトリアゾール71 も NBS と比べてより
N
H
穏やかな試薬である｡ 2-(2-ニトロフェニルスルフェニ
O
N
H
N
28
27
CONH 2
COMe
O2 N
ル)-3-メチルインドールに NBS を作用させて得られる2-
O 2N
OH
(2-ニトロフェニルスルフェニル)-3-メチル-3-ブロモイン
OH
72
ドレニンは､ NBS より選択的な試薬である｡本試薬を
NHCOMe
N
10倍 mol 量の50％酢酸中で作用させたとき､トリプト
N
H
ファンが完全に消失し､メチオニンがメチオニンスルホ
N
H
O
O2 N
29
N
CONH 2
COMe
OH
キシド､システインがシスチンに酸化されるほか､他の
30
Scheme
Scheme 18 18
アミノ酸に変化は認められなかった｡ 30倍 mol 量で20
HNB-Br は水溶液には溶けないので､水と混ざりうる
時間の反応ではチロシンに14％程度の減少が見られた｡
対照とした NBS では､トリプトファンの他にチロシン､
有機溶媒に溶かしてタンパク質溶液に加える｡溶媒とし
ヒスチジン､メチオニンおよびシステインが完全に消失
ては､アセトン､ジオキサン､ジメトキシエタンなどが
する結果となった｡
用いられており､メタノールでは加溶媒分解が起こるこ
NBS 以外の修飾法としては､ 2-ヒドロキシ-5-ニトロ
とが知られている74 ｡ HNB-Br の関連化合物として､ 2-
ベンジルブロミド､アリールスルフェニルクロリド､ホ
ヒドロキシ-5-ニトロベンジルクロリド (HNB-Cl)､ 2-メ
ルミル化､オゾン酸化がある｡まず､ 2-ヒドロキシ-5-ニ
トキシ-5-ニトロベンジルブロミド､ 2-アセトキシ-5-ニト
トロベンジルブロミド (HNB-Br) は､酸性条件下では､
ロベンジルクロリドおよびジメチル- (2-ヒドロキシ-5-
チオール基を除けばトリプトファンに対して特異的な試
ニトロベンジル)スルホニウムクロリド (MHNBS-Cl)
薬である73｡塩基性 pH ではフェノール性水酸基とも反
などがある｡ HNB-Cl は HNB-Br と同等の性質を示し､
応するようになる｡この試薬の反応性の大きいことは､
2-アセトキシおよび2-メトキシ誘導体は HNB-Br と比べ
次に示す共鳴によるカルボニウムイオンの安定化による
て反応性においては劣り､水に対する溶解性も悪くなる｡
ものと考えられている (図８)｡
MHNBS-Cl はインドール核をアルキル化するとともに
ジメチルスルフィドを遊離し､反応性では HNB-Br と
− 18 −
Recent advances in protein chemical modification.
比べて劣るが､水溶性という利点があり､酸性 pH にお
ンパク質にシステイン残基やメチオニン残基が存在する
いてはかなり安定である｡アミノ酸側鎖特異性は HNB-
と､これらの残基の側鎖の硫黄原子も同時に酸化される
Br と同様であって pH4ではメチオニンやチロシンとは
(Scheme 21)｡
反応しない｡
O
R
R
アリールスルフェニルクロリド類は､酸性条件下で､
+
O3
+
トリプトファンとチオール基とのみ反応する特異性の高
O
CHO
N
H
N
H
Scheme
Scheme 21
21
い試薬である75−77｡アリールスルフェニルクロリドは､
トリプトファンのインドール核の２位と反応し､チオエー
インドール核の酸化反応は殆ど pH の影響を受けず､
テル結合を形成し､アリールスルフェニルトリプトファ
いろいろの pH でタンパク質のオゾン酸化が可能である
ンを与える (Scheme 19)｡
が､トリプトファン残基への選択性を高めるには､酸化
R
に用いるオゾン濃度および反応温度のコントロールが必
R
ClS
要である｡酸化溶媒として､一般に水､種々の緩衝液や
+
N
H
H
N
H
O2 N
NO 2
濃厚ギ酸が用いられるが､遊離のアミノ基はオゾンと反
Scheme
Scheme 19 19
応しやすいのでトリス緩衝液は使用しない方がよい｡水
修飾に用いられるアリールスルフェニルクロリドは､
溶液系の反応では､タンパク質の高次構造を保ったまま
2-ニトロフェニルスルフェニルクロリド (NPS-Cl)､ 4-
修飾できるので､分子表面に存在するトリプトファン残
ニトロフェニルスルフェニルクロリド (pNPS-Cl)､ 2,4-
基の修飾に適している79｡ギ酸系の反応では､タンパク
ジニトロフェニルスルフェニルクロリド (DNPS-Cl) お
質を変性させた状態で反応させるので､分子内部に存在
よび2-ニトロ-4-カルボキシフェニルスルフェニルクロリ
するトリプトファン残基も修飾される｡
ド (NCPS-Cl) などがある (図９)｡
⑥フェノール基 (チロシン残基)：チロシンはフェノー
ル性水酸基をもち､この水酸基のプロトンの解離は pH
NO 2
ClS
ClS
ClS
依存的であり､ p Ka は10.1である｡プロトンが解離すれ
COOH
NO 2
O2 N
pNPS-Cl
ば､共鳴によりベンゼン環の電子密度が高くなるので､
O 2N
DNPS-Cl
NCPS-Cl
求電子試薬と反応しやすくなる (図10)｡
図９アリールスルフェニルクロリド類
O
O
O
R
R
この試薬の欠点は水系にだけでは溶けにくいことであっ
て､酢酸とかギ酸をある割合で使用することが多い｡カ
R
ルボキシル基をもつ NCPS-Cl が比較的溶けやすいので､
図10
フェノール性水酸基の共鳴構造
できるだけ緩和な条件を選ぶときには､この試薬が適し
ている｡しかし､一方では溶媒に有機酸をまったく使用
せず､結晶試薬をそのまま用いることもある｡
チロシンの化学修飾に多用されているテトラニトロメ
タンとヨウ素化反応について述べる｡まず､テトラニト
トリプトファンをギ酸に溶かし､塩化水素ガスを通じ
ロメタン (TNM) は､ Riordan ら80 および Sokolovsky
るとインドールの NH 基がホルミル化を受け､ N-ホル
ら81が pH8という穏和な条件でチロシンおよびタンパク
ミルトリプトファンを生成する｡ N-ホルミル基は弱塩
質に作用させ､チロシン水酸基のオルト位にニトロ化が
基性にすると除去され､インドールを再生する｡これは､
起こり､ 3-ニトロチロシンが生成することを見出して以
トリプトファンの修飾反応のうちでも唯一の可逆的修飾
来チロシン残基の修飾試薬として用いられるようになっ
反応である (Scheme 20)｡
た (Scheme 22)｡ N-アセチルイミダゾール82 よりも
R
TNM はチロシン残基に対してより選択的である｡
R
HCl/HCOOH
O
N
H
OH -
O
N
NO 2
CHO
+
Scheme
Scheme 20 20
まれる殆ど全ての官能基を酸化することができるが､等
キヌレニン残基に変換することができる｡しかし､タ
H+
P
Scheme
Scheme
22
mol のオゾンとの反応条件を選ぶと､トリプトファン残
78
+
P
オゾンは気体状の強い酸化剤であり､タンパク質に含
基の側鎖インドール核を優先的に酸化して N-ホルミル
NO 2
+
22
TNM はチロシンよりチオール基とより速く反応する
ことが知られている83｡チオール基のみとの反応では､
ニトロホルムイオンに基づく吸収より追跡することがで
− 19 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
きる｡反応性は pH5∼9の範囲であまり差がないが､ pH
スチジンがヨウ素化を受け､トリプトファンも酸化反応
5以下では減少する｡チオール基と TNM の反応では､
を受けることがある｡
⑦チオエーテル (メチオニン残基)：タンパク質にお
ジスルフィドやスルフィン酸が生成する｡したがって､
チオール基を含むタンパク質でチロシンの修飾を行う場
いて､メチオニンはその存在率がトリプトファンと同様
合には､チオール基を可逆的に保護する必要がある｡チ
に低いものであるが､その機能には興味がもたれている｡
オール基の保護には四チオン酸カリウム (S４O６２−) で
チオエーテル基は弱い求核性をもつが､タンパク質中の
−
処理して､ S-スルフェニルスルホネート (R-S-SSO３ )
他の求核的グループとは異なり､ pH1∼14の範囲でプロ
とする｡修飾反応後､この保護基はメルカプトエタノー
トン化することが無いので､酸性条件下での選択的修飾
ルあるいはジチオスレイトールなどのチオール試薬で処
が可能である｡
理して除去し､チオール基を再生させる84｡その他のア
メチオニン残基の修飾には､過酸化水素や過ヨウ素酸
ミノ酸残基との反応として､トリプトファン､メチオニ
などの酸化剤および N-クロロスクシンイミド､ N-ブロ
ン､ヒスチジンに大過剰の TNM を使用した場合､ pH7
モスクシンイミド､クロラミン T､トリクロロメタン
以上でニトロホルムイオンの生成を認め､反応が起こる
スルホニルクロリド (CCl３SO２Cl) などの活性ハロゲン
81
ことが報告されている｡しかし､アミノ酸混合物に
をもつ酸化剤によるメチオニンスルホキシドへの酸化､
TNM を作用させて変化があったのはチロシンとシステ
ならびにハロゲン化アルキルによるメチオニンアルキル
インのみであり､反応性には大きな差がある｡
スルホニウム塩への変換がある｡メチレンブルーを光増
ヨウ素化試薬よるチロシン残基の修飾はかなり古くか
感剤とする光酸化反応でも酸性 pH でほぼ選択的にメチ
ら行われている｡ヨウ素化試薬としては､三ヨウ化物イ
オニンスルホキシドへ酸化を受けるが86 ､ pH によって
−
オン(I３ )､一塩化ヨウ素､ヨウ化カリウム＋クロラミ
はヒスチジンやトリプトファンにも反応を受けるので､
ン T などがある｡いずれの試薬でも､ヨウ素化の活性
光増感酸化反応はそれぞれのタンパク質について反応残
種は次亜ヨウ素酸 (HOI) と考えられている｡また､ペ
基の検討が必要である (Scheme 24)｡
ルオキシダーゼを触媒としてヨウ素化する方法も行われ
S
Me
P
る｡チロシンにヨウ素化試薬を作用させると２段階の反
+
I-
CH 2CO 2H
S+
ICH 2CO 2H
Me
P
O
H 2O
M
Me
(Scheme 23)｡
O
+
S
P
応で3-ヨードチロシンと3,5-ジヨードチロシンを与える
O
I
+
O
H 2O 2
おり､不溶化ラクトペルオキシダーゼを用いる場合もあ
I3-
I
Scheme Scheme
24
24
I
+
チオールを含まないタンパク質では､過酸化水素はほ
P
P
P
ぼ特異的にメチオニンを酸化し､メチオニンスルホキシ
Scheme 23 23
Scheme
ドとする｡チオール基は過酸化水素によりスルフィン酸
131
ヨウ素化反応には I および I の放射性ヨウ素を使用
やジスルフィドに酸化される｡チオールの酸化は低い
することができる便利さあり､標識残基を含むペプチド
pH では反応速度が減少するが､メチオニンの酸化は
125
I および I
pH が低くなるほど反応性が増大する傾向がある87 ｡一
は個別に定量することができるので､タンパク質を相当
般に､他の残基の反応性は pH を低くすると小さくなる
の分離と反応の課程の比較できる｡また､
125
131
125
するリガンドを含む系では I 試薬で､リガンドを含ま
ので､過酸化水素によるメチオニンの酸化は低 pH 条件
ない系では131I 試薬でヨウ素化を行い､２つのタンパク
下で行われるのが普通である｡
質を一緒にして､タンパク質分解酵素で消化し､ペプチド
次に､ Shechter ら88は､ N-クロロスクシンイミド (N
を分離する｡リガンドが結合する部位にヨウ素化された
CS)､ N-ブロモスクシンイミド (NBS) クロラミン T
125
チロシンがあると､その残基を含むペプチドでは､ I
など活性ハロゲン試薬によるアミノ酸混合物の酸化反応
／131I の比が他の修飾ペプチドに比べて小さくなる｡こ
を検討した (図11)｡
の方法がカルボキシペプチダーゼ A にβ-フェニルプロ
ピオン酸 (拮抗阻害剤) を用いて適用され､ Trp248が
85
活性部位に存在することが示された｡また､ヨウ素化
試薬はチオール基を容易に酸化する｡チロシンの選択的
修飾を問題とするときは､先に述べたように､チオール
基の可逆的な保護が必要である｡他のアミノ酸では､ヒ
− 20 −
O
N
O
Cl
N
O
O
NCS
NBS
図11
Br
Me
SO 2NHCl
䉪䊨䊤䊚䊮T
活性化ハロゲン試薬の構造
Recent advances in protein chemical modification.
pH2.2および8.5において NBS 量を増加しつつ酸化生
ゼ､血液凝固系のプロテアーゼ類からパン酵母のカルボ
成物を調べた結果､いずれの pH においても､メチオニ
キシペプチダーゼ Y､細菌起源のスプチリシン類まで
ンが最も酸化を受けやすく､ついてトリプトファン､シ
かなりの数のものが知られている｡これらは､ジイソプ
ステイン､チロシン､ヒスチジンの順序で変化を受ける｡
ロピルフルオリン酸 (DFP) で活性セリン残基がアル
酸性 pH の方が､ pH8.5よりも酸化反応が起こりやすい｡
キルリン酸化を受けて失活するという共通の性質をもっ
NCS は pH2.2および7.5で､メチオニンおよびトリプト
ている｡活性部位のセリン残基は大きな求核性水酸基を
ファンのみを酸化する｡クロラミン T は､ NCS と同様
もつ活性セリンであって､他のセリン残基に比べて反応
に pH2.2ではメチオニンとトリプトファンの両方を酸化
性が異常に高いことで区別することができる｡この活性
するが､ pH8.5ではメチオニンのみを酸化し､トリプト
セリンを含むプロテアーゼ (セリンプロテアーゼ) につ
ファンには影響を与えない｡また､反応性の序列は NB
いては､ DFP からシアン酸に至るまでさまざまな求電
C>NCS>クロラミン T である｡
子試薬もよる修飾が行われている90｡このような特殊な
また､メチオニンのチオエーテル基はヨード酢酸やヨー
セリンを除けば､他のセリン (およびスレオニン) 残基
ドアセトアミドのようなアルキル化試薬と反応してアル
については､緩和な条件下での選択的反応はないに等し
キルスルホニウム塩を形成する｡ pH4以下の酸性領域の
い｡幾分過酷な条件下のアセチル化反応がある91｡これ
アルキル化反応は､メチオニンとシステインに限られ､
は､アミノ酸混合物をトリフルオロ酢酸に溶かして塩化
pH が高くなるとヒスチジンたアミノ基が反応するよう
アセチルを作用させると､セリン､スレオニンおよびチ
になる｡
ロシンは O-アセチル化を受け､システインは S-アセチ
ところで､メチオニン残基に特異的なブロモシアン
ル化を受け､トリプトファンは分解する｡しかし､トリ
(BrCN) による化学的開裂は､タンパク質の断片化の
プトファンをギ酸中塩化水素で処理して得られる N-ホ
最初のステップとして多用され､１次構造を研究する上
ルミルトリプトファンはこの条件で安定である｡チロシ
で欠くことのできない手法になっている89 ｡ BrCN によ
ンの O-アセチル基はヒドロキシルアミンにより pH6.5
りメチオニン残基で開裂したペプチド断片を再結合させ
で除去できるが､セリンおよびスレオニンの O-アセチ
る再構成も行われている｡ BrCN でメチオニン結合を切
ル基は pH10以上ではじめて除去することができる｡
断した場合にはメチオニン残基はホモセリンラクトンと
セリン酵素の活性セリンは特異的な修飾が行えるので､
なり､このホモセリンラクトンが他方のペプチドのα-
これを利用した２次的修飾反応も可能である (Scheme
アミノ基による求核攻撃を受けて再びペプチド結合を形
26)｡
成すれば､メチオニン残基がホモセリンに置換される
HN
(Scheme 25)｡このような共有結合の再生がなくても､
CH 3COSH
CH 2SO 2F
HN
断片間の非共有結合による相補的な結合により､非修飾
O
タンパク質と同じ空間構造をとり､活性の再生あるいは
O
SH
HN
OH
O
O
SO 2 CH 2
増大が生じる場合がある｡
OH -
HN
CH 2
Me
OH
S
BrCN
H
N
N
H
O
R
O
N
H
+
O
O
H2N-R'
Scheme 26
26
Scheme
H
N
N
H
R'
R
セリンプロテアーゼの活性セリン残基のデヒドロアラ
O
ニンやシステインへの変換がある｡デヒドロアラニン酵
Scheme 25
Scheme
25
BrCN による開裂反応は､タンパク質の断片化のみに
素の調整には､フェニルメタンスルホニル酵素をアルカ
注目するれば､ペプチド結合の切断を伴わない化学修飾
リで処理するが､微妙な条件の設定が必要である｡チオー
法にはそぐわない｡しかし､ C 末端ホモセリンラクトン
ル酵素の調整では､フェニルメタンスルホニル酵素をチ
において､ペプチド結合の生成が起これば､メチオニン
オ酢酸やチオ安息香酸で処理する｡
残基のホモセリン残基への変換という１つの修飾反応と
⑨チオール基 (システイン残基)：システインのチオー
考えられる｡共有結合形成の有無にかかわらず､ BrCN
ル基 (-SH) とシスチンのジスルフィド基 (-S-S-) は､
断片間の再結合により活性が再現すれば､各断片に種々
多くの酵素､ホルモン､その他の生物学的に活性なタン
の修飾を施すことにより構造と機能の関係を調べる事が
パク質の特異的な機能に密接なかかわりをもち､したがっ
できる｡
て多くの生理的過程とも関係がある｡チオール基は非常
⑧水酸基 (セリン残基)：活性部位にセリン残基をも
に高い反応性を示し､アルキル化､アシル化､酸化､チ
つタンパク質分解酵素には､膵臓からのキモトリプシン､
オール−ジスルフィド交換反応､フェニルハライドとの
トリプシン､エラスターゼ､十二指腸のエンテロキナー
反応､メルカプチドの形成､ヘミメルカプタールの形成､
− 21 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
電荷移動型複合体の形成など多種多様の化学反応を起こ
が最もチオール基に対して特異的であり､そのアミドは
す｡一方､チオール基に比べてジスルフィド結合の反応
酸に比べて40倍遅く反応するが､特異性は２倍になる93｡
性は低い｡種々の試薬の影響が小さいこと､その安定性
タンパク質中の多数の親核性基は､モノハロ酢酸によっ
から､ジスルフィド結合がタンパク質の高次構造の維持
てアルキル化され､カルボキシメチル化される｡カルボ
を担っていることが示唆される｡
キシメチル化されたタンパク質は通常安定な誘導体であ
低分子チオール化合物の SH 基の場合とは異なり､タ
り､修飾タンパク質を研究する場合好都合である｡また､
ンパク質中の SH 基の p Ka は多くの因子の影響で変化
チオールは分極したり､あるいは容易に分極可能な二重
する｡その一つは､タンパク質中でのチオール基の空間
結合をもつアクリロニトリル､アクリルアミド､アクリ
的配置である｡覆われた (masked) あるいは埋没して
ル酸エチル､アクロレイン､無水マレイン酸､ N-エチ
いる (buried) チオール基は､タンパク質分子の中の疎
ルマレイミド､ビニルスルフォンなどの化合物に付加す
水的環境にあって溶媒に接触できないために､一般に分
る｡これらの反応は不可逆で通常塩基性 pH で急速にお
子表面にある (exposed) チオール基よりも高い p Ka 値
こることから､メルカプチドイオンが反応種である｡
を示す｡また､タンパク質中のチオール基の電離に影響
その他のアルキル化反応として､キノン環の二重結合
を与えるもう一つの重要な因子は､近傍に存在する荷電
に付加してヒドロキシキノンあるいはキノンのチオエー
基による静電効果である｡チオール基のすぐ近くに荷電
テル誘導体を生成し､またキノンはチオールを酸化して
したアミノ酸残基が存在すると､チオール基の p Ka は
ジスルフィドにする｡エチレンオキシドによるチオール
∼8.35へ低下し､荷電したアミノ酸残基が近傍にないと
化合物の S-ヒドロキシエチル化は､メルカプトイオン
きは､ p Ka は∼9.5となり､また近くに負に荷電したア
の求核置換を律速段階として起こり､一般にチオール基
ミノ酸残基があるときにはタンパク質チオール基の
の p Ka が高ければ高いほど､相当するメルカプチドイ
p Ka は10.3へ上昇する｡さらにチオール基は水酸基と異
オンの反応性が大きくなる｡ O-メチルイソ尿素は通常
なり､水素結合形成能に乏しい｡それは､硫黄に電気陰
タンパク質のアミノ基のグアニジル化に使用されるが､
性度が酸素に比べて小さく､炭素と同等であることから
同時に S-メチル化も起こる｡ 1-フルオロ-2,4-ジニトロベ
説明することができる｡したがって､水素結合の形成に
ンゼン (FDNB) ､ 1- クロロ -2,4- ジニトロベンゼン
よってシステイン残基のチオール基がタンパク質の分子
(CDNB) および2,4,6-トリニトロベンゼン-1-スルフォン
構造の安定化に寄与しているとは考えにくく､ -S-は-CH
酸 (TNBS) はチオール基をアリル化する｡これら３種
2-とほぼ等しい疎水性を示すことから非解離状態ではシ
類の試薬はもともとタンパク質のアミノ基の標識に用い
ステインの側鎖はむしろ疎水結合に関与する可能性が高
られてきたが､通常､チオール基の方がアミノ基よりも
いと考えられている｡
速く反応する｡ 3-マレイミド安息香酸 N-スクシンイミ
チオール基の化学修飾法として､ハロゲン化アルキル
ジル (NBS)､エチルクロロアセタミド､ 4-クロロ-3,5-ジ
によるアルキル化がある (Scheme 27)｡ハロゲン化ア
ニトロフェナシルブロミドなどは､二官能性試薬として
ルキル化剤としては､モノヨード酢酸およびそのアミド､
使用されている (図12)｡これらは､タンパク質側鎖中､
モノブロモ酢酸およびそのアミド､ α-ヨードプロピオ
チオール基､アミノ基､イミダゾール基間に架橋する｡
ン酸､ β-ブロモエチルアミン､モノクロロ酢酸､クロ
ロアセトフェノンなどが上げられる｡
O
O
O
P
-
S
+
-G +G
I - CH 2COO
-
P
S-CH2COO
+
N
-
N
I
O
O
Scheme
27
Scheme 27
O
図12 二官能性試薬 NBS の構造
タンパク質チオール基とモノハロ酢酸の反応に関して
は､反応試薬のもつカルボキシルアニオン(XCH２COO−；
チオール基は､ケテン､塩化アセチル､無水酢酸､無
X=I, Br, Cl) とタンパク質あるいは補欠分子族が有す
水コハク酸､エチルトリフルオロ酢酸などのアシル化剤
る荷電したアミノ酸側鎖との静電相互作用が重要な因子
と容易に反応する (Scheme 28)｡
92
として存在している｡モノハロゲン化酸およびその酸
P
アミド誘導体はチオール基と反応するだけでなく､メチ
SH
+
(CH3CO) 2O
P
Scheme
Scheme
28
オニンのチオエーテル基と反応してスルホニウム塩を作
S-COCH 3
+
CH3COOH
28
る｡また､イミダゾール基､アミノ基､フェノール基な
しかしこの反応はアルキル化反応とは異なり､チオー
どとも反応することが報告されている｡種々あるハロ酸
ル基に特異的ではなく､アミノ基も容易にアシル化され
の中でα-ヨードプロピオン酸およびそのアミド化合物
る｡
− 22 −
Recent advances in protein chemical modification.
CoA､ 4-ホスホパンテテイン､リポ酸､グルタチオン
などの低分子チオールおよびグリセルアルデヒド-3-リ
ニルと反応し､ジスルフィド結合を生成する (Scheme
29)｡
ン酸デヒドロゲナーゼ､フィシン､パパイン､チオラー
P
ゼなどの酵素に存在する高分子チオール基は､容易にチ
SH
+
P
Cl-S-R
S-S-R
+
HCl
Scheme
Scheme 2929
オエステルを形成してアシル基を転移することができ
る94｡このことは､多くの酵素反応において､アシル化
Fontana らは､この化合物の2-ニトロ､ 4-ニトロ､ 2,4-
酵素の中間段階を経て反応が進行することを証明してお
ジニトロフェニル誘導体を合成し､酢酸中でタンパク質
り､生物学的に非常に重要である｡
と反応させ､システインとトリプトファン残基が選択的
低分子チオールやタンパク質チオール基は､ヨウ素､
に反応することを見出した｡ニトロフェニルハロゲン化
フェリシアニド[Fe(CN)６３− ]､四チオン酸ナトリウム
スルフェニルとシステインの反応生成物は酸性で安定で
(Na２S４O６)､ o-ヨードソ安息香酸､過酸化水素によって
あるが､塩基性で壊れてニトロチオフェノールを放出す
緩和な酸化を受け､分子間あるいは分子内ジスルフィド
る｡また､ β-メルカプトエタノール､チオグリコール
を形成する｡しかし､これらの試薬は､チオール基だけ
酸､水素化ホウ素ナトリウムで還元できる｡また､アゾ
でなく､チロシン､トリプトファン､メチオニンなどの
ベンゼン-2-スルフェニルブロマイドは､先の試薬に比
官能基とも容易に反応する｡ヨウ素処理では､チロシン
べ､水に易溶で､しかもトリプトファン残基と反応せず､
のベンゼン環､ヒスチジンのイミダゾール環のヨウ素化
反応を pH5.0で行うことができる (Scheme 30)｡
が起こる場合もある｡チオール基の酸化速度とその性質
-
Br
P
S
は､使用する酸化剤とチオール基の酸化還元電位､ pH､
P
SH
+
S
S
N
N
+
N
N
温度､試薬濃度さらにタンパク質分子構造中の空間配置
に依存する｡タンパク質中でチオール基どうしの接触が
HBr
Scheme 30
Scheme
30
妨げられる場合や､ただ１個しかチオール基を含まない
タンパク質の三次構造の安定化は､弱い非共有結合性
場合には､分子内ジスルフィド結合は形成されない｡し
相互作用 (ファンデルワールス相互作用､水素結合など)
かし､特定の条件下では分子間ジスルフィド結合を形成
を巧みに利用しておこなわれている｡しかし､非共有結
して､その結果タンパク質は凝集する｡また､チオール
合性の力はタンパク質の三次構造を安定化する主要な相
基は酸化剤の添加によって酸化を受けるのはもちろん､
互作用であるが､これは数ある相互作用の１つにすぎな
空気中の酸素によって自発的に酸化される｡この分子状
い｡多くのタンパク質はさらに共有結合性の相互作用で
酸素によるチオール基の酸化速度は､微量の金属イオン
安定化され､天然状態にある二次構造セグメント間でジ
(特に､鉄と銅) の存在で非常に加速される｡したがっ
スルフィド架橋結合が形成されている｡ジスルフィド結
て､これら金属イオンと複合体を形成するキレート剤を
合に対して変性剤を共存していない条件下､還元による
添加したり､ β-メルカプトエタノールやジチオトレイ
部分的選択的開裂では､その生物活性がほとんど変わら
トール (DTT) などの添加によって､遊離のチオール
ないか､部分的に無くなっている｡これらの修飾タンパ
基が活性の発現に必要な酵素タンパク質のチオール基の
ク質の安定性は､部分的に還元したタンパク質分子は､
保持､安定化できる｡
たとえばタンパク質分解酵素による消化や熱による変性
チオール基の酸化剤中､最も特異的なのはチオール−
に対して､未修飾のタンパク質に比較して抵抗性を減じ
ジスルフィド交換反応である｡このチオール−ジスルフィ
ている｡また､修飾したタンパク質において､新たに出
ド交換反応は､多くの生化学的過程に重要な役割を果た
現したチオール基を種々の試薬で修飾することによって
しており､タンパク質の再生､またジスルフィド結合を
も､タンパク質に構造と機能に関する多くの情報が得ら
含むタンパク質の生合成の際に､さらにある種のタンパ
れている｡
ク質の凝固および重合に大きく寄与している｡タンパク
ジスルフィド結合のチオールによる還元的開裂には､
質の修飾試薬としてのジスルフィド結合は､その反応の
過剰のチオールの存在が必要である｡ β-メルカプトエ
可逆性に注目してチオール基の保護に用いられている｡
タノール､ β-メルカプトエチルアミン､ DTT あるいは
例えば､ヘモグロビンのアミノ基をシアネートで修飾す
ジチオエリストールなどがタンパク質のジスルフィド結
るときに､反応性チオール基をシステアミンで保護し95､
合の還元剤として用いられている (Scheme 31)｡
アスパラギン酸トランスカルバミラーゼをジチオニトロ
OH
OH
S
安息香酸 (DTNB) と反応させた後に､求核置換反応で
96
S-シアノあるいは S-スルホ誘導体を与える｡
次に､チオール基は酸性溶媒中でハロゲン化スルフェ
− 23 −
P
+
S
SH
S
SH
HS
S
OH
OH
P
SH
Scheme 31
Scheme
31
HO
SH
P
S
+
SH
S
HO
薬膳科学研究所研究紀要
タンパク質中のジスルフィド結合に反応性は､一般に
第３号
を組み合わせたプロテオーム解析を紹介する｡
鎖間のジスルフィド結合の方が鎖内ジスルフィド結合よ
プロテオーム解析は､ゲノムプロジェクトで見出され
りも還元されやすい｡通常タンパク質中の全ジスルフィ
た遺伝子とタンパク質を対応させたり､それらのタンパ
ド結合を切断するためには､尿素､塩酸グアニジン､
ク質の機能を明らかにするために､タンパク質の分離精
SDS のような変性剤の共存を必要とする｡
製､アミノ酸配列や立体構造の分析､翻訳後修飾の解析､
その他のジスルフィド結合開裂反応としては､亜硫酸
97
タンパク質の生理活性の測定などを行う効率的かつ効果
塩あるいは青酸塩を用いた反応､銀イオンおよび水銀
的な手法である｡一般にプロテオーム解析には､二次元
イオンによる､アルカリ pH でジスルフィド結合の加水
電気泳動などのタンパク質の分離精製法と MS による
98
分解反応､水素化ホウ素ナトリウム (NaBH４) による
99
100
還元的開裂反応､モノチオリン酸との反応､第三級
高感度アミノ酸配列分析法を組み合わせた超微量タンパ
ク質構造解析法が用いられている｡
ホスフィン類による還元101､電解還元102､酸化による方
タンパク質の機能は､様々であるが､機能しているタ
ンパク質はほとんどの場合､何らかの物質と相互作用し
法などがある｡
ている｡そこで､タンパク質が他のタンパク質あるいは
化学修飾法を利用したプロテオーム解析
103−105
リガンドと相互作用している際の相互作用部位の構造解
析､さらに､タンパク質の発現量､発現時期､組織特異
ヒト全ゲノム配列が明らかになった今日､タンパク質
性､細胞内での局在性に関する解析を行うために､タン
を理解することの重要性はこれまでになく高まっている｡
パク質側鎖の官能基への化学修飾を用いたプロテオーム
ヒトには数万種類のタンパク質が存在しており､フォー
解析の手法が見出された｡
アミノ酸残基の存在環境の違いを､側鎖官能基の反応
ルディングして特異的な立体構造を形成し､酵素反応､
免疫反応､エネルギー変換､物質輸送､細胞運動など多
の特異性を利用して質量差に変換する方法が化学修飾で
彩な生命機能を担っている｡タンパク質は相互作用して
ある｡タンパク質が変性しない条件において化学修飾す
複合体､超分子､さらには複雑なネットワークを形成し
ると､分子表面に存在する官能基は修飾され質量が増加
て､個々のタンパク質では考えられない特異性や高機能
するのに対し､相互作用に関与する部位に存在する部位
性を発揮する｡タンパク質を理解するためには､構造と
に存在する官能基は修飾されず質量変化が起こらない｡
機能を知ることが必要であり､今日のタンパク質研究も
したがって､この手法はタンパク質−タンパク質相互作
これらの総合的理解を目標として展開している｡ X 線
用､タンパク質−リガンド相互作用部位の解析に利用で
結晶解析や多次元核磁気共鳴法をはじめとするさまざま
きる他､タンパク質の表面に存在する残基と分子内部に
な手法によってタンパク質の構造が解明され､タンパク
埋もれている残基との区別にも利用できる｡一般的なタ
質研究の大きな原動力となってきた｡しかし､タンパク
ンパク質中のアミン酸残基への化学修飾反応は､前項に
質の構造は PDB から得られるような美しい立体構造の
まとめたとおりである｡親水性のアミノ酸残基の中でも
グラフィックスからイメージされるような静的なもので
アミノ基､カルボキシル基､チオール基は､種々の特異
はない｡
的な修飾反応が報告されており､修飾による活性の変化
また､タンパク質は､さまざまな高分子および低分子
と相互作用することによって､それぞれ独自の機能を発
を指標として､活性と修飾箇所の関係について解析が数
多くなされている｡
修飾反応後の解析は､まず化学修飾の反応後､得られ
揮している｡あるタンパク質がどの分子を認識するか､
あるいはそのタンパク質のどの部分に結合しているかを
た修飾タンパク質について､どれだけの質量変化があっ
解析することは､そのタンパク質の機能を研究するうえ
たのか､ MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/
で重要な知見となる｡そのため､タンパク質−タンパク
Ionization)
-TOF
(Time-Of-Flight)
MS106 ､
ESI
107
質相互作用､タンパク質−リガンド相互作用の解析は､
(Electrospray ionization) MS を測定することにより､
タンパク質の機能を明らかにするうえで重要である｡近
反応の進行を確認する｡タンパク質相互作用部位を解析
年､タンパク質の相互作用を解析する方法として､表面
する際､単独で行った場合と複合体を形成させて行った
プラズモン共鳴法､超遠心分析法､マイクロカロリメト
場合とで､修飾反応後のタンパク質の質量差が見られな
リー法などマクロな分析法や原子レベルでの解析が可能
かった場合には､反応させる試薬を条件を検討し直す必
な X 線結晶解析､多次元核磁気共鳴法 (NMR) および
要がある｡反応条件が適切と判断された場合は､修飾タ
質量分析法 (MS) などミクロな分析法など多くの優れ
ンパク質を酵素消化してペプチド混合物とし､液体クロ
た方法論が開発されている｡ここでは､高感度でかつ迅
マトグラフィー(LC)／ESIMS や MALDI-TOFMS によ
速な相互作用解析として有用な有機化学的方法と MS
りペプチド断片の質量を測定する｡詳しく解析すること
− 24 −
Recent advances in protein chemical modification.
により､複合体形成時には修飾されず､単独で試薬と反
P
H2N
COOH
P
応させた場合に修飾された残基が､相互作用にかかわっ
ている部位と特定できる108｡化学修飾反応においてタン
N
C
N
パク質の高次構造が保持されていなくてはならないため､
円二色性 (CD) スペクトルを測定することにより､修
飾反応において二次構造が保持されていることを確認す
O
P
H2N
N
P
O
ることができる｡
NH
化学修飾法によるタンパク質解析として､ミトコンド
リアタンパク質の糖化､酸化的ストレスと老化109､タン
O
パク質アセチル化のモニタリング110､タンパク質翻訳後
N
H
修正111,112､翻訳後修飾解析へのアプローチ113､フェニル
O
P
チオカルバモイルペプチドを用いた反応モニタリングタ
N
H
P
ンデム質量分析114､大腸菌での Ada 依存アルキル化損
115
116
N
H
Scheme 32
Scheme
32
害､アルコール性脂肪肝のプロテオーム分析､神経
対しての選択的な修飾試薬を用い反応させた後､もう一
科学への適応117､翻訳後修飾のための化学的プロテオミ
端をアジドのように光アフィニティーラベル化試薬にし
118
クス､二次元電気泳動と質量分析との化学的タグアプ
て非特異的な修飾反応を行うことも可能である｡これに
ローチ119､タンパク質糖鎖形成の研究120､ NO２基によっ
より､第一段階の反応で修飾されたアミノ基近傍に存在
て引き起こされた修正を伴う血小板タンパク質のプロテ
するアミノ酸残基を非特異的な反応で架橋することがで
オーム解析121などが報告されている｡
きる (Scheme 33)｡
次に､タンパク質の複合体の相対的な位置関係を知る
O
O
N O 3S
NaO
SO 3Na
N
N O
ための１つに分子間架橋試薬を用いて化学修飾を行い､
O
MS を利用したペプチドマッピングの手法によりその架
O N
O
6
O
O
(pH 7-9)
P1
橋部位を決定する方法がある｡この方法では､緩和な条
O
H
N
N
H
O
P1
P2
NH 2
11.4 Έ
件下で架橋試薬と反応させることにより､共有結合を介
+
して２つの官能基を固定する｡そして､架橋されたタン
P2
NH 2
NH 2+
+
H 2N
パク質を酵素消化してペプチド混合物とし､それぞれの
(CH 2)n
+
NH 2+
H 2N
ペプチドの質量を求めることで架橋部位を決定すること
P1
NH
HN
P2
(CH 2)n
MeO
ができる｡架橋方法は､大きく２つに分けられ､１つは､
OMe
(pH 9, n=2,4,6)
ジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC) のような縮
8.6 Έ(n=4)
11.0 Έ(n=6)
Scheme 3333
Scheme
合剤を用いて近接する官能基同士を直接結合する方法で
架橋試薬の中には､化学的に切断可能なスペーサーを
ある｡これは､タンパク質−タンパク質の複合体の場合
もつものもある｡これは､２つのアミノ酸の架橋試薬で
にも用いられるが､主に１つのタンパク質において分子
分子内にジスルフィド結合をもつ水溶性試薬3,3'-ジチオ
内架橋を形成させ､近接した官能基の位置を特定する場
ビス(スルホスクシンイミジルスルホナート) (DTSSP)
合に用いられている｡２つのチオール基間にジスルフィ
の反応がある122｡ DTSSP では12.0Åのスペーサーを挟ん
ド結合を形成させたり､アミノ基残基とカルボキシル基
で２つのアミノ酸を架橋することができる｡架橋反応後､
残基との間にペプチド結合を形成させたりするのに用い
キモトリプシンを不活性化した TPCK 処理トリプシン
られている｡ (Scheme 32)｡近接して存在する２つの
消化を行い､ペプチド混合物とした後､還元剤により切
官能基を直接結合するので､本来の官能基の位置よりも
断する｡架橋後のトリプシン消化で得られたペプチド混
さらに近づくことに注意が必要である｡
合物と消化後に還元して得られたペプチド混合物の MS
もう１つは､スペーサーを入れて分子間架橋する方法
スペクトルを比較することにより､架橋試薬により修飾
である｡これは､２価の架橋試薬を用いて､一定の長さ
されたペプチドを比較的容易に見つけ出すことができる｡
を有するスペーサーを挟んで２つの官能基を固定化する
また､架橋されたペプチドの MS/MS 測定を行う場合､
方法である｡架橋される官能基は､用いる試薬の反応の
繋がれた２本のペプチド鎖のフラグメントイオンが１つ
特異性に依存する｡例えば､２つのアミノ基を架橋する
観測されるのでその解析は容易ではないが､還元により
こともできるが､一方がアミノ基､もう一方がチオール
切り離した場合には､ MS/MS 測定では1本のペプチド
基というように異なる官能基に対しても修飾を行い架橋
鎖のフラグメントイオンだけを観測できるので､配列解
することもできる｡また､架橋試薬の一端にアミノ基に
析を容易に行うことができる利点がある(Scheme 34)｡
− 25 −
薬膳科学研究所研究紀要
P1
+
NH 2
また､ ICAT のビオチン骨格はイオン化しやすく､その
P2
H 2N
他のペプチドのピークが検出されにくく､タンパク質の
O
NaO 3S
O
N O
O
O N
O
SO 3Na
O
(pH 7-9)
除去できる cleavable ICATTM 試薬が開発された125,126 ｡
これは､ビオチンタグの隣に酸で切断する部位があり､
O
H
N
P1
同定効率が下がる問題がある｡そこで､ビオチンタグを
S
S
O
S
N
H
S
O
第３号
P2
アビジンカラムを通した後､トリフルオロ酢酸で切断し､
LC/MS/MS
or
MALDI-TOFMS
12.0 Έ
ビオチンタグを除去する｡さらに､リンカー部位が重水
素から13 C に変わり､ 8Da の差から9Da に変えられた
䊃䊥䊒䉲䊮ᶖൻ
(図14)｡
O
H
N
H
N
ㆶర
Peptide
S
Peptide
N
H
S
O
O
O
Peptide
p
SH
HS
Peptide
N
H
O
NH
HN
O
Scheme
Scheme 34 34
O
*
Cleavable Linker
さらに､同位体標識試薬を用いたタンパク質の発現解
H
N
*
*
N
H
N
H
S
*
析がある｡生体内ではそれぞれの遺伝子の発現量は生体
O
*
*
*
*
O
*
I
N
H
*= 12C䉁䈢䈲13C
図14 cleavable ICAT 試薬の構造
の状況によって変動するので､網羅的にタンパク質の量
を調べる必要である｡しかし､タンパク質はその抽出法
が画一でなく､翻訳後修飾を受けるなど取り扱いが難し
その他､システイン残基へのラベル化試薬として､ア
く網羅的な変動を調べることは困難であった｡ 1999年に
クリルアミド(31)127−129､ 4-ビニルピリジン(32)130､ヨー
123
124
Oda と Gygi らによって MS を用いて異なる状態のタ
ドアセトアニリド(33)131などがある (図15)｡
ンパク質の存在量の違いを定量的に測定する方法が報告
された｡これは､異なる状態の細胞のタンパク質を安定
X
X
同位体で標識し､ MS による分析でえられるペプチドマ
NH 2
X
H
N
X
X
I
O
X
31
的な差を解明しようとするものである｡この方法は､タ
X
N
O
X
スフィンガープリントと比較することでタンパク質の量
X
X
X
X
32
33
ンパク質の絶対量を正確に捉えることは難しいが､異な
䋨X= H䉁䈢䈲D䋩
る組織細胞のタンパク質存在量の相対的な違いを精度よ
図15 チオール基反応性安定同位体標識試薬
く検出することができる｡具体的には､異なる組織から
抽出したタンパク質のシステイン残基に異種の同位体を
その他の安定同位体標識試薬としては､リシン残基
結合させたビオチン(Isotope-coded Affinity Tag；ICA
のε-アミノ基を特異的に修飾する O-メチルイソ尿素
T) を共有結合させた両組織のタンパク質を混合し､そ
(34)132,133 ､ α-アミノ基およびリシン残基のε-アミノ基
のまま酵素消化してアビジン固定化カラムによりビオチ
を化学修飾するコハク酸無水物 (35)134 ､プロピオン酸
ン化されたペプチドを分離し､これを LC/MS/MS を用
無水物 (36)135,136 ､ ICPLTM 試薬 (37)137,138 ､ Exac TagTM
いて分析し､量的変化のあるタンパク質を検出する方法
試薬139 ､ SPITCTM 試薬 (38)140,141 および iTARQTM 試薬
である (図13)｡
(39)142−144 などがある｡また､トリプトファン残基のイ
ンドール基に反応する NBSTM 試薬(40)75,76,145がある (図
16)｡
O
NH
HN
X
O
X
X
S
O
I
N
H
O
X
X
O
X
O
N
H
X
X
X
O
X
X
HN*
O
*
䉼䉥䊷䊦෻ᔕၮ
H2N*
䊎䉥
䊎䉥䉼䊮
OMe
X
X
X
X
X
O
O
O
X
X X
*
34
35
36
O
HO 3S
N C S
*
N
O
37
38
*
*
*
*
*
N*
*
39
ClS
*
*
O
ICAT 試薬を用いる事により､システイン残基を含む
N*
O
*
N
O
ICAT 試薬の構造
N
O
*
*
O
X
㊀䈇⹜⮎䋺d8-ICAT䋨X= D; ㊀᳓⚛䋩
シ䈇⹜⮎䋺d0-ICAT䋨X= H; ᳓⚛䋩
O
*
*
O
X
䊥䊮䉦䊷
図13
X
*
O 2N
*
*
40
ペプチドのみ検出できるため MS スペクトルが単純に
䋨X= H䉁䈢䈲D䇮*= 12C䉁䈢䈲13C, 14N䉁䈢䈲15N䋩
なり解析が容易になる一方､この方法ではシステインを
図16 アミノ基およびインドール基反応性安定同位体標識
試薬
持たないタンパク質を検出できないという欠点もある｡
− 26 −
Recent advances in protein chemical modification.
また､翻訳後修飾タンパク質であるリン酸化セリン・
スレオニンに対して塩基性条件下でベータ脱離反応を起
薬の改良により､定性と定量の同時解析を行える可能性
が高い修飾化試薬の開発に取り組む予定である｡
こし､デヒドロアラニン骨格とし､ 1,2-エタンジオール
(HSCX２ CX２ SH) などのチオール誘導体を作用させマ
参考文献
イケル付加反応を起こすことにより､安定同位体を標識
させる方法もある146｡
１. Horwich, A. L. & Weissman, J. S. Deadly conformations-protein misfolding in prion disease. Cell 89, 499-510 (1997).
２. Booth, D. R. et al. Instability, unfolding and aggregation of
将来への展望
human
以上､タンパク質中のアミノ酸残基の化学修飾法から
lysozyme
variants
underlying
amyloid
fibrillogenesis. Nature 385, 787-93 (1997).
３. Sidransky, D. & Hollstein, M. Clinical implications of the
化学修飾法を利用したプロテオーム解析の現状について
p53 gene. Annu Rev Med 47, 285-301 (1996).
述べた｡タンパク質は生命体の主要な機能分子であり､
４. Fersht, A. タンパク質の構造と機構. 医学出版 (2006).
栄養学においても体タンパク質代謝は､タンパク質摂取
５. David W. Mount､岡崎康司／坊農秀雅 (監訳). バイオ
インフォマティクスゲノム配列から機能解析へ. メディ
量やエネルギー摂取量により､また成長､加齢､妊娠､
授乳､運動など生理的状態や､ストレス､低栄養､疾病､
外傷などの病的状態において適応的に変化しており､そ
カル・サイエンス・インターナショナル (2002).
６. Petsko A Gregory､ Ringe, D. タンパク質の構造と機能
ゲノム時代のアプローチ. メディカル・サイエンス・イン
の根源はタンパク質の構造と機能からきている｡
ターナショナル (2005).
タンパク質中のアミノ酸残基への化学修飾は､古くか
７. 大野素徳. 生物化学実験法 12. 学会出版センター (1981).
ら研究がなされているが､修飾反応の条件においてタン
８. 大野素徳. 生物化学実験法 13. 学会出版センター (1981).
パク質の高次構造が変化しないことが重要であり､その
９. 石黒正恒. 生物化学実験法 8. 学会出版センター (1978).
ためには比較的緩和な条件下､かつ､非特異的な会合が
10. Means, G. E. & Feeney, R. E. Reductive alkylation of amino
起こらない条件下で行われなければならない｡この様な
ことから修飾反応の特性や様式を一般化して､すべての
groups in proteins. Biochemistry 7, 2192-201 (1968).
11. Stark, G. [The excretion of aldosterone, cortisone and
cortisol in non-pregnant subjects and in normal and patho-
タンパク質に適用することは容易なことではない｡
logical pregnancy.]. Arch Gynakol 192, 519-30 (1960).
また､ポストゲノム世代におけるプロテオーム解析と
12. Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of
して､タンパク質−タンパク質相互作用､タンパク質−
proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups.
Biochemistry 4, 1030-6 (1965).
リガンド相互作用の同定解析から発現解析あるいはリン
酸化部位､糖結合部位のような翻訳後修飾解析について
13. Boyd, H., Calder, I. C., Leach, S. J. & Milligan, B. Nacylsuccinimides as acylating agents for proteins: synthe-
定量的情報を得る定量解析へとシフトしてきている｡こ
sis, hydrolysis and aminolysis. Int J Pept Protein Res 4,
のため､従来のタンパク質を網羅的に同定し､その機能
109-15 (1972).
を解明することを目的としていた方法では､限界があり
14. Habeeb, A. F., Cassidy, H. G. & Singer, S. J. Molecular
新たな解析方法として化学修飾法を用いたプロテオーム
structural effects produced in proteins by reaction with
解析法の必要性が問われている｡しかしながら､プロテ
succinic anhydride. Biochim Biophys Acta 29, 587-93
(1958).
オーム解析に利用されている化学修飾法は､チオール基､
インドール基､アミノ基の３種類に限られており､これ
15. Frist, R. H., Bendet, I. J., Smith, K. M. & Lauffer, M. A. The
protein subunit of cucumber virus 4; degradation of
らの残基同様にタンパク質表面に存在する傾向が大きい
親水性アミノ酸のセリン､スレオニン､アスパラギン､
viruses by succinylation. Virology 26, 558-66 (1965).
16. Gounaris, A. D. & Perlmann, G. E. Succinylation of
グルタミンなどの側鎖を選択的に修飾する方法は報告さ
れておらず､また疎水性アミノ酸についても特異的な修
pepsinogen. J Biol Chem 242, 2739-45 (1967).
17. Habeeb,
A.
F.
immunochemical
飾方法は報告されていない｡
Atassi,
properties
M.
of
Z.
Enzymic
lysozyme.
and
IV.
Demonstration of conformational differences between
このように､化学修飾法によるタンパク質解析法はま
alpha-lactalbumin and lysozyme. Biochim Biophys Acta
だ発展途上段階にあり､目的のタンパク質解析に応じた
新たな試薬・方法論が開発される今後の発展に期待した
&
236, 131-41 (1971).
18. Shiao, D. D., Lumry, R. & Rajender, S. Modification of
い｡
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最後に我々は､化学修飾を利用したタンパク質解析の
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new
deuterated
alkylating
agent
for
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− 31 −
薬膳科学研究所研究紀要
coded affinity tag approach for isolating and quantitating
phosphopeptides in proteome-wide analyses. Anal. Chem.
73, 2578-2586 (2001).
− 32 −
第３号
高齢者のうつに対する社会的サポートの課題
本田
侑紀
中村学園大学栄養科学部
(2010年４月１日受理)
キーワード
高齢者､うつ､ソーシャル・サポート
厚生労働省において３年ごとの10月に全国の医療施設
要
約
に対して行われている患者調査の結果において｢気分障
害｣ (うつ病､躁うつ病､気分変調症等) の総患者数は､
近年､うつ病､躁うつ病､気分変調症等の気分障害を
1996年には43.3万人であった総患者 (調査日には通院し
罹患する人数が急激に増加している｡その中で高齢者の
なかったが前後に通院している者を含む) は1999年には
占める割合は40.5％に達しており､うつ病の対策は高齢
44.1万人とほぼ横ばい｡しかしその後､ 2002年に71.1万
社会において重要な問題である｡本総説では､高齢者の
人､ 2005年には92.4万人､ 2008年には104.1万人と９年
うつ病の原因を探り､この課題に対処しているケースス
間で約2.4倍に増加している｡また年齢別では､男性は
タディを紹介し､その中から具体的な課題を抽出し､今
40歳代が最も多く､ 30歳代がこれに続き､女性は60歳代､
後のうつ病の総合的な対策を提案する｡
70歳代が最も多い２｡しかし､この調査について､うつ
病の有病率調査からいえば全国に数百万人のうつ病者が
緒
いるはずだが､この患者調査によれば､受診しているう
論
つ病患者はやっと90万人を超えたとしている｡多くのう
近年､｢うつ｣という言葉を頻繁に耳にするようになっ
つ病者が適切な治療を受けていないという事実は重要だ
た｡｢うつ｣という言葉は気のふさぐことを示すが､こ
との指摘もある３｡また､厚生労働省による2002年の
こでいう｢うつ｣は｢鬱病｣のことであり､広辞苑では
｢自殺防止対策有識者懇談会｣の最終報告において､早
気分障害の一型で､抑うつ気分・悲哀・絶望感・不安・
急に取り組むべき実践的な自殺予防対策として､うつ対
焦燥・苦悶感などがあり､体調がすぐれず精神活動が抑
策の必要性を示している４｡この背景として､自殺者の
制され､しばしば自殺企画・心気妄想を抱くなどの症状
70％は精神疾患を有しており､そのうち最も多いのがう
１
を呈する原因不明の精神の病気と定義されている｡厚
つ病であることが報告されている３｡
生労働省における患者調査では､この｢うつ｣に罹患し
２
ている人数の推移は以下の通りである (図１) ｡
また我が国は今や平均寿命79歳を超える長寿国であ
り５､総人口に占める65歳以上の割合は､ 2010年現在の
総人口､約１億2700万人に対し20％以上である６｡国立
社会保障・人口問題研究所が2006年12月に推計した将来
人口によると､今後総人口は長期にわたって減少し､ 45
年後には１億人を割り8993万人になるものと推計されて
いる｡同時に､この時の総人口に占める高齢者の割合は
40.5％に達すると予測されている (図２)７｡このうち､
現在のうつ病に対する高齢者の割合は他の年代に比べて
大うつ病の発生頻度は多くなく1.8％程度であるが､基
準を満たさない閾値下うつ病あるいは小うつ病とよばれ
るグループの発生頻度は高く10％に上るとの報告がある｡
図１気分[感情]障害(操鬱病を含む)の総患者数の推移
65歳以上の認知症有病率が６∼９％であることと比較し
− 33 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
ても､高齢者においてうつ病は認知症と同等ないし､そ
れ以上の重要性を有する疾患であるといえる８｡
このような現状を踏まえ､以下では高齢社会における
うつ病を取り上げ､その対策を検討する｡
高齢社会におけるうつ病の現状
(1) ｢うつ病｣の症状とメカニズム
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一般的なうつの症状として､強い抑うつ気分､興味や
喜びの喪失､食欲の障害､睡眠の障害､精神運動の障害
図２高齢者(65歳以上)の割合の推移と将来推計
(制止または焦燥)､疲れやすさ､気力の減退､強い罪責
９
感､思考力や集中力の低下などが挙げられる｡その原
因は未だ解明に至っておらず､国際的にも十分な意見の
ࢺࣜࣉࢺࣇ࢓ࣥ
一致がみられていない10｡よって､うつ病の治療に用い
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られている薬物から病態メカニズムを示す｡
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抗うつ薬の開発の歴史は､ 1950年代に結核の治療薬と
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して開発された｢iproniazid｣と抗ヒスタミン剤として
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開発された｢イミプラミン｣に抗うつ作用があることが
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発見されたことが始まりとされている｡その後､抗うつ
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薬の開発と併せて､その作用機序を通してうつ病の病態
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メカニズムを明らかにする研究が進められた｡結果､イ
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ミプラミンをはじめとする三環系抗うつ薬は共通してモ
図３モノアミン仮説 (セロトニンシナプス)
ノアミントランスポーターを阻害し､シナプス間隙に放
出されたモノアミンの前シナプスニューロンへの再取り
込みを阻害することが明らかになった｡一方 iproniazid
つ病の発症の危険因子として､様々なストレス､例えば
は､
主要なモノアミン分解酵素である MAO
つらい被養育体験・最近のライフイベンツ (離婚､死別､
(monoamine oxidase) を阻害し､再取り込みされたモ
その他の喪失体験)・心の傷 (トラウマ) になるような
ノアミンの分解を抑制することから､シナプス間隙にお
出来事 (虐待､暴力など) がうつになる要因として示さ
けるモノアミン濃度の上昇によって抗うつ作用が発揮さ
れている13｡また､ソーシャル・サポートの不足が死亡
れるという｢モノアミン仮説｣が1960年代に提唱される
リスクの増大､身体的健康状態の悪化､高齢者の抑うつ
ようになった (図３)｡現在でもこの｢モノアミン仮説｣
症状のリスク増大と関連するとの報告もある14｡他にも､
が主流であり､モノアミンの中でも特に睡眠・食欲・感
うつ病は身体疾患患者に合併して起こることがすでに分
情などのコントロールに関係が深いセロトニン(５-ＨＴ)
かっており､主な身体疾患に見られるうつ病の有病率は
｡
次の通りである (表１)15 ｡このように､身体患者にお
その内セロトニンは､脳血液関門をほとんど通過せず脳
いても高いうつ病合併率が示されている｡厚生労働省の
内におけるセロトニン合成は､体内で合成できない必須
患者調査でもわかるように､高齢者は受療率が高く何ら
アミノ酸の一つであるトリプトファンが脳内に取り込ま
かの病気に罹患しており､入院の患者においては約半数
れ､Ｌ-５ＨＴＰを経て合成される｡脳内セロトニン合
を70歳以上が占めている16 ｡さらに､本田ら17 における
成は､血漿中遊離型トリプトファン濃度とトリプトファ
身体機能と抑うつの関連性を調査したものでは､抑うつ
ンの脳への取り込み率により調節されていることから､
症状と歩行機能が関連していることが明らかとなり､生
血漿中遊離型トリプトファンの濃度の変動はうつの症状
活機能の低い群は高い群に比べうつ傾向が高いことが示
とノルアドレナリン(ＮＡ)の関与が指摘されている
10,11
12
の依存的な生物学的指標となっている｡
されている｡
(2) うつ状態を誘発する要因
(3) 高齢者の生活状況
内閣府による高齢者生活調査では､高齢化の急速な進
以前より｢うつ病は几帳面でまじめな人が無理をして
10
疲れるとおきる｣という考えが広く行き渡っている｡
展や高齢単身世帯の増加の背景に､高齢者の社会的孤立
厚生労働省のうつ対策推進方策マニュアルによれば､う
が懸念されるとある18｡現段階で｢社会的孤立｣を調査
− 34 −
高齢者のうつに対する社会的サポートの課題
するには､具体的に把握する際の指標や対象年齢も多様
人間関係の喪失などの心理社会的背景が関連しており､
であるため孤立状態の結果は研究において様々である19｡
心理社会的背景に影響を及ぼすものの一つに､地域社会
内閣府による調査では｢会話の頻度｣｢困ったときに頼
の中での孤立や人間関係の希薄化によるソーシャル・サ
れる人の有無｣｢社会活動への参加や交流などの状況｣
ポート不足が挙げられている｡小泉ら14による都市部で
の３項目の調査結果により高齢者の社会的孤立が示され
のソーシャル・サポートと抑うつ症状の関連性を調査し
ている｡｢会話の頻度｣の中から､一人暮らし世帯の人
たものでは､男女ともソーシャル・サポートの欠如と抑
は会話が少ない人が多く､会話が２∼３日に１回以下と
うつ症状との間に関連が認められ､男性では関連するソー
回答した男性は41.2％､女性は32.4％であった｡また､
シャル・サポートの｢種類｣と関連の｢強さ｣の両面に
｢困ったときに頼れる人の有無｣においても同様に､一
おいて影響がみられた｡特に､退職後の高齢男性におい
人暮らし世帯では頼れる人がいない人の割合が高く､男
て地域社会での人間関係の希薄化､孤立がソーシャル・
性で24.4％､女性で9.3％｡｢社会活動への参加や交流な
サポート欠如の要因となり､抑うつ症状の出現に強く影
どの状況｣においても高齢になるほど (特に80歳以上)
響することが示唆されている13｡また､小泉らと同一の
社会活動への参加や交流が低調で､男女とも一人暮らし
評価尺度を用いた村岡ら21の報告から山形県長井市での
世帯は低調であった18 ｡また､河合20 が東京都で行った
調査対象者におけるソーシャル・サポート欠如者の割合
調査 (65歳以上一人暮らし高齢者を対象)では､｢友人・
を換算したものでは､｢困ったときの相談相手がいない｣
知人の有無｣｢近所付き合いの有無｣｢社会活動の有無｣
と回答した者の割合は､村岡らの非都市部 (山形県長井
の３項目を指標として２項目に該当した場合を孤立とみ
市) で3.2％､小泉らの都市部 (宮城県仙台市) で24.7
なした結果､一人暮らし高齢者の中でのその発現率は
％と約８倍の格差｡｢具合が悪い時の相談相手がいない｣
27.0％であったと報告されている｡
と回答した者の割合は､村岡らで2.5％､小林らで22.1
このような高齢者の抑うつ症状の出現には役割意識や
％と約９倍の格差｡｢家事などの日常生活を援助してく
れる人がいない｣と回答した者の割合は､村岡らで13.8
表１身体疾患に見られるうつ病の有病率 (％)
％､小林らで39.1％と約３倍の格差｡｢体の具合が悪い
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ときに病院に連れて行ってくれる人がいない｣と回答し
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た者の割合は村岡らで4.1％､小林らで25.3％と約６倍
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たと報告されている (図４)14 ｡これらは､隣人関係の
希薄化､核家族化､独居者の増加などの非都市部と異な
る都市部特有の環境要因がソーシャル・サポートの欠如
に反映されたためと考えられている｡都市部において､
こうしたサポートを高齢者に行っていくためには､訪問
指導やケースマネジメントなどの技能をもつ保健福祉専
門職の養成などの必要性が指摘されている14｡
高齢者のケアの現状
健康増進対策の一つとして平成12年度 (2000年) から
開始された｢健康日本21｣ (厚生労働省) では､大きな
課題となっている生活習慣や生活習慣病を９つの分野で
選定し､それぞれの取り込みの方向性と具体的な目標を
示している｡その一つに｢休養・こころの健康づくり｣
があり､｢最近１カ月間にストレスを感じた人の割合の
減少｣｢睡眠によって休養が十分に取れていない人の割
合の減少｣｢自殺者の減少｣などの目標を掲げている22｡
ここでは､この目標を達成するにあたり行われている､
うつ予防・支援マニュアル (厚生労働省) の先進的取り
図４
非都市部と都市部のソーシャル・サポート欠如者の
割合の比較
組み事例を挙げる23｡
− 35 −
薬膳科学研究所研究紀要
１) 100万人都市で展開する総合的な高齢者うつ対策事
第３号
とうつ状態の改善が見られたと報告されている｡また､
業 (宮城県仙台市)
高齢者だけでなくうつ病患者全体において先に述べたよ
宮城県仙台市は県内の他市町村に比べると高齢化率は
うに｢希死年慮｣を有している者もあり､一般には10％
低いが､高度成長期に造成された大規模住宅地では高齢
程度が死にたい気持ちをもっているとされる３｡そのた
化が急速に進んでおり､ソーシャル・サポートの不足な
め､自殺予防のためにうつ病についての普及啓発が必要
ど高齢者の孤立の問題も深刻な地域である｡ここでは普
であり､厚生労働省では2010年に月別自殺者数の最も多
及啓発､アセスメント､相談､訪問､ケースマネジメン
い３月を｢自殺対策強化月間｣と定め､地方公共団体､
トにわたる総合的なプログラムが実施されており､人口
関係団体等とも連携して､重点的に広報啓発活動を展開
規模の大きな都市でも実施可能なように事業全体が高度
するとともに､関係施策を強力に推進することを広く呼
に組織化されている (表２)23｡
び掛けている26｡また､うつにおいても｢睡眠｣の問題
を切り口として､｢うつのサイン｣に気づき､早めの専
２) レクリェーションボランティアが企画・運営するお
楽しみ同好会 (鹿児島県肝付町)
門機関への受診を促すことを目的としキャンペーンを行っ
ている｡
この事例は､閉じこもり予防と自殺予防を目的に実施
次に､高齢者のうつ病を治療する方法として具体的に
されてきた機能訓練事業とボランティア育成事業から出
示したものでは､服部８における｢高齢者うつ病の治療
発し､今では企画・運営すべてを住民ボランティアが実
戦略モデル｣がある (図５)｡これは､高齢者に特有の
施するようになったもので､レクリェーション活動を中
廃用症候群の予防を組み込んだもので､急性期と慢性期
心とする地域支援活動が行われている｡この事業の背景
を分けて考えている｡一般的なうつ病の治療は精神的安
には､旧内之浦町において高齢者の閉じこもりからの後
定と抗うつ剤服用が基本であり､これは高齢者において
追い自殺が相次いだことがあり､その対策として始まっ
も変わらず､その後治療により抑うつ気分が軽快したの
たものである｡内容はレクリェーションで交流し､お弁
ちにも意識が戻ってこない時期がしばらく続く｡若年層
当を食べて帰るといったものであるが､行政スタッフだ
けでは到底実施できないということもあり､高齢者同士
表２
での助け合いを目的に高齢者レクリェーションボランティ
アの育成が平行して進められ､ボランティアがスタッフ
23
として事業に参画するようになっている｡
さて､ここまで挙げた事例は､地域において行われて
100万人都市で展開する総合的な高齢者うつ対策事
業 (宮城県仙台市)
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いる事例である｡次に挙げるのは､うつ病の高齢者を対
象とした医療・看護・介護において総合的なケアである｡
高齢化率が上昇し続けている近年､高齢者の受け皿と
しての病院・病床が増大したことに対する見直しから､
介護保険制度が2000年にスタートし､医療制度において
は｢在宅医療｣が注目されるようになった｡在宅医療に
おいては､チーム医療を認識したうえで､多職種協同に
䈉䈧∛䈱ℂ⸃䉕ᷓ䉄䉎䇯
より地域の医療・看護・介護各々の力を引き出していく
不断の努力が必要であるとされている24｡多職種協同と
いうのは､患者と患者家族を中心に訪問リハビリテーショ
ン・訪問マッサージ・訪問調剤薬局・訪問介護・デイサー
ビス・ショートステイ・訪問入浴・訪問歯科診療と在宅
療養支援診療所が連携をとり､病院と相互に情報交換ま
た治療を行っていくものである24｡
稲谷ら25による高齢者デイケアにおける老年期うつ病
の不眠や不安､抑うつ感情を主訴とする高齢女性に対す
る心理面接の事例では､うつ状態に陥ったＡさんが､そ
れまで抱えてきた葛藤や心理的重荷を表出できる時間と
場所を老人痴呆デイケアで定期的に提供することを試み､
その結果クライエントの認知機能および情動機能の安定
− 36 −
図５高齢者うつ病の治療戦略モデル
高齢者のうつに対する社会的サポートの課題
では薬物投与と生活指導程度で回復を待つことができる
んぱく質の摂取不足によりセロトニンの前駆体であるト
が､高齢者では急性期の安静から引き続いて起こってく
リプトファンの摂取も併せて不足することにより､うつ
る運動機能の低下､日常生活動作能力の低下といった廃
状態の悪化につながることも予測される｡
用症候群の予防が極めて重要になると指摘している｡す
以上のことから､今後の高齢者のうつ病に対する社会
なわち､急性期における安静中心の治療から賦活を主と
的サポートのあり方として､地域密着型の高齢者支援､
する治療へ変換し､精神・運動機能維持のための認知､
ソーシャル・サポート (人間関係の希薄化､孤立を防ぐ
身体リハビリテーションを行い､生活面でデイケアなど
ための支援) の普及・充実を図るほか､栄養状態の把握
の介護サービスを積極的に活用することが望ましいとし
を実施していくことも重要と考える｡先で紹介した総合
８
ている｡
ケアである｢チーム医療｣を予防においても普及させ､
医師､看護師､ＰＴ (理学療法士)､ＯＴ (作業療法士)､
言語聴覚士､薬剤師､歯科医師､管理栄養士､ソーシャ
まとめ
ルワーカーなどの多職種協同によってうつ状態､低栄養
高齢者人口は年々増加し､将来像として45年後には約
状態の早期発見・早期対応を行うことが望まれる｡
半数を高齢者が占める世の中になるのは免れない｡また､
うつ病が蔓延する現代では国による対策の一つとして
参考文献
｢うつ対策｣｢自殺対策｣が重要な課題となっている｡高
齢者の生活を見ても､一人暮らしをする者の割合は､後
１. うつ【鬱 "
に生まれた世代ほど上昇しており､年齢別に見ると婚姻
うつびょう【鬱病 ". 広辞苑, 第六版, 岩波
書店, 2008
などにより30代後半までは下がり､その後､年齢が上昇
２. 厚生労働省：患者調査" (指定統計66号), 統計表データ
するにつれて配偶者との離別や死別などによりその割合
ベース, 1996∼2008年, http://www.mhlw.go.jp/toukei/
list/10-20.html
は高くなるが､今や世代間の差は年齢が上昇しても維持
27
されている｡よって今後､高齢者の一人暮らしは加速
３. 保坂隆：うつ病と自殺, うつ病診療最前線―プライマリ・
ケアにおけるゲートキーパーとしての役割とは？―, 治療,
的に増加すると予測されており､地域社会での人間関係
の希薄化､孤立した状態の人数が増えることが懸念され
91 (No.8), p.2095∼2098, 2009年
４. 厚生労働省：自殺防止対策有識者懇談会, 自殺予防に向け
る｡高齢者のうつにおいて､現在､重要視されているも
のはソーシャル・サポートであり､地域支援を通じて高
ての提言, 2002年
５. 厚生統計協会編集：国民衛生の動向, 厚生統計協会, p.69
∼70, 2008年
齢者のケアにあたっている｡内容としては人間関係に重
きを置いたもので､孤立を防ぐことを重要課題としてい
６. 総務省：国勢調査", 統計局・政策統括官 (統計基準担当)
る｡一方､平均年齢58.9±16.5歳のうつ病患者における
・統計研修所, 統計データベース, 1975∼2005年, http://
食生活の実態をしたものでは､うつ病患者は健常対象に
比べて､食欲がなく欠食が多い｡食事の量は適量でなく､
www.stat.go.jp/DATA/kokusei/2005/index.htm
７. 国立社会保障・人口問題研究所：日本の将来推計人口―
2006 (平成18) 年12月推計―, 2006年
食事内容においても多様な食品をとっておらず､調理済
８. 服部英幸：高齢者うつ病の臨床, 第48回日本老年医学会学
み食品やインスタント食品をよく利用すると報告されて
術集会記録, 日本老年医学会雑誌, 43巻５号, p.566∼568,
2006年
おり､食事に対する意識については栄養や食事について
考えることが少なく､自分の食事について問題があると
感じている｡その中で食事の改善に必要なこととして多
く挙げられたものは､家族の協力､栄養士などの専門家
のアドバイス､栄養情報サービスの整備､市販食品や外
９. 権藤恭之編：高齢者心理学―うつ病・自殺―, 第３版, 朝
倉書店, p.179∼185, 2009
10. 山下格：精神医学ハンドブック, 医学・保健・福祉の基礎
知識, 第五版, 日本評論社, p.75∼89, 2004年
11. 神庭重信, 橋岡禎征, 門司晃：抗うつ薬の薬理作用機序
食の栄養価の表示､飲食店でのバランスのとれたメニュー
最近の知見, 第129回日本医学会シンポジウム―うつ病[Ⅰ]
基礎・病態―, p.24∼30, 2005年
の提供であり､専門家の援助の期待が大きいことが分か
る28｡このような状況を踏まえ､ 2006年に厚生労働省よ
り｢新予防給付｣が創設され､当該給付において｢運動
器の機能向上｣､｢栄養改善｣及び｢口腔機能の向上｣と
12. 河野友信, 筒井末春編：うつ病の科学と健康
一般医のた
めの, 朝倉書店, 1987年
13. 厚生労働省：厚生労働省地域におけるうつ対策検討会, う
つ対策推進方策マニュアル―都道府県・市町村職員のため
いったサービスが組み込まれている29｡また､高齢者の
に―, 2004年
うつ病において危険を伴う疾病の一つとして低栄養 (Ｐ
14. 小泉弥生ほか：都市在住の高齢者におけるソーシャル・サ
ＥＭ) があり､必要な量のたんぱく質の摂取不足､エネ
ポートと抑うつ症状の関連性, 日本老年医学会雑誌, 41巻
ルギー不足により他の疾患にも罹患しやすくなる30｡た
４号, p.426∼432, 2004年
− 37 −
薬膳科学研究所研究紀要
15. 大内清：定型および非定型うつ病患者への対応, うつ病診
23.
第３号
｢うつ予防・支援マニュアル｣分担研究班
療最前線―プライマリ・ケアにおけるゲートキーパーとし
保健管理センター班長
ての役割とは？―, 治療, Vol.91 (No.8), p.2029∼2031,
ル (改訂版), p.25∼46, 2009年
大野裕：うつ予防・支援マニュア
24. 高瀬義昌, 五十嵐中, 小林慶鑑：在宅医療の立場から, う
2009年
つ病診療最前線―プライマリ・ケアにおけるゲートキーパー
16. 大塚眞理子：医療と福祉の連携・協働そして統合へ, 高齢
としての役割とは？―, 治療, Vol.91 (No.8), p.2056∼
者の健康問題から高齢者ケアを再考する, 社会福祉研究,
2061, 2009年,
第106号, p.60∼69, 2009年
17. 本田春彦ほか：地域在宅高齢者における身体機能と抑うつ
の関連性, 東北文化学園大学
慶応義塾大学
25. 稲谷ふみ枝, 津田彰：高齢者デイケアにおける包括的心理
的援助, 老年期うつ病 (回復期) の利用者に対する心理面
保健福祉学研究, 第３巻,
接の事例, 久留米大学心理研究所, 第５号, p.81∼90,
p.51∼61, 2005年
2006
18. 内閣府政策統括官 (共生社会政策担当)：高齢者の生活実
態における調査の結果―2009(平成21) 年12月発表―, p.1
26. 内閣府政策統括官 (共生社会政策担当)：自殺対策強化月
間・睡眠キャンペーン, 2010年
∼38, 2009年
19. 冷水豊：高齢者の社会的孤立と社会福祉の役割を問う, 高
27. 内閣府政策統括官 (共生社会政策担当)：高齢社会白書―
高齢化の状況及び高齢社会対策の実施状況―, 2008年
齢者の健康問題から高齢者ケアを再考する, 社会福祉研究,
28. 松尾令子, 浅沼奈美, 大沢亜貴子, 大滝純一：うつ病患者
第106号, p.51∼59, 2009年
の食生活の実態―国民栄養調査を用いて―, 杏林医学会雑
20. 河合克義：大都市における高齢者の社会的孤立と社会保障・
誌, p.102∼103, 2005年
社会福祉の課題―東京都港区のひとり暮らし高齢者の生活
29. 厚生統計協会編集：国民衛生の動向, 厚生統計協会, p.229
実態を中心に―, 社会政策学会誌, 第７号, p.118∼131,
∼239, 2008年
2002年
21. 村岡義明, 生地新, 井原一成：地域在宅高齢者のうつ状態
30. 蓮村幸兌, 佐藤悦子, 塚田邦夫編：在宅チーム医療栄養管
の身体・心理・社会的背景要因について, 老年精神医学雑
理研究会, スリーステップ栄養アセスメントを用いた在宅
誌, 第7巻, p.397∼407, 1996年
高齢者食事ガイド―脱水, PEM, 摂食・嚥下障害, 褥創
22. 厚生統計協会編集：国民衛生の動向, 厚生統計協会, p.84
∼94, 2008年
− 38 −
への対応―, p.115∼121, 2006年
Original Article
The masticatory score and the occlusal force based on
the textural properties of food for infants
Keiko YOSHIOKA＊1, Yoshimi MINARI＊1, Ai TOKIFUJI＊1 and Taeko YONEDA＊2
＊1
Department of Nutritional Sciences, Nakamura Gakuen University, 5-7-1 Befu, Johnan-ku, Fukuoka, 814-0198, Japan
＊2
Graduate School of Health and Nutritional Sciences, Nakamura Gakuen University, 5-7-1 Befu, Johnan-ku, Fukuoka, 814-0198,
Japan
Key word: infant period, masticatory score, occlusal force, textural properties, dietary behavior
Abstract
Masticating is much concerned with appetite and the adjustment of lipid and energy metabolism, besides
chewing foods and having the subsidiary function to aid the foods with digestion and absorption. It also has the
relationship with the brain function and has a physiological significance.
In this study we surveyed the dietary behavior concerning the mastication of the nursery school children,
who are in the important age of the formation of dietary habits. The masticatory score was calculated and the
relationship between the masticating power examined by the occlusal force and the masticatory behavior was investigated. 30 kinds of foods which infants are able to intake were chosen and the hardness of the textural properties of foods was examined. There was a high correlation between the hardness and the difficulty of intake, and
the appropriateness of the choice of foods was confirmed. Furthermore the masticatory score calculated from the
survey of food taking ability corresponded with the occlusal force, which made it possible to express the synthetic masticating power of infants quantitatively. There were a few infants who indicated a low value in the
masticatory score and the occlusal force among the experimental subjects.
Therefore, it is necessary to lead the appropriate dietary behavior and is important for infants to form a
good dietary habit in the infant period.
摂取食品の物性値からみた幼児の咀嚼スコアと咬合力
吉岡
慶子＊1, 三成由美＊1, 時藤
亜衣＊1, 米田
妙子＊2
＊１中村学園大学栄養科学部
＊２中村学園大学大学院栄養科学研究科
キーワード
幼児期､咀嚼スコア､咬合力､テクスチャー特性､食行動
(2010年４月１日受理)
調節等と深く関わり､脳機能と関連して生理的意義をも
要
約
つとされている｡本研究では食習慣の形成に重要な時期
である幼児期の保育園児を対象とし､咀嚼に関する食行
咀嚼動作は食物を噛み砕き､消化吸収を助ける補助的
動調査を行い､咀嚼スコアの算出､咬合力測定による咀
機能はもとより､食欲や脂質代謝の調節および熱代謝の
嚼力について､総合的に咀嚼行動との関連性を検討した｡
− 39 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
摂取可能食品30食品のテクスチャー試験による硬さと
調査対象および方法
摂取難易度間には高い相関がみられ､食品の選択の妥当
性が確認された｡また､摂取可能食品の調査から算出さ
１) 調査対象
れる咀嚼スコアは､咬合力を反映するものであり､これ
調査対象は福岡県築上郡上毛町新吉富保育所の満２歳
らは幼児の総合的な咀嚼力の数値化を可能とした｡対象
∼満５歳までの幼児45名とし､咀嚼に関する食行動調査
とした幼児の中には､丸飲みすることがよくある､食事
および身長､体重､咬合力の測定が可能であった30名を
をあまり噛まない等がみられた｡また､咀嚼スコアおよ
分析対象とした｡
び咬合力が低値を示した者もいた｡この時期からの適正
な咀嚼行動の変容が求められ､食習慣の形成の重要性が
２) 咀嚼に関する食行動調査
示唆された｡
咀嚼に関する食行動調査は､保護者に聞き取り調査を
行い､食べる速さ､食事時間､咀嚼程度の項目について､
緒
５段階評点尺度法で記入した｡咀嚼力の主観的評価法は
論
平井ら10の食品選択方法に準じて摂取可能食品の調査を
咀嚼動作は食物を噛み砕き､消化吸収を助ける補助的
行い､摂取難易度ごとに分類した食品30品目について摂
機能はもとより､食欲や脂質代謝の調節および熱代謝の
取可能率 (％) および咀嚼スコアを算出した｡咀嚼スコ
調節等と深く関わり､脳機能と関連して生理的意義をも
アは､食品30品目を難易度毎に５群に分け､各群の摂取
つとされている１,２｡特に､近年､咀嚼と肥満との関係
可能率の比率を係数として算出した｡摂取可能食品30品
が明らかにされつつある｡坂田らは､咀嚼動作で神経ヒ
目については卓上型物性測定器(TPU-2S(B))を用い､
スタミンが賦活され､満腹中枢を介して食欲を抑制した
歪率80％でテクスチャー試験を行い､硬さの値と摂取難
り､視床下部から交感神経を介して末梢エネルギー代謝
易度第Ⅰ群∼第Ⅴ群との関係を調べた｡
を調節したりすることで､エネルギー代謝が駆動される
と報告している３｡このような基礎研究をもとに､松田
３) 咬合力の測定
らは咀嚼動作が中枢に及ぼす影響について臨床研究を行
咀嚼力の客観的評価法として､デンタルプレスケール
い､咀嚼動作が中枢におけるインスリン受容体を活性
(感圧紙法) を用い､オクルーザー (FPD-707) で咬合
化し､インスリン分泌を促進することを明らかにしてい
力 (Ｎ)､面積 (mm２) を測定し解析を行った｡
る４,５｡また､斎藤らは高校生を対象に咀嚼状況と肥満､
食習慣との関連について調査を行い､肥満群はよく噛ま
４) 肥満度(％)の算出
６
ずに食べるのが速いという結果を得ている｡一方､肥
肥満度(％)の算出は､幼児の身長､体重から肥満度
満および肥満症の予防のためには､食行動の形成に重要
[(実測体重−標準体重)／標準体重×100] を表し､標準
な時期である幼児期からの望ましい食習慣の形成が必要
体重は村田ら11の年齢別身長別標準体重を用い､ 15％以
とされているが､幼児の咀嚼動作と肥満に関する研究は
上12 を｢肥満傾向｣とした｡さらに､対象者の BMI
多くみられない｡
(Body Mass Index)[体重(kg)÷身長(m)２]を算出して
他方､咀嚼力の評価法としては､主観的方法と客観的
肥満度との関係を Pearson の相関係数を用いて調べた｡
方法の２種類に分けられる｡主観的評価法は主に質問紙
や聞き取りによるもので､客観的評価法はグミゼリーや
５) 対象者への倫理的配慮
ガムを実際に咀嚼して評価する場合や咬合圧､咬合接触
本研究は保育園児の保護者に予め研究の意義を十分に
面積などの補綴学的データ､舌や咀嚼筋の筋活動､下顎
説明し､承諾を得たもので､中村学園大学倫理審査委員
運動等の生理学的データを応用する手法等がある７∼９｡
会の承認を得て実施した｡
咀嚼力の評価はそれらの主観的方法と客観的方法を組み
合わせて用いることが望ましいと考えられるが､幼児に
６) 統計解析
統計解析は Statistical Package for Social Science
おける咀嚼力のデータは少なく､評価の指標は確立され
(SPSS) (16.0J, SPSS Inc., Chicago, USA)を使用し､
ていない｡
本研究では幼児期の保育園児を対象とし､咀嚼に関す
る食行動調査を行い､咀嚼スコアの算出､咬合力測定に
Pearson または Spearman の係数を用いて相関関係を調
べ､さらに主因子法による因子分析を行った｡
よる咀嚼力について､総合的に咀嚼行動との関連性を検
討した｡
− 40 −
The masticatory score and the occlusal force based on the textural properties of food for infants
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図１. 咀嚼に関する食行動調査
結
果
１) 咀嚼に関する食行動調査
咀嚼に関する食行動調査を図１に示す｡アンケート対
象者30名の年齢構成は２歳10％､３歳33％､４歳23％､
５歳33％であり､そのうち肥満度が15％以上の幼児は10
％であった｡
問１.の食べる速さについては｢遅い｣が最も多く47
％を占めていた｡問２.の食事時間では20分間以上が97
％を占めていた｡問３.の丸飲みをする頻度では｢よく
ある｣､｢時々ある｣を合わせると37％であった｡問４.
の食事の咀嚼程度について､｢あまり噛まない｣は13％､
図２. 摂取難易度別30食品の分類
問５.の米飯を噛む回数が５回以下の幼児は７％みられ
た｡
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２) 摂取可能食品の調査
摂取可能食品の調査は平井らの食品選択方法に準じて
食品30品目を選択し､難易度毎に５群に分類した｡その
摂取難易度別30食品の分類を図２.に示す｡また､摂取
可能食品30品目のテクスチャー試験による硬さと摂取難
易度との関係を図３.に示す｡難易度Ⅰの食品のかたさ
は､プリン0.46[×10４Ｎ/ｍ２]∼バナナ6.3[×10４Ｎ/ｍ２]
の範囲であった｡難易度Ⅱの食品のかたさは､水炊きの
鶏肉10.6 [×10４Ｎ/ｍ２ ] ∼ロースハム47.3 [×10４Ｎ/
ｍ２]の範囲であった｡難易度Ⅲの食品のかたさは､焼き
− 41 −
図３. 摂取難易度別30食品の硬さと摂取難易度との関係
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
鳥27.0[×10４Ｎ/ｍ２]∼揚げせんべい123.2[×10４Ｎ/ｍ２]
の範囲であった｡難易度Ⅳの食品のかたさは､豚の生姜
焼き48.5[×10４Ｎ/ｍ２]∼らっきょう175.0[×10４Ｎ/ｍ２]
の範囲であった｡難易度Ⅴの食品のかたさは､たこの酢
の物71.4[×10４Ｎ/ｍ２]∼たくあん204.5[×10４Ｎ/ｍ２]
の範囲であった｡それらの食品のテクスチャー試験によ
る硬さと摂取難易度間には高い相関(r=0.893)が認めら
れ､硬さの値は摂取難易度が高くなるにつれて高い値を
示した｡
選択した取可能食品30品目について､対象者のうち摂
図５. 標準摂取可能率
取経験のある者の割合を食品別に図４.示した｡いちご､
鶏のから揚げ､りんごおよびおかきは100％であったが､
表１. 咀嚼能力の点数化(咀嚼スコア)
らっきょうは摂取経験率が最も低く､ 33.3％であった｡
食品群毎にみると､第Ⅴ群の摂取経験率が低い傾向がみ
⟲㩷
られた｡各食品の摂取可能率の算出は､摂取経験のない
者のスコアが０点と同等に評価されることがないように､
摂取経験者のフルスコアを100点として換算した｡
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換算して咀嚼スコアを算出すると､２歳70.7∼５歳77.7
であった｡
３) 咬合力の測定
オクルーザーによる咬合力測定例を図６.に示す｡デ
ンタルプレスケール上に印記された咬合圧の違いによる
発色濃淡を圧力値に換算し､幼児の咬合接触状態を表し
た｡デンタルプレスケールの発色点は咬合接触点を示し､
咬合力(Ｎ)＝発色点の各面積(mm２ )×各平均圧(MPa)
の総和から算出される｡また､ヒストグラムは５MPa
ごとの圧力域とその面積割合が左右に分かれて表示され､
左右の圧力の分布状態が把握でき､その差が大きい幼児
もみられた｡
幼児の年齢からみた咬合力と咬合面積を表２.に示し
た｡幼児の咬合力の平均値は､２歳246.40､３歳272.50､
図４. 摂取難易度別30食品における食品別摂取経験率
４歳281.90､５歳373.60と年齢が上がるにつれて高い値
を示し､それに伴い､咬合面積も増す傾向がみられた｡
幼児30名の各食品群における摂取可能率を図５.に示
咬合力と咀嚼スコアの関係を図７.に示す｡咬合力と咀
す｡摂取可能率は第Ⅰ群64.6％､第Ⅱ群61.4％､第Ⅲ群
嚼スコア間には相関が(r=0.619)が認められ､咬合力が
51.2％､第Ⅳ群49.3％､第Ⅴ群36.6％とⅠ群∼Ⅴ群になる
高い幼児ほど咀嚼スコアも高値を示した｡
につれて摂取可能率が低下した｡咀嚼スコアは､これら
の摂取可能率を係数として表１.の通り算出し､各個人
４) 年齢､肥満度､咀嚼スコア､咬合力および咀嚼に関
する食行動調査項目の因子分析
の咀嚼力を点数化したもので､第Ⅰ群の摂取可能率64.6
％を１とすると､第Ⅱ群1.05､第Ⅲ群1.26､第Ⅳ群49.3､
年齢､肥満度､咀嚼スコア､咬合力および咀嚼に関す
第Ⅴ群1.77となり､第Ⅰ群と第Ⅴ群の間には約1.8倍の
る食行動調査項目について因子分析を行い､抽出された
摂取難易度の差が認められた｡各食品群の得点に､難易
３因子８項目を表３に示す｡第１因子では年齢､咬合力､
度に応じた各係数を乗じ､それらの合計点を100満点に
咀嚼スコアの因子負荷量が高く､共通因子は｢咀嚼能力｣
− 42 −
The masticatory score and the occlusal force based on the textural properties of food for infants
表２. 年齢からみた咬合力および咬合面積
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図７. 咬合力と咀嚼スコアの関係
図６. 咬合力測定例
表３. 年齢､肥満度､咀嚼スコア､咬合力および咀嚼に関する食行動調査項目の因子分析
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と読み取られ､因子寄与率から全体の約22％の分散が説
上の幼児は10％であったが､現在､わが国における幼児
明された｡第２因子には丸飲みする頻度､食事を噛む程
の肥満度に関する調査データは極めて少ないため､この
度､咀嚼回数の因子負荷量が高く､共通因子は｢咀嚼の
集団に対する肥満児の割合については評価し難い点があ
程度｣とされた｡第３因子は食べる速さと食事時間の因
る｡本研究では幼児の体格指数として､性別､身長､年
子負荷量が高く､累積寄与率より第３因子までで全体の
齢の違いに関わりなく､標準的な体型からの隔たりを評
約50％の分散が説明された｡
価できるという点で優れているため､肥満度を用いた｡
しかし､現在､幼児の体格と生命予後に関する資料は少
考
なく､幼児の理想的な体格の定義はされていない｡本研
察
究の対象者の肥満度と BMI との関係を調べた結果､肥
咀嚼に関する食行動調査については､肥満度が15％以
満度と BMI 間には高い相関(r＝0.973)が認められ､対
− 43 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
象者30名においては両方の指標から同様の結果が得られ
の咀嚼力を評価するためにはさらに広範にわたる調査を
るものと考える｡
行い､データを集積し､幼児の標準的な咀嚼スコアや咬
摂取可能食品については､ 1988年頃から補綴分野の領
合力､咬合平衡状況を調べ､評価の指標を作成すること
域で義歯装着者の咀嚼能力を評価する指標として使用さ
が必要である｡それらの指標を用いて幼児の咀嚼力と咀
れているものであるが､本研究はその方法に準じて幼児
嚼行動との関連性を明らかにすることで､食習慣の形成
用に食品を選択し､応用したものである｡摂取可能食品
期である幼児の食教育の基礎資料の一助とし､食習慣の
のテクスチャー試験による硬さと摂取難易度間に高い相
自立期から生涯に亘るまでの良好な食習慣の形成に寄与
関が認められたことは､摂取食品選択の物性的な妥当性
すると考えられる｡
を示すものと考えられた｡一方､第Ⅴ群については摂取
経験率が低い傾向がみられ､その地域の食文化的背景を
謝辞
考慮して検討する必要があると考えられる｡
咬合力とは咬合接触面に作用する圧縮力とされ､完全
本研究の調査の実施に多大なご協力を頂きました福岡
歯列を具える健常成人では平均約1,000Ｎといわれてい
県築上郡上毛町新吉富保育所の皆様方に深甚なる謝意を
る13｡咬合力は歯､歯周組織､顎骨､顎関節､筋などの
表します｡
顎口腔が正常な形態を維持し､本来の機能が営まれると
考えられ､幼児における咬合力解析は顎口腔構造の成長､
参考文献
発達段階と深く関わる｡幼児の正常咬合の実像は明らか
にされていないのが現状であるが､対象保育園児の咬合
１. 坂田利家：肥満症防止と治療における咀嚼の臨床的意義.
力は健常の成人の約25％∼37％に相当し､今後年齢に伴
日本味と匂学会誌, 13(2) 149-156, 2006
２. 坂田利家, 深川光司：咀嚼で駆動される中枢制御のエネル
い発達していくことが推測された｡
ギー代謝. 日本咀嚼学会雑誌, 11(2) 99-107, 2002
咀嚼力の評価について､咀嚼スコアと咬合力の関係を
みると相関が認められ､聞き取り調査による主観的評価
３. Sakata T, Yoshimatsu H, Masaki T, Tsuda K: Anti-obesity
actions of mastication driven by histamine neurons in rats.
と機器測定による客観的評価の一致性が確認された｡咀
Experimental Biology and Medicine, 228(10) 1106-1110,
嚼スコアと咬合力の値に一致性が認められたことは､摂
取可能食品の調査が幼児の咀嚼力を簡便に数値化でき､
2003
４. 松田秀人, 橋本和佳, 関哲哉, 吉田真琴, 増田拓也, 他７
その有用性を検証するものであった｡
名：咀嚼のインスリン分泌に及ぼす影響(第１報). 日本咀
嚼学会雑誌, 11(2) 141-145, 2002
年齢､肥満度､咀嚼スコア､咬合力および咀嚼に関す
る食行動調査項目の因子分析では､咀嚼行動と肥満度の
５. 松田秀人, 橋本和佳, 関哲哉, 滝口俊男, 山本司将, 他７
名：咀嚼のインスリン分泌に及ぼす影響(第２報). 日本咀
間に明確な関係は認められなかった｡それは食行動の蓄
積がまだ少ないと考えられる幼児を対象とし､また､肥
嚼学会雑誌, 11(2) 147-151, 2002
６. 斎藤寛子, 江田節子：高校生の咀嚼力と肥満・食習慣との
満児の人数が少なかったためと考えられる｡しかし､丸
関連. 山形県立米沢女子短期大学紀要, 37, 149-159, 2002
飲みすることがよくある､食事をあまり噛まないと回答
７. 富永一道, 安藤雄一：咀嚼力の評価における主観的評価と
した幼児や､咀嚼スコア､咬合力が低値を示した幼児､
客観的評価の関係. 口腔衛生会誌, 57, 166-175, 2007
さらには左右の咬合圧の差が大きいと思われる幼児がみ
８. 竹原順次, 本多丘人：成人男性集団における咀嚼機能の評
られた｡幼児期は咀嚼機能の発達期であり､吸啜から咀
価第１報チューインガム法による検討. 口腔衛生会誌,
嚼を開始するまでの機能獲得期と､乳歯列完成から混合
歯列を経て､永久歯が生えそろう成熟期に分類される14｡
50, 23-30, 2000
９. Leake JL: An index of chewing ability. J Public Health
Dent, 50(4) 262-267, 1990
2∼3歳頃にはすでに咀嚼側が存在し､ 4歳頃までにはそ
10. 平井敏博, 安斎隆, 金田洌, 又井直也, 田中收, 池田和博,
の特徴が確立されるが､その後の成長発育に伴い､咀嚼
内田達郎：摂取可能食品アンケートを用いた全部床義歯装
着者用咀嚼機能判定表の試作. 補綴誌, 32, 1261-1267,
15
運動は変化するとされている｡さらに､幼児期は咀嚼
1988
16
機能の習熟期ともいわれ､健全な成長発育を図る上で
この時期からの適正な咀嚼行動の変容が求められ､食習
慣の形成の重要性が示唆された｡
11. 伊藤善也, 奥野晃正, 村上優利香, 他９名：肥満度判定の
ための幼児標準身長体重曲線. 小児保健研究, 55(6) 1996
12. 杉浦令子, 坂本元子, 村田光範：幼児期の生活習慣病リス
本研究は対象保育園児の咀嚼に関する食行動を調査し､
咀嚼スコアや咬合力から咀嚼力を数値化してその実態を
クに関する研究.栄養学雑誌, 65(2) 67-73, 2007
13. 服部佳功, 佐藤智昭：咬合力測定に基づく咬合診断の可能
明らかにしたもので､幼児の咀嚼に関する資料として貴
重な知見を得ることができたと考えられる｡今後､幼児
性. 顎機能誌, 12, 12-16, 2005
14. 田村康夫：咀嚼筋活動からみた小児の咀嚼発達. 顎機能誌,
− 44 −
The masticatory score and the occlusal force based on the textural properties of food for infants
16. 小松崎明, 末高武彦：透過レーザー法による咬合平衡状況
13, 11-15, 2006
15. 斎藤一誠, 早崎治明, 中田志保, 岩瀬陽子, 中田稔：乳児
歯列小児と成人女性における咬合相の運動経路. 顎機能誌,
9, 13-29, 2002
− 45 −
を指標とする咀嚼機能評価法に関する研究−乳歯列期の評
価方法について−. 口腔衛生会誌, 53, 221-226, 2003
腸内環境からみた子どもの食と健康
徳井
教孝１・三成
由美２
１産業医科大学健康予防食科学研究室
２中村学園大学栄養科学部
(2010年４月６日受理)
２) ライフコースアプローチ２
１) 子どもの体重の変遷
小児の成人病化が問題となって久しい｡特に小児肥満
ライフコースアプローチとは｢胎児期､幼少期､思春
は成人期の生活習慣病の要因となる可能性が高いと言わ
期､青年期およびその後の成人期における物理的・社会
れその対策が求められている｡文部科学省学校保健統計
的暴露による成人疾病リスクへの長期的影響に関する学
調査データから小児における肥満児の推移をみると､平
問｣と定義されている｡胎児期や幼少期の社会環境要因
成に入った頃から小学生､中学生､高校生の肥満者の割
が成人期にどのような影響を及ぼすのか､長期的な観点
合が多くなってきている｡小学校では､肥満者の割合が
からリスク要因をさぐる学問である｡この考えの基本は
1.5％∼2.0％の範囲で推移していたものが､平成に入っ
成人疾病胎児起源仮説といわれる｡子宮内での成長およ
てから２％を超え３％に迫る勢いで増加傾向にある｡中
び発展の臨界期における栄養状態が身体システムの構造
学生､高校生も１％前後であった割合が1.5％前後まで
および機能をプログラミングすることで長期的に成人疾
増加している｡興味深いことに平成に入った時代の小学
病罹患リスクに関与するという仮説である (図１)｡上
生が幼児の時､すなわち昭和50年代後半の幼児の肥満者
記で述べた低出生体重児に例をとれば､低栄養状態で子
割合をみると減少傾向が見られる｡この現象の背景にあ
宮内発育が不十分で出生体重が低い児は標準出生体重児
るものは何か｡ Peter D Gluckman らは､日本における
に比べ､成人期の肥満や生活習慣病のリスクが高くなる｡
1980年から2004年までの出生体重の推移を検討して､肥
この理由として､胎児は子宮内での低栄養状態によって
満児割合と出生体重との関連を次のように推察してい
将来低栄養状態でも生存できるようにプログラミングさ
る１｡ 1980年代から日本の出生体重の平均値は減少傾向
れる｡しかし､出生後､予測以上に栄養状態が改善され
がみられるが､これは妊婦の喫煙や妊娠子癇の予防のた
ると､栄養摂取過多になり肥満を発症しやすくなるとい
めの体重維持などによるものである｡母親の食事制限に
うものである｡現在まで､ライフステージごとの生活習
よって胎児へ供給される栄養は減少する｡これによって
慣病の要因が検討されている (図２)｡胎児期ではこれ
出生体重は低下傾向を示すことになる｡実際､平成15年
まで述べたように低体重を初めとするストレス､妊娠中
の国民健康・栄養調査データをみると､ 1990年は低出生
の母親の健康状態など､乳児期では栄養過多の幼児食､
体重児の割合は6.3％であったが､その後漸増して2004年
キャッチアップ成長率､低成長､学童期では過食や足の
には9.4％まで増加している｡この低出生体重児の推移
長さなどである｡小児期の足の長さは循環器疾患のリス
と小学生の肥満児割合の関連をみると､ 1980年代から低
ク要因のマーカーといわれている３｡思春期では過食､
出生体重児が増加し彼らが小学生になる1990年代には小
運動不足､肥満､高血圧が成人期の生活習慣病リスク要
学生の肥満児割合が増加する傾向がみられた｡すなわち､
因となっている｡
低出生体重児が成長して小学生となるころには､彼らが
また､詳細な糖尿病､肥満､冠動脈疾患リスク､乳が
肥満児となる可能性が高いことを示唆する現象がみられ
んなどに関するライフコースアプローチ的な研究も報告
たわけである｡この現象を説明するために､最近ライフ
されている｡たとえば､日本の研究を例にとると糖尿病
コースアプローチという新しい考えが導入されている｡
では勤労者の糖尿病患者と非糖尿病患者､および病院の
糖尿病患者を対象にした断面研究では､成人期の糖尿病
患者と非糖尿病患者の出生体重が2500ｇ以下の割合を比
− 47 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
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図１
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ライフコースアプローチの仮説
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図２
ライフステージごとの生活習慣病の要因
較すると､それぞれ18.6％､ 9.8％と有意に糖尿病患者
小児の遺伝子まで影響する可能性を示唆するような研究
の方が低出生体重児の割合が高いことが判明した４｡肥
も行っている｡まだ､動物実験の段階であるが､親の子
満では上記に述べたように生態学的研究により1980年代
へのスキンシップが子のストレス反応を抑制する能力を
以降の日本の平均出生体重の減少とその後の小児の肥満
遺伝子レベルで影響することによって高めうることが報
割合が関連していることが示唆されている｡また冠動脈
告されている｡ DNA の配列に変化を起こさずかつ細胞
疾患リスクでは､石川県内の1965年から1974年までに生
分裂を経て伝達される遺伝子機能の変化やその仕組みを
まれた4626人 (男2198人､女2428人) を20歳になるまで
研究するエピジェネテｲクスという学問分野がこのよう
追跡を行い､出生体重が重いほど血圧､血清コレステロー
な知見をこれから提供してくれると思われる｡
５
ルは低いことを明らかにしている｡また､３歳から20
歳までの身長の伸び率が高いほど血圧､血清コレステロー
３) ライフコースアプローチと腸内細菌叢
ルは低い結果を示している｡
ライフコースアプローチ的な研究は小児の生活環境が
− 48 −
ライフコースアプローチでは幼少期のときの環境が将
腸内環境からみた子どもの食と健康
来の疾病リスクと関連をもつことに注目をおいているが､
いる14｡近年､前立腺がんの罹患率が急増しているがこ
幼少期にその基盤が形成されると考えられている一つが
の背景には､エクオール産生者の割合が低下しているこ
腸内細菌叢である｡腸内細菌叢は乳幼児ではその授乳や
とが推測されている｡我々は､福岡県下の幼児､ 20歳代､
食生活により多様性がみられるが､それ以後はその多様
50歳以上の３つの群でのエクオール産生者割合を比較す
性は縮小する｡その多様性の中で親子間の腸内細菌叢は
る予備調査を行った｡その結果､エクオール産生者の割
類似性が低く､個々人の腸内細菌叢を決定するのが授乳
合はそれぞれ､７％､ 21％､ 50％となり若年者ほど低い
や離乳食ではないかと考えられている｡また一度形成さ
ことが判明した (未発表)｡
れた腸内細菌叢は食生活が変化しても大きく変わらない
このようなライフステージ別にエクオール産生者の割
ことが多くの研究で報告されている｡そのため､腸内細
合が異なる理由は何か｡それがわかれば前立腺癌への対
菌叢の影響は長期間継続する可能性が高く､いかに健康
策も検討できる｡イソフラボンを含有する大豆加工品の
的な腸内細菌叢を形成していくのかが重要な課題となる｡
味噌や豆腐の摂取はエクオール値と関連がない15｡この
今後ライフコースアプローチ的な研究において腸内細菌
事実は､大豆加工品をいくら摂取してもエクオール産生
叢と健康の関連を研究することは大変意義があると考え
は期待できないということを意味している｡最近の疫学
られる｡
研究で魚摂取が前立腺がんリスクを低下させることが報
これまでライフコースアプローチと腸内細菌叢の関連
告されている16｡日本人はエクオール産生者の割合が欧
を検討した研究として､腸内細菌叢の中のビフィズス菌
米人に比べ高く､かつ魚介類の摂取も欧米に比べ多いと
と小児肥満の研究がある｡乳児期のビフィズス菌数と７
いう事実から､魚介類を含む海産物はエクオールの産生
歳時のその子の体重を比較すると､７歳時のときに過体
に関与している可能性があると考えられる｡
重の児は標準体重の児に比べ､乳児期のときのビフィズ
ス菌数が少ない６｡これまで母乳で育てられた乳児は腸
５) 腸内細菌叢の地域性
内細菌叢の中のビフィズス菌の割合が母乳で育てられて
いない児より高く､かつ肥満児が少ないという報告があ
腸内細菌叢がどのような状態であれば健康増進につな
る７,８,９｡これらの腸内細菌と脂肪代謝に何らかの関係
がるのか｡この課題を解決するための一つの方法として
が示唆されており､今後腸内細菌からみた肥満対策も検
䋨䋦䋩
討される可能性がある｡
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⑔ጟ⋵䌋↸
れによってその後ストレスに対して過剰な反応が引き起
こすことがある10,11 ｡反対に母子のスキンシップがある
とストレスには正常な反応を引き起こす｡この現象の機
序として､母子分離を行うことで子の腸内細菌叢が変化
䊎䊐䉞䉵
䉵䉴⩶䈱ഀ
ഀว
また動物実験であるが､乳児期に母子分離を行うとそ
を起こしそれがストレス反応に影響することが示唆され
ているが､その経路として､ ①サイトカインや菌体成分
による､ ②腸内細菌の作用によってつくられたアミン類､
䋱䌾䋲ᱦఽ
③腸内細菌の作用によってつくられた短鎖脂肪酸の影響
が示唆されている12｡
䋳䌾䋵ᱦఽ
図３沖縄県と福岡県の腸内細菌叢に占めるビフィズス菌の割合
４) ライフテージ別の腸内細菌叢
䠄䠂䠅
Ἀ⦖┴Iᮧ
⚟ᒸ┴䠧⏫
腸内細菌叢まで変化している可能性がある｡イソフラボ
ンの１種であるダイゼインは腸内細菌叢によって代謝さ
れエクオールが産生される｡このエクオールはエストロ
ங㓟⳦䛾๭ྜ
時代ともに小児の食生活が変化し健康増進に寄与する
ゲン活性が高い｡これまでの動物実験や疫学研究により､
エクオールが前立腺がん､乳がんの予防因子として期待
されている13｡しかし､エクオールは､ダイゼインを代
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䠏䡚䠑ṓඣ
謝する腸内細菌が存在しないと産生されない｡日本人で
は30％から50％の人がエクオール非産生者と報告されて
− 49 −
図４沖縄県と福岡県の腸内細菌叢に占める乳酸菌の割合
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
生態学的研究がある｡平均寿命が高い地域の住民とそれ
５. Miura K, Nakagawa H, Tabata M, Morikawa Y, Nishijo
より低い地域の住民について､腸内細菌叢を分析してそ
M, Kagamimori S.Birth weight, childhood growth, and
の違いをみるものである｡この研究方法では２つの地域
cardiovascular disease risk factors in Japanese aged 20
で腸内細菌叢に差が認められても､すぐに腸内細菌叢と
長寿の因果関係があるとは結論できない｡しかし､腸内
years. Am J Epidemiol. 2001 Apr 15;153(8):783-9.
６. Kalliom ki M, Collado MC, Salminen S, Isolauri E. Early
differences in fecal microbiota composition in children
細菌叢と健康との関連を検討するための基礎資料として
may predict overweight. Am J Clin Nutr. 2008 Mar;
価値がある｡そこで､日本の長寿地域として沖縄県 I 村
87(3):534-8.
を取り上げ､福岡県Ｋ町と比較することにした｡両県と
７. Owen C, Martin R, Whincup P, Smith D, Cook D. The
も乳幼児を対象に採便し腸内細菌叢を分析して､その特
effect of infant feeding on the risk of obesity across the
life course: a quantitative review of published evidence.
徴を検討した｡今回は健康に何らかの利益をもたらす機
能があるビフィズス菌と乳酸菌について１歳∼２歳児､
Pediatrics 2005;115:1367-77.
８. Kalliom ki M, Salminen S, Arvilommi H, Kero P,
３歳∼５歳児の２群に分類して比較をした｡ビフィズス
Koskinen P, Isolauri E. Probiotics in primary prevention
菌については､沖縄県が福岡県の約６倍と高い値を示し
of atopic disease: a randomized placebo-controlled trial.
た｡なぜ､沖縄県は福岡県に比べ非常に高い値を示した
Lancet 2001;357:1076-9.
のか｡これほどの差がでるような食生活の差がみられる
９. Harder T, Bergmann R, Kallischnigg G, Plagemann A.
のか｡今後これらについて検討する必要がある｡乳酸菌
Duration of breastfeeding and risk of overweight: a
に関しては､逆に福岡県の割合が高くなった｡ビフィズ
ス菌､乳酸菌とも年齢の増加とともに割合は減少する傾
meta-analysis. Am J Epidemiol 2005;162:397-403.
10. Levine S, Huchton DM, Wiener SG, Rosenfeld P. Time
course of the effect of maternal deprivation on the hy-
向がみられた｡
pothalamic-pituitary-adrenal axis in the infant rat. Dev
腸内細菌叢は乳児のときにその原型が形作られ､以後
Psychobiol. 1991 Dec;24(8):547-58.
食習慣が変化してもあまり変わらないとされている｡こ
11. Meaney MJ, Aitken DH, van Berkel C, Bhatnagar S,
の点についてはさらに検討する必要があると思われるが､
Sapolsky RM. Effect of neonatal handling on age-related
もしそうだとすれば､長寿地域では幼児の時から腸内細
impairments associated with the hippocampus. Science.
菌叢の中で健康増進効果があるとされるビフィズス菌が
他地域に比べはるかに多いことが示唆される｡腸内細菌
1988 Feb 12;239(4841 Pt 1):766-8.
12. Sudo N, Chida Y, Aiba Y, Sonoda J, Oyama N, Yu XN,
Kubo C, Koga Y. Postnatal microbial colonization
叢を決定づける乳児の食生活がどのように異なるのか､
programs the hypothalamic-pituitary-adrenal system for
それを明らかにしていくことで､成人期の疾病リスク要
stress response in mice. J Physiol. 2004 Jul 1;558(Pt 1):
263-75. Epub 2004 May 7.
因を保有し始める小児期からの健康なライフスタイルの
形成を目指すことができる｡そのような食生活を食育活
13. Ingram D, Sanders K, Kolybaba M, Lopez D. Casecontrol study of phyto-oestrogens and breast cancer.
動に取り入れることでより健康増進に結びつく活動が推
進できると考えられる｡
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− 50 −
原著論文
福岡県児童における食育推進のための魚介類摂取の意識・嗜好の地域差
大仁田
あずさ＊１・三成
由美＊１・徳井
教孝＊２・内山
文昭＊３
＊１中村学園大学 (〒814 0198 福岡市城南区別府5 7 1)
＊２産業医科大学 (〒807 8555 北九州市八幡西区医生ヶ丘1 1)
＊３中村学園大学大学院 (〒814 0198 福岡市城南区別府5 7 1)
(2010年４月１日受理)
キーワード
魚介類､小学生､アンケート､摂取頻度､嗜好､調理法
summary
児童の食生活や健康状態において､魚嫌いや魚離れに関する情報が氾濫しているが､実際に児童の魚離れや魚介類に関する報告は少な
い｡そこで､児童の魚介類に対する意識・嗜好の実態を明らかにすることを目的に､生活環境の異なる市街部と農村部で調査を行い､比
較検討したので報告する｡対象および調査期間は市街部Ｆ市10校の５・６年生の児童1,082名 (2002年10月∼11月)､農村部Ｕ郡17小学校
の５・６年生の児童1,183名 (2003年６月∼７月) である｡調査は無記名の自記式質問紙調査法にて実施したものを基礎データとした｡
調査項目は､児童の食意識､魚介類のイメージ､摂取状況､栄養知識､知名度､嗜好等である｡解析は､クロス集計を行い､ χ２検定を
用いた｡魚介類の嗜好に関しては１％レベルで有意差が認められ､魚が嫌いな児童は市街部に比べ農村部が高い数値を示し15.3％､ 17.5
％であり､嫌いな理由は骨がある､くさい等であった｡児童の魚介類の栄養知識は､農村部に比べ市街部が有意に高値を示したが､科学
的根拠のない情報を得ている事が伺えた｡魚嗜好のイメージでは両地域で共通して､おいしさと食べやすさの要因が深く影響していた｡
また､魚介類の摂取頻度や調理法の知識やその食体験に地域差は認められなかった｡本研究において､市街部と農村部の児童に大きな差
は認められず､魚はおいしいというイメージを持ち､魚が嫌いな児童は少ないという結果を得た｡また国民栄養調査､食品群別摂取量の
魚介類の年次推移よりも､魚離れが急に起こっているとは考えにくい事が示唆された｡
Regional Difference of a Survey on Awareness and Preference of Fish and Shellfish
Intake for Promoting Food and Nutrition Education by Elementary School Children
in Fukuoka Prefecture
Azusa OHNITA＊１, Yoshimi MINARI＊１, Noritaka TOKUI＊２, Fumiaki UCHIYAMA＊３
＊1
Nakamura Gakuen University, 5-7-1, Befu Jounan-ku Fukuoka-shi, Fukuoka, 814-0198
＊2
University of Occupational and Environmental Health, Japan,1-1,Iseigaoka yahatanishi-ku kitakyusyu-shi, Fukuoka, 807-8555
＊3
Graduate School of Nutritional Sciences, Nakamura Gakuen University, 5-7-1, Befu Jounan-ku Fukuoka-shi, Fukuoka, 814-0198
Key word: fish, elementary school children, questionnaire, method frequency of intake, food preference, cooking method
summary
Nutrient intakes according to age classes including schoolchildren in the national nutritional survey in fiscal 2000 showed an
insufficient carbohydrate intake and an excessive fat intake in children aged 7-14 years. This problem may be solved by recommending intakes of rice as a staple and cereals and forming the habit of having Japanese low-fat dishes consisting of fish and shellfish as a main side dish, soybean products, and vegetables. As a basic study to improve reduced fish intake and form healthy
dietary habits involving fish, we developed a dietary education program for the formation of a proper defecation habit by
Japanese-type medicated diets" using the precede/proceed model as a behavioral change model developed by Green, L.W. et al. in
the U.S., and evaluated its effects. An awareness/present status survey of fish and shellfish was performed in 1,082 children in the
5th/6th years of primary school in urban areas and 1,183 in rural areas in F Prefecture. No regional differences were observed.
Of all children, 66% considered fish delicious, suggesting that fish is their favorite food.
− 51 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
ても検討し､さらに､効果的な食教育を考察する基礎資
緒
言
料とすることを目的とした｡
将来にわたる食行動､食習慣に大きな影響を与える学
方
法
童期は､自分の意思により､食事の内容や選択する機会
が増えるとともに､自己管理能力の育成が期待される重
(1) 調査対象
要な時期である｡
市街部として､福岡市の市街地にある公立小学校10校
近年､社会環境の多様化により､児童を取り巻く食環
に通う５,６年生の児童1082名と農村部として福岡市か
境が大きく変化し､偏食､過食､朝食の欠食等による肥
ら車で90分の距離にある面積の約75％が森林､耕地で農
満の増加や生活習慣病の若年化等､健康問題と関連のあ
業の盛んな２つの町の公立小学校17校に通う５,６年生
る食生活が問題視されていることが伺える１∼７｡平成18
の児童1183名を調査対象とした｡
年国民健康・栄養調査結果によると､年齢階級別栄養素
等摂取量の７∼14歳では､たんぱく質が推奨量に比べ高
(2) 調査期間
調査期間は市街部が2002年10月下旬から11月中旬､農
値を示し､脂肪エネルギー比も同様に目標量に比べ男女
ともに高い数値を示していた１｡
村部が2003年６月中旬から７月上旬である｡
これら食生活の解決策の一つは､主食である米飯と魚
介類､大豆製品､野菜類などを取り入れた低脂肪の和食
(3) 調査方法
を食べることの習慣化だと考えられる｡特に主菜になる
児童の魚介類に関する意識・実態調査票を作成し､各
魚介類は､優れたたんぱく質源として日本人の食生活
学校の学級担任を通じて児童に配布後､無記名の自記式
には不可欠な食品であり､また脂質栄養学上においても
質問紙調査法にて実施したものを基礎データとした｡
重要な食品である｡厚生労働省から発表された｢日本人
の食事摂取基準2005年版｣においても増やすべき栄養素
(4) 調査内容
として n-3 系脂肪酸の目標量が新たに設定され８､魚介
調査内容は､｢属性｣､｢食意識｣､｢魚介類に対する実
態｣､｢魚介類に対する知識｣､｢魚介類に関する知名度､
類の摂取が重要視されている｡
魚介類に関する調査では､児童の食物嗜好と学校給食
食経験､嗜好度｣､｢魚介類の調理法に関する知名度､食
の関連性について検討した結果､学校給食で魚介類を用
経験､嗜好度｣の６項目に大別した｡｢魚介類に対する
いた料理は嗜好度が低く９､また､児童の魚介類摂取量
実態｣を把握するための指標として､魚介類に対する
については漸減傾向にあり､朝夕食では魚類より肉類を
｢嗜好｣､｢摂取頻度｣､｢嗜好と摂取頻度の関連｣､｢嗜好
摂取し､肉食嗜好がやや高いことを報告している10｡特
とイメージの比較｣､｢家庭における魚介類の購入状況と
に､魚嗜好の地域差をみた調査では､戸塚らや宮寺らは
廃棄方法｣を設定した｡また､｢魚介類に対する知識｣
幼児を､星野らは女子学生を対象に農山村､大都市､臨
の指標として､魚介類の｢旬に関する知識｣､｢鮮度の見
海都市の各都市別に分け､魚介類の嗜好の地域差をみた
分け方に関する知識｣､｢栄養､働きに関する知識｣を設
ところ､いずれの調査においても大都市で魚介類の嗜好
定した｡｢魚介類に関する知名度､食経験､嗜好度｣に
度が最も高く､地域の違いにより魚介類の嗜好が異なる
ついては､おさかな普及協会のインターネットホームペー
ことを報告している11∼13｡
ジ｢フィッシュワールド｣で行っているアンケートの中
魚介類に関して浜崎らは､魚介類に含まれるドコサヘ
の魚介藻類を参考に41種類をあげ､その魚介類の中から
キサエン酸 (DHA) は攻撃性を抑える働きがあり､魚
｢知っている｣､｢食べたことがある｣､｢食べたことがあっ
を食べなくなったことも子どものキレる要因になってい
て好き｣について複数回答を求めた｡また､魚介類の調
ると指摘するなど14､児童の魚離れ・魚嫌いに関する情
理方法は､生；｢刺身｣､焼く；｢塩焼き｣､｢みそ焼き｣､
報も多くいわれている｡
｢バター焼き｣､煮る；｢につけ｣､｢味噌煮｣､｢揚げ煮｣､
しかし､平成９年∼平成18年国民栄養調査の食品群別
蒸す；｢蒸し物｣､揚げ物；｢から揚げ｣､｢衣揚げ｣､｢フ
摂取量の７∼14歳の年次推移をみると､魚の摂取量は60
ライ｣､その他；｢酢の物｣の中から該当する項目につい
ｇ前後とほぼ横ばいであり７､児童の魚離れが進行して
て複数回答を求めた｡
いるとは考えにくい｡
本研究では､児童の魚介類に関する意識､嗜好､摂取
(5) 解析方法
量などの実態を明らかにするために､生活環境の異なる
魚介類の意識､嗜好の実態項目ごとに単純集計､クロ
市街部と農村部について調査を行い､その地域差につい
ス集計を行い､２項目間の関連性についてはχ２検定を
− 52 −
福岡県児童における食育推進のための魚介類摂取の意識・嗜好の地域差
行い､危険率５％をもって有意とした｡
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結
果
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調査票の回収率は市街部95.7％で1035名より､農村部
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98.4％で1164名より回答が得られた｡
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(1) 児童の属性
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調査対象児童の属性を表１示した｡市街部の５,６年
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の男子507名 (49.1％)､女子526名 (50.9％) で､農村
図１−１食事をする目的
部は男子590名 (50.7％)､女子574名 (49.3％) であり､
両地域とも男女比がほぼ同一割合で地域による差は認め
られなかった｡家族構成について､核家族と祖父母と同
居している拡大家族を比較した結果､拡大家族と答えた
児童が市街部21.1％､農村部66.8％であり､農村部が市
街部に比べ有意に高い割合を示していた(p＜0.01)｡次
に､母親の就労状況について調査した結果､母親の就労
｢あり｣と回答した児童は､市街部62.3％､農村部69.7
％であり､地域差は認められなかった｡た｡
(2) 児童の食意識
１) 食事をする目的
児童の食事をする目的として､｢おなかがすくから｣､
｢生きるために｣､｢おいしいから｣､｢ただなんとなく｣､
｢その他｣のいずれかを選択させた結果を図１−１に示
図１−２魚介類に対するイメージ
した｡｢生きるため｣と答えた児童が市街部62.1％､農
村部57.5％と高い数値を示し､次いで｢おなかがすくか
魚介類に対するイメージでは､魚は美味しく､また､く
ら｣､｢おいしい｣からの順であり､市街部､農村部によ
さい食品であるというイメージを持っていることが伺え
る差は認められなかった｡
た｡
２) 魚介類に対するイメージ
児童の魚介類に対するイメージについて５段階法で６
(3) 児童の魚介類に対する実態
１) 魚介類に対する嗜好
項目について調査した結果を図１−２に示した｡児童の
児童の魚介類に対する嗜好について､｢大好き｣､｢好
表１
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き｣､｢どちらでもない｣､｢嫌い｣､｢大嫌い｣の５項目に
調査対象児童の属性
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ついて図２−１に結果を示した｡魚介類を好む児童は市
街部で58.2％､農村部52.7％であり､逆に､魚介類を嫌
う児童は市街部15.3％､農村部17.5％であった｡農村部
に比べ市街部に住む児童は魚介類に対する嗜好が有意に
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高かった (p＜0.01)｡
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臭い｣､｢皮がある｣､｢口ざわりや舌ざわり｣､｢おいしく
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２に示した｡市街部､農村部の両地域において､地域差
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は認められず､｢骨がある｣が高い数値を示し､市街部
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児童が魚介類を嫌う理由として､｢骨がある｣､｢味・
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ない｣､｢その他｣の６項目について調査した結果を図２−
53.8％､農村部55.9％であった｡次に､魚介類を嫌う理
由として､｢おいしくない｣､｢味・臭い｣､｢皮がある｣
の順であった｡
− 53 −
薬膳科学研究所研究紀要
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第３号
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図２−１児童の魚介類に対する嗜好
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図３児童の魚介類に対する摂取頻度
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農村部で61.4％であった｡逆に､｢大嫌い｣と答えた児
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童が､｢３日に１回以上｣摂取する割合は､市街部で39.3
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％､農村部30.0％であった｡両地域ともに､魚介類を好
きな児童ほど摂取する頻度が高く､逆に嫌いな児童ほど
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摂取する頻度が低いことが伺えた｡
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４) 魚介類の嗜好とイメージの比較
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児童の魚介類の嗜好とイメージとの関連について比較
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した結果を図５に示した｡市街部､農村部ともに､魚介
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図２−２児童が魚介類を嫌う理由 (複数回答)
類を好きな児童はイメージが良く､嫌いな児童において
は悪いイメージ持っている傾向が伺えた｡好きな児童に
２) 魚介類に対する摂取頻度
おいては､特においしいというイメージを持っており､
児童の１週間における魚介類の摂取頻度を検討するた
嫌いな児童においては特にくさい､食べにくいというイ
メージを持っていることが伺えた｡
めに､｢１日に２回以上｣､｢１日１回｣､｢２∼３日に１
５) 家庭における魚介類の購入状況
回｣､｢４∼５日に１回｣､｢１週間に１回｣､｢食べない｣
の６項目について調査した結果を図３に示した｡１日に
児童の家庭における魚介類の購入状況について図６−
１回以上食べる児童は市街部14.0％､農村部16.6％であ
１に示した｡市街部の児童においては｢魚まるごと１匹｣
り､３日に１回以上摂取している児童は､市街部が54.6
と回答した割合が最も高く､次いで｢切り身｣､｢内臓・
％､農村部が55.5％であり､地域による差は認められな
うろこをとったもの｣の順であった｡農村部では､｢切
かった｡
り身｣､｢魚まるごと１匹｣､｢内臓・うろこをとったもの｣
３) 魚介類に対する嗜好と摂取頻度の関連
の順であった｡市街部より農村部が下処理済みの魚介類
児童の魚介類に対する嗜好と摂取頻度の関連を図４に
を購入していることが伺えた｡
示した｡魚介類が｢大好き｣と回答した児童が｢３日に
６) 家庭における魚介類の廃棄方法
１回以上｣魚介類を摂取する割合は､市街部で65.9％､
児童の家庭における魚介類の廃棄方法の調査結果を図
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図４
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児童における魚の嗜好と摂取頻度の関係
− 54 −
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福岡県児童における食育推進のための魚介類摂取の意識・嗜好の地域差
６−２に示した｡廃棄方法で､魚介類の皮､内臓､骨を
り､農村部で28種類であった｡知名度の高い食品は市街
｢捨てる｣と答えた児童が市街部56.8％､農村部47.4％
部で､あさり､あじ､さんまであり､農村部で､かに､
と最も高い数値を示していた｡一方､｢調理して食べる｣､
たこ､さけの順であった｡また､両地域ともに知名度が
｢動物のえさにする｣といった食品の再利用や､｢土や肥
低いものは､メルルーサ､さわら､たちうおなどであり､
料にする｣といった環境を考慮した項目は低い数値を示
これらは学校給食の献立として出ているにもかかわらず､
していた｡
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㪈㪏㪅㪌㩼
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(4) 児童の魚介類に対する知識
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１) 魚介類の旬に関する知識
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児童における魚介類の旬に関する知識を図７に示した｡
魚介類の旬を｢知っている｣と答えた児童は､市街部67.9
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％､農村部51.2％であり､農村部に比べ市街の児童の方
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が知識度が有意に高かった (p＜0.01)｡
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２) 魚介類の鮮度の見分け方に関する知識
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図６−１児童の家庭における魚介類の購入状況
児童における魚介類の鮮度の見分け方に関する知識の
結果を図８に示した｡両地域ともに知識度の高かった項
目は､｢つやがある｣､｢身がぶよぶよしていない｣､｢目
ᝥ䈩䉎
が澄んでいる｣であり､その他の項目については､ 50％
以下と低値を示していた｡
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３) 魚介類の栄養・働きに関する知識
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児童の魚介類の栄養・働きに関する知識の結果を図９
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に示した｡児童の知識の理解度の高いものは､｢頭が良
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䉒䈎䉌䈭䈇
くなる｣､｢カルシウムが多い｣､｢血がさらさらになる｣
という項目であった｡また､家庭科の授業で習った､魚
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はたんぱく質が多いという知識を知っている児童は市街
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部で44.1％､農村部で33.0％であった｡マスメディアや
図６−２児童の家庭における魚介類の廃棄方法
魚の歌などの媒体の影響によるためか､科学的根拠のな
い魚介類の情報を得ていることが伺えた｡
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(5) 魚介類に関する知名度､食経験､嗜好度
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児童の魚介類に関する知名度を図10に示した｡知名度
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で80％以上占めたものは41種類中､市街部で30種類であ
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図７児童における魚介類の旬に関する知識
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図５
児童の魚介類の嗜好とイメージ
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図８児童における魚介類の鮮度の見分け方に関する知識
(複数回答)
− 55 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
魚名を知らない児童の割合が高かった｡
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次に､魚介類の食経験では､ 80％以上の児童が食べた
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ことがあると答えた魚介類は､ 41種類中､市街部で17種
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類､農村部で11種類であり､さけ､かに､いか､その他
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大衆魚のいわし､あじ､さばなどであり､市街部の方が
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若干､食経験が豊富であることが伺えた｡また､相対的
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示しており､魚名は知っていても､食べたことのない児
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こが上位を占めていた｡その他の種類では大きな差は見
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ろ､のり､かにが好まれ､農村部では､かに､のり､た
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また､魚介類の嗜好度については､市街部では､まぐ
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にみると､食経験の割合が知名度より約15％低い数値を
童がいることも伺えた｡
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図９児童の魚介類の栄養・働きに関する知識
図10−１
図10−２
児童における魚介類の知名度
児童における食べたことのある魚介類
図10−３
児童における好きな魚介類
− 56 −
福岡県児童における食育推進のための魚介類摂取の意識・嗜好の地域差
また､魚介類の食経験では､地域間に差はなく､魚介
られなかった｡
類の知名度と同様の傾向を示していた｡
(6) 魚介類の調理法に関する知名度､食経験､嗜好度
魚介類の調理法に関する嗜好度では､児童が好む調理
児童における魚介類の調理法の知名度について図11に
法は､｢さしみ｣､｢塩焼き｣､｢唐揚げ｣､｢フライ｣､｢バ
示した｡地域間に差はなく､ 80％以上の児童が知ってい
ター焼き｣の順で､簡単に作れ､油を使った料理を好む
ると答えた調理法は､上位から｢さしみ｣､｢塩焼き｣､
傾向が伺えた｡
｢煮つけ｣､｢唐揚げ｣､｢フライ｣の順であった｡逆に知
名度の低いものは､｢揚げ煮｣､｢みそ焼き｣､｢蒸し物｣､
考
察
｢みそ煮｣であり､これらは日本の伝統的な調理法であっ
た｡
近年､食生活における国民の健康志向が強まり､水産
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図11−１ఽ┬䈮䈍䈔䉎㝼੺㘃䈱⺞ℂᴺ䈱⍮ฬᐲ
児童における魚介類の調理法の知名度
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図11−２
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図11−３
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児童における魚介類の好きな調理法
− 57 −
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薬膳科学研究所研究紀要
第３号
魚介類が嫌いな児童では､その理由として､｢骨があ
物､特に魚介類の優れた栄養的特性が注目されるなど､
食と健康に関する関心が高まっている15,16 ｡水産資源が
る｣､｢味｣､｢臭い｣､｢皮がある｣等があげられ､戸塚ら
豊富な日本において､魚介類は国民の良質なたんぱく源
の幼児の調査と11同様の結果であった｡このことから､
であり､脂質栄養学上､重要な食品である｡
今後､児童の魚嫌いを緩和するためには､魚介類の下処
しかし､魚介類に関する調査では､学校給食の献立か
ら児童の魚介類摂取状況と嗜好について検討した結果､
理､調理方法の工夫をすることが重要であると思われる｡
そして､児童に対して､おはしの持ち方､使い方､特に
９
渡部らは魚介類を用いた料理は嗜好度が低く､加賀谷
魚の骨を上手に取る食べ方についても指導の必要性があ
らは､魚介類の摂取状況が減少していると報告してい
ると感じられた｡
10
る｡このように児童の食生活において魚嫌いや魚離れ
志垣らは､大学生を対象にした調査で､夕食における
に関する情報が多くいわれているが､実際に実態調査を
魚介類の摂取頻度で｢週に３∼４回以上｣と答えた割合
行ない､魚離れの現状を明らかにし検討した報告は少な
が50.5％を占め､国民栄養調査による魚介類の摂取頻度
い｡
割合より多かった20と報告している｡児童を対象にした
そこで､本研究では､生活環境の異なる福岡県内の児
童2,265名を対象に､魚嫌い､魚離れの食行動の実態を
本調査においては､大学生に比べ､若干､摂取頻度が少
ない傾向が伺えた｡
明らかにするために､魚介類の意識・実態調査を実施し､
検討した｡
魚介類の栄養に関する知識については､児童はマスメ
ディアや媒体による影響のためか､科学的根拠のない情
児童を対象とした本調査の結果では､魚に対するイメー
報を得ていることが伺えた｡また､児童は魚名は知って
ジは､おいしい､くさい､食べにくい食品であり､坂本
いるが､実際に自分の食べた魚料理の魚名が分からない
らの児童の調査の味は､おいしいというイメージを持ち､
等､いまや加工品の普及により､フライや切り身の魚ば
匂いについては悪印象を持っていたとの結果と一致して
かりで丸のまま食卓へ上がることが少なくなっているか
いた17｡また､本研究では､魚の嗜好とイメージの比較
らではないかと考えられる｡
で､魚介類を好きな児童は､おいしいと良いイメージを
魚介類の旬に関する知識度では､市街部に比べ農村部
持ち､嫌いな児童は､臭い､食べにくいという悪いイメー
が低く､魚の旬を知っている児童が少ないということは､
ジを持っていたことが伺えた｡
冷凍技術の発展に伴い､漁獲された魚をすぐに冷凍でき
魚介類の嗜好に関する調査で､戸塚らは､魚介類は幼
11
児の69.1％に好まれ､好きな食品であると報告してお
るようになり､季節にかかわらず､食卓に並べることが
できるようになったと考えられる｡
り､本研究の児童を対象にした調査で､魚介類が好きな
社会環境が多様化し､経済・流通が発展したためか､
児童は市街部58.2％､農村部52.7％の結果と比較すると､
魚介類及び調理法の知名度､食経験､嗜好度の項目で地
幼児の方が魚介類に関する嗜好度が高いことが示唆され
域差は認められず､また児童はまぐろ､甘えびを好むと
た｡児童を対象にした調査で､山本らは､魚介類は児童
いった高級魚志向にあることも伺えた｡児童は､蒸し煮､
の28％に嫌われている18と､また､加賀谷らは､それよ
みそ焼きといった日本の伝統料理よりも､塩焼き､フラ
10
り低値の12％の児童が魚介類が嫌いであると報告して
イなど簡単に作れ､油を多く使った調理法が好まれてい
いる｡本研究においても､魚介類を嫌いな児童の割合は､
たことも示唆された｡
両地域ともに17％前後と低い値を示していることからも､
これらの結果より､児童に魚を普及させるためには､
現在､問題視されている児童の魚嫌いの現状は伺えなかっ
魚介類の栄養・知識､日本料理の魚のおいしさ､環境の
た｡魚介類が嫌いといわれている現状は､肉類と比較し
負荷低減にむけた食材の購入・選択・調理方法､食べ方､
て魚介類は嫌いだと捉えられていたり､高齢者と比較し
そして後片付けなどを取り入れた食教育が必要であると
て魚介類の摂取量が低いことが原因ではないかと考えら
考えられた｡
れる｡
しかし､一方では､小林らの調査で児童の食嗜好は､
まとめ
肉食傾向が強くなり､魚中心の食事が減少している19と
報告されている｡このことは､社会情勢の変化に伴い､
魚介類は､日本人に重要なたんぱく質であるが､児童
いわゆる魚好きな高齢世代のいない若い世代中心の核家
の魚嫌いが問われているため､その現状を明らかにする
族が増加したことや､魚を触れるのが嫌いである､魚介
ために魚介類についての嗜好や意識の現状について調査
類を用いた調理は手間がかかるなどの理由により魚料理
を行った｡また､市街部と農村部の地域の違いについて
が食卓へ上る頻度が少なくなったからではないかと考え
も､児童を対象に検討した｡
られる｡
１) 児童の食事をする目的は､｢生きるため｣が約60％
− 58 −
福岡県児童における食育推進のための魚介類摂取の意識・嗜好の地域差
今後､児童が魚をよりおいしく､健康に食べるために
と最も多く､次いで｢おなかがすくから｣､｢おいしい
は､魚の鮮度の見分け方､臭みの取り方､日本料理､魚
か｣の順であり､地域差は認められなかった｡
２) 魚のイメージでは､地域差は認められず､おいしい､
の骨を上手にとる食べ方､魚の正しい栄養・働きを含め
た食教育の必要性を感じた｡特に､児童および保護者に
くさい､食べにくい食品であると思われていた｡
３) 魚の嗜好調査において､魚が嫌いな児童は市街部で
魚介類と健康についての関わりを理解させ､魚介類に対
15.3％､農村部で17.5％であり､いずれも嫌いな理由
する関心や正しい栄養知識の普及を図る指導の対策が必
として骨がある・味・臭いが比較的多く地域間に差は
要であると考えられた｡
認められなかった｡
４) 魚の摂取頻度では､３日に1回以上魚を摂取してい
謝
辞
る児童は市街部で54.6％､農村部で55.5％であり､地
域による差は認められなかった｡
稿を終えるにあたり､調査にご協力いただきました福
５) 魚介類の摂取頻度と嗜好の関係では､両地域ともに､
魚介類が好きな児童ほど､摂取する頻度が高い傾向が
岡県内の各小学校の先生､対象児童の皆様に深く感謝申
し上げます｡
伺えた｡魚介類の嗜好とイメージの比較においては､
また､論文をまとめるにあたり､御助言や御指導を賜
魚介類を好きな児童はおいしいという良いイメージを
りました先生に厚く御礼申し上げます｡
持ち､嫌いな児童はくさい､食べにくい等悪いイメー
ジを持っていた｡
最後にこの研究の集計にご協力いただいた中村学園大
学家政学部食物栄養学科卒業生の江口紗綾香さん､小池
６) 家庭における魚介類の購入・廃棄方法では､市街部
より農村部の方が下処理済みの魚介類を購入する割合
賢一さん､白井絵美さん､原恵理香さんに心から感謝致
します｡
が高かった｡廃棄方法では｢皮・内臓・骨を捨てる｣
本研究は､平成14年４月∼平成16年３月文部科学省科
と回答した児童が最も多く､逆に､食品の廃棄物を再
学研究費の｢児童における魚介類の環境調和型食教育プ
利用する家庭が少ないことが伺えた｡
ログラムの開発とその評価 (主任研究者・三成由美)｣
７) 魚介類の旬に関しては､農村部より市街部が知識度
の一環として実施された一部を報告する｡
が高く､鮮度の見分け方では､両地域ともに知識度は
低く､つやを見る見分け方以外は50％以下と低い数値
文
献
を示していた｡
８) 魚介類の栄養・働きに関する知識では､家庭科など
１. 健康・栄養情報研究会編：国民栄養の現状−平成18年国民
栄養調査結果−､第一出版､東京67∼71 (2009)
で習う基本的な栄養・働きよりもマスコミでいわれて
２. 福原桂､田辺由紀､金子佳代子､石井荘子､坂本元子：小
いる科学的根拠のないものを間違って理解していた｡
学生の食生活及び食に関する意識・知識の発達的変容 (第
９) 児童の80％以上が知っている魚介類は41種類中､市
１報) ４年生から６年生における発達的変容､日本家政学
街部30種類､農村部28種類であり､地域差は認められ
ず､いわし､あじなどの大衆魚の知名度が高かった｡
会誌､
51､ 605∼612 (2000)
３. 大木薫､稲山貴代､坂本元子：幼児の肥満要因と母親の食
また､食経験のある魚種は知名度の結果とほぼ同様で
意識・食行動の関連について､栄養学雑誌､ 61､ 289∼298
(2003)
あったが､相対的にみると､知名度より約15％低い数
値を示しており､魚名は知っているが､食べたことは
４. 石永正隆､望月てる代､上田愛子､市育代､七枝美香､小
田光子､岸田典子：肥満児と非肥満児における脂肪酸､コ
ない魚介類があることが伺えた｡嗜好度の高い魚介類
レステロールおよび植物ステロールの１日摂取量､日本栄
は､両地域ともに､かに､のりなどであり､市街部に
おいては､まぐろが高い数値を示していた｡
養・食糧学会誌､
54､ 291∼296 (2001)
５. I.Villa Elizaga, J.I.Gost Garde, R.Elcarte Lopez: Child nu-
10) 魚介類の調理法では､知名度､食経験ともに｢さし
trition and cardiovascular risk, Diary Products in Human
み｣､｢塩焼き｣､｢煮つけ｣､｢フライ｣､｢からあげ｣の
Health and Nutrition (1994)
６. 白木まさ子､深谷奈穂美：小学校の食生活状態と自覚症状
割合が高く､逆に日本の伝統料理である｢みそ煮｣､
について､栄養学雑誌､ 51､ 11∼21 (1993)
｢みそ焼き｣､｢揚げ煮｣､｢蒸し物｣は低い数値を示し
ていた｡児童が好む魚介類の調理法は､知名度､食経
験の結果と同様に簡単に作れ､油を多く使った調理法
７. 山本由喜子：小学生の体位と生活活動及び食事内容の関連
性､栄養学雑誌､ 63､ 235∼240 (2005)
８. 第一出版編集部編：厚生労働省策定
の割合が高く､地域間に差は認められなかった｡
日本人の食事摂取基
準 (2005年版)､第一出版､東京､ p.54∼56 (2005)
以上の結果より､児童はおいしいというイメージを持
９. 渡部由美：小学校児童の食物嗜好と学校給食の関連性につ
いて､栄養学雑誌､ 47､ 31∼40 (1989)
ち､魚嫌いという現状は伺えなかった｡
− 59 −
薬膳科学研究所研究紀要
第３号
書店､東京､ p.2 (1994)
10. 加賀谷みえ子､福谷祥子､木村友子：児童の魚嗜好と食生
16. 21世紀の水産を考える会編：魚離れへの挑戦､成山堂書店､
活の関連､椙山女学園大学研究論集､ 24､ 463∼475 (1993)
東京､ p.2∼10 (1993)
11. 戸塚清子､峯木真知子､井戸明美：魚介類およびその料理
に対する全国保育園児の嗜好とそれに影響する要因､日本
17. 坂本友子：魚料理の嗜好に関する調査､九州女子大学紀要､
28､ 55∼62 (1992)
調理科学会誌､ 34､ 205∼213 (2001)
12. 宮寺里香､高橋淳子､峯木真知子､土屋明美：幼児の魚介
18. 山本隆子､西川貴子､清水典子：魚嗜好と関連因子､神戸
女子短期大学論攷､ 32､ 191∼209 (1987)
類に対する嗜好調査､聖セシリア女子短期大学紀要､ 22､
19. 小林幸子：女子高校生の体格別食意識と愁訴､栄養学雑誌､
51∼58 (1997)
45､ 197∼207 (1987)
13. 星野英子：女子学生の魚食嗜好について､甲南大学家政学
20. 志垣瞳､池内ますみ､小西冨美子､花
部紀要､ 27､ 81∼91 (1992)
14. 浜崎智仁：DNA で学級崩壊やキレの問題に迫れるか？､
憲子：大学生の魚
介類嗜好と食生活､日本調理科学会誌､ 37､ 206∼214
FOOD Style 21､ 4､ 51∼54 (2000)
(2004)
15. 21世紀の水産を考える会編：シーフードの新時代､成山堂
− 60 −
中村学園大学薬膳科学研究所紀要刊行規程
第１条
中村学園大学薬膳科学研究所 (以下｢本研究所｣という) は, 研究成果を発表するため, 研究紀要を刊行する｡
第２条
研究紀要は中村学園大学薬膳科学研究所紀要と称し, 英文名は Proceedings of PAMD Institute of Nakamura
Gakuen University とする｡
第３条
研究論文の研究紀要への投稿者は, 本研究所の運営委員, 研究所員および編集委員会が認めた者とする｡
第４条
研究紀要刊行のため, 本研究所に分子栄養学部門, 栄養疫学部門, 生体応答部門, 開発・教育部門の各部門長より構
成する編集委員会を置く｡
第５条
編集委員会の委員長は研究所長とする｡
第６条
投稿する論文の査読は各部門で行い, 査読責任者は部門長とする｡
第７条
論文の採択は編集委員会が承認する｡
附則
この規程は, 平成20年３月１日より施行する｡
中村学園大学薬膳科学 (PAMD) 研究所
１. 雑誌名：中村学園大学
研究紀要投稿規程
薬膳科学研究所紀要
英語名：Proceedings of PAMD Institute of Nakamura Gakuen University
２. 投稿は査読制とし, 各部門長に直接提出する｡
３. 原稿はＡ４サイズ (297mm
210mm) に, パソコンのワープロソフトで作成する｡
４. 原稿の上下に20mm, 左右に25mm の余白をとり, 英文原稿の設定は１行約70文字, 縦40行, 和文原稿の設定は１行約37
文字, 縦40行を基本とする｡文字サイズは英文・和文ともに12ポイントを基準とする｡
５. 図表・グラフ等は MicrosoftR PowerPointR にレイアウトする｡
６. 原稿は, 注・参考文献・グラフ・図表・数表等を含めてページの限度はありません｡
７. 研究紀要は次の種類によって構成する｡
①
オリジナル論文：要旨, 目的, 実験方法, 結果及び考察, 引用文献で構成する｡
②
レビュー論文：要旨, 本文で構成する｡但し, 引用文献は50報程度とする｡
８. 論文の構成は, ①論文題目・②氏名・③所属機関・④要約・⑤キーワード・⑤本文 [(a)目的 (b)方法 (c)結果及び考察]・
⑥参考文献の順序とする｡
①
論文題目：原稿の１ページ目の最初に, 論文題目を書くこと｡和文原稿の場合は, 英語と日本語の論文題目及び要約の
順にそれぞれ記入すること｡
②
氏
名：和文原稿の場合は, 英語表記の下にローマ字表記も添えること｡執筆者が２名までの場合は, 10行目までに
入るようにフォントサイズを調整すること｡タイトルが長い場合や執筆者が２名を越える場合は, これに準じる｡
③
所属機関：研究所の所属機関は｢中村学園大学薬膳科学研究所 ∼部門, 英文名：Department of ∼, Institute of
Preventive and Medicinal Dietetics, Nakamura Gakuen University｣とする｡和文原稿の場合は英語を添え, 所属機関
名はイタリック体で記入すること｡
④
要
⑤
キーワード：要約の次の行にキーワードを３つから５つ程度, 論文の使用言語で入れる｡
約：所属機関から行送りして見出しを付ける｡要約は, 英文とする｡
⑥
本
文：キーワードから行送りして本文を書き始めること｡和文原稿の場合, 句読点・カギ括弧 (｢｣) などは１文字
に数える｡各セクションのタイトルはゴシック体を用い, センタリングするとともに, 前後に１行の空白を設けること｡
⑦ 参考文献の書式：例 Corma, A. Inorganic solid acids and their use in acid-catalyzed hydrocarbon reactions. Chem.
Rev. 95, 559-614 (1995).
中村学園大学薬膳科学研究所
研究紀要第３号
平成22年４月１日
平成22年４月５日
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印刷
発行
中村学園大学薬膳科学研究所
〒814 0198 福岡市城南区別府５丁目７番１号
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城島印刷株式会社
TEL (092) 531 7102番

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