シマウキゴリの胚発生過程

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シマウキゴリの胚発生過程
斉藤, 大樹; 荒井, 克俊; 山羽, 悦郎
水産増殖, 52(2): 177-184
2004
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http://hdl.handle.net/2115/35210
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著作権は日本水産増殖学会に帰属する
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arai-91.pdf
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Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
水産増殖
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シマウキゴリの目玉発生過程
斎 藤 大 樹 荒 井 克 俊 1・山羽悦郎2
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近年， 地球環境の変化 に伴い水産資源の減少や遺
の確立および中佐葉の形成には ，卵黄細胞からの誘導
伝 的多様性の喪失が指摘されている。遺伝的多様性 は
Mizunoe
ta
.
l1996)，背
が重要な役割を 果 たす こと (
育種の素材として欠かせない。将来，こ れらを遺伝子
腹軸の誘導には卵黄細胞に存在す る母系の細胞 質因子
資源として利用するには，保存し再生する技術を確立
Mizuno
が関与 している こと が明らかにされ ている (
することが必要である。現在魚類におい て も，細胞の
.
l2001
)，借腹生産 (
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。さらに，始原生殖細胞 (
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関与している (
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)。以上 の様 に，
の発生工学的技術の開発が進められてきている。発生
硬骨魚類の匹発生における細胞分化 には，卵内に不均
工学の技術の多くは，初期目玉発生時の配偶子や旺を材
j
f領域間で
一に 蓄積された細胞質の働き と
， 組織間.i
料 とし ている。こ れら の技術を確立 し新しい育種法 を
生じる匹誘導が段階的に組み合わされている こと が 明
展開す るためには ，硬骨魚類の初期目玉発生過程を理解
らか となってきた。
Kusudae
ta
l
.2004)，核移植 (
Wakamatue
t
凍結保存 (
することが肝要である。
ゼ ブラフイツシ ュにおける 一連の研究は，脊椎動物
魚類の距発生過程は ， ゼブラフイツシュを主たる
の形態形成を明らかにするための モデル実験系として
材 料 とし て実験発生 学 的手法お よび突然変異体 に よ
重要で、あるだ けでなく，旺発生 を制御する ， いわゆる
り解析されてきている。一連の研究から ，胞 脹期 の
発生工学的技術を魚類に適用 す る上で多くの 可能性を
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割球には分化 多能性が存在すること (
提示している。例えば，ゼブラフイツシュとほぼ同様
1
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lLaw 1985)，嚢
n
f期における背腹軸
の匹発生機構をもっキンギョでは ，胞匹期の匹盤下部
2
0
0
4年 4月 8日受付 :2
0
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4年 5月 3
1日受理.
l北 海道大学大学院水産科学研究科育種生物学講座(
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2北海道大学北方生物園フィ ール ド科学センタ ー水圏ステ ー ション 七飯淡水実験所 (
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斎藤 ・荒井・山羽
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領域を他距へ移植することで生殖系列キメラの作出が
可能となっている(Ka
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)。この技術は，胞匹期の旺盤
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は分化多能性を有し，
H
f盤の下部領域で PGCsが形成
卵膜の除去および培養
シマウキゴリ受精卵の卵膜は，実体顕微鏡下でピ
ンセットを 用いて外科的に除去した。卵膜除去卵は，
嚢匹形成が終了するまでは 淡水産硬骨魚用リンゲル液
されるという知見を統合してはじめて可能となった。
2
.
8m MKCl，1
.8m MCaC12) に0.
01%
(
1
2
8m MNaCl，
しかし，硬骨魚は多様性に富んでおり，卵や庄の形
のペ ニシリンとストレプトマイシン，および1
.6%鶏
状，大きさ，発生速度が魚種間で大きく異なっている 。
卵白を加えた培養液(一次培養液)で培養した。 嚢距
H
f発生(形態形成)へどの様な影響
形成終了後は， 1
.8m MCaC1
.8m MMgC12を含む
2と1
を与えているかは不明である。特に，水産における重
蒸留水に 0
.0
1%のペ ニシリンとストレプトマイシンを
要種を多数含むスズキ目魚類では，旺発生過程に関す
加えた液中 (2次培養液)で培養した。死卵等による
.
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る報告は形態的な記載が中心で(Arakawae
ta
培養液の悪化の発生への影響を排除するため，それぞ
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6
9)，匹操作の主たる時期である初期目玉発生
れの卵膜除去距は全匹発生過程を通じて96穴プレート
期の知見に乏しく，発生工学的技術を導入して育種へ
(
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)で個別に培養した。匹の培養は， 20tのイ
これらの違いが，
の展開を図るうえで障碍となっている 。
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sは，スズキ目
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ンキュベーター内で行った。卵膜未除去距は，水道水
(
約 40ml
) を満たした 90mmシャーレ中で培養した 。
ハゼ科に属する魚種である。本種では，比較的容易
に受精卵を採取でき，Hfを人工的に培養することが
発生段階の決定
可能である 。スズキ目魚類において生殖細胞を用いた
受精直後(1細胞期)の受精卵を選別し，卵膜を除
発生工学的技術を検討するためのモデル実験系を確立
去後， 20tのインキュベーター内で培養した 。第 l卵
するために，著者らは本種の始原生殖細胞の動態に関
割の開始を起点とし，
して詳細に観察している 。 しかしながら，本種の匹発
時間的変化を観察した。割球の数を計測できる発生段
生過程については外部形態の記載はあるものの，一定
階では割球数を基準に発生段階を決定したが，ウキゴ
温度条件下での発生速度は示されていない (Hamada
リ匹の肱盤は不透明であるため， 6
4
細胞期以降は外部
1
9
6
8)
。本研究では ，育種におけ る発生工学的研究に
形態から割球の数を計測することができなかった。そ
資するために，シマウキゴ リにおける初期医発生の形
こで， 64
細胞期以降は 3
0分毎に脹盤を分離し， 1% ク
態形成を最近の知見をもとに捉え直すとともに一定温
エン酸三ナトリウムを含む淡水魚、用リンゲル液を満た
度下での発生段階を決定した。さらに細胞標識により
したガラスシャーレに入れ，各割球を解離させ割球数
細胞運命を明らかにすることで初期距における形態形
を計測した。割球の分離手術には，パスツールピペ ッ
成機構を明らかにし，他魚種の知見と比較した。
トを引き伸ばし，先端にグラスウールを接着した微細
H
f発生過程における外部形態の
ガラス針を 用 いた。 0
.
8%寒天を コーティ ングしたガ
材料および方法
ラスシャーレに一次培養液を満たし，その中に脹を入
れ，微細ガラス針を切断面となる匹盤と卵黄の境界面
受精卵の採取
4月下旬 -7月上旬の期間に，河川中の石の下に生
に押し当て，
H
f盤を分離した。
胞Hf中期から後期における匹盤の形態的変化は，
みつけられたシマウキゴリ受精卵を材料として用い
ゼブラフイツシュの脹発生過程を詳細に記載した既
た。卵の採取は，北海道函館市近郊の戸切地川および
報(
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immele
ta
.
l1
9
9
5)の表記法を用いた。匹環形成
茂辺地川で行った。発生段階の早い卵を含む卵塊を石
以降エピボリー終了までは，
H
f盤が卵黄細胞に覆い被
近年，ウキゴリ属の分類が再検討され，従来の
発生段階では受精後(採取後)の日数 (
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)で示した 。
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s， ウキゴリ G
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割球の標識
に分類された (
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)。 これら 3魚種は同所
胞の運動を観察するために， 0.2MKClで調整した 5%
的な生息域があることが知られている(石野 1
9
8
7
)。
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) 溶液を，シマウキゴリ妊の 1
6
そこで本研究では，用いた卵群を鮮化させ，その斑紋
細胞期から 3
2細胞期の単一の割球へ顕微注入すること
から稚魚がシマウキゴリであることを確認した。
により標識した 。顕微注入のためのガラス針は，微小
単一割球由来の細胞の挙動，特に胞距期における細
ガラス毛細管芳微小針作製機 (
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) により延
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司訓SS句叫
さっている割合を基準に発生段階を決定した 。体節形
成期には匹発生過程を体節数により示し，それ以降の
て
ごと採取し，ピンセットで石より卵を分離して水道水
中で培養した 。
シマウキゴリの旺発生過程
1
7
9
伸し，実体顕微鏡下で先端部をピンセットでわずかに
した。卵膜を除去した旺をブアン氏液により 2時間固
壊し開 口させて作製した 。顕微注入は，細胞標識用色
定した後， 80%エタノールに置換し使用するまで保存
素をガラス針に充填し，実体顕微鏡下でマイクロマニ
した。定法に従って，厚さ 8μmの連続切片を作成し
ピュレーター (
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) とマイクロインジェクター
スライドガラスに貼り付けた後，ヘマトキシリン・エ
(
E
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) を操作して行 った。顕微注入直後に蛍
オシン二重染色 (HE染色)を施し観察に用いた。
光顕微鏡により FITC
・
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nを含む割球を確認し，
結 果
他の割球へ標識色素が移行していた場合，その匹は廃
棄した。その後，標識された割球に由来する細胞の挙
動を ，実体蛍光顕微鏡 (
OLYMPUSSZ12FLM)で経
任発生過程
河川から採取された卵塊中には，未受精卵も含まれ
時的に観察した。
ていた。その卵膜は球形で膨潤しておらず，卵と密着
していた (
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A
)。受精卵は卵膜が膨潤し ，長水滴
組織切片の作成
シマウキゴリ匹を経時的に固定し，組織切片を作成
型を呈した。シマウキゴリ距の細胞質は，未受精卵に
‘.
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斎藤・荒井・山羽
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0
おいても卵黄細胞から明瞭に区別することができ ，卵
たこの発生段階の粧の組織切片を観察すると，エオシ
黄細胞を包み込むように分布していた。受精直後の旺
ン好性の頼粒が体細胞から消失していた 。体節の分節
へ蛍光色素を顕微注入しても，卵黄細胞には色素が拡
は，その卵群あるいは個々の卵により差が認められた
散することは無く距盤内だけで拡散した。受精直後の
0'tではおよそ 1時間 に 1体節ずつ分節した 。 1
4
が
， 2
妊の卵黄細胞には多数の油球が散在していたが，発生
体節期 (
41
時間)には眼胞内にレンズが形成され (
F
i
g
.
の進行に伴って融合し，体節形成期が終了する発生段
，1
6体節期 (
4
3時間)には耳胞が認められた 。 1
8
1P)
F
i
g
.
1
R
)。
階では単 ーの油球を形成した (
体節期 (
4
5時間)には囲心腔と心臓を確認すること
L
第 1卵割，第 2卵割は経割を行ったが，第 3卵割は
F
i
g
.1Q)
。コイ目魚類では，体節数の増加
ができた (
F
i
g
.1C
E
)。
距により異なり，一部の妊で緯割した (
にともない卵黄細胞が変形し後方へ伸長 (
卵黄伸長)
緯割した匹では結果として，佐盤の 8割球の構成が上
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.
l1
9
9
5)
，シ
することが知られているが(Kimmele
F
i
g
.1E，i
n
s
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t
)。 しかし，この
下 2層の構造を呈した (
マウキゴリ匪の卵黄細胞は球形を維持していた (
f
i
g
.
第 3卵割の卵割様式は比較的不均一で、， 1- 3個の割
1R
，S)
o3
0体節期までに，外部形態から腸管の形状が
球のみが緯割を起こした佐も観察された 。 また，採取
明瞭になった 。最終的な体節数は 36-37 (
6
3時間 )で
6
細
直後の卵でも，不均一な卵割様式は認められた 。 1
あったが，外部形態からは正確な数の計測は困難だ、っ
胞期以降の匹では，割球が整然と配列しているものか
F
i
g
.1T
)。この発生段階以降，眼色素の網膜へ
た (
ら不規則に位置しているものまで様々だ、った。しかし，
の沈着および体表でのメラノフォアの沈着が認めら
どのような卵割様式であっても，その後の妊発生への
れ，発生 6日目には組織学的に標の形成も認められた
影響は認められなかった 。匹盤はその後6
.
5時間で， 2
(
T
a
b
l
e1
)
。卵膜の除去を行わなか った脹は僻化し遊
細胞期から 5
1
2細胞期に達した。このとき，匹盤深部
泳を開始した (
F
i
g
.
1
V
)
。
に位置する割球と組織学的に比較すると，佐盤の表層
'tで培養したところ，
卵割期のシマウキゴリ距を 4
に位置する割球のほうが大きい傾向があった (
F
i
g
.
2
)。
0
'tで培養を再開するとふ
匪発生がほぼ停止したが， 2
s
f盤の表層付近には多量のエオシン好性の頼粒
たたび匹発生を開始した 。 また， 1
2時間程度の 4
't処
が観察された (
F
i
g
.2
)。第 1卵割面が形成されてから
理ではその後の形態形成に異常は認められなかった 。
また，
1
2時間後には，匹盤と卵黄の境界が平 らになり距全体
p
h
e
r
e期に達し (
F
i
g
.1
H
;T
a
b
l
e1
)
，
が球形を呈する s
0ml
) に約 1
0
0
シマウキゴリ旺は， 1シャーレ中(約 4
個体の，高密度で培養すると発生に遅滞が見られ，体
1
4時間後には卵黄細胞が匹盤を押し上げる，いわゆる
パルジング (
b
u
l
g
i
n
g
) が観察された (Dome期)。
1
6時間後には目玉環が確認できたことから， これ以降
の発生段階では佐盤葉下層の細胞がもぐり込みを開始
する，嚢旺期であると考えられた。またこのとき，背
側の匹環部には肥厚が認められ，背側と腹側の違いを
i
g
.1
1)
。こ
明瞭に区別することができた(距盾期;F
s
f盤の背側では
s
f盤葉下層の細胞層が
れ以降，エピボリーの進行に伴い，
さらに細胞が収敬して肥厚し，
より動物極側へ拡大しているのが認められた 。 また，
F
i
g
.
卵黄細胞の覆い被せも背側の方が早く進行した (
1
]
， K)o80%エピボリ一期までは，明瞭な匹体構造を
認めることはできなかったが， 90%エピボリ一期 (
2
4
時間)をすぎると，背側動物極側が急激に肥厚し，明
F
i
g
.1
L
)。この時期には，
確な頭部領域を形成した (
l
主体部腹側の卵黄栓付近にクッパー胞の形成が認めら
れた。
2
6時間後には匹盤が完全に卵黄を包み込む尾芽匹
期に達した。この時期にはすでに 1-2体節が形成さ
F
i
g
.1M)。ウキ
れており，眼胞の構造も確認された (
ゴリの匪盤は不透明で，その特徴はエピボリーの終了
4
体節期 (
41
時間 )ま
まで継続していたが，その後， 1
F
i
g
.1M
P
)0 HE染色を施し
でに匹体が透明化した (
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斎藤・荒井・山羽
1
8
2
察された。標準的な 90mmのプラスチックシャーレに
8細胞期以降は，妊によりいくつかの異なった卵割
様式が認められ，その中に割球が上下 2層の構造を呈
0個
卵膜未除去の卵を入れた場合， 1シャーレにつき 2
する匹があった。しかし，どの様な卵割様式をとっ
体程度の密度では正常に発生した。
てもその後の形態形成に違いが認められなかった。こ
節形成期以降には頭部の媛小化など奇形化した匹が観
のことは，初期卵割期の割球の位置や配列パターンの
標識した割球の動態
違いは形態形成に重要な役割をもっていないことを示
16~32細胞期に 標識した割球を ，蛍光顕微鏡によ
している。さらに， 16~32細胞期に FITC で標識した
り経時的に観察した。標識した割球も，未標識の割球
割球の子孫は，初期嚢肱期まで腔盤の中で大規模な
E盤表
と同様のタイミングで卵割を行い，胞匹期には A
混合を起こした。この結果は，初期嚢匹期まではそれ
層から深層まで位置する細胞集団を構成した。第 1卵
ぞれの割球が匹盤の中で位置を変化させても形態形成
割面の形成か、
ら 8時間後 (
約1
0
0
0
細胞期)までは標識
に影響を与えないことを示している。すなわち本種の
F
i
g
.3
A
)，1
0時間後
割球はそれぞれ隣接していたが (
発生機構が，少なくとも初期嚢匹期まで臨盤の割球に
になると標識された細胞の一部が標識細胞の集団から
分化多能性が維持されており，卵黄細胞からの誘導に
F
i
g
.
分離し，未標識の細胞中への移動が認められた (
より中距葉および背腹軸が決定されるという，ゼブラ
3
B
)。その後 1
2時間後 (
s
p
h
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r
e期)までに，標識され
Ho
フィッシュで提示されている初期細胞分化機構 (
た細胞と未標識の細胞は大規模に混合し，標識細胞は
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9
8
5) と同等であ
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mmel1993;K
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F
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g
.3
C
)。この拡
匹盤のより広い領域へと拡散した (
ることを強く示唆している。このことから，基本的な
散は，初期嚢匹期まで続いた (
F
i
g
.
3
D
)。
匹発生メカニズムは魚類の中で広く保存されているも
のと考えられる。ハゼ科魚類では，未受精卵の段階か
考 察
ら匹盤と卵黄細胞が明確に部域化されていた。このこ
とは，コイ科魚類では不明瞭な脹盤と卵黄細胞の誘導
本稿では， 20tにおけるシマウキゴリの匹発生過程
作用も，本種を用いることで実験発生学的に明らかに
と発生速度を明らかにするとともに，発生段階の指標
できる可能性がある。今後
となる形態的特徴および器官形成を記述し，表にまと
必要である。
T
a
b
l
e1
)
。現在まで，ハゼ科魚種では， シロウオ，
めた (
この点での詳細な研究も
シマウキゴ リ胞匹期距盤の各割球のサイズは，匹
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，および、海産のハゼ科魚種， n
e
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盤深層部に位置する割球よりも匹盤表層に位置する割
gobyの距発生過程における形態的変化が観察されて
球のほうが大きかった。両生類伍では，卵黄頼粒が多
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.
11
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9
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6
9)
。それらハゼ
いる(Ar
量に含まれる植物極では卵割溝の形成速度に遅滞が起
科魚種とシマウキゴリの伍発生過程を比較すると，匹
Hara1
9
7
7
)。また，最初
こることが報告されている (
のサイズに違いがあるものの ，後期嚢匹形成期に急激
に生じる緯割は卵黄頼粒の少ない動物極側で起こり，
に頭部が増大し，体節形成期に卵黄伸長が起こらない
結果として動物極側の割球が細かくなることが知られ
f発生過程での共通の形態的特徴が認められた。
など， s
ている。 HE染色を施した組織切片上では，シマウキ
また，細胞質と卵黄は，未受精卵の段階から明瞭に部
ゴリ伍の組織切片でも肱盤の表層付近に多量のエオ
e
g
r
o
域化され区別できた。この特徴は，ハゼ科魚種 n
シン好性の頼粒が観察されたことから，目玉盤表層にお
gobysfと共通である。しかしながら，受精直後に卵
ける分裂が頼粒により抑制されている可能性が考えら
f盤形成過程で細胞質が
黄と距盤の細胞質が混在し， s
れる。一方，嚢匹形成から初期体節形成期にかけて佐
卵黄細胞の内部を流動して動物極側に集合するゼブラ
体が透明化し，それと同時に HE染色を施した組織切
ta
.
12
0
0
0
)と
フイツシュなどのコイ目魚類(Leunge
片上ではエオシ ン好性頼粒の消失が認められた。この
f発生過程
は異なっていた。また，コイ目魚類では， s
ことから，伍の不透明性はこの頼粒に起因するもので
で卵黄細胞の形態は柔軟に変形し，いわゆる卵黄伸長
あったことを示している。この頼粒がいかなる機構で
と呼ばれる構造を形成するが，ハゼ科魚類では一貫し
匹盤の表層に位置しているのか，どの様な機能を有し
て球形を維持する J 卵黄を構成する成分あるいは卵黄
ているか明らかではないものの，胞目玉期の匹細胞は分
細胞を支持する細胞骨格の違いが，このような旺発生
化多能性を持っていることが明らかであることから，
過程における形態の違いの原因ではないかと考えられ
分化の方向性を決定する因子としての機能は無いもの
た。実際，卵形成過程において，卵黄を構成する複合
と考 えられる。
タンパク質であるピテロジェニンの分子構造や卵黄球
サンプリンク'を行った函館の近郊では，河川の水温
の存在様式が，魚種によって異なっていることが知ら
1
.
8
tから 1
9
.
5
tの範囲の期間にシマウキゴ
の平均が 1
9
8
9
)。
れている(高野 1
f発生期間の
リの産卵が行われているが，実際には， s
-圃
1
8
3
シマウキゴリの脹発生過程
水温は大き く変動する (
6
.
5-2
3
.
0
t
:)。本研究では，
なお，本研究は平成 14-15年度日本学術振興会科学
旺発生過程の温度条件を均一化するため，水温を一定
No.0446，斎藤
研究費補助金(特別研究員奨励費 DC2，
:
に 設定 した 。 自然界と比較し て，本研究の 条件
の20t
大樹)および平成 14-15年度日本学術振興会科学研究
ではやや高い水温が継続したことになる。しかし，適
B
)(
1
)
， No.14360105，代表研究
費補助金(基盤研究 (
切な培養条件では多数の個体が正常に発生・鮮化し，
者
山羽悦郎)に より実施された 。
文 献
ると発生を再開した。また半日程度の 4t:処理では，
その後の匹発生過程に形態的な障害は認められなかっ
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生の停止や再 開などの調節が可能であ ることは，初期
目玉を操作する研究に 用いる上で重要な特徴である。
本研究の結果から，卵や卵膜の性質に違いがあっ
ても ，基本的な匹発生機構は硬骨魚類 中で広 く保存
されていることが明らかとなった。このことは，伍盤
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移植によ る始原生殖細胞 の移植 (
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) など，現在まで一部の魚種に限定されていた発
生工学的手法をより多様な魚種へ展開できる可能性を
示している。今後は，シマウキゴリでそれらの技術の
適用を図り知見を 集積すると共に ，より 多様な魚種で
の展開が期待される。
要 約
20
t:におけるシマウキゴリ の距発生過程を詳細に観
察 した 。さら に，卵割期における単一割球の標識実験
により，匹盤における分化の方向性が決定される時期
を明ら かにした。その結果，未受精卵の段階から細胞
質が卵黄から分離していること，体節形成期に至るま
で旺細胞中には卵黄頼粒が分布しているが体節形成期
以降消失し匹体が透明化すること，第 3卵割以降，卵
割の様式が不規則になることが明らかとなった。また，
1
6
細胞期から 32
細胞期に標識された細胞追跡の結果，
胞距期から初期嚢脹期まで，標識細胞は未標識の細胞
と旺盤内で大規模な混合を起こすことが明らかとなっ
た。この結果は，初期嚢佐期まで佐盤の細胞は分化多
能性を有していることを示唆している 。
謝 辞
本研究を取り まとめるにあたり， 北海道大学大学院
水産科学研究科育種生物学講座の後藤晃助教授，李大
雄助手， 藤本貴史氏，相田貴紀氏およ び、水産学部の学
生諸氏には採卵に関して御協力いただいた。また，北
海道大学北方生物園フィールド科学センター水圏セン
ター七飯淡水実験所技官の 木村志津雄氏。および事務
の都木美佐江氏には良好な研究環境を提供していただ
いた。ここに篤くお礼申し上げる。
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t:の培養条件では旺発生はほぼ停止し，水温を上げ
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