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dijestVol2 - 病理技術者のためのメーリングリスト
閲覧用 持出し厳禁 閲覧後は元の場所に戻してください 病理技術者のためのメーリングリスト ダイジェスト版 Vol. 2 平成 14 年 11 月 編集責任 神奈川県臨床衛生検査技師会 病理研究班メーリングリスト管理ｸﾞﾙｰﾌﾟ ビクトリア青の調子はいかがでしょうか。 ･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････ ある職場の技師の独り言･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 古本･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ また、感染型コンピュータウィルスが流行っているようです。 ･････････････････････････････････････････････････････････････ みなさんに提案があります。･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 皆さん、顕微鏡の写真とかどうされてます？まだ、35MM フィルムですか？前回よりの追加分･････････････････････････････････････････ MDM2 蛋白の抗体お持ちじゃないですか？ ･････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 西湘地区在住ジモティー、お勧め秋の行楽ガイド 箱根編 ････････････････････････････････････････････････････････････････ 時間が取れましたのでピュア・エオジンを作製しようと試みました。･････････････････････････････････････････････････････････ 質問 1）この染色液で染めた H.E.標本は暗所保存で、何年間位染色性が保たれるのでしょうか？ ･･･････････････････････････････････････ 質問 2）どの位の染色枚数で 3 日間でしょうか？枚数にかかわらず、3 日間なのですか？ ････････････････････････････････････････････ 質問 3）フロキシンを入れないでピュア・エオシンのみの場合も染色液の劣化は速いのでしょうか？ ････････････････････････････････････ どなたか，オステオポンチン（OSTEOPONTIN）って，染めたことありませんか？･････････････････････････････････････････････････ 標本にマーキングするときの道具って、皆さん何を使っています? ･･･････････････････････････････････････････････････････････ 3 3 3 3 4 4 4 4 5 6 6 6 6 6 すみません、御存じの方教えて下さい。今週末、電顕学会で札幌に行ってきます。今からでも間に合う格安航空券情報や札幌お勧め情報など、何かありましたら ･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 6 ところで，皆さんのところでは，ホルマリン固定後の水洗って，どうしてます？ ･････････････････････････････････････････････････ 6 シッフ液を自作しているようですが、よろしかったら組成・作製方法を教えてもらえませんでしょうか。 ･････････････････････････････････ 7 今度，臨床検査系の雑誌に， “酵素抗体法，過染してしまったら，どうする？” ･･････････････････････････････････････････････････ 7 皆さんのところでは，ゲフ（迅速）の標本作製は，どうされてます？･････････････････････････････････････････････････････････ 8 グリメリウス染色の一方法 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 9 質問です。脱灰後の免疫染色って、染まるのですか？･･･････････････････････････････････････････････････････････････････ 9 病理の市販システムにドクターヘルパー ･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 9 ●メーリングリストからのメールに振り分けルールを設定するとはどうすればいいのですか？教えてください。 ･････････････････････････････ 9 マッソントリクローム染色に使っている青は，アニリン青ですか？それともメチル青ですか？･････････････････････････････････････････ 9 ONE STEP MASSON 染色･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 10 お願いします。 なんでこんなところが剥がれてるの？どうしてだんだんに薄切されてるの？AZANMALLORY の色がいつも一定の染まりになぜならないのか？悩み多き日々です。 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 10 新染色法のすべてでアルカリ水解後の PAS 染色の記載があります。たしか百瀬さんの名前も入っていたと思うのですが・・。まず、還元剤に水素化ホウ素酸ナ トリウムを使用していますよね。私は大学時代に水素化ホウ素酸ナトリウムおよび THF 試薬は反応活性が高く危険を伴うので注意するようにとよく言われまし た。危険性の具合はいかがなものなのでしょうか。また、水解試薬として KOH を使用しているようですがその作用機序をお教え願えませんでしょうか。私の認 識では、アセチル化する試薬としては無水酢酸、塩化アセチル、ケテンまたは無水塩化アルミニウムや塩化アセチルなどが有名と思っていました。KOH にもそ ･･ 11 骨髄生検(ホルマリン固定)でギムザをやる意義って何だろう? ･････････････････････････････････････････････････････････････ 12 ヘマトキシリンの OVER NIGHT って，やったことありませーん？ ･･････････････････････････････････････････････････････････ 12 ナイルブルー染色 ･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 12 アポトーシス検出のための CASPASE-3 の抗体って，どこのメーカーのを使うんですか？････････････････････････････････････････････ 13 免疫染色の加熱処理は，何でやってます？ ･････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 13 型違いの輸血をしてしまった場合の副作用(即時型溶血性輸血副作用)として DIC を起すという記載があります。なぜ DIC を起すのでしょうか。 ･･･････ 14 なにゆえ多くの施設においてエタノールとキシレンが採用されているのか疑問です。 ･････････････････････････････････････････････ 14 劇毒物薬を含めて保管・管理はどうされてます？･････････････････････････････････････････････････････････････････････ 14 パラジメチルアミノベンチリデンロダニン法どうすればきれいに染色できるのですか？ ････････････････････････････････････････････ 15 免疫染色（酵素抗体法）の一次抗体の希釈って，何でやってます？ ･････････････････････････････････････････････････････････ 15 のようなシアル酸の C7-9 中のどれかをアセチル化する作用があるのでしょうか。できれば、そちらの作用機序も教えていただきたいのですが・・・。 ビクトリア青の調子はいかがでしょうか。 先日、VB の話題になりまして、70%アルコールでの分別をしっかりやると核の 染色性が保持されるとききました。ではではっと実際に行ってみました。アルコ ール分別でのアルコール交換回数を３回にして青色がほとんど見られない状 態にし長めに浸けておきました。その後、水洗(少し長め)をして炭酸リチウム処 理・硫酸ナトリウム処理・処理なし・HE のみと各２枚づつ同条件で後 HE をおこ なってみました。結果は、良好でしたよ。VB 処理を行ったものに関しては処理 法により差異はみられませんでした。HE のみのものと比較するとヘマトキシリ ンの強度はほとんど差がでませんでした。むしろ、VB 処理のほうはエオジン がカブリ気味で濃い紫色を呈しました。まだ、数件しか試していないのでハッキ リとは言えませんが、よさそうな印象ですよ。 [返信]; 有り難うございます。お恥ずかしながら、私の方はあまり進歩が無 く・・・・。(-_-;)一応ヘマトキシリン 2 種で時間を変えて染めたりしてみたんです が・・・。分別ですか。核に VB が残っているとダメなんですね。素朴な疑問なの ですが・・・・。70％アルコールの分別って、どのくらいやっても大丈夫なの か・・・。かなりしっかりやらないと、背景が抜けてくれない（特に長時間入れて しまった場合とか。）し、でも、あんまりやると弾性繊維まで抜けちゃうのでは？ なんて心配になってします。以前核に VB が残っている場合は１％塩酸アルコ ールで分別した方が良いと教えて頂いたのですが、初めから塩酸アルコール 分別ではいけないのですか？ [返信]; 詳細を記載していませんでしたね。固定液:20%中性緩衝ホルマリン固 定時間:約 24 時間対象臓器:十二指腸乳頭部 VB 液:武藤化学染色時間:2 時間洗 浄:70%アルコール およそ 3 分/3 分/5 分でした。洗浄に関しては最終槽で液に 着色がないことを確認しました。水洗:約 3 分蒸留水後核染色(マイヤー変法) 5 分水洗色だし水溶性エオジン 3 分軽く水洗蒸留水、脱水、透徹、封入(マリノー ル)でした。以上の工程で行ったら、比較的結果が良いようでした。アルコール の時間に関しては、長いと染色性が落ちるかもしれませんね。(未確認)むしろ、 回数を多くしたほうが効果的かもしれません。(未確認)今回の程度では、弾性 線維が薄い印象は受けませんでした。微細なものまでも染まっていました。塩 酸アルコールに関しては、試していないのでなんとも言えません。まぁ、ボチ ボチやっていきましょう。私も引続きやっていきます。良い結果が出ればいい ですね。 [返信]; 脱パラフィン操作は手作業でやっていますでしょうか。だとしたら、およ その時間をお教えねがえませんでしょうか。また、機器でやっているのでした ら、そちらの時間もお教えねがえませんでしょうか。だいたいで結構です。 [返信]; 手作業でやっています。キシレン4槽で3分・3分・5分・5分ぐらいです。 [返信]; この件については、いろいろ検討していたのですが、とある日を境に ヘマトキシリンの染まりに差が出なくなってしまいました。はて??と思っていた のですがその原因はよく解かりませんでした。境の日以前は脱パラを手作業 で行っていた点、アルコールの分別に気を使っていなかった点などが境の日 以降との相違点です。で、境の日以降にも手作業で脱パラしてみたり、アルコ ール分別をルーズにしてみたりしたのですが、差は出ませんでした。ちょっと 不可解で原因は解からずじまいでした。でも、まぁ染まりがよかったのなら当方 もホッとしました。この件に関しては長い眼でみながら様子をみましょう。 ある職場の技師の独り言 私は○○○病院に勤務しております。3 人という少数精鋭で日常業務を行って おります。主な業務は研究・教育に関するものですが、勿論、診療に関する仕 事もしています。今日のコーヒーは不味い！こんな会話が始業のチャイム代 わりとなり、一日が始まります。文句を言わないと一日が始まった気がしませ ん。とても、仲の良い職場です。私の部屋のルールとも言いますか、基本方針 は自分が法律です。協力出来ることは一応しますが、誰か一人がとても忙しそ うにしていても、「忙しそうだねー！」とからかうだけで、他の人はお茶をしてい ます。全くそんな気はないので「手伝う？」という言葉は出てきません。心にも 無いことを言う人たちの集まりでなく、本当に恵まれた職場です。また、試薬な ども自分の分さえあれば後のことは考えません。使い切って置いておきます。 嫌がらせと思う方もいらっしゃると思いますが、そんな気持ちもなく平気でやる のです。思いやりの気持ちとかの問題では無いのです。たまに、自分がそれ に当たってしまい仕返しされてしまうことも多々あります。くやしい思いをしてい ます。人間関係を育む難しさを私はこの職場で学びました。試薬を作ることは 出来るだけしたくありません。しかし、どうしても必要なときは「秘書ちゃーーー ーーーーーーん」と言うと嫌―――――な顔をした秘書ちゃんがやってきます。 何という職場でしょう・・・本当は秘書なんてものはいません。20 代後半の女の 子が一人います。そろそろ下の物が欲しいとなげいています。私は 11 年たっ て初めての部下と呼べるものが出来ました。彼女が就職して現在6 年ですから、 後 5 年早いと言ってやりました。まだまだ、甘いです。私の上司は最近、学位を 取得し博士になりました。博士になるとお召し物は変わりますがカラオケで歌う 歌は変わらず加山雄三です。台詞は暗記しているようです。チャコの海岸物語 を奥さんの名前で歌うこともしばしばあります。最近は IT 化が進み、携帯メー ルでの仕事のやりとりが主流になってきました。口では言わずにメールでの連 絡事項が多くなってきています。時代の波について行くことは大切なことです が、覚えるまでに時間がかかり、何度も根気よく、秘書ちゃんが教えてあげなく てはいけません。一度覚えてしまうと今度は、やりたくて仕方なくなり、周りの 人に困られてしまうという、ちょっとおちゃめ？な上司ということにしておきます。 ただ、子供なだけです（お子ちゃまなのー…）。最近はイスラム教と、キリスト教 の争いごとで心を痛めています。その為か、秘書ちゃんを呼ぶ回数が増え秘 書ちゃんは困っています。キリスト教の信者なのにも拘わらず、仏滅を気にし たりするちょっと変わったクリスチャンです。上司は国際留学を推奨しています。 これからの時代に英語は絶対に必要であることは誰もが感じていることでしょ う。しかし、本当に英語？我が上司の語学の上達は未知の世界です。私の職 場の良いところは、極端に人を褒め称えることです。調子にのらせて、仕事を 押しつけてしまおうという根端です。臨床医の出入りも多いこの部屋は、学会な どのお土産もよくいただきますが、へみたいな物は一切食べません。とにかく、 文句で始まり文句で終わるというのが私の職場です。三人とも A 型なせいか、 特有の細かい部分があります。ちょっとしたことで揚げ足を取られてしまいます。 うっかり口にしてしまうと一生根に持たれますし、また嫌いな物は排除してしま うか、顔や態度に出てしまう正直者が集まっています。…… 古本 先日東京の教育会館で行われた細胞診セミナーに行って参りました。１日目の 帰り道に古本屋街で出会った一冊の有機化学の本についてお話します。私が 古本屋街を歩いていると、おそらく処分本?が道端に陳列されていました。そこ にはポロボロの一冊の有機化学の本がひっそりと並んでいました。おもしろい かなと思って手を伸ばしてみると、価格表示は¥400、それが更にお安くなって ¥200 のプライスになっていました。これは買いだ!と思ったんですがなんとなく 踏ん切りがつかず、また元にあった場所に戻し御茶ノ水駅に向かって歩きだし ました。帰りの道すがら、なんとなくその本が気になって気になってしょうがなく なってしまい、「やっぱり買おう」と神保町に引き返しました。 その本屋に引き 返した時、そこには見物客が多く私の欲しかった本は誰か知らない第三者の手 中にありました。「こいつ本当に買うのかな?」「買わないのなら早く手放してよ」 と思いつつ、横目でチラチラ見ながらその人がその本を諦めるのを数分間待 ちました。そして、ついにその瞬間がやってきました。その第三者が元の場所 に置いた瞬間、人の波を押しのけて遂にゲットしました。帰りの電車でその本 を眺めていると、なんと昭和 33 年出版の第 14 版ものでした。内容もかなり古く、 理論の本というよりも経験則および実験則主体の本でした。本も汚いし「やられ た∼」とおもいながら、ふとページをめくっていくと染料についての記載があり ました。昔の有機化学では、染料の合成というのは大切なことだったのでしょう。 中にはエオシンに関する記載もありました。以前この会で「エオシンの由来に ついては不明確である、追跡項目とさせてください」との記載を思い出し読み進 めていくと・・・・。1871 年 Baeyer がピロガロールからフルオレシンを合成した。 そのフルオレシンから合成されたものがエオシン A であるという記載がありま した。やはり、エオシンは合成色素だったんですね。フルオレシンからエオシ ン合成についての詳しい記載はありませんでしたが、その本には塩基性フク シンの合成方法やその他の色素の合成方法が記載されていました。まあ、 ¥200 にしては、私にとって楽しい内容のものでした。ちなみに本の名は TITLE: TEXTBOOK OF ORGANIC CHEMISTRY 1951 EDIT: FIESER & FIESER (夫婦での 著書のようです) MARUZEN CO., LTD 追伸私は中古の物を買うことが多いので、 このような経験はよくあります。とくにカメラの本体やレンズは中古購入が多い ですね。中古物は出会ったときが、購入するときという鉄則があります。明日買 おうと思うと、次の日にはないことが多いですね。ですから、皆さんすべての出 会いを大切にしましょう。一期一会という言葉もありますし・・・。ちなみに、当院 の同僚はそのきたない本を見て何かついているかもしれない(霊)からそんな 本は買わないといっていました。(^_-) また、感染型コンピュータウィルスが流行っているようです。 僕のところにも、昨日の夜、WORM_KLEZ.Hというウィルスが届きました。このウ ィルスは、受信メールに触れただけで、添付のマクロが実行され、感染してしま うという悪質なものです。ちなみにタイトルは、“A Win XP patch”でした。僕は、 プロバイダーのウィルスチェックサービスで、ウィルスをチェックし、しかもウィ ルスバスターというウィルス駆除ソフトをインストールしているので、大丈夫だ ったようですが…Windows ユーザーで、Outloook Express または Outlook を使 っている方は、特に狙われやすいので注意して下さい。（Macintosh の場合は、 あまりウィルスに神経質にならなくてもいいみたいです…？）対処方法として は、ウィルス駆除ソフトをインストールし、常に最新版に更新しておく。契約して いるインターネットプロバイダーが、ウィルスチェックサービスなどをやってい るようだったら申し込んでおく。Windows ユーザーの方は、Outloook 系のメール ソフトから、他のメールソフトに切り替える。Windows ユーザーの方は、大事な ファイルは、C ドライブに保存しないで、D ドライブに保存するように心がける。 怪しいメールが届いたら、右クリックして、メールを削除する。知ってる人から のメールでも、添付ファイルが付いてたら注意する（転送型のウィルスもありま すので…）などが考えられます。 [返信]; すみません。私は任意保険(アンチウイルスソフト)に入っていません。 でも、ウイルスは見かけませんよ。旧niftyserveの会員なのですが、@nifty会員 とは少し違いがあります。もちろん、皆さんのインターネット環境とも違います。 niftyserve はもともとパソコン通信から派生したもので、現在でもそのシステム を受け継いでいます。@nifty は富士通の info-web から派生したものでみなさん のインターネットプロバイダと何ら変りはありません。旧 niftyserve の場合チョッ トいろいろ違う部分があるので直接的に入ってこれないのかな、もちろんプロ バイダウイルスチェックというサービス自体もありません。いつも、なんとなく 大丈夫かな?なんて思っていたのですが、そろそろウイルスソフトを買おうかな (ーー;)なにか、ウイルスチェックソフトを入れたらバリバリ感染していたりし て・・・。(-_-メ) [返信]; 以前は日に 4∼5 通ウイルスメールが来ていた時期がありましたが、 最近はご無沙汰ですね。大学のサーバーは一般のプロパイダーほど親切で はないのでサーバーに直接アタックするようなウイルスでないと駆除してくれ ません。従って自分の身は自分で守るしかないのです。臨床科はかなりひど いらしく共用のパソコンはまず感染していると思ったほうが良いそうです。昨日 も臨床の先生が自分の所のパソコンは怖くて使えないので貸してくれと、うち の教室のきました。Outloook 系のプレビュー（メールを開かなくても中身が見え る状態）をオンにしておくだけで感染するウイルスもあります。携帯のワン切り と同じで興味本位で見ず知らずのものには手をださないことですね。最近の流 行としてウイルスに感染するとメールのアドレス帳のアドレス宛に（つまりお友 達に、友達が少ない人は被害も少ないのね）マイドキュメントフォルダー内のド キュメントや画像の名前をつけた件名（つまり日常的な、いかにもありそうな件 名）でMS-Word、MS-Excel などのデータファイルに感染し、添付ファイルとして ウイルスと共に送信する。（内緒のファイルもみんなに知れてしまう。エンジェ ル大ピンチ。）そしてある日（10 月 16 日など）がくるとＣドライブの全てのファイ ルをきれいさっぱり消してくれる。（きっときれい好きなのね。）被害を受けたそ の時から、こんどは自分が加害者になってしまうのです。アンチウイルスソフト を導入しないひとは、任意保険に入らずに車を運転しているようなものですか ら、それ相応のリスクは覚悟しなければなりませんね。ここに最近の傾向と対 策な ど い ろ い ろ で て い ま す の で 参考に し て 下さ い 。 http://www.ipa.go.jp/security/isg/virus.html みなさんに提案があります。 本メーリングリストもはや３ヶ月が経過しようとしています。つきましては、新規 参加会員の獲得とよりいっそうの情報取得を兼ねて、全国規模の会に発展させ ていこうと思います。改変事項 1.入会/脱会の完全自由化 2.全国誌レベルの出 版物へのアピールを考えています。個人的には最低でも 300 人以上の規模に したいと思っています。(この規模になるとゴミメールが激減するはず・・・。なぜ なら全国的にゴミメールを出した人の人格が疑われるから・・・)まず、1 に関し ては本メールサーバの egroup に設定があるので試してみます。概要は、本メ ールアドレスに直接投稿した時点で入会となり、本メールアドレスに空メールを 送った時点で脱会とすることです。人の出入りが激しくなる分、管理グループで の把握が難しくなるのですが・・・。また、現在の状態では、入会したのは良い が脱会の方法が解からない。まるで、虎の穴のように、一度入ったら抜けられ ない(抜け方が解からない)。などの不備があります。その辺の整備も必要です ね。2.に関してはまず、神臨技の会報にこのリストのことを掲載してもらう。次に、 日本臨床衛生検査技師会の会報に掲載してもらう。などです。もちろんクチ込 みでも構わないのですが、入会に際しての敷居を低くして入会しやすくすること も重要だと思っています。私本人としても、自分の染色理論等に対しての意見 を広く聞きたいし、もっともっと皆に啓蒙していきたいと思っています。それに、 本来免疫染色や遺伝子関連の話なども活発に討議していきたいし・・・。いろい ろな人がいろいろな意見を出して討論したほうが、楽しいし勉強にもなると思う のですが・・。皆様のアイデア・ご意見をお待ちしております。 皆さん、顕微鏡の写真とかどうされてます？まだ、35mm フィルムですか？ 前回よりの追加分 [返信]; これ実際の画像を見せてもらったんですが、なかなか良かったですよ ね(^_-)まだ、デジタル映像が銀塩の解像度に追従してないので、直接リバーサ ルフィルムを撮影しても何ら画質の低下は感じられませんね。撮影台を使って デュープ(?)を作製するなんで、なんとも病理らしくて良いですよね。カメラのレ ンズの写り込みに関しても工夫すればなんとかならないかな∼?まあ、専用の ものが一万円以下で出ているので、それを使ったほうが確実かな(^_-) [返信]; DB と画像の関連付けは手作業で行うのですか? [返信]; 画像処理から DB 化は手動で行っています。手術材料がそれほど多く ないので時間的には問題がありません。ちなみに染色も封入も手動です。 [返信]; デジカメ性能がどんどん上がってきています。一昔前よりも格段に画 質が良くなってきました。この分でいくと銀塩写真を越えることは間違いありま せんね。そのころもきっと当院は銀塩だと思います。DB 設計とくに患者情報の 取得とか、DB 設計のコンセプトなどなど・・。VB って簡単なんだけど、バグると 最悪ですよねぇ∼。あと、DB 設計は基本コンセプトが重要ですね。どおしても データ量が多くなるとスピードが落ちてきてしまいます。立ち上げ当初時の速 度はかなり早くないと、後々カッタルくなってしまいますねぇ∼(^_-)マクロを多用 すると速度は低下します。可能な限り VB で書きましょう。あと、JET データベー スは途中処理を強制的に修了したりストップをかけたりすることに非常に弱い ですね。でも、基本的には非常に固い DB なので起動に乗ってしまえば、ほと んどスタックはありませんでした・・・。というのが私のACCESSに対する感想で す。ちなみに・・・。自作のDBの場合、直接DBデータの書き換えを行うような設 計が多いですよね。入力すると後戻りできないような・・・。ちょっとキケン・・・。 これを回避するにはコツがあります。DB データを直接書きかえるのではなく、 SQL でそのレコードを別のテーブルに用意します。そして、そのコピーデータ を書き換えて、実行ボタン等を押すことにより元レコードの削除→コピー改変デ ータの挿入という作業のプログラムを組みます。すると、実行ボタンを押さない 限り元データは改変されません。この方法は最も基本的な入力形態で、おそら くどのシステムでも行っています。この場合エラー処理やテーブルのキー設定 を的確に行わないと速度が低下してしまいます。ACCESS での DB 作製を考え ている人。リファレンスの購入は絶対に必要です。 MDM2 蛋白の抗体お持ちじゃないですか？ あったら、少し分けて頂けませんか？当院で、intimal sarcoma susp（何か珍しい らしい…）が出て、病理の先生が染めてみたいらしいんですけど… 宜しくお願 いしまーす m(_~_)m [返信]; ●Oncogene Res.の MDM2(OP46)ならあります。Paraffin Section 可です。 教授に聞いたらいいですよとのことです。ちょっとだけよ∼。うちでも何か怪し いものを近々染めるみたいですね。 [返信]; 感謝(^.^)!!! 感謝 m(_~_)m SRL 便とかでもいいんですが、特に急がない ので、申し訳ありませんが、持ってきて頂けますか？出来たら、能書のコピー とかもいただけますか？ [返信]; Oncogene Res.の MDM2-Ab(OP46)，お陰様でよく染まりました．どうも ありがとうございました．条件は：抗原賦活：クエン酸（pH6.0）ボイル 95℃ 40 分， 自然冷却１時間一次抗体の希釈率：500倍（0.2 μg/ml）→0.1μg/mlでもいけると 思います．一次抗体の反応：４℃ Overnight detection： HRP-ポリマー法 発 色：DAB で良いようです．ちなみに，抗原賦活を行わないと染まらないようです． また何かありましたら宜しくお願いします．m(_~_)m 感謝！感謝！ 西湘地区在住ジモティー、お勧め秋の行楽ガイド 箱根編 [返信]; 以前、関東甲信の講習会案内を医学検査（日臨技雑誌）に掲載してほし いとお願いしたところ、全国紙に地区単位の情報は載せられないと断られた経 緯があります。まっ、いろんな形・方法でトライしてみてもいいですが… 神臨 技病理研究班で、メーリングリストの概要をまとめて、投稿するって手もありま すよー(^.^) 現在、メーリングリストに参加されている皆さんの率直なご意見を 頂戴して、今後の参考にさせて頂いたら良いのではないかと思います。（皆さ ん、宜しくお願い致します） 例）内容が難しすぎる（堅すぎる）、もっと実践的に してほしい、ふざけたメールはやめてほしい(‘.’;)、セクハラまがいなのはいた だけない(‘.‘;)…等々 [返信]; ネズミ講式会員増加計画はどうでしょう。24 人が 4 人で 96 で 96x4=384 でいっきに300人オーバーですね。●学会場入り口で手相の勉強をしています ので拝見させて下さい。と言って誘い。あなたには不幸の相が見えます。その 悪相を消すにはメーリングリストに入る必要があるといって入会させる。（う∼ ん！ 統一教会みたいですね。） ●会員名簿を利用して勧誘する。その際「お めでとうございます。厳選なる抽選の結果、あなたにメーリングリストの入会権 利が当たりました。」とのたまわる。 [返信]; 個人的には、医学検査と同時に送られてくる会報を狙っています。すば らしいアイデアです。是非みなさん実行してみてください。(^_-) くれぐれも、友 達をなくさない程度に・・・。 秋はやっぱり箱根でしょう。「箱根なんて・・」とおっしゃる皆さん、箱根をバカに してはいけません。歴史と伝統を兼ね備えた行楽地なんてそうザラにあるもの じゃありません。ジモティー磯崎が考えた箱根散策ガイドをお知らせします。自 動車編 まず、箱根で最も頭を悩ませること・・・。それは、渋滞。渋滞がなけれ ば時間に余裕もあり、ドライブもより一層楽しいものになるはず。そこで、箱根 へのアクセスとして国道１号線は使用しません。南足柄市から直接仙石原にぬ ける白黒林道(地元では金時林道という)を紹介します。東名高速大井松田イン ターで降りて、南足柄方面を目指します。大きな橋(足柄大橋)を越え直進トンネ ルをすぎたら、一つめの信号を右折し延々道なりに進みます。山道をかなり走 ると地蔵堂という場所があるので、その分岐を夕日の滝方向に進みます。この 地蔵堂に「手打ちうどん」のお店があります。(萱葺き屋根の渋い茶屋風の建物: 万葉うどんと名づけられていました)ここのうどんは素朴な味で、且つ周りの空 気もおいしいのでうどんの風味に絶妙のスパイスを与えてくれます。値段も安 いのでお勧め!☆☆ 夕日の滝に向かってしばらく走ると左手側に大きな看板 (降水量により通行止めになる旨)があるので左折します。さぁ、ここからが金時 林道の始まりです。前面舗装された、林道をどんどん進んでいきます。右手に は金時山、左手には箱根外輪山の山々が連なり、天気が良ければ相模湾も眺 望可能です。ただし、杉林が多いので紅葉を楽しむことは×です。延々九折の 道を快適に進んでいくと、仙石原の国道に到着します。そこはもうすでに箱根。 国道を左折し宮城野方面に向かいます。(地蔵堂からの所要時間約 20 分)途中、 右手にガラスの森が見えてきます。ガラスの森の向かいには仏蘭西料理の 「アルベルゴ・バンブー」というお店があります。奥まっていてちょっと解かりづ らいが、ここは、なんといっても雰囲気が良い。お店入り口のパルテノン神殿の ような造りはいただけないが、室内の壁画や大きなワンフロアの店内と程よい 照明があいまって、なんとも言えぬ世界がある。お勧めは、ディナーである。 森の中にひっそりとたたずむ建物は光の装飾が施されて、大変美しい。食事の 内容・味にも問題なく☆☆である。ここは、クレジットカード可、宿泊施設もある ようなので行ってみるのも面白い。 バンブーを横目にさらに直進していくと、 仙石原の交差点があり、そこを右折する。しばらく走ると、そこにはススキの大 平原が・・。有名な「仙石原湿原」である。すすきを堪能しながらさらに進んでい く。湖尻を抜け、今度は大涌谷に向かう。道路表示に従って走っていくと、だん だん硫黄のニオイが漂ってくる。さぁ、大涌谷に到着。ここが本日のメインです。 ここに来たら、必ず「黒ちゃんタマゴ」を食べましょう。なんといっても、このタマ ゴ!! 一つ食べると四年長生きするという超スゴイタマゴなんです。で、またこの 「黒ちゃんタマゴ」の入っている紙袋がすばらしい。レトロ感覚あふれるデザイ ン、四年も長生きするという超すごい効能をひっそりとうたっているロゴ、もうマ ニアにはたまらない一品です。旅の記念に是非この袋はとっておきましょう。さ ぁ、「黒ちゃんタマゴ」を食べたら、大涌谷散策です。硫黄のニオイのする遊歩 道を歩くと「ガスに注意」の看板が・・・。さすが火山地帯だけあって有毒ガスが 発生するらしい。クチにハンカチを当ててさらに上を目指す。遊歩道の終点は、 温泉がたんたんと涌き出ている。ここに、タマゴを入れて「黒ちゃんタマゴ」は 完成するらしい。つまり、ここが生命(長生き)の源なのだ。もちろんここでは記 念撮影をしましょう。注意しなければならないのは、その辺りには様々な物質 が漂っていて、太陽の光線状態によっては、昔の黄ばんだ写真のような写りに なります。その、黄ばみ具合を楽しみに大涌谷の石碑のところで記念撮影をし ましょう。もちろん、撮影者は他人に頼みます。ここで注意しなければならない ことが一つ・・・。周りにいる人々が日本人と思ってはいけないということ、昨今 の箱根には観光目的の中国人、韓国人が多数います。よく会話を聞いていな いと言葉が通じないので要注意です。撮影をすませたら下の戻り、お土産セン ターでお土産を物色します。ここでのイチオシは、なんといってもチョンマゲか つらと塩ビの日本刀です。昔懐かしいこれらのものは、箱根の国際化によって 日本を象徴するおみやげとなっています。中国人には大人気?さぁ観光もしたし、 ホテルに行きましょう。本日宿泊するホテルは姥子温泉にある「ホテルグリー ンプラザ箱根」にします。このホテルは比較的低価格でそれなりの設備を持っ た良いホテルです。エステや他の娯楽施設(ゴルフ)も完備しています。さらに 良いのが富士山を展望できる露天風呂です。満足度☆☆です。気をつけたい のが、このホテルを予約するときには食事は洋食にしましょう。洋食のほうが 質量ともに Good です。お腹一杯になるまで食べさせてくれますよ。レストラン は☆☆です。ラウンジで軽く一杯飲んで、今日一日の疲れを癒し「おやすみな さい」ZZZZ------翌日は完全フリーです。渋滞を避けて観光、観光・・・。湯河原 パークウエイで湯河原に下りるも良し(渋滞あり)、ホテルから湖畔までのハイ キングを楽しみ、ついでにスカンジナビア号で芦ノ湖周遊するもよし、テーマパ ークめぐりをするも良し、ロープウエイで大涌谷下車、箱根連山を縦走ハイクす るもよし、乙女峠を抜けて御殿場に下りてプレミアムアウトレットで買い物&御殿 場高原ビールでドイツ風料理をつまみにビール三昧、温泉「時のすみか」で一 風呂浴びるも良し・・・。楽しさ盛り沢山ですよ。帰路は国道１号線で下山しましょ う。家へのおみやげは小田原で最もおいしい魚、鯵を買いましょう。ただし、干 物です。お勧めは、山安の鯵の干物です。山安といっても、お土産屋さんで購 入しては芸がありません。箱根板橋にある山安の工場に直接買いにいきます。 ねらいは「キズセット」。商品としては出回らない形落ちが破格のお値段で購入 できます。形にとらわれなければ、味は最高です。まぁ、小ぶりのものが多い のですが価格対価値で☆☆☆です。6∼10 枚入りで¥300 という安さはブッチギ リです。また、その近くには、イチゴ大福の隠れた名店大沢屋菓子店があり、こ このイチゴ大福(シーズンのみ)は絶品☆☆☆です。ただし、ここ５年くらい店頭 に出ていません。主人いわく「最近はいいイチゴがなくてイチゴ大福を作れな い」と言っていました。でも、ここのイチゴ大福は絶品に値します。これはもう普 通のイチゴ大福ではありません。私も、一時期イチゴ大福を研究していました が、ここのイチゴ大福が一番でした。まず、食感が異次元です。イチゴ大福の 根幹を揺さぶるような・・。店の前にイチゴ大福の幟が立っていたらチャンスで す。是非トライしてみてください。時間があれば、小田原に立ち寄ってみてくだ さい。いいお店が一杯あります。ただし、閉店時間は早いので要注意です。う なぎは「かしまた」、スタンド天ぷらは「きくもと」、座敷は「だるま」などなど・・・。 アド街ックテレビでは紹介されていない名店が沢山ありますよ。胃袋がいくつ あっても足りませんね。まぁ、こんな感じで箱根には良い所がい∼っぱいあり ます。この秋いかがですか(^_-) 時間が取れましたのでピュア・エオジンを作製しようと試みました。 ずっと以前に教えを頂きながらお礼もしないで、すみませんでした。昨日、時間 が取れましたのでピュア・エオジンを作製しようと試みました。13日金曜日に１） Eosin Y 5g 蒸留水 1000ml 塩酸 10mlEosin を蒸留水に完全 に溶解してから塩酸を加える。上記を混合し、一夜放置する。をおこない、15 日 月曜日に２）上記の液をろ過し、そのろ紙に残っている沈殿物を蒸留水にて約３ 日ほど洗浄する。（毎日夕方になると漏斗にふたをしておき翌朝水洗を開始す る）をおこない始めたのですが、大きめのロートに大きなろ紙を用いていたの ですが、ろ紙が破れてしまい、実習生さながら両手がエオジンに、恐ろしく奇麗 に染まってしまいました。皮膚年齢を考えながら恐るおそる薄めのハイターに 手を入れ、なんとか解決！・・・手は・・・ですが・・・。エオジンはだいぶ溢れてし まったのですが、残りをもとの広口試薬瓶にいれ、蒸留水をいっぱいにして撹 拌し、放置して帰りました。今日は上澄みを捨て、蒸留水を再度満たして撹拌中 です。この操作を繰り返しても宜しいでしょうか？ほんとは全てを濾過し、上か ら蒸留水を掛けながら洗うのですね？この操作を 3 日間ですね？・・・ろ紙の号 数とか、メーカーにこだわりがありますか？以下はろ紙を何枚かに分けてろ過 し、半乾き状にしようと思うのですが・・・。３）３日目に水をきり、ろ紙上の沈殿物 を半乾き状にする。（乾燥させ保存させることも可能）４）上記のろ紙ごと沈殿物 を 1000ml の無水アルコールを入れたフラスコに入れよく溶かす。５）上記の液 を使用時に４倍にうすめ、ろ過して使用する。このあとフロキシンを 5）の使用 液に加えるのですか？・・・どの位の割合ですか？購入しようと思うのですが、 メーカー、種類？などは？a) SIGMA Cyanosine( P 2759 Crystalline)･･･ Cat.Page566 b) Wako Phloxine B (166-02072)･･･Cat.Page1353 など？また、洗浄 用の蒸留水はどの位の量が適当なのでしょうか？ [返信]; 当院でも迅速用にピュアエオシン(その昔は塩酸沈降エオシンとか言っ ていたような・・・)を自家作製しているので、横レスながらお答えします。濾紙に 関しては東洋濾紙の No1 を使用しています。破れないコツは、いじくらないこと です。蒸留水の量は適当です。厳密な記載がないのでアバウトで良いと思い ますよ・・・。まぁ、納得いくまでやってみたら如何でしょうか(^_-)この組成は原液 で使用時希釈となっています。くれぐれも使用液をたくさん作らないことをお勧 めします。染色性がかなり悪くなります。フロキシンに関しては入れたり入れな かったりしています。たしかメルクだったような・・・。ちょっと考えるとフロキシン は精製しなくて良いのかなど考えられますが、その辺は無視しています(^_-)。 基本的には、いわゆる不純物を取り除く作業なので、神経質になるとキリがな いと思っています。適当なところでやってみることをお勧めしま∼す。 [返信]; ●早速のお返事ありがとうございます。フロキシンはピュアエオシン使 用液（4 倍希釈・水溶液）200ml に 0.5ｇ位入れればよいですか？ [返信]; ちょっと手元に資料がないのでなんとも言えませんが・・・。ちょっと多い ような気がします。調べて明日レスさせて戴きます。お好み次第という感じなの で少なめに入れて染めてみては如何でしょうか。多いとまっ赤赤になっちゃうと 思います。 [返信]; 特に詳細な記載はありませんでした。当院ではお好み次第ということで 適当に入れています。迅速用なのであまり気にしていません。料理の塩・コシ ョウ感覚でいれてみたら良いのではないかと・・・。回答になっていませんね(;_;) こりゃまた、失礼いたしました。他の人のレスを待ってみましょう。 [返信]; 有り難うございます。料理の下手な私でも、「味・塩・コショウ」混合パウ ダーは得意です。とっても気に入りました。それでやってみます。 [返信]; 最近は家でごくたま∼にしか料理はしないのですが、根っからの病理 (料理?)人の私にはパッケージに書いてあるマニュアル通りに調理ができない 性格になってしまいました。なんで、5 分間加温するの・・・?とか順番逆のがい いんじゃないの・・・とか・・・、お湯を入れて 3 分じゃ麺が硬くない? とか・・ 本当 はマニュアルのとおりが一番美味しいのでしょうが、なんとなく奇異な感覚に陥 ってしまうのは、私だけ・・・(>_<) [返信]; すみません、フロキシンを入れるのに書くのを忘れていました。フロキ シンは WAKO の 166-02072 を使用してしています。ろ紙は同じく東洋ろ紙を使 用しています。うちでは No2 を使用していますが No1 でも問題ありません。基 本的はかなりアバウトに作っています。しかし、しっかり詳しく書いておけば良 かったのにと反省しております。手を汚させてしまってすみませんでした。あと、 くだらないことですが１３日の金曜日って日が良くなかったかも・・・ [返信]; 一応、もったいないので、そのまま容器に蒸留水を足して、撹拌、一夜 放置する。などと勝手におこなってみたのですが、2 回目あたりから上澄みが エオシン色になり、沈殿物が少なくなってきました。慌てて、濾紙に取り、半乾き にして、半量の 99.5％エタノールを加えたところです。一晩経っても沈殿物が残 っているのですが、もう少しエタノールを加えてもよさそうな気がしてます。ほ ぼ、飽和状態が本来の溶解状況なのでしょうか？ 塩酸を加えた直後は白っぽ いオレンジ色の沈殿物が多く出来、上澄みが透明な水でしたが、洗っていると 塩酸が無くなるに従い、溶解してくるのですね？ [返信]; フロキシンを 0.5g/200ml いれたら大変なこと(超赤色)になっていたか も・・。やはり、洗浄過程でフロキシンをいれるのですね。当院では、エオシン のみ塩酸沈降洗浄させて、あとからフロキシンを入れています。フロキシンは 赤味が強いので太い膠原線維などは鮮烈な色になりますね。ただし、長期間 その染色性が維持できるとはいい難いですね。ピュアエオシンにフロキシンを 混入した場合、フロキシンの効果はあまり長持ちしません。なぜかはよく解か らないのですが、経験上そのような印象を受けます。また、希釈した使用液で の保存も染色性の劣化を引き落とします。(酸を入れると復活するかも・・)使用 液のフロキシン添加量を単純に計算してみまみしょう。まず原液の比率エオシ ン= 5g /1000ml = 約 0.5% (g/100ml)フロキシン = 0.5 / 1000ml = 0.05% (g/100ml) それを 4 倍希釈するということは 1:3 の混合比となりエオシン = 0.5 / 3 = 0.167g フロキシン = 0.05 / 3 = 0.017g ということになります。100ml に対しておよそ 0.02g の計算なので、やはり塩コショウ状態でしょうね。(^_-) [返信]; 間違えました。正式には それを4倍希釈するということは1:3の混合比 となり エオシン = 0.5 / 4 = 0.125g フロキシン = 0.05 / 4 = 0.013g でした。 [返信]; 染色枚数にもよりますが時間がたつと染色性が低下しますので、うち では３日でとりかえてます。 [返信]; はっや∼。３日とはなんとも速いサイクルですね。貴施設標本の赤味 具合は、このあたりからきているのですね。でも、なぜフロキシンの染色性の 劣化が速いのでしょうか。一応過剰量の色素は入っているはずだし、使用液に 入れても日を追うごとに落ちていきますね。フロキシンの染色性の至適状態と エオシンの至適状態とすこしギャップがあるのかなぁ∼。それとも、朱に交わ れば紅くなる的にエオシンに引っ張られちゃうのかな・・・。話変り。以前、どこ ぞの施設かでエオシン液をワインのように熟成させているなんていうのを聞い たことがありました。施設名は覚えていない(>_<)今では、ナンセンスだなぁ∼。 なんて思ってしまいます。 質問 1）この染色液で染めた H.E.標本は暗所保存で、何年間位染色性が保た れるのでしょうか？ 質問 2）どの位の染色枚数で 3 日間でしょうか？枚数にかかわらず、3 日間 なのですか？ 質問 3）フロキシンを入れないでピュア・エオシンのみの場合も染色液の劣 化は速いのでしょうか？ [返信]; 通常の HE 標本と同様と考えてもらって構いません。新調した液はかな り色素が組織につくので、色素自体の減少度とでもいいましょうか、消費される 色素量もおおくなるのではないかと思います。たしか、川井さんの報告だと塩 酸処理するエオシンの量は 10g ですが 5g でも使用に際して支障はないと書い てあります。また、使用液(アルコール希釈液)の割合は 1:3(アルコール)なので 東海の場合には成書の 1/2 量で行っている可能性が考えられます。色素量が 1/2 量のためにタレが速いのかもしれませんね。レスを待ちましょう。(週末は 学会とか書いてありましたね) 原法でも保存液を使用時に希釈するように書い てあります。つまり、このことは使用液では染色性の劣化が速いことの裏付で はないでしょうか。原液がどの程度まで染色性が保たれるか否かについては 実験していないのでわかりません。ただし、使用液に関しては、褐色瓶・室温保 存で半年から１年くらいで劣化します(経験的検証)。もちろんその間も緩やかな 劣化を示しているものと思われますが明らかな劣化はそのくらいの時期から 始まるようです。(以前作るのが面倒なので多量の使用液を作った経験あり)い わゆる水溶性エオシン染色液がどのくらいまで使用可能かは私も存じ上げて おりません。フロキシンに関しては使用液に添加後一ヶ月程度はらくにもちま すよ。当院でピュア・エオシンを使用している理由というのは、1.色素の組織に 対する吸着性が良い。2.溶媒がアルコールなので迅速時の脱水性が良い等が 挙げられます。迅速用の固定液(篠田さんらの報告)を使用すると、もともと固定 液に酢酸が入っているためか、水溶性エオシンでもかなり色素が乗って来ます。 ただし、当院の場合、病理医側のリクエストで固定はホルマリンにしてほしいと のことだったので、アルコールの入っている迅速用固定液は使用していません。 もちろん、作り置きはしてあるのでイザというときには使用可で∼す。 [返信]; １０年前の標本を見てみましたが、鮮やかさが少しなくなっていました。 診断の見直しなどの場合には問題にはなりませんが、学会や論文の写真をと る時には染色しなおした方が良いかと思います。当施設は１日約１６０∼２００ 枚染色しています。３系列で染めているので１バットあたりの枚数は５０∼７０ 枚ぐらいになります。たまたま先週、３日間でかえないで１週間しようしていた ところ、土曜日にはびっくりするぐらい、エオシンがのってきませんでした。や はり、上記の磯崎さんの言っている通りかなとわたしも思います。あと、これは 経験的ですが、一度使用（染色する）と、その染色液は未使用の使用液にくらべ 劣化が早いような気もします。このことは、水分の混入のための影響かなと思 っていたりします。こんど、実験してみます。 どなたか，オステオポンチン（osteopontin）って，染めたことありませんか？ オステオポンチン：カルシウムやハイドロキシアパタイトに対する結合部位を 有する分泌型糖蛋白で，主として腎や骨に発現し，細胞外マトリックスとしてカ ルシウム沈着に関与している．一方，本因子は免疫学の領域ではEta-1 と呼ば れ，B および T リンパ球を活性化するサイトカインであることが知られていた． 近年，Ashker らがオステオポンチンは Th1 免疫応答の開始に必須のサイトカイ ンであることを報告し，免疫調整機構における本因子の意義が注目を集めるよ うになった．また，オステオポンチンには RGD 配列が認められ，これを介して マクロファージの発現する αv β3 インテグリンとも結合する．したがって，本因 子はマクロファージに対してはケモカインとして作用し，その遊走や浸潤を促 進する． って書いてあるんですけど… [返信]; ●オステオチンポンなんてエンジェル好きの抗体ね！（Bone Sialoprotein 1, Urinary Stone Protein, spp-1, eta-1, nepbropontin, uropontin という 名前であるかもしれない）Santa Cruz から出ていて immunohistochemistry と書 いてあるが、paraffin-embedded sections って書いてないので凍結切片しか染ま らないかな？Santa Cruz でも goat のポリクロが 2 種類しかでていないので、他 のメーカーではないかも。もちろんうちにはないよん∼！参考；Improved immunohistochemical staining of osteopontin (OPN) in paraffin-embedded archival bone specimens following antigen retrieval: anti-human OPN antibody recognizes multiple molecular forms. Calcif Tissue Int 1997 Apr;60(4):380-6 なんて良さそう？ [返信]; サイトカイン，ケモカイン系って，簡単には検出出来ませんよね？（一 般的には…）ほとんどの医者（特に臨床系）が，抗体さえあれば，何でも染まる と思っていやがる…（ーー；）ちょっと知恵がついた医者は，煮ればいいと思っ てやがる…（ーー；）こんな施設は，当院だけでしょうか？…●参考；Improved immunohistochemical staining of osteopontin (OPN) inparaffin-embedded archival bone specimens following antigen retrieval: anti-human OPN antibody recognizes multiple molecular forms. Calcif Tissue Int1997 Apr;60(4):380-6-@.@- ありがとう ございます．文献取り寄せてみます． [返信]; Overexpression of osteopontin in hepatocellular carcinoma. Pathology International(1320-5463)52巻1号 Page19-24(2002.01) 手元にあったのでこれを 見ると、ご希望のフォルマリン固定パラフィン切片で染色可能ですね。オートク レーブ前処理が必要で IBL 製でした。 [返信]; ありがとうございます．よかったら，紙なら FAX，デジタルならメールで 文献頂けませんか？宜しくお願いします． [返信]; Pathology International って，確か日本病理学会の学術誌でしたよね！ (あまり読んでないもんで…）失礼しました．それなら，当方でも手に入ると思い ます（ファーストでは１回しか発表したことないけど，僕も一応会員なんで…．３ 年間も会費を滞納してたけど，本年度からは銀行引き落としにしました）もし， ないようだったら，改めて連絡させてもらいます．ありがとうございました． 標本にマーキングするときの道具って、皆さん何を使っています? うちは、万年筆(カートリッジ式)でパイロット社の赤を使用しています。特に不具 合はないのですが、万年筆以外にマーキングする道具ってあるのかな・・・? もし、あったらお教え願えませんでしょうか?ではっ(^^)以前マーキング用の万 年筆にモンブラン社の高級万年筆を使っていたら、床に落としてしまいペン先 がヘナチョコになってしまった・・・。かなり高かったのに・・・。(;_;) [返信]; 細胞診のマーキングには，古典的なペンを使ってるねー（インクをペン 先に付けるやつ）あとは，CT の試験の時，貰った？買った？（当時は，¥22,000 だった：試験料）先の細いサインペンみたいなやつを，昔は使ってたねー(^.^)!!! アチキは，この¥22,000 のペン１本しか持ってないんだけど…何本も，持ってる ヤツがいて…おーい，また今年も¥22,000 のペン買うのー！？って，からかっ てた…(~v~)!!!笑えない(?.?) [返信]; 弊社には専用マーカーがあります。対物レンズの形をしているので、レ ボルバに常時つけておけます。 ガ イ ド を 標本に 向け て 軽く 押す だ け で 、 マ ー ク が で き ま す 。 E-Mail: [email protected] URL: http://www.zeiss.co.jp [返信]; へぇ∼。知りませんでした。さすが・・。ところで、先ほどカタログをみた のですが、これって載っています?チョットイメージが沸かないのですが・・・。と いうことは・・・、マーキング時には実際の細胞は見れないということなのでしょ うか(>_<)。う∼む、よく解からない(;_;)デモ機は何度か覗かせて戴いたのですが、 そのマーキングシステムの実物にはお目にかかれなかったような・・・。 すみません、御存じの方教えて下さい。今週末、電顕学会で札幌に行ってき ます。今からでも間に合う格安航空券情報や札幌お勧め情報など、何かあり ましたらお願いします。 [返信]; 毎日何便も飛んでるから，直前でも大丈夫でしょうー！？いざとなった ら，北斗星 or 大洗海岸からフェリーって手もありますよー(^.^)V ちょっと高めだ けど… 板前料理“深谷”（札幌市南４西４．ロビンソンデパートのすぐ近く．TEL： 251-0663）がおすすめです．時価だけど，旬のいい魚が食べられまーす．腹一 杯喰って呑んで，一人福沢諭吉１枚位かな？ボーノボーノ ヤムヤム (^-^)!!! [返信]; インターネットでとれますよ。早朝便ならまだ特割りが残ってるようです。 （ANA） ところで，皆さんのところでは，ホルマリン固定後の水洗って，どうしてま す？ うちは，手術材料や解剖材料では，切り出しのとき臭いんで，十分水洗してから 切り出しし，それから包埋してるんですけど…生検材料なんかは，あまり水洗 せず（カセットに入れてから，５∼10 分くらい？…，人によっては水洗せずその まんま？…）に，自動包埋装置にかけてるんですけど…皆さんとこは，どうして ますか？ホルマリン固定後の水洗は，どれくらいやらなければいけないってい う記載もあまり見られないように思うんですけど！？…水洗不十分（ホルマリ ンが残ってる）だと，染色（例えば，PAS とか）に影響とかしないんでしょうか？ …どないです (? .? )さっ，天気もいいし，お出かけでもしようかなー (^.^)V [返信]; ●以前に神奈川の病理研修会で武藤の渡辺さんの講演（H.E.だったか 固定のことだったかは忘れた）で、私が同じようなことを質問した覚えがありま す。”ホルマリンによる固定は可逆的なのであまり長く水洗しない方が良い。” という内容に対して、”どれくらい水洗すると組織に悪影響が出るのか”といっ た内容で質問をしたら、”試した事がないので分からないが、数日という単位で 水洗をすると悪影響が出てくると思う”との回答で、逆に私のところではどれくら いの時間なのかと逆質問されました。その時は、確か”動物などの小組織では 余分なホルマリンを洗い流す程度、剖検材料では半日程度”と答えたような気 がします。私の持っている古い赤本には、10％ホルマリン固定で 2-7 日固定し て 12-24 時間流水で水洗して脱水包埋に移ると書いてあります。佐野先生の組 織学研究法には 10％時 3-7 日固定で 12-24 時間水洗、20％時 1-3 日固定、24 時間水洗と記載があります。昔（私が病理に入局した頃）はこれらの古典に準 拠してやっていたような気がします。今は前記の用に数時間からせいぜい半 日止まりかと思います。自動包埋機の時間セットと自分の都合に合わせている のが現状かな。 [返信]; ●そうなんだー！逆に，水洗不十分だと，どうなりますかー (? .? )残って いるホルマリンの影響とかは無いですかー？ [返信]; ●今や廃版の病理技術マニュアル 3 によると”固定完了後の水洗につ いて”という項がありそこにはたいていの技術書に、組織片の固定完了後はよ く水洗して脱水、脱脂列に進めるように書いてあるが、その必要はまったくない。 ないどころかしばしば有害でさえある。理論的にもホルマリン固定は一種の可 逆反応であるから、いったん固定された組織片でも、組織中のホルマリン濃度 が下がれば蛋白質は、少なくとも不安定な状態になる。水洗することなく、ただ ちに脱水、脱脂列に移すべきである。経験上、一晩程度の水洗で、顕微鏡標本 の上でただちに気が付くほどの変化はないが薄切片が 2um 程度だと、目さえ 慣れればかなりの程度気になるのは事実である。取り扱い上、水洗が必要な 場合でも、できるだけ短時間に留めるのがよく、もちろん水洗ししないに越した ことはない。（原文）つまり必要以上に固定時間が長くないのであれば水洗は 不要。PAS 等に非特的な反応がでるのは過固定であったか、自動包埋装置の アルコールなどが汚れていたかなど水洗以外の問題ということかな。 [返信]; 固定後の水洗の件ですが、更に調べてみました。病理技術マニュアル 3 病理組織標本作製技術 上巻 切出しから包埋まで 日本病理学会編 p23∼ 附 固定完了後の水洗についてたいていの技術書に、組織片の固定完了後は よく水洗して脱水・脱脂列に進めるように書いてあるが、その必要はまったくな い。ないどころかしばしば有害でさえある。理論的にもホルマリン固定は一種 の可逆反応であるから、いったん固定された組織片でも、組織中のホルマリン 濃度が下がれば蛋白質は、少なくとも不安定な状態になる。水洗することなく、 ただちに脱水・脱脂列に移すべきである。経験上、一晩程度の水洗で、顕微鏡 標本の上でただちに気がつくほどの変化はないが、薄切片が 2 μm 程度だと、 目さえ慣れればかなりの程度気になることは事実である。取扱い上、水洗が必 要な場合でも、できるだけ短時間に留めるのがよく、もちろん水洗しないに越し たことはない。と記載されています。また、先日購入した"Theory and Practice of Histological Techniques" John D. Bancroft(Editor), Marilyn Gamble (Editor); Hardcover; @ $179.00 の中には水洗の記載はありませんでした。プロセッシン グ機器の第一番目にはホルマリンが使用され、続いて 70%アルコール∼という 具合に設定するような記載でした。当院はというと、基本的に生検や手術材料 も翌日報告を心がけでいるので、流暢に水洗している時間はありません。ほん とうに軽く水洗するか、もしくはしないでそのまま包埋装置に入れるかです。脱 灰したものに関しては、ある程度長い時間水洗を行っています。基本的にホル マリンは水及びアルコールに可溶であり、明確な記載はないもののかなりの 量を溶解することが可能な物質です(化学辞典には載っていなかった)。つまり、 包埋過程での脱水系列時には同時に脱ホルマリン作用も並行して作用してい るものと考えています。包埋装置のアルコール量も必要以上に多いので水洗 の必要性は感じません。つきつめて考えると(ホルマリンを除去するという目 的)、固定完了後の水洗よりも脱パラ後の水洗のほうが重要のような気がしま すね。ホルマリンが蛋白質の三次元構造に歪みを与えるという固定方法が可 逆の反応であるという意見に関しては、私も賛同します。なぜなら、もし不可逆 な反応ならば、臓器の保管に関しては水でも良いわけで、それを使用していな いということは、やはり可逆性があるのだと考えられます。ただし、可逆である というからにはホルマリンによって固定された蛋白質が完全に元の状態に戻る かといこと関しては、そうは言えません。つまり、架橋を形成するメチレンの蛋 白質との結合距離が適正であり、立体化学的歪みが生じていないものに関し ては、その不可逆性が保たれるものと解釈しています。免疫染色などの賦括化 で、加温するものがありますが、その効果がメチレン架橋の解離に限局するも のであるとするならば、このメチレン架橋というものは予想外に結合力が弱い ものなのかもしれませんね。でも、賦括化に関しては能書きどおりに行ってい るシロウトのようなものなのでよく解かりません。ではっ(^^)水という物質はこれ また面白い特性がありますね。化学の復習を兼ねて是非アップしたいと思って います。(^_-) [返信]; 皆さんのレスが速すぎて、回答にタイムラグがでてしまいました。私的 には、薄切・脱パラ後に水洗するから問題ないと思っています。 シッフ液を自作しているようですが、よろしかったら組成・作製方法を教え てもらえませんでしょうか。 こんばんみ∼(＾-＾) シッフ試薬の作り方書いておきます。が、既製の本にある ものと一緒だと思いますよ∼。シッフ試薬 塩基性フクシン...1ｇ 1N HCL...20mｌ 重亜硫酸ナトリウム（無水）...1ｇ 活性炭....2∼3ｇ 蒸 留水...200mｌ ①蒸留水を沸騰させ火を止めてから少しずつ塩基性フクシン を加える②5∼10 分煮沸③50℃まで自然冷却④1N HCL を加えて 25℃まで冷 やす⑤これをろ過する⑥重亜硫酸ナトリウムを加え溶解し冷蔵庫で 2∼5 日密 栓保存する⑦活性炭を加えよく吸着させてからろ過する（無色）になる 以上で すがおかしかったら言ってください 今度，臨床検査系の雑誌に， “酵素抗体法，過染してしまったら，どうする？” ってタイトルで執筆依頼（Q&A)が来てるんですけど…通常の HRP-DAB による 染色の場合，一度過染させてしまったら，もう戻れないですよねー？（もう，あ なたと私は，引き返せない関係になってしまったのよー(‘.’!) もう戻れないの (‘.‘;)！：よく，○○君が言われているセリフ…）仕方ないから，Q：“酵素抗体法， 過染してしまったら，どうする？”A：“ばかやろー！，気合い入れて染め直せ ー！（ーー；）”とでも書いてやろうかと思うんですが，そういうわけにもいかな いので…皆さん，何かいい方法知ってませんかー？ [返信]; ●対処療法ですがヘマトキシリンでの核染を強めに行う位ですかね。 （本質的に過染（共染？）が良くなるわけではないが見やすくなる） [返信]; 一度過染してしまったら・・・・・・あなたと同じく、救えない。あぁ∼∼、神 様(=_=)。。 [返信]; DAB 過染の件についてですが、昨今の免疫染色は診断的要素が強くな っているので必要以上に手を加えていくことは、すこし危険な印象を受けます。 また、過染をなんとかならないかといわれても、じゃあ少し色を落とせばいい のか、どこまで戻せば良いのかなど、ちょっとわかりづらい質問ですね。まぁ、 そのような危険性を無視してでも本問題を解決するとするならば、どの段階を ターゲットに、問題に対処していくかが問われます。(共染ではなく単なる過染 について)ターゲットとする段階としては 1. 一次抗体とその抗原物質との反応を 切断する 2. HRP-DAB を切断する 3. DAB 発色をなんとかするなどが考えられ ます。私は、免疫反応に関しては専門ではないのでそれに類する機構はお答 えできません。 私が考えられることは DAB の発色に関することくらいかな(>_<)。方法としては 二つ考えられます。まず、DAB を過酸化の状態にして分子の共鳴振動帯を遷 移させること、あと酸化して発色するのだから逆に還元して元の状態に戻すと いう方法です。酸化に関しては、生体試料にも使用可能な酸化剤が多数ありま すよね。だからこれは可能です。そして、還元する方法はというと、生体試料で 強い還元性を持たせる試薬は私の知る限りではありません。有機合成などで は 非 金 属 性 で は H2S,HI,I-, 低 級 酸 化 物 お よ び 低 級 酸 素 酸 塩 (CO, SO2,Na(H2PO4), Na2S2O3, イオン化傾向の強い金属またはそれらのアマルガ ム及び低原子化金属塩(Li, Na, Ca, Mg, Zn, Fe, Fe(II), Sn(II), Ti(III),Cr(II))など、水素 化物(AlH[(CH3)2CHCH2], LiAlH4, NaBH4)などが挙げられます。特には水素化合 物の還元剤が主流のようです。ですが、これを生体試料に利用するのはちょっ と困難なので、事実上はかなり難しいと思っています。だから、還元について は現状では困難だと思いま∼す。で、ですね。先に結論から申し上げておくと、 次亜塩素酸によって酸化させることで発色強度を軽減させることが可能だと思 われます。 ただし、濃度・時間についての詳細な検討はしておりません。どち らかというと高濃度且つ短時間で処理するのが良いと思います。この方法はバ ックグラウンドを下げるというよりは強く染まった DAB 発色に対して過酸化?の 状態を作りだし見た目の発色を押さえる作用があります(いわゆる漂白?)。でも、 完全には漂白されません。完全に漂白する前に組織が溶けてしまいます(次亜 塩素酸はかなり強い組織破壊(融解)を引き起こします)。また、DAB 発色も茶褐 色から黄色みがかった茶色のような発色に変化します。(さっき実験してみまし た)ということはですね。過酸化にしてあげるとうまくいくかもしれません。例え ば、メラニンの漂白法(過マンガン酸カリウム-シュウ酸処理)での処理なんかも 成功するかもしれませんね。(これは試していません)また、高濃度の過酸化水 素なんかも良いかも・・・。非常におもしろそうな感じがしますね(^_-)。DAB の発 色機序に関しては私はよく知りません。m(__)m これを機会にすこし勉強しま∼ す。 [返信]; 過染（Overstaining）と共染（交差反応：crossreaction）では，まったく意味 が違うのじゃー (-.-!) お間違えのないように… 過染してしまったら… 染色し たプレパラート自体をいじるのは困難かもしれないけど，標本を撮影して，フォ トショップ等で明るさ・コントラストを変えるって手はあるよねー (^.^)!!! [返信]; ふむふむ、科学的な処置で過染が薄くなるのですね。自分としては、染 め直す方が簡単なのでそうしていますが。 借用標本で未染が残っていない場合は困ります。二重染色のときに使うグリシ ン Buffer でも少しは薄くなりますが...... うーん、難しいと思います。（ーー） [返信]; へぇー！遭難ですか！？初めて聞きました．また，何かいい情報があ ったら，教えてちゃぶれ m(_~_)m [返信]; 過マンガン酸カリウム-シュウ酸処理！！は、ダメダメでーす これは、 ＤＡＢ反応産物そのものが、分解されて消えてしまいます。この方法で、同一細 胞での２種抗原の証明をしたことがあります。１回目に免疫反応・ＤＡＢ発色し、 撮影した後、過マンガン酸カリウム-シュウ酸処理で漂白する。２回目に、次の 目的の抗体で免疫反応・ＤＡＢ発色し、撮影する。こうして、同一細胞で２種の抗 原の存在を証明するというやり方です。ただし、１回目の抗原が、この酸化・還 元でも影響が無いことが前提ですが。 [返信]; 消えるということは・・・。この言葉は私にとって「OK,OK でーす」に聞こ えます。反応時間や濃度などを検討すれば過染（Overstaining）処理に使えるの ではないかと思ってしまいます。 [返信]; 前回の説明中で誤りががりましたので、謹んで訂正させていただきま す。「１回目の抗原が、この酸化・還元でも影響が無いことが前提ですが」の１ 回目の抗原ではなく、２回目の抗原ですねゴメンナサイ [返信]; 過染ですが、もう今さらかもしれませんが、やはり酸化ですよね。過マ ンガン酸、重クロム酸、高濃度の過酸化水素いずれも色は落ちますが、やはり 染色度合いのコントロールは難しいし、脱色して次に染色しようとしても、抗原 性が失活していることが多いし、HE 染色をしても染まってこないし、良いことな いですよね。あと、デジタル処理ですが、確かに最近はマクロもミクロもデジタ ル化されていて、簡単に処理できてしまいますが、本に書いてしまうのは、あ まり賛成できません。少し前に聞いたことですが、医学写真学会っていうのが ありまして、そこで、デジタル処理の問題が提議されたようなんですが、やはり、 最後にはその写真を使う人のモラルに任せるしかないような事を聞きました。 [返信]; DAB の発色機構について調べてみました。このあたりを詳細に書いた 資料が手元にないので推察的考察の部分が多いのですが・・・。また、私にとっ てこの難問の解明はかなり苦労しました。おかげでアップがこんなに遅れてし まったし、その間モンモンとした日々を過ごしてしまった(;_;)。反省 DAB はビフェ ニル([Be]-[Be])にアミノ基が片方の[Be]に二つ、計四つついた構造をしていま す。( [Be]: ベンゼン環を表現しました )ベンゼンに対してベンゼンが共有結合 性に結合するときには、オルト-パラ配向性活性化基となります。また、アミノ基 がつく場合にも強いオルト-パラ配向性活性化基となります。DAB の場合、この 理論と矛盾するか否かは非常に問題があります(構造式からはオルト-メタの配 位 と も と れ る ) 。 実 際 に は [Be]-[Be]3,3'-diaminobenzidin の 名 称 で す が 3,3',4,4'-tetraaminobiphenylという表記もあります。HRPと過酸化水素の酸化によ り茶褐色の発色を示すようですが、単体としては電子顕微鏡の分野で使用され ているような記載がありました。DABはビフェニルに四つの一級アミノ基を有す る構造(アリ−ルジアミンが二つパラ位でつながった構造)ですが、この一級ア ミノ基はベンゼン環に結合する OH 基と同様に酸化に強い反応を示します。第 一級アミンの反応性はベンゼンに付加する反応基のなかでは活性が非常につ よいのが特徴です。また、[Be]-[Be]の共有結合は回転可能で、且つアミノ基も 回転可能です。下記にも示すように多数付着したアミノ基がその回転可能なこ とにより様々なアミノ酸とアミド結合をすることが可能(二つのアミノ基の結合で きる距離範囲が広い)です。また、ベンゼン環は伸縮性に乏しく、アミノ基が-OH 基をもつDNAや他の蛋白質と容易に結合してしまい、DNAの複製・合成に悪影 響を与えることは明らかで、ここが発ガン性があるといわれる所以だと思われ ます(-OH 基に対してアミド結合を起す)。DAB の発色に際しては H2O2 の存在 が必須になります。調べた限りでは、一級アミノ基は強い酸化で-NO2 とります。 しかしながら、単純な酸素を付加する酸化反応ではベンゼン環にある-NO2 基 はメタ配行性活性基であり反応はここで止まってしまいます。個人的には、 DAB 発色のあの濃い茶色はこれでは納得できません。ここでペルオキシダー ゼの役割が重要になります。ぺルオキシダーゼは H2O2(酸化剤として作用す る)の存在下で酸化還元を行う酵素です。この酸化還元に関しては単なる酸素 の付加という形ではなく、水素の供与体と受容体という関係の酸化還元の形式 となります。つまり、水素(プロトン)を与える側は(+)の原子が減るわけですから その原子(分子)はトータルで(-)の電荷を有することになりこれが酸化されたと いうことになるのです。一例を挙げると HO-[Be]-OH という物質に対して H2O2 存在下でペルオキシダーゼを反応させるとO=[Be(キノン)]=Oという物質に変化 します。水素がなくなっているのがよくわかりますね。このような、考え方に基 づくと反応自体がおぼろ気ながらでてきます。DAB の発色機序(ポリマー系 HRP-DAB)1.アミノ酸ポリマーに吸着させたペルオキシダーゼと DAB が酵素基質複合体を形成する 2.ペルオキシダーゼの作用(酸化還元)によって複合体 中 DAB のアミノ基の水素が N から剥ぎ取られ N2-となる。3.活性の高い N2-と 溶液中の DAB がアゾ化合物を形成する 4.巨大発色基団となる。です。図解 DAB H2N NH2 | | H2N-[Be]-[Be]-NH2 ■ ■ ■ ■ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ■: ペルオキシダーゼ ~~~~~~~~~~ : アミノ酸ポリマー となり :N N: :N N: | | | | :N-[Be]-[Be]-N: または :N-[Be]-[Be]-N: ■ | ■ | ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~ となり R-N=N N=N-R N=R N=R | | | | R=N-[Be]-[Be]-N=N-[Be]-[Be]-NO2(-NH2) ■ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ (H2N-)O2N NO2(-NH2) | | R: -[Be]-[Be]-NO2(-NH2) となり、発色するというものです。専門の皆様いかがでしょうか ではっ(^^) [返信]; さきほど病理と臨床 Vol. 6 臨時増刊号 免疫組織化学 昭和 63.14 に それらしき図表がありました。真偽のほどは定かではありませんが、ちょっと 反応に無理があるような気がしないでもありませんね。先日のメール(DAB に ついて)の補足説明というか訂正というか・・・。まず、図においてペルオキシダ ーゼはあんなに小さくありません。誤解のないようお願いします。また、 DAB-HRP 複合物に対して DAB が吸着する反応では、オルト-パラ位の-N:また は-NH2が結合しamino-azinsをすることは可能です。また、-NH2が脱水素化さ れると-N=と記しましたが、実際には-N≡になり-N=N-となる可能性が高いよう なきがしま∼す。ちょっと表現が難しい・・・。難しすぎ? 皆さんのところでは，ゲフ（迅速）の標本作製は，どうされてます？ うちでは，検体を OCT コンパウンドで急速凍結し，クリオスタットで薄切．固定 は，ホルマリン 10，エタノール 90，酢酸１の固定液で１∼２分固定し，ヘマトキ シリン１分エオジン 30 秒くらいで染めてるんですけど… [返信]; こんにちは。固定は無水アルコールで１分 染色は同じくです。迅速免 疫染色の時には、リンパ球系の抗体の時にはアセトン核内抗原の時には、ホ ルマリンとアルコールの等量混合その他はアルコールで行っています。あと、 脂肪を大量に含む組織の時にコンパウンドにビオレなどの洗剤を混ぜて凍結 させると切りやすいと聞きましたが、まだ、洗剤をいれるのが恐くて試しており ません。界面活性剤は試しましたがいまいちでした。班長はじめどなたか経験 ありますか？ [返信]; OCT コンパウンドで急速凍結（液体窒素）３０秒し、液体窒素中より、取 り出す 包埋皿から自然に外れるまで放置（３０秒くらい？）＊凍結ブロックをテ ィッシュペーパーで包む＊＊手中に握りしめる（３０秒くらい？）でガラス等の準 備＊これにより、凍結ブロックの温度を【-２０∼-２５℃】位に戻す！！薄切の 極意！！固定は同じヘマトキシリンは今は、ギル５で２０∼３０秒分別なしお湯 で色出しアルコール性エオジン １０秒（１０回から１５回）すばやく水洗脱水・透 徹封入おしまい [返信];脂肪検体の界面活性剤は試しましたがいまいちでした。自分もスゴー ク楽しみにしてやってみましたが同じ感想でした。去年の全国技師会のあれで すよね！ちょっと通販気味ですかね？ [返信]; こんばんみぃ∼。ゲフの脂肪組織ですが、うちでは、ママレモンを入 れて使用しましたが、ゴミ箱にいった気がします。なんか、いい方法教えてくだ さい。 [返信]; 迅速標本作製について当院の方法をお知らせします。-80℃の冷凍庫 に入れてあるヘキサン溶液に OCT コンパウンドに入れた組織をドボンで∼す。 クリオスタットで薄切後 20%中性緩衝ホルマリンにドボンといれます。その後、 電子レンジに入れて 5 秒三回照射後しま∼す。そして、水洗ヘマトキシリンも電 子レンジに入れて 5 秒三回照射ぬるま湯に入れて水洗エオジン(自家製ピュ ア)10 秒脱水・透徹・封入で∼す。脂肪組織の多いものは根性あるのみで∼す。 クライオンなどで再凍結すると比較的切れる・・・かな。 [返信]; 脂肪染色だけは、20％ホルマリンですけど あと、さくらの迅速固定液 もいいですよ。あれは、緩衝材も入っていて、さらに迅速固定でもあるし。てと こかな。また、迅速特殊染色の依頼原稿を書きます。来年の医学書院「検査と 技術」の技術講座です。あっちこっちで似たことばかり書いてますね。まあ、頼 まれるうちが花かな・・・もうちょいで、人生○○年になるので、のんびり、好き なことやって行きたいと思っているのにね・・・ [返信]; 是非とも脂肪という難題を解決していただきたいものです。(後輩から の切なる希望(^_-)) グリメリウス染色の一方法 今回グリメリウス染色の一方法を書かせていただきます。この方法で染色時間 はト-タル３時間あればだいたい染まります。2 日間かけてる方、一読を.. ∼グリメリウス染色法∼ ①0.3％の硝酸銀を作りこれを D.W で 10 倍希釈 （0.03％硝酸銀を作る。でもこれが 0.05％でも大丈夫よ∼ん）②還元液 ヒドロ キノン..0.03g 亜硫酸ナトリウム..2.5g D.W..100ml 始めに少量の D.W でヒドロを 完全に溶かしてから亜流ナトを溶かし 100ml にメスアップ③スライドガラスを D.W でよく洗った後、0.03％銀液を恒温槽にいれ温度を 58∼59℃に設定しスタ ート（15 分位で 58℃になります）④同時に還元液と洗い用の D.W も温めはじめ る⑤0.03％硝酸銀に 1 時間30 分位鍍銀後還元する⑥1 回ではたぶん弱いので 温めておいた D.W で良く洗い再び鍍銀30 分 ⑦これでだいたい出ると思いま すが弱ければ再び鍍銀してね⑧水洗後 5％ハイポ 2 分位 ⑨ケルンエヒテ ロート 5 分位⑩脱水、透徹、封入＊注意点＊・鍍銀は孵卵器など温度が不安 定なものはさけましょう・塩化金でバックを消すのはやめましょう・ブアン固定 はイタズラにコラーゲンを染めるだけなので使うのはやめましょう・銀液に入 れる前など切片はよくふいてからいれましょう・銀液と還元液の温度差がない ようにしましょう・強すぎるハイポは銀を逆に落とします 以上クレームは受け 付けません。失敗しても恨まないでください。よろぴく∼ [返信]; ●ヒドロキノンの量が結構少ない（通常1％）けれどそこがミソかな？高 温で反応させるとエンドポイントが難しいですからね。●避けたいのはやまや まだけど他にない貧乏な大学ではどうしましょう？●陽性が引き立って良いよ うな気がするのだけどダメ？バックがかぶった時は結構効果が有るような気 がするが。●バックのかぶりを低下させる効果があると思うがこれもダメ？● 写真用の定着液が良いみたいですね。●受け付けなくても勝手レスして盛り上 がりますよ∼。 [返信]; グリメリウス染色って、経験上ハイドロキノンの優劣に左右されるような 気がします。新しいとバックも出ず、古いとバックがでてくるような気がします。 免疫染色が普及した現在、オーダもめっきり減りそのたびに新しいハイドロキ ノンを購入するハメに陥っていま∼す。 質問です。脱灰後の免疫染色って、染まるのですか？ 抗体によっても違うとは聞いたのですが、詳しいことを知っている方、教えてく ださい_(._.)_あと∼、脱灰液の違いによってはどうですか？うちでは、KCXを使っ ているのですが、免疫染色の可能性のあるときは EDTA にしています。あとぉ ∼、ブロックにして、面出しした後に 脱灰液につけたりしています。意外と切 れるんですよねぇ∼(^-^)、でも 免染でるか不安(-_-;)（ぬるま湯で、石けん水を 作り、５分ぐらい浸けて、んで、水で洗った後、いつも通り薄切！！これもや る！！）皆さんどうしていますか。教えてください。 [返信]; ●私もあまり経験がないんで文献的なものになりますが、○過脱灰や 硝酸を使用しなければ影響はほとんどない。○CD5, CD43, CD20, CD79a など が脱灰操作により抗原性が減弱する。○表面マーカーの失活を防ぐには EDTA による低温脱灰が良い。といったようなことがでていますね。結構大丈夫 な感じですね。Let`s try 最近では以下の論文がありますが、見ていません。 Immunocytochemistry for the Hard Tissue Formation Journal of Hard Tissue Biology(1341-7649)10 巻 2 号 Page123-124(2001.11) [返信]; ●灯台下暗しで神奈川県臨床衛生検査技師会雑誌の抄録に良い文献 がありました。免疫組織化学的染色における脱灰操作の影響 特に腫瘍におい て24巻2号 Page120(1989.04)腫瘍では正常組織より抗原性の保持は弱く、中で も高分化型より低分化型の方が、抗原性は弱い。無機酸類、特に塩酸を使用し た場合、影響が大きい。5%ギ酸ホルマリンが良好など [返信]; この論文読みました。非常になつかしく感じます。まだ、職について間 もないころの話です。う∼ん、本当に懐かしい。でも・・。結構いけると思います が・・・。日臨技などにも類似の報告があったような・・・ [返信];当施設では、5％ギ酸/10％ホルマリン液 or プランクリュクロ液を使用し ています。1 晩いれて出します。（堅いものはそれ以上）これぐらいだと、だいた いの抗体は大丈夫ですが、脱灰時間が長いと、影響があるようです。（特にリ ンパ球の膜抗原）EDTA がよいという説もありますが、使ったことがないので、 なんともいえません。どうなのでしょうかねえ。（? _ ?） [返信]; プランクリュクロって２時間程度の脱灰時間ではダメですよねぇ。やっ ぱり一晩いれないと・・・。これって迅速脱灰液って言えるのでしょうか?なんとな く不満(-_-メ) EDTA は無機金属イオンをキュレート結合で複合物を形成し、脱無 機金属作用が発生します。エチレンジアミンってホルムアルデヒドからも作れ たような・・・。(不確かな情報)で、あまり害はなさそうですね。 病理の市販システムにドクターヘルパー なるシステムがあると聞きました。鉄道系の会社が作っているらしいのですが、 詳しいことを知っている方がいらっしゃいましたらご一報戴けませんでしょうか。 お願いします。 [ 返 信 ]; ○ 住 友 電 気 工 業 が 作 っ て い た よ う な 気 が 。 http://www.lan.sei.co.jp/management-soft/DrH/index.html でもちょっと違うような 気が。いじくれば病理のシステムも作れないことはないですが。汎用システム で す ね 。 テ ク ノ ラ ボ ； 病 理 シ ス テ ム http://www.tlabo.com/product/byouri/index.htm 住商情報システム；PathoPack http://www.scs.co.jp/pdf/pathopac.pdf マ ツ ナ ミ 硝 子 ； Path Window http://www.matsunami-glass.co.jp/medical/pw/pw.html サクラファインテック； CNA-Net http://www.sakura-finetek.com/syouhin/byouri/byouri.html Nikon ； Expath http://www.ave.nikon.co.jp/instech/mi/m_sys/expath.htm フェズインター ナショナル；病院病理システム http://www.fes.co.jp/system2/system2iryo.html A&T ； CLINILAN PA http://www.aandt.co.jp/jpn/product/pa.htm UPA ： UNIVERSAL PATHO http://www.uap.co.jp/j-it.html モ ノ リ ス ； PATHO View http://www.qbiz.ne.jp/monolith/patho.html といったところはいかが。 ●メーリングリストからのメールに振り分けルールを設定するとはどうす ればいいのですか？教えてください。 皆さん，メーリングリストに参加されたとたん多くのメールが配信されてきて， 戸惑っていらっしゃるのではないかとご察し申し上げます．Outlook Express5.5 での本メーリングリスト[PathologicMT-NET] からのメールを振り分ける方法を ご説明します．まず，ファイルから，フォルダ→新規作成で，ローカルフォルダ の中に[PathologicMT-NET] というフォルダを作成します．次に，ツール→メッ セージルール→メールで，１（ルールの条件）：件名に指定した言葉が含まれる 場合と２（ルールのアクション）：指定したフォルダに移動するにチェックを入れ ます．３（ルールの説明）で，件名に[PathologicMT-NET] を含む場合， [PathologicMT-NET] フ ォ ル ダ に 移 動 す る に し て ， ル ー ル 名 を [PathologicMT-NET] にし，OK をクリックします．これで，今後，本メーリングリ ストからきたメールは，[PathologicMT-NET] に移動します．Windouws の Outlook Express5.5での手順を記述しましたが，OSやソフトのバージョンが多少 異なっても同様の操作をすれば大丈夫だと思います．（Outlook でもたぶん同じ ような手順だと思います）また，他のメールソフトでも同様の機能を有している と思います．簡単な説明で申し訳ありません．ご理解頂けましたでしょうか！？ 何かご不明な点などございましたら，ご連絡下さい．くだらないメールも多く送 られてきます．（ほとんどは，私からのもので…，あまり堅苦しくならないように とのつもりで出しているのですが…，申し訳ありません．）メーラーが一杯にな らないように，必要のないメールは，どんどん削除して下さい．（削除されても， 過去のメールは，ログファイルをご希望されれば，読み直すことが可能です） なお，本メーリングリストは，いつでも入脱会が可能です。ご不明な点やご意見 などございましたら，何なりとお申し付け下さい．今後とも宜しくお願い致しま す． マッソントリクローム染色に使っている青は，アニリン青ですか？それとも メチル青ですか？ 皆さんのところで，マッソントリクローム染色に使っている青は，アニリン青で すか？それともメチル青ですか？アニリンは発癌性があるとかで，今入手出 来るアニリン青は限定されてしまっていて，あまり染色性がよくないって聞いた ことがあるんですがー…どないでっか (? .? ) [返信]; アニリン青を使ってます。メチル青は使ったことがないです。和光、クロ マ、メルクとそれぞれ 1 本づつまだ在庫があり、クロマかメルクを使っています。 まだ当分もちそうなので今のところ切り替えるつもりはないです。ちなみに和 光からは粉は出ていませんが、溶かしたアニリン青液は販売していますね。 [返信]; アニリン青を使っています。教科書に書いてある以上これを使うのが 標準的ですよね。"Theory and Practice of Histological Techniques" John D. Bancroft (Editor), Marilyn Gamble (Editor);ではメチル青を使用するように書かれ ています。代用色素としてアニリン青は書かれています。以前も述べたように ベンゼン環につくアミノ基は活性が高く様々な物質と反応します。発ガン性って このへんによるのかな?色素のもつ波長自体も、ほとんど差はありません。メ チル青 約 607nm アニリン青 595-610nm です。違いはスルホン基の位置とベ ンゼン環の数その他です。メチル青は構造式をみた限りでは非常に対象性の 良い構造になっています。メチル青およびアニリン青は aminotrimethane 系の 色素(パラローズアニリンなどもこの部類です)に属し、構造式の似通った類縁 色素です。構造式をみた限りでは、メチル青のほうが染色幅(域?)が狭いような 印象を受けます。マッソンの青は濃いほうが引き締まった印象がありますね。 [返信]; MT 染色の青のことですが，以前間違えて，微生物用？（25%？)とかいう アニリン青を買ってしまって，それを使ってアニリン青液を作ったら，なんか“気 合い”の入らない，寝ぼけたような染まりになっちゃったことがありました．皆さ んも，購入するときは注意してねー (^.^)V アチキは，メチル青を使って，MT 染 色したこともあるんですけど，結構シャープな染色性で，“いい感じ”でしたよー (^.^)V アチキも，基本的には，切れのある染色の方が好きだピョーン (^.^)!!! [返信]; メチル青についてもう少し調べてみました。メチル青(CI.706, methyl blue, Methylblue, cotton blue, helavetian blue)などとも呼ばれる。細菌学の領域で基本 小体(ウイルスやリケッチア、またはそれによって生じた封入体)の染色に用い られることがある。Mann 染色に用いられる以外あまり多方面にもちいられるこ とはない。と記載されていました。使ったことはないのですが、ウォーター青と いう色素も膠原線維染色に使用されていたという記載もあります。よく調べたら これはアニリン青 WS(CI42755)のことでした。アニリン青はチャイナ青という別 名もあります。また、Spirit blueも大きな意味でアニリン青と呼ばれています。綿 などを青く染めるための色素であったと考えられます。最近では、化学繊維が 発達しているために、染料 dye というものは以前と比べて少なくなってきていま す。化学繊維の着色方法には沢山ありますが、最近では繊維の設計(高分子設 計)の段階で色素をその配列の中に組み込んで合成する手法が多くみられま す。後から染めるよりも退色が少なくけんろう性が高いのだそうです・・・・。また、 脱線してしまいました。ではっ(^^) [返信]; メチル青関連の記載を掲載します。病理技術マニュアル 3 病理組織標 本作製技術 下巻 染色法 より●アニリン青(C.I.42755)エタノールには溶けに くいが、水にはよく溶ける。以前は water blue I(C.I.42755)(現在のアニリン青 WS) と methyl blue(C.I.42780)の混合物であった。そもそもは sprit blue(C.I.42755)のス ルホン化生成物の塩であった。最近では、この混合物はほとんどなくなってい るが、メーカによってはメチル青をアニリン青と称しているところもあり、若干の 混乱があるが、両者の間には染色性については大きな差はないといわれてい る。非常に大きな分子であるため、他の小さな分子の色素と組合せて、細胞構 造へのとり込まれ方の差を利用した染色に用いられる。 [返信]; ○蛇足sprit blueはアルコールには溶けやすいが、水には溶けにくい。 アニリン青と逆なのが面白いですね。 [返信]; 先日上司にお願いして、メチル青を購入しました。Methyl blue C.I.Nr 42780 Merck早速Massonで比較してみました。結果はメチル青のほうがややコ ントラストの良い青色を呈しました。ただし、対照としたアニリン青は新調したも のではなく、少し使い込んだものでした。メチル青の染色液の組成はメチル青 2g, 氷酢酸 2.5ml, 蒸留水 100ml で、Theory and practice Histological Techniques を参照しました。色素の量やその他に違いがあるために全く同一な条件では ありません。メリットとしては、メチル青は水に良く溶けるために、煮沸等の操 作を必要とせず、調整が簡単だという点と、やや青味が強調されるという点くら いでしょうか。あっ、それから発ガン性が低いという点もあげられますね。当院 ではこちらにシフトしようかなぁと考えています。 ではっ(^^) One Step Masson 染色 かなり昔の話だけど，うちで，One Step Masson 染色ってやってたことあるんだ けど… まだ，この方法を使っているところってあるのかなー？Deposit を検出 するのには，イマイチだったけど，繊維化をみるのにはそこそこ使えたような 気がしたんだけどー… もう，染色液の処方や，染色方法も定かでないけど… いまさら，One Step法を推奨しようとか，掘り起こそうとかいうつもりはないんだ けど… 簡便・迅速法としてなら使えるかもー？… 皆さーん，どないですか？ [返信]; 以前に検討した結果では、deposit 検出には、そこそこの結果がでまし たが、色調はくすんだオレンジ色というか、Masson 特有の、あの赤色はでませ ん。特に、myogenic な細胞を推定する上で、あの鮮烈な赤色はやはり欲しい気 がします。膠原線維の観察には支障はないですよ。 [返信]; one step の染色法は次の通りです。１．脱パラ後第１媒染４０分 ２．水 洗後鉄ヘマ５分 ３．１％塩酸アルコールで分別 ４．水洗・色だし後１％酢酸水 ５．Masson one step 液２０分 ６．１％酢酸水３回 ７．脱水・透徹 One step 液の 処方は以下の通りです。 Ａ：１％酢酸水にポンソーＳＸを１％の割に溶かした もの Ｂ：１％酢酸水に酸フクシンを１％の割に溶かしたもの Ｃ：0.5％アゾフロ キシン 100ml に氷酢酸0.2ml を加えたもの ①Ａ，Ｂ，Ｃを等量混合する。 ②蒸 留水100ml にメチル青（アニリン青）0.5g、オレンジＧ2.0g 、氷酢酸8ml を混合す る． ③2.5％リンタングステン酸水溶液と 2.5％リンモリブデン酸水溶液を１：３ に混合したもの①、②、③を４：４：１の比率で混合し、使用液とする。今見直す と、結構面倒くさい処方です。 [返信]; One-step 法では、赤色系の色素が吸着しないようですね。実際に私は やったことがないので、真偽の程は太田さんの結論を信用するとして・・・。この ことについて、少し意見を述べさせていただきます。なぜ赤色が乗って来ない かを私流に解釈してみました。ここで、必要となることは以前私が申し上げたよ うに、染色原理の新しい解釈をすると比較的容易にこの現象を理解することが できます。つまり、私の考える染色原理というのは次のとおりです。1. 分子量 の大きな色素は大きな荷電状態を有する また、小さな色素は小さな荷電状態 を有する 2. おのおのがつりあう荷電状態の蛋白質と結合する。3. おのおのの 色素の有する結合基による結合距離が適性なものとのみ強い結合性を有する。 です。今回の場合、巨大分子であるアニリン青と中位のアゾカルミン及びその 類縁色素、小さい分子のオレンジGという構図となります。これらは共に酸性色 素の挙動を示します。つまり、巨大色素であるアニリン青はそのつりあう蛋白 質と結合するのですが、大きな荷電状態を有することにより、その影響を及ぼ す範囲は非常に大きくなります。同じ酸性色素である赤色系色素はアニリン青 とは斥力を生じ近寄ることができなくなるわけです。オレンジに関してはもとも との荷電が弱いためにその影響は小さなものとなるわけです。話変り。よく、分 子量の大きな色素は拡散能力が小さい(つまり運動性に乏しい)という記載があ りますが、何をもってこのようなことを結論づけているのかが非常に不明確だ と私自身考えています。クロマトのような完全な二次元での拡散能力を言って いるのなら理解できますが、実際の反応系は三次元でありクロマト等の結果を ダイレクトにこの理論に反映させることはナンセンスではないかと思っていま す。実際に、アルコール溶液下で異なる分子量の色素を有する染色液(例えば EA50)を敵下するとどうでしょう。結果は低分子の色素の拡散は三次元的に類 円及び幅の広い涙状を呈します。かたや、巨大分子である色素は、重力の作 用をうけるように縦長の棒状の挙動を示します。私は、このメスシリンダーにア ルコールを満たし、現象をデジカメで撮影して、その体積分布を計算してみて います。近似計算なのでまだ完全な結果はでていませんが・・。こんなことはど うでも良いのですが、分子の挙動のみに焦点を合わせると、巨大分子は非常 に早いスピードで下方向(三次元座標では Z 軸に相当)に進むことが実験結果と して現れてきます。つまり、溶液中での落下ということが運動エネルギーとして 表現されれば運動性を表現できるのではないかとも考えられます。はっきりと した、結論はないのですが、巨大分子が重力の影響を受けるとするならば、染 色時には必ずエマルジョンが起こるために、その運動性が鈍であるという結論 には至らないと考えられます。今後実験の再現性と物理計算をもちいてそのこ とを表現できたら良いなぁと考えています。(>_<)「それが、どうしたの? そのこ とが何か意味があるの?」と聞かれても、「べつに・・」と答えることしかできませ んが、そのあたりを少しづつ解明していきたいなぁ・・と考えています。 なんでこんなところが剥がれてるの？どうしてだんだんに薄切されてる の？AzanMallory の色がいつも一定の染まりになぜならないのか？悩み多き 日々です。 病理経験は１年半ぐらいです。馴染めないところも多々あり、苦労しております。 薄切がまだ下手で四苦八苦しております。なんでこんなところが剥がれてる の？どうしてだんだんに薄切されてるの？AzanMallory の色がいつも一定の染 まりになぜならないのか？悩み多き日々です。 [返信]; それはそれは・・・。最初はそんなものでしょう(^_-)でも、なれると病理 のお仕事って楽しいですよ(^_-)ぱりっと染め上がったときの爽快感は・・・。あり ますねぇ。きっとミクロトームが悪いんですね(^_-)スライドガラスに根性がない のだと思います。これもミクロトームが悪いんじゃないですか?と自己中心的な ものの考え方もありますよ(^_-) 完全な愛情不足ですね。常にコントロールを 立てて染めてみては? 時間とともにその悩みは風化してしまいます。今のフレ ッシュな感覚で活発なご意見をお願いします。 [返信]; 揚げ足をとる訳ではないので、気を悪くなさらずに読み進めて下さい ね。変な風に思われるのは本意ではないので・・・。私も知らなかった(忘れて いた?)事実がみつかりました。AzanMallory について調べてみました。いろいろ 調べてみるとAzanMalloryっていう染色方法って載っていないのに気づきます。 つまり AZAN 染色か Mallory 染色でないと載っていないと思います。これは、 AZAN 染色と Mallory 染色染色が別物であるということを意味しています。赤本 なんかの染色一覧にはアザン・マロリー染色という記載になっていて、これが まずいのだと思います。Mallory 染色はマロリーさんが考案した膠原線維染色 です。AZAN とほとんど変らないのですが、赤色色素に酸フクシンをしようして いるのが特徴です。それに比べて AZAN 染色はアゾカルミンを使用するという 色素の違いによって名称が分かれている訳です。ちなみに AZAN 染色はハイ デンハインが考案したという記載になっています。また、AZAN 染色の名称は AZ-ocarmin とAN-ilinblue の頭文字をとったものです(赤本にも載っています。私 はこのことは脳みその片隅にも残っていませんでした・・・(ーー;)) アザン染色 の名称がすべて大文字で記載されているのには理由があるのですね。実際に 私も今の今まで混同していて、その意味合いが不明瞭なまま 15 年という長い 時間を過ごしつづけていたことに、愕然としてしまいました。どっちでも良いじゃ ないかということも言えなくはありませんが、正確にはこのようなことになって いるのですね。皆さん知っていました?えっ、知らないのは私だけ?話変り、皆さ んは AZAN 染色や Masson 染色、はては EVG 染色における原理をご存知かと 思います。有名なのはメルク?や cytology の本で書かれたシェーマですね。分 子量の違いにより色素が入り込む穴ぼこの大きさが異なるというあの図です。 私は個人的には、あの図の原理は間違っていると思っています。つまり。本当 に穴ぼこなんか存在するのか、また、そんなに都合の良い大きさの穴ぼこだら けなのか・・とか、穴ぼこのない平らな蛋白質はないのか、平らであれば電気 的結合のみなのでかなり弱いのかなどなど数え上げたらきりがないくらい疑問 を感じる図だと思っています。ごく個人的な意見を述べさせていただくと、穴ぼ こなんていうのは存在せずアミノ酸の配列が複雑に入り組んだ蛋白質が存在 するのみだと考えています。また、膠原線維などは蛋白質が規則的に並んだ 紐上の物質であると思われます。いったいどこに穴など存在するのでしょうか。 それから、病理の染色原理に習う「物理化学的染色」だとか「物理的染色」という 考え方に対してはナンセンスだと思っています。つまり、結合というのは電気 的なものであり、化学反応そのものなのです。すべて化学的染色といっても良 いと思っています。私の考える染色原理というのは次のとおりです。1. 分子量 の大きな色素は大きな荷電状態を有する また、小さな色素は小さな荷電状態 を有する 2. おのおのがつりあう荷電状態の蛋白質と結合する。3. おのおのの 色素の有する結合基による結合距離が適性なものとのみ強い結合性を有する。 です。異論・反論おまちしておりま∼す。(^_-)V [返信]; ○（状況がわからないので一般的に）剥がれる原因としては●切片が 厚い●乾燥が不十分（切片と硝子の間に水が残っている）●包埋の状態（脱水 不良、パラフィンへのクロロホルムなどの混入など）●染色方法（100％アルコ ールから水に、あるいはその逆など膨化を伴う操作）●組織の問題（壊死組織 が多いなど）●コーティングスライドを使う○カセット、及びカセットアダプター の固定不良●取り付け部分のがたはないですか？これが一番初歩的であり がちなミスです。ギュっと締めましょう。特に堅い組織を切る際にはもう一度締 め直した方が良いですね。●アダプターはカセットのサイズに合っています か？（メーカーによっと大きさが微妙に異なるのでいろいろな施設のブロックを 切る場合には特に注意が必要）●余分なパラフィンをカセットに付けたままア ダプターに付けてませんか？何ブロックか薄切していると残ったパラフィンで アダプターにパラフィンが固着してそれがゆがみの原因になる。●ミクロトー ムの滑走面に傷がついている。堅い組織などを切っていてズガンと当ててま せんか？○もう少し具体的に症状を伝えていただくと治療方法が見つかるかも 知れません。 [返信]; ●佐野先生の組織学研究法では Azan 染色（MALLORY-HEIDENHAIN) となってますね。アザン（の）マロリー（変）法と考えれば良いのではないでしょ うか。●個人的には穴ぼこの方が分かりやすくて良いと思いますが。染色の理 解の手助けになれば良いのであって詳細な反応は理解できないし。免疫染色 の反応でも四角や三角のおうとつが結合するような図が多いではないですか、 ABC やポリマー法などの反応にしてもしかり。 [返信]; 了解しました。そのような解釈に落ち着きましょう。まぁ、別に重箱の隅 をつつくつもりもないのですが・・・。えっ もうつついているって? !正確にはマロ リーのハイデンハイン変法(AZAN)ですね。(^_-)また、蒸し返してしまった・・・。 実習性などに染色原理を教えるときに非常に困ります。逆に、実習生に突っ込 まれると、この図では対応できません。心の内では「穴なんかあるのかよ∼」 と思いながら、その図を使用して教えています。自分自信、そのよう意識を抑 制していると、逆にどんどん反抗心が沸いてきてしまいます。正根が屈折して いるのでしょうか・・。もうあの図が登場してから結構な月日が流れています。 そろそろ、より詳細なものがでても良いと思うのですが・・・。 [返信]; ○今や染色理論で論文を書く人も見かけないので、引用する側も旧来 のものを使わざるえない状態ですね。やはり枯れた分野なのかな。 [返信]; 悲しいかな・・・。おっしゃるとおりかもしれませんね。枯れ木に花を咲 かせる、「花咲か爺さん」にでもなりたい気分です。(;_;) [返信]; 色々アドバイスありがとうございます。AzanMallory についていろいろ 考えさせられました。AM 染色は、剖検腎組織の時 EM、PAS 染色とともに、必 ずつける特染です。AzanMallory の色がいつも一定の染まりになぜならないの か？というのは、ひとつは私の薄切技術が悪いので、1.5 μで薄切しても厚め になったりして濃いめに染色される。もう一つはアゾカルミン G をアニリンアル コールで分別するとき、どこを目安にして分別すべきか解かってないので赤み 調整がそのとき次第で色々。その結果、その後のアニリン青とオレンジ G 混液 の入りが微妙に違ってしまい、お今回はいいかな！からなんかへん！まで 色々になっています。三井さん ・・・・・・ どこを目安に分別すればいいの ですか？赤血球の色をオレンジにしたくて、今回本にのってるように、媒染剤 を使用しオレンジ G から染色し、リンタングステン酸だけで分別してみました。 アゾカルミンの色がアニリンでの分別の時ほどパッキとせず、違うのです。次 にオレンジ G、アゾカルミン G 染色の後、アニリンアルコールで分別したら、オ レンジ G がなくなってしまいました。 [返信]; ●あと臓器や固定状態によっても変わってくるので注意が必要ですね。 ●私の施設の場合でいうとアニリンアルコールは全く使用してません。という のはアニリンアルコールでの分別は脱色が早く止めるポイントが難しいからで す。（感覚的にはアニリンアルコールは分別ではなく脱色のような気がしま す。）水洗していれば段々と色が落ちていくのでそこで調整しています。（分別 ではなく全体的に色を落として調整するだけ、分別は後のリンタングステン酸 で行うので）アゾカルミン G の色が強すぎる時のは媒染の時間を短くすれば良 いと思います。リンタングステン酸での分別でまだ全体的に濃い感じだったら また水洗すると全体的に色は脱色されます。●アニリン青は最後の脱水過程 で少し色落ちします。そこでほんの少し過染気味にして脱水過程を通すのが通 好みのテクですかね。アニリン青が強い--捨てるか、脱色して染め直す。アニ リン青がちょっと強い---低濃度アルコールから脱水をしてアニリン青を落とし ながら調整。（赤も落ちてしまうので注意が必要）アニリン青がほんのちょっと 強い--純アルコールで一気に脱水。（通常）アニリン青をこれ以上落としたくな い--イソプロピルアルコールで脱水。アニリン青が弱い---アニリン青液にもど す。といった事で調整しています。●オレンジGで染色した後、余分な液を洗い 流す程度の短時間の水洗にしないと水洗でオレンジ G は容易に流れ落ちてし まいます。またアゾカルミン G も赤血球を染めるのでマッソンほど赤血球の色 はオレンジにならないように感じます。●アザンやマッソンの主たる目的は膠 原繊維=アニリン青なので、青が引き立つ赤色に染めるように心がける事かと 思います。アザンはマッソンより濃い赤、濃い青でメリハリのついた色合いが 良いのではないかな。 [返信]; 私は核の赤色と細胞質の赤色の区別がつく程度を目安にしています。 当院の場合、外部の標本を染めることは少ないので固定及びその他のファクタ ーは一定しています。従って、染色操作はその都度調整するようなことはしま せん。ある程度の染色条件を決めて機械的に染色しています。また、青色を強 く出したいとき(紺のような色)にはリンタングステン酸の分別を早めにやめて (赤色が残った状態)青色を付けると深い青を呈してきますね。アゾカルミンの分 別操作としては アゾカルミン修了後 軽く水洗 アニリン・アルコール(0.1ml アニ リン+95%アルコール 100ml) 一分程度(ニ、三分ならあまり退色しません)酢酸・ アルコール(1ml 酢酸+95%アルコール 100ml) 十秒程度蒸留水にて軽く水洗軽く 水洗アニリン・アルコール 一分程度酢酸・アルコール 十秒程度蒸留水にて軽 く水洗その後、リンタングステン酸へという工程で全て行っています。アゾカル ミンGはメルク社を使用しています。アゾカルミンGは製造する会社によってか なり違いがみられます。比較してみるのも面白いかもしれませんね。固定は武 藤の 20%中性緩衝ホルマリンです。症例によっては RBC が赤色になってしまう ものも多く存在します。私の場合には通常の染色手順を試みても違う色をとる ようなものは、やはり何かが違うのでそのまま提出するようにしています。無 理な着色はしません。どうしても、オレンジが必要であれば、液を新調したり、 色素の容量を増やす等の手立てはありますが・・。脱色に関しては、水洗のみ も行ったのですが・・・。水洗したまま放置してしまうと完全に色素が抜けてしま うので、それほど手間ではないアニリンアルコール系で行っています。私の経 験では、流水の水量や当たり具合や一定の時間までは緩やかに退色するが、 ある時点から急速に退色が始まるような印象を受けたので水洗による脱色は 行っていません。 新染色法のすべてでアルカリ水解後の PAS 染色の記載があります。たしか 百瀬さんの名前も入っていたと思うのですが・・。まず、還元剤に水素化ホ ウ素酸ナトリウムを使用していますよね。私は大学時代に水素化ホウ素酸ナ トリウムおよび THF 試薬は反応活性が高く危険を伴うので注意するように とよく言われました。危険性の具合はいかがなものなのでしょうか。また、 水解試薬として KOH を使用しているようですがその作用機序をお教え願え ませんでしょうか。私の認識では、アセチル化する試薬としては無水酢酸、 塩化アセチル、ケテンまたは無水塩化アルミニウムや塩化アセチルなどが有 名と思っていました。KOH にもそのようなシアル酸の C7-9 中のどれかをア セチル化する作用があるのでしょうか。できれば、そちらの作用機序も教え ていただきたいのですが・・・。 はじめにこの反応の歴史的経緯から述べさせていただきます。１）１９５０年代： シアル酸のシアリダーゼ感受性がアルカリ水解後に高められる現象が指摘さ れていた。２）１９６７年：Lavetto が O-acetyl 基の関与を指摘。３）続いて： Culling らは C7-8-9 上に O-acetyl 基を有するシアル酸（8-O-acetyl 基で代表さ れる）の存在を反映したものであることを証明し、染色方法を開発した。４）現 在：「染色法のすべて」に記載されている方法は、Culling らの方法をさらに勝山 らが検討したもの。酸化時間を９０分に延長、還元は Lillie らの方法に従ってい る。原理：１）酸化還元処理の目的は、8-O-acetyl-NANA 以外の組織切片上の 糖残基中にある近接水酸基などの反応を除外するためのものです。NaBH4 液 は過ヨウ素酸によって生じたアルデヒド基を封鎖（還元）するためのものです （今のところ NaBH4 によるトラブルは起こっていません）。[ここまでの酸化還元 処理によって C7-8-9 上の O-acetyl 基を有するシアル酸（8-O-acetyl-NANA で 代表される）は修飾されない。]２）KOH 処理は 8-O-acetyl 基をケン化して 8-OH として C7-8-9 上に近接水酸基をつくる反応です。３）最終的にこれらの近接水 酸基を PAS 反応で検出します。原理図を描けばよいのですが、少々面倒です のでひかえさせていただきます。もし、必要でしたら FAX します。注） 8-O-acetyl-NANA の他7-O-acetyl-NANA,9-O-acetyl-NANA についても Culling らは言及している。7-O-acetyl-NANA の証明法としては、アルカリ水解 PAS 反 応の還元反応のステップをチオニンシッフに置き換えた Culling らの方法がある。 しかし、この反応は 7-O-acetyl-NANA が切片上に唯一存在する場合は問題な いが、３０分の酸化で生ずる糖残基の近接水酸基は他にもあるので特異性に かける。9-O-acetyl-NANA の証明法の特異性にも疑問が多いし、意義は不明。 注）8-O-acetyl-NANA の証明法の変法として、還元処理を cold thionin Schiff に 置き換えた方法がある（Stain Technol 60:201-205,Hayama et al） 。 [返信]; KOH はアセチル基をケン化して水酸基とする作用なのですね。危険 度は少ないと考えて良いのでしょうか。やはりドラフト等の設備で行うべきなの でしょうか? また >[ここまでの酸化還元処理によって C7-8-9 上の O-acetyl 基 を有するシアル酸>（8-O-acetyl-NANA で代表される）は修飾されない。]とあり ますが、なぜこれらには作用しないのでしょうか・・。>8-O-acetyl-NANA すみ ません NANA は何をあらわしているのでしょうか・・・。また、質問になってしま いました。申し訳ありません。私は最近個人的にシッフ試薬に非常に興味があ りまして、羽山・百瀬さんの書かれた「新染色法のすべて」は拝読いたしました。 ただ失礼ながら書かせて戴くと、以前にもこの会には書いたのですが ------------ 以下前掲載文章 --------------------「新染色法のすべて」 p136 図2(PAS反応)の表記は間違っていますね。このglucose及びglucosamine では過ヨウ素酸処理で分断される C-C 結合の特定ができませんね。この場合 ピラノースの 1,4 炭素につくのは-OH でなく-O-でなければならないと思います。 私はこの表記をみてなぜ 2,3 炭素が分断されるのか全くわからなくなってしま いました。大きな意味では間違ってはいないのですが、狭い意味では間違って い ま す 。 こ の 間違い に 気づ く の に 何冊の 本を 読ん だ こ と か ・ ・ ・ 。 -------------------------------------------------というように一時期、 迷宮にはいりこんでしまいました。まぁ、そんな話はどうでも良いのですが・・・。 アルカリ水解に関しては非常に興味がもてます。この会で何度も書いているの ですが、組織染色化学において酸化反応は非常に多く認められます。もちろん 操作も簡単なので広く使われているのでしょう。しかしながら、還元ということに なると実際に検査室レベルで行えるものはほとんどないといっても過言ではな いと思っています。もちろん、非常に弱い還元能を有するものはいくつか存在 しますけれど・・・。(化学とくに有機化学系で有名な還元法としては接触水素化・ 水素化アルミニウム・リチウム、水素化ホウ素が有名)そういった意味でもこの NaBH4 処理というものに、非常に感心があります。強い?還元ができないため に諦められている染色も沢山あります。この NaBH4 が比較的安全であるなら ば、一度試してみたい操作だなぁと感じました。 [返信]; １）NaBH4 の危険度は少ないと思います。特別ドラフト内で扱うようなこ とはしていません。保存は冷蔵庫内で行っていますが、危険性を考慮してと言 うよりは還元力の劣化を防ぐためです。２）NANAはN-acethylneuraminic acidの 略です。３）[ここまでの酸化還元処理によってC7-8-9上のO-acetyl基を有する シアル酸（8-O-acetyl-NANA で代表される）は修飾されない。]とありますが、な ぜこれらには作用しないのでしょうか・・。について：申し訳ありません。これに は少々勉強しないと答えられません。取り合えず、ーOH 基あるいはーNH2 基 など関連する基が隣接した炭素原子 に存在しないときには、過ヨウ素酸による酸化は起こらないと理解しておいてく ださい。過ヨウ素酸の条件をもっと過酷な条件にするとか、過ヨウ素酸以外の 酸化剤を用いれば違ったメカニズムで修飾されるかも知れませんが。４）グル コースおよびグルコサミンの過ヨウ素酸による化学反応図について：この図は モデル図の一つと考えて下さい。確かにグルコースおよびグルコサミンがフリ ーの場合は、近接水酸基は炭素原子C2-C3の他、C1-C２あるいはC3-C4にも 存在するわけで、どこが切れてもよいわけです。C1-C２の位置からはギ酸が 生成されますし、C2、C3 にはアルデヒド基、C3、C4 からはグリセロアルデヒド のようなものができる可能性があります。過ヨウ素酸酸化により、フリーの単糖 はずたずたに切れて、組織切片上うでは染色することができないでしょう。とい うことでフリーの場合、酸化反応が起っても、もはや Schiff 試薬との結合は存在 しないことになります。なお、新染色法のすべての図１の染色原理図では、ポ リサッカライドに対しての反応となっています。 [返信]; 詳細な回答をありがとうございます。1)2)については了解いたしました。 3)については私の勘違いでした。シアル酸の C7,8,9 はすでにアセチル化され ているので保護されて当然ですね。本会にていろいろ調べてみまして、ある程 度の考察ができたものを、以前に掲載しました。以下再掲載いたします。病理 技術者のためのメーリングリスト ダイジェスト版 Vol.1 p18 参照 [返信]; 4)についてレスをつけていませんでしたね。おっしゃるようにモデル として考えます。ただ、できれば・・・今後執筆の機会も多いでしょうから、このこ とを少し考慮していただけたら幸いです。悪気があっての意見ではないことを ご承知おきくださいね(^_-) 骨髄生検(ホルマリン固定)でギムザをやる意義って何だろう? 本日、当直明けのボケた頭で朝っぱらから特染をしていました。骨髄生検の特 選です。当院では骨髄がオーダされた場合、H&E 染色、PAS 染色、鉄染色、エ ステラーゼ染色、銀染色そしてギムザ染色をセットとして行っています。以前は ウンナも染めていましたが止めました。ふと、思ったのですが・・・。骨髄生検 (ホルマリン固定)でギムザをやる意義って何だろう?15 年も病理をやっていて、 今更何言っているのって感じですが、もう一度勉強を兼ねて皆様に教えて戴き たいのです。ギムザ染色が有効な疾患にはどのようなものがあるのですか? 染色の何をみたら鑑別となるのでしょうか。ちょっと曖昧な質問で申し訳ありま せんが、よろしくお願いします。ではっ(^^)私学生時代から「血」の付く科目(血 液・血清 etc)はもっぱら弱く、今なおそのトラウマにとりつかれておりま∼す [返信]; 主に顆粒などを観察するためだと思うけど… 含水銀固定液（ツェンカ ー）で固定しないと，ホルマリンとかじゃあまりよくでないみたい…でも，ツェン カーで固定すると，表面マーカーなんかがあまり染まらなくなっちゃうだよね… 全ての染色に万能な固定液って無いかのかなー？？？ [返信]; 一般的に言えば、血液スメアと同じ目的だと思いますが、意義（必要 性）という事になるとあまりそれを感じない気がします。（血液を専門にやって いる人が聞いたら怒られそう！）ちょっと質問の内容と離れますが、骨髄生検 材料の病理組織とスメア標本の長所、短所ということで（ギムザに限らず）言う と、○スメア標本；長所：血球細胞個々の微細構造を把握しうる 短所：造血巣の 状態を忠実に反映しないことがある。○病理組織； 長所：骨髄内の造血状態、 異常細胞の増殖などを全般的に把握しうる。短所：細胞 1 個 1 個の分析が難し い。といった事が記載された論文があります。極論を言えば、スメアやスタンプ 標本が可能な材料であれば、病理組織のギムザは不必要ということかな。血 液疾患にはとりあえずギムザをやっておけば何となく安心感が得られるという 精神的な効果はあるかもしれません。 ヘマトキシリンのover night って，やったことありませーん？ ヘマトキシリンの over night って，やったことありませーん？アチキは，昨日の 夕方，バタバタといろんなことやりながら，ついでに HE もやってたら，HE やっ てるの忘れて，ヘマトキシリンに入れたまま，帰っちゃったー (^v^!)ちなみに， うちは，２倍のカラッチ… 今朝思い出して，上げたら，真っ黒!? (@.@!)塩酸アル コールとアンモニア水に交互に漬けて脱色したんだけど，なかなか色落ちしな い (-.-;)しょうがないから，PAS に使う 0.5%過ヨウ素酸に漬けたら，みるみる内 に，脱色された．これって，結構いけますよねー (^-^)V [返信]; ○あり∼ま∼す。一晩どころじゃなくて一週間くらいのもあります。その 後の染色性はどうなんですか？やはり酸化されているのでヘマトキシリンの 染色時間は短くて良いのですかね。 [返信]; ん？アバウト，アバウト (^.^)V ナイルブルー染色 皆さんにお聞きしたいことがあります。ナイルブルー染色なのですが、皆さん は日常の業務で染色してますか？もしくは染色した経験ありますか？どのくら い一般的な染色なのかを知りたいと思っています。ちなみに獨協では「染めた ことはないけど、試薬はあるよ」とのことでした。なるべく多くの施設の方に教え ていただけたらと思います。よろしくお願いします。m(_ _)m [返信]; ナイルブルーですかー？うちの病院では，まずやらないですねー何 年か前に染色したっきりです．なんやかんや染まっていたような気がしました けど…あまりよく覚えていません… スミマセン (_~_) 確か，脂質の種類鑑別 に使うんですよねー (? .? )中性脂肪，コレステロール，リン脂質，脂肪酸などの …(?.?) [返信]; 今は免疫染色担当なので、聞いてみないとわかりませんが、自治医 大では、ほんとにたまにですが、でるようです。以前何回か染色したことはあり ます。脂肪の種類を染め分けることができたような、ピンクに異染色するのが あったような.....。 [返信]; 中性脂質と酸性脂質を赤と青に染め分けるメタクロマジー染色ですよ ね。10 数年の病理暦で 2-3 回くらいでしょうか。ズダン III やオイルレッドｏに較 べたらかなり頻度は少ないですね。ここ 10 年くらいはやっていないかも。ちな みに試薬はメルクです。今も売っているみたいですね。余談ですが、通常凍結 切片で脂肪染色はやりますが、重クロム酸カリと四酸化オスニウムの後固定に より脂肪を不溶成分にしてパラフィン包埋にもっていく方法があります。結構綺 麗にできて自分的には満足だったのでが、オーダーした病理医の先生が”どう もこれアーティファクトぽいのよね”とのたまわり（あんたおれのスーパーテク ニックを信頼しないとは 100 万年早いんだよ！と心の中で怒鳴った想い出があ ります。） [返信]; ナイルブル−染色は、ほとんど染色しません。過去には、新人（３人） の研究（県学会用）として、胃黄色腫、胆嚢コレステロールポリープ、大腸メラノ ーシスの検討項目の一つとして用いたことがあります。あとは、実習生、２級試 験等のスライド試験用に染めた程度です。実際の業務ではあまり染色しません。 それに、染色後すぐに鏡検し、撮影しておかないと、中性脂肪の赤色が、青に 変化してしまうのであまり使いかってが良くないと思っています。中性脂肪と他 の脂肪酸等との差異をみるのも固定条件等にも影響されたりするので注意が 必要です。 [返信]; アチキも理論的には可能なことは知っていましたが，実際にやってみ たことはありません．ところで，染めたのは，ズダン III ですか？それともオイル レッド O ですか？ちなみに，うちでは，脂肪染色としてはオイルレッド O をやる ことが多くなってきま した． [返信]; ○随分前のことなのでうろ覚えですが、たぶんズダン III でしょう。うち はオイルレッド O はあまり染めませんので。 [返信]; 日常は全く染めていません。当院の染色マニュアルにも載せててま せん。入職して 1 年目に一度だけ染めたような気がします・・・。チョット調べた 範囲ですが、ナイル青はクレシル紫なんかと類縁色素のようですね。いろいろ 書いてはあるのですが、あまり興味を引かれる記載はありませんでした。 [返信]; 皆さんたくさんの返信ありがとうございます。やはりナイルブルーは 一般的ではないのですね。今回、羊水中の胎児の脂肪について少し調べてい たのですが、産科や細胞診の教科書には必ず「ナイルブルー」と書かれていま す。しかし、最近の文献には「ナイルブルーを染めた」というものはないし、獨 協では染めたことはないというし・・・。ところで実際には使われている染色なの だろうか？と、疑問に思ってしまって。ナイルブルーは特殊（というか趣味の範 囲？？）な染色なのかもしれませんね。みなさんありがとうございました。 [返信]; いやいや！羊水となると，話はちょっと変わってきますねー！？羊水 検査には使うこともあったような気がします…詳しいことは忘れましたが…（ど ういう目的で使うのか？今現在でも有効なのか？…）どなたか，詳しい人はい ませんかー？僕も，解る範囲で調べて見ようと思います． [返信]; 羊水で，ナイルブルーをやる意味が分かりました．破水の診断のため にやるんでしたね！妊娠中に破水が起こると膣スメア中に胎児由来の胎脂細 胞が見られるので，ナイル青染色を行って，胎脂細胞（赤色系）と胎脂の付着し ていない細胞（青色系）を鑑別するんでしたねー！？えっ(@.@)！そんなことは 分かってるってー…こりゃまた失礼 m(_~_)m 僕は，すっかり忘れてましたー… ということで，当院の細胞診においても，忘れてしまうくらい，ほとんど Order が ありません．（古典的な方法？ってなことになりますかー？）また，何か分かっ たらお知らせします． [返信]; 専門ではないので、あくまでも調べた限りで報告します。ナイル青は 羊水をもちいた胎児成熟度の検査にも用いられます。その中で、皮膚成熟度検 査に用いられています(した)。以下本文そのまま掲載羊水中の細胞は胎児ある いは羊膜を起源としている。妊娠の進行につれて胎児の扁平上皮細胞は、膣 壁スメアのエストロゲン効果の増大に伴う変化に似ていなくもない成熟による 変化を示す。ナイル青硫酸(Nile blue sulfate)を用いて羊水中細胞を染色すること によって細胞の中の脂肪を含む細胞の割合を知ることができる。Nile Blue によ ってオレンジ色に染色される細胞は妊娠 34 週までは 1%以下であるが、妊娠 34-48 週では 1-10%に増大する。妊娠38-40 週では 10-50%となり、妊娠40 週以 降は 50%以上となる。単純で迅速に行える検査である。血液・尿以外の体液検 査法 検査と技術 vol.18 no.6 1990 増刊号とありました。超音波画像等の進歩 に伴ってほとんど行われなくなった検査の一つだと考えられます。 [返信]; 本当にありがとうございます。手持ちの資料でも、膣内容物を染色し て破水の証明に用いる。ただし妊娠３２週以降にならないと陽性にならないの が欠点である。という程度の記載しかなく、この先も出会うことはあまりなさそう な染色なんですね。皆さん本当にありがとうございました（*＾▽＾*）。 [返信]; いいえ、いいえ(^。^)この件については以降、謝辞レスは不要としてく ださい。勝手に盛り上がります。いろいろ調べると面白いです。まず、メタクロ マジーを起す脂質の由来っていったい何なのでしょう。どうして、34 週以降に陽 性細胞が増えるのでしょう。「細胞診を学ぶひとのために」では非常に不親切に 書いてありますよね。また、余談なのですがこの本の増補版と第 2 版では内容 および著者が異なっていますね。話もどします。まず、メタクロマジーを起す脂 質の由来は胎児の成長に伴う皮脂腺の発達と相関があるようです。皮脂腺の 分泌する脂質がナイル青と反応してメタクロマジーを起すようです。つまり、皮 脂腺由来の細胞であるとしています。ここにまたまた、詳細な報告があるので 紹介します。羊水中脂肪細胞出現率 羊水中の有形成分には羊膜由来のもの のほかに、胎児の皮膚から剥離したものや消化管、泌尿器系由来のものが含 まれている。Brosens と Gordon は羊水の遠心沈査を 0.1% Nile Blue sulfate 溶液 で染色し、その中でオレンジ色あるいは褐色に染まる脂肪含有細胞を、胎児の 皮脂腺 Sebaceous glands 由来のものと認め、この細胞が妊娠 38 週以降に羊水 中に急増する例が多いことから、胎児成熟度判定法になるのではないかと提 唱した。この細胞はオレンジ細胞 Orange stained cell または脂肪細胞 Fat cell と よばれ、羊水中クレアチニン値が胎児腎の機能的成熟をあらわすのに対して、 胎児皮膚組織の成熟を表現する一種の index と考えられる。本法はその後 Anderson ら、Barnett らによって追試されて胎児成熟度と強い相関を有すること が証明された、本邦では鳥越、本多ら、大月の報告がみられる。鳥越は 500 個 の細胞けの形態、染色性について考察し、次の 5 群に分類した。I 群: 大型また は中型で多角形・紡錘形あるいは円形を示し、胞体は淡青色で核は比較的小さ いものII群: I群と同様の形、染色性を有し、核のみられないものIII群: 小円形で 胞体は濃青色、比較的大きい核を有するもの IV 群: 小型の卵円形または多角 形を呈する無核の細胞で、胞体は均一に明るいオレンジないしピンク色 V 群: IV 群と同様の形の細胞であるが、オレンジ色大小の顆粒を有するもの 次に分 娩後直後の新生児について、各部から smear を作り同様の染色を行い件さした ところ、I,II 及び III 群の一部は皮膚、粘膜など扁平上皮由来、III 群は羊膜上皮細 胞、IV及びV群は手掌、足蹠を除いた皮膚に由来するものと思われる成績を得 た。妊娠後期に短期間に急激な増加を示すIV、V群の細胞をとくに脂肪細胞Fat cell と呼ぶが、この脂肪細胞は妊娠 36-38 週にかけて、それまでの平均 10%以 下からいちやく平均40%以上にも達するようになる。また、妊娠38 週頃からは、 そのほかにオレンジ色大小の脂肪球と思われる円形顆粒もみられるようにな る。以上のことから羊水中の脂肪細胞は胎児の皮膚腺に関係したものであり、 その動向を追求することは、胎児皮膚の成熟度を観察することになるものと考 えられる。---鈴木雅洲・馬場一雄編集 臨床胎児医学 東京医学社: p360-361,1982 というものでした。基本的に産科または婦人科の領域の事項で あるために、病理では関与しないものだと考えられます。細胞の本によくでて いるというのは、もともと細胞診は婦人科から派生したものなので掲載されて いると考えられます。それから、ナイル青のメタクロマジーの機構については、 詳細な記載はありませんでした。Staining Procedures に書いてあるかどうか・・・。 資料がないのでよくわかりません。ただし、このメタクロマジーは時としてpH指 示薬として用いられるようです。変色域は pH10-11 となっています。 アポトーシス検出のための caspase-3 の抗体って，どこのメーカーのを使う んですか？ アポトーシス検出のための caspase-3 の抗体って，どこのメーカーのを使うん ですか？Promega 社ですか？賦活化は必要ですか？¥78,000 は払えないので … http://www.gakusai.co.jp/igaku/iannai.htmhttp://www.gakusai.co.jp/igaku/t-011.ht m よかったら教えて下さい．m(_~_)m企業秘密ですかー？（内緒なのー？） (? .? ) あと，single-stranded DNA の検出には，どこの抗体使うんですかー？DAKO で すか？IBL ですか？…至適条件はー？よかったら，教えてちょ m(_~_)m これも， もしかしたら，企業秘密ですかー？（内緒なのー？） (? .? ) [返信]; caspase-3(Code No,A3537)は、ダコ・サイトメーション社にございます。 値段が¥78、000 なのでもしかしたら・・弊社かもしれませんね。因みに、希釈倍 率は×250 で、賦活化は、10mmol/Ｌ クエン酸緩衝液での温浴処理(95℃、40 分間)を推奨しております。また、single-stranded DNA の抗体(Code No,A4506)も、 ダコ・サイトメーション社にございます。 希釈倍率×100∼400 で、賦活化は無しです。(但し、過固定等の為染色性が低 い場合はプロテイナーゼ K 処理を推奨)以上、宜しくお願い申し上げます。 免疫染色の加熱処理は，何でやってます？ 皆さんのところでは，免疫染色の加熱処理は，何でやってます？マイクロウェ ーブ（MW：電子レンジ）？オートクレーブ（AC）？鍋？うちは，ホットプレートで やってるんですけど…どないでっか？やっぱ，煮るものによって，賦活化の効 果って違うんですかねー？T-FAL の圧力鍋って，型番は？何というを使うんで すかー？切片を入れる容器には何を使うんですかー？ドーゼですか？ビーカ ーですか？…ドーゼだとしたら，耐熱性とかじゃないとだめですかー？（耐熱 性のドーゼって，どこで売ってるんですかー？）加熱条件はー？よかったら， 具体的な方法を教えてくれませんかー… [返信]; あと、電気沸騰魔法瓶もありですね。いろいろ書かれているけど ER,PgR,Her2 はこれでやっています。MW・オートクレーブは能書きに書かれて いるときは従っているようです。いろいろ試すのも面白いかも・・・電子炊飯器な んてのはいかが?直火焚きなんていう製品もありますね。磁気加熱のクッキン グプレートなんていうのも面白そう・・。炭火でアウトドアよろしくじっくりなんて いうのも良い? [返信]; 免疫染色の熱処理の件ですが、MW とオートクレーブと温浴と３種類使 ってまあす。抗体によってかえてます。オートクレーブは今年、卓上のものを購 入したので、結構手軽に使えます。大きさは、ちょっと大きめの電子レンジって とこですかね。 [返信]; さすがですねー (^.^)!!!やっぱ，賦活化の効果は，温浴→MW→AC の 順？で上がっていくんですかー？確かに，bcl-2，CD10…で，温浴より AC の方 がよかった経験はありますが，温浴でもそこそこ出るので，今は，特別なこと がない限り，温浴（クエン酸緩衝液 pH6.0 または EDTA-NaOH pH8.0 で，95℃以 上 40 分→自然冷却１時間）しかやっていません．反応が弱いだろうと予測され るマーカーは，イミダゾール DABで発色するようにしています．MWは，賦活化 専用の機械を使ってるんですか？切片を入れる容器は，耐熱性ドーゼ？ビー カー？耐熱性ドーゼって，どこで売ってるんですか？賦活化用bufferに，クエン 酸緩衝液 pH7.0 って使ってますか？やっぱ，いいですか？よかったら，メーカ ー＆型番＆値段を教えてちょ！ [返信]; ●免疫染色の熱処理の件ですが、効果ということになると、そうともい えないですかねえ。（MW 処理の方が AC よりもよい場合もありますし、処理時 間が短い方が強く染色されることもあるしで）東屋医科機械の MI-77 を使ってま す。（染色にも使えるので）賦活化だけならふつうの家庭用電子レンジで十分だ とおもいますが。染色かごごと入れちゃうので、500ml のビーカーでやっちゃい ます。ラップで覆っておけば、長い時間でもあまり液は減りません。（かごが 2 つ以上の時は、1000ml のビーカーで）*Hercep Test のときしか使いませんが、 マツナミのカタログにありました。AC にいれるときは、プラスチックのドーゼを 使ってます。MBL でも扱っているみたいですよ。CD4 のときには使ってます。 いいです。pH6.0 を NaCl で pH7.0 に自分で調製して使っています平山製作所 （TEL 048-735-1241）｛去年の病理研究班合同講習会（千葉）のとき固定式のを 展示してましたよ｝温度と時間が固定式のと、自分で設定できるのとがあります （値段は高い）。うちでは、後者をつかっています。 型番 HRM-242II 値 段 53 万 7000 円 固定式は 26 万円 [返信]; ●以前まで日新ＥＭ製のマイクロウエーブ（温度をコントロールでき る）を使用していましたが最近はパソリナ製卓上型オートクレーブ（130,000 円） を使用することが多いですね。大型のオートクレーブで検討していた頃は組織 の破壊が強くてあまり良い印象がなかったのですが、この小型の物はそういっ た事があまりないし、なにしろ面倒くさくないのが一番利点かな。賦活化用 buffer はクエン酸緩衝液 pH6.0 でほとんどすましてます。マイクロウエーブとの 比較では AC が 10 分なら MW は 20 分で同様な効果が出るといった感じですか ね。固定が強い組織などは AC だけでは出ない事があります。その時には熱 処理+酵素処理ですね。（今年の精度管理の標本が一例）温浴は全くやってま せん。●TPX 染色バット（VESSEL COLORATION）縦型：8 枚用（溝付き） 980 円 横型：15 枚用（溝無し） 1100 円卓上型オートクレーブと染色バットの話は今年 の病理研修会で私が話しましたが忘れちゃいました？ [返信]; この歳になると，10 のこと言われても，２∼３覚えていればいい方な のよねー（‘.’;)…場合によっては，耳から耳へ素通りしてしまうことや，耳に入 らずに反射してしまうことも…でも，周りの人たちによく「もー！鈴木さんは，人 の話まったく聞いていないんだからー(X.X)）と怒られます．ゴメンチャイ m(_~_)m でもね！これは DNA のせいだから…許してちゃぶれ m(_~_)m 型違いの輸血をしてしまった場合の副作用(即時型溶血性輸血副作用)として DIC を起すという記載があります。なぜ DIC を起すのでしょうか。 型違いの輸血をしてしまった場合の副作用(即時型溶血性輸血副作用)として DIC を起すという記載があります。なぜ DIC を起すのでしょうか。じつは院内の 勉強会時に輸血についての講義がありまして、上記の質問をしたら誰も答えて くれませんでした。病理とはちょっと違うのですが何方かお答えしてもらえませ んでしょうか。 [返信]; たぶん僕に質問したと思うのでお答えします。１）血管内で赤血球の抗 原抗体反応がおこり、赤血球が崩壊すると、赤血球の膜にあるトロンボプラス チン様物質が血球を凝固に導き、DIC を生じさせる。２）抗原抗体反応による補 体の活性や免疫複合体による血球や血管壁の損傷による組織トロンボプラス チンの血管内流入も関与する。３）ショック症状を呈すときには循環不全による 組織傷害も加わり、DIC の発言をさらに助長する。DIC の原因には以上が挙げ られるが、型違い輸血の場合は1)と3)が主な原因だと思います。（「教科書では 知り得ない免疫血液学（輸血）の知識」より抜粋） [返信]; トロンボプラスチン様物質の本体は何なのでしょうか。抗原抗体反応に 伴う補体活性の機序がよく理解できないのですが・・ [返信]; 色々調べてみましたが、トロンボプラスチンとか赤血球基質としか書い てありません。ただ今調査中です。（文献：Mollison,P.L.:Blood Transfusion in Clinical Medicine,p.644,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1983) 抗原と反応した抗体の Fc 領域に C1q が結合し古典的経路により C1 から順に 働き、赤血球膜上の C5b を核にして C6 から C9 までが結合すると管状構造の C5b-9 複合体が出来る。これを通路にしてカリウムイオンなどが赤血球の外に 流出し、水分子が外から内に入るため細胞がふくれ、破裂する(血管内溶血）。 この様に、補体が活性化するときに、分子量役 10,000 のポリペプチドである C3a、C5a の遊走がみられ、これらアナフィラトキシンは、小動脈の平滑筋に直 接働き、また肥満細胞などの種々の細胞を破壊し、ヒスタミンの様な血管作働 物質を遊出する。このとき、C5a は C3a の 10∼20 倍の強い作用を持ち、肥満細 胞からヒスタミン、ロイコトリエン(遅発反応性物質)などの血管透過性拡張物質 と顆粒球、大食細胞からライソゾームの水解酵素をゆうしゅつさせたり、血小板 を凝集させたり、平滑筋の攣縮を起こさせる。これらの作用に加えて、末梢循 環不全の結果、組織からのトロンボプラスチンの血管内流入により DIC はさら に助長される。 [返信]; いっぱい、いっぱいです。もともと知識が少ないのでこのくらいが限界 です。C3,C3b?!,&%>P`+?*です。基本に立ち戻り、教科書を紐解いて勉強し直し ます。詳細な回答をありがとうございました。施設の皆にも教えてあげるつもり です。 なにゆえ多くの施設においてエタノールとキシレンが採用されているのか 疑問です。 弊校の授業、実習では脱パラ系列にキシレンとエタノール、脱水剤にエタノー ル、透徹剤にキシレンを用いております。脱パラ系列にはこのほかにも種々の 試薬を用いることが出来ます。しかし、なにゆえ多くの施設においてエタノール とキシレンが採用されているのか疑問です。コスト重視でしょうか？それとも標 本の仕上がりに試薬の取捨選択がなされた結果でしょうか？もしよろしければ、 現在お使いの脱パラ系列で用いている試薬・浸漬時間も併せて教えてくださる と幸甚であります。 乱文ですみません．．． [返信]; キシレン ｘ3 15min.純エタノール ｘ2 3min.90%エタノール ｘ1 1min.80%エタノール ｘ1 1min.70%エタノール ｘ1 1min.エタノール系列は落第方 式なので大体の％です。脱パラフィンが目的なのでキシレンの時間は大体守 りますが、（長くいれっぱなしにすることはある）エタノール系列の時間はかな りラフです。（切片がアルコールに馴染めば大丈夫と考えています。）キシレン 以外の溶剤ですが、今まで使用したことはありません。文献的には石油ベンジ ンなども使われてきたようです。毒性、揮発性、コスト、入手難易度などを勘案 して今のところキシレンが最も使われているのかと思います。正直なところ他 に選択肢がないというのが現状でしょうか。ちなみに包埋の脱水系ではクロロ ホルムを使っています。キシレンよりも揮発性でパラフィン中に残留しずらいの と組織の保存性のよさがポイントかな。あと臭いがキシレンの臭さに較べて甘 い臭いで好きです。エタノールとメタノールですが、メタノールの方が脱水力が 強くが脱水剤としては優秀なのですが、毒性も強く価格も高いのでエタノールし か使ってません。 [返信]; いわゆる中間剤と呼ばれるものについて調べてみました。アルコー ルの除去剤としては、アニリン、ベンゼン、ツェーデル油、クロロホルム、デカ リン、ジオキサン、イソブチルアルコール、クレオソート、オリガヌム油、トルエ ン、キシレン、ナフサなどです。また、特殊な方法としては安息香酸メチル・セ ロイジン-ベンゼン・パラフィンという方法や、全くアルコール不要の仲介剤とし てジオキサン、n-ブチルアルコールなどがあるようです。用途に応じて一長一 短があるようですが、キシレンが用いられる背景としては、三井さんが言うよう なことが主であると考えられます。当院では中間剤としてクロロホルムを使用 しています。メリットとしては、溶剤の組織からの抜けが良いこと、組織の収縮 が少ないことなどがあげられます。デメリットとしては、有害であることでしょう か・・・。アルコールに関してですが、エタノールを利用する理由としては、メタノ ールに比べて人体への有害性が低いということでしょうか。でも、クロロホルム を使用しているのならどっちもどっちという感じがしますが・・・。日本で純品の エタノールは酒税がかけられるので割高になっていますね。現在病理検査等 では酒税のかからないメタノール・エタノールの混合溶液を使用している施設 が増えているのではないでしょうか。メタノールの眼に対する有害性ですが、 これは良く雑誌やテレビなどでも挙げられることがあるのですが、メタノールは 肝臓内の脱水素酵素によってホルムアルデヒドに変化します。その後に酸化を 受けて蟻酸として処理されるわけですが、この速度はエタノールの処理に比べ て 7 倍遅いといわれています。「急性中毒ファイル」廣川書店などをみると、網 膜の退行変性と記載されています。毛細血管などが多く存在する臓器などはこ のような変化が微量でも影響され、ホルムアルデヒドによって固定されてしま い、何らかの影響がでる可能性が高いと思われます。以後、引続き調査します。 時間についてはキシレン ｘ3 5min.純エタノール ｘ2 3min.90%エタノール ｘ1 1min.80%エタノール ｘ1 1min.70%エタノール ｘ1 1min.自動で行っています。ま た、免疫の場合にはキシレンの時間を延ばしています。 [返信]; 使用できる試薬はゴマンと出てくるのですね。感激いたしました。施設 によって用いておられる試薬が異なり、浸漬時間も異なっているのですね。勉 強になりました！ありがとうございました。どうか今後とも宜しくお願いいたし ま！！ [返信]; ●もう一つ付け加えると封入剤はほとんどキシレンで溶かしてあるの ですよね。他の溶剤が混入すると退色のものになるんじゃないかな。 [返信]; ところでクロロホルムってよく犯罪ドラマで使われますよね。しかし動 物実験などの麻酔ではエーテルは使うけれどクロロホルムなど使わないです。 ホントに効くのかしら？たまにクロロホルムを交換する時に吸いこんでチョット らりりそうになったことはあるけれど。麻酔作用よりシンナーみたいな幻覚作用 の方がある感じだが。きっと使用経験豊富なエンジェルが回答してくれるか な？あとメタノールを飲むと目が潰れるってホント？確かに毒性は強いといわ れているが、なんで目なんだろう。都市伝説かな？ [返信]; たまにクロロホルムを交換する時に吸いこんでチョットらりりそうになっ たことはあるけれど。麻酔作用よりシンナーみたいな幻覚作用の方がある感じ だが。 [返信]; 最近は，クロロホルムじゃなくって，筋弛緩剤とかを使うのがトレンドな んじゃなかったけー (? .? )あとメタノールを飲むと目が潰れるってホント？確か に毒性は強いといわれているが、なんで目なんだろう。 “目散るアルコール” って，中学の時覚えたじょー (^.^)V [返信]; クロロホルムの麻酔作用はエーテルよりも数倍強いそうです。と同時 に循環系に対する抑制作用も強いのでマウスなどでは心機能停止に陥る可能 性が高いですね。ちなみに、一回暴露に伴う症状(ヒト)4000ppm 嘔吐、失神 約 15000ppm 麻酔作用とあるので、かなり高濃度のものを吸引しないとダメでしょ う。また、聞いた話ではクロロホルムで麻酔の後覚醒時にものすごい頭痛を伴 うそうです。代謝産物の作用?だから、決して犯罪等には使用しないようにしま しょう。へたすると死んじゃうよ。 劇毒物薬を含めて保管・管理はどうされてます？ クロロホルムをはじめとして，病理の検査室には，悪用されるとヤバイ試薬（ト ルエン，アジ化ナトリウム，カコジル酸ナトリウム…）がいっぱいありますけど， 劇毒物薬を含めて保管・管理はどうされてます？以外に知られていないかもし れませんが，マイヤーのヘマトキシリンに使う抱水クロラールも確か麻酔作用 とかがあるんですよねー！調べてみると，ヤバイ試薬だらけです．うちでは， 取りあえず，毒劇物薬だけ鍵のかかる薬品庫に入れてますが…皆さんのとこ ろでは，どないでっか？ [返信]; 当大学では劇物、毒物は鍵の掛かる薬品庫に入れ、台帳により出し入 れを管理することが義務づけられています。従って劇物、毒物の入っている冷 蔵庫にも鍵を付けてあります。毒物が 11、劇物が 47 品目あります。実際に使っ ている物はたかがしれているのですが不必要な物も捨てるに捨てられない状 況です。台帳に記載することになっていても、みんななかなか書いてくれない んですよね。染色関連だと塩化第二水銀とかカコジル酸、チオセミカルバジド などが毒物指定ですね。以前まで無印だったアジ化ナトリウムがあの事件で 毒物指定になったのは記憶に新しいですね。法規上のこのヤバイ試薬という のは急性毒性を起こす物で発がん剤などは全く無印なのがいかにもお役所的 ですね。最近エタノールも使用目的と使用量を記載する台帳を作るよう通達が ありました。台帳だらけになりそうです。でもそういう時代なのですね。 [返信]; ちょっと忘れたけど、薬としても使用されますね。かなりヤバイものに 関しては処分(業者)しました。試薬メーカも不必要なものに関しては回収しても らいたいものだ・・・。 [返信]; ちなみに抱水クロラールは「てんかん」の発作抑制薬では無いです か？ちょっとあやふやな怪しい記憶ですが・・・・・・ [返信]; ●「てんかん」の発作抑制薬がホントかどうかちょっとわかりませんで した。抱水クロラールって正式名称がトリクロロアセトアルデヒド 1 水和物という いかめし名前なのですね。メルクインデックスで調べるとあの殺虫剤のDDTの 原料なのです。確かに臭いをかぐと結構な刺激臭ですね。●シグマのカタログ によると used as an anesthietic for laboratory and farm animals とあるので確かに 麻酔作用はあるようですね。 パラジメチルアミノベンチリデンロダニン法どうすればきれいに染色でき るのですか？ Wilson 病の剖検があったので Cu 染色をパラフィン切片で実施してみました。パ ラジメチルアミノベンチリデンロダニン法を使用しました。飽和アルコール溶液 ３ｍｌに５％酢酸ナトリウム１００ｍｌに、37℃２４時間以上いれて見ました。本に あるように赤紫ぽっくならず、DAB 発色調の顆粒がたくさんありました。どうす ればきれいに染色できるのですか？ [返信]; ●久しく銅染色などやっていないので染色態度が銅だったか忘れたけ れど、発色は赤∼褐色なので DAB 発色調=褐色と考えればうまくいっているの ではないでしょうか。 [返信]; この染色は手技的には難しくないので、試薬に依存する部分が大きい と思います。当院で半年前くらいに染めたときには茶>赤色を呈していたように 記憶しています。DAB のような色といわれると、なるほど似ているかもしれま せんね。ちなみに p-ジメチルベンジリデンロダニンは東京化成工業の D647 を 使用しています。できれば、コントロールと一緒に染めることをお勧めします。 病理組織・細胞診のための日常染色法ガイダンス 検査と技術増刊号 p884 で は 10%酢酸ナトリウムを使用しているようで、私どももそれに従って染色しまし た。 免疫染色（酵素抗体法）の一次抗体の希釈って，何でやってます？ 免疫染色（酵素抗体法）の一次抗体の希釈って，何でやってます？うちは， 1%BSA・15mM NaN3・PBS で希釈してるんですけど…僕の教えに行ってる学校 の実習で，たまたま一次抗体（グルカゴンのウサギポリクローナル抗体：この 抗体は小分け凍結してあったが，ディープフリーザーが壊れて解凍してしまい， それを再び凍結保存したもの）を，ただのPBSで希釈してしまったら，過染がひ どくって…検出方法は，LSAB 法で，ちゃんと正常血清でブロッキングもしてた んですが…もしやと思って，1%BSA・15mM NaN3・PBS で希釈し直したら，綺麗 に染まりました．まっ，一次抗体の希釈は，BSA や二次抗体と同種動物非免疫 血清などの protein 成分を入れた PBS で希釈するのがセオリーだとは思うので すが，BSA って抗体の変性・劣化を防ぐだけでなく，やっぱ非特異反応を抑制 する効果もあるんですねー！？（あんまり気にしたことはなかったけど…）ど ないでっか？ [返信]; 冷蔵庫保存の 10 年くらいまえのグルカゴン抗体でも染まるくらいだか ら、結構丈夫なものもありますね。●うちでは Dako 社の抗体希釈緩衝液と自家 製（1%BSA・0.02％% NaN3・PBS）を併用してます。自分で作らないと納得しない という一部のこだわりさんを除いて Dako 社のものを使っています。楽チン推進 派なので。抗体の変性・劣化を防ぐのはどちらかというと NaN3 ではないでしょ うか？防腐剤ですし。キャリアプロテインの主たる目的は人食い反応を押さえ ることでしょう。ちなみにtweenみたいな界面活性剤もちょっといれるとより良い です。 [返信]; ●解凍、凍結を繰り返すと力価が落ちるのでだめよって書いてありま すね。一度位は良いのかな。まあ賞味期限が切れた冷蔵庫保存の 10 年くらい まえのグルカゴン抗体でも染まるくらいだから、結構丈夫なものもありますね。 ●うちでは Dako 社の抗体希釈緩衝液と自家製（1%BSA・0.02％% NaN3・PBS）を 併用してます。自分で作らないと納得しないという一部のこだわりさんを除いて Dako 社のものを使っています。楽チン推進派なので。抗体の変性・劣化を防ぐ のはどちらかというと NaN3 ではないでしょうか？防腐剤ですし。キャリアプロ テインの主たる目的は人食い反応を押さえることでしょう。ちなみに tween みた いな界面活性剤もちょっといれるとより良いです。 [返信]; うちんとこは１％BSA.PBS を使用してます。アジ化ナトリウムはいろ いろめんどうなので使ってません。凍結保存して 7、8 年たったものでも大丈夫 みたいですよ。