公開特許公報 特開2015-123014

〔実 7 頁〕
公開特許公報（Ａ）
(19)日本国特許庁（ＪＰ）
(12)
(11)特許出願公開番号
特開2015-123014
（Ｐ２０１５−１２３０１４Ａ）
(43)公開日 平成27年7月6日(2015.7.6)
(51)Int.Cl.
ＦＩ
テーマコード(参考)
Ｃ１２Ｎ
5/04
(2006.01)
Ｃ１２Ｎ
5/00
２０３ ２Ｂ０３０
Ａ０１Ｈ
3/04
(2006.01)
Ａ０１Ｈ
3/04
４Ｂ０６５
審査請求 未請求
(21)出願番号
特願2013-270266(P2013-270266)
(22)出願日
平成25年12月26日(2013.12.26)
請求項の数12 ＯＬ （全11頁）
(71)出願人 311002447
キリン株式会社
東京都中野区中野四丁目１０番２号
(74)代理人 100091096
弁理士
平木 祐輔
(74)代理人 100118773
弁理士
藤田 節
(74)代理人 100169579
弁理士
(72)発明者 大西
村林 望
昇
東京都中野区中野四丁目１０番２号
キリ
ン株式会社内
(72)発明者 縄田
由紀子
東京都中野区中野四丁目１０番２号
キリ
ン株式会社内
最終頁に続く
(54)【発明の名称】エチレン阻害剤を用いた不定胚の誘導法
(57)【要約】
【課題】培養細胞からの不定胚誘導率を高めることによ
り、効率的に不定胚を製造する方法を提供することを目
的とする。
【解決手段】不定胚形成細胞を、エチレン作用阻害剤及
び/又はエチレン生合成阻害剤を含む培地で培養する工
程を含む、不定胚の製造方法。
【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
よる増殖法が利用されている。現在用いられているイン
【請求項１】
ビトロ培養法は、無菌環境下での挿し木、株分け、塊茎
不定胚形成細胞を、エチレン作用阻害剤及び/又はエチ
誘導、りん茎誘導の他、植物体再生能を有する細胞から
レン生合成阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、不
不定芽や不定胚を経由し、植物体を再生する方法等であ
定胚の製造方法。
る。
【請求項２】
【０００３】
エチレン作用阻害剤が銀イオンである、請求項１記載の
これらのうち、細胞から不定胚を経由して植物体を再生
方法。
する方法は、大量の植物体が効率良く得られることが期
【請求項３】
待される方法である。たとえば樹木苗の場合、米国ノー
エチレン作用阻害剤がクリザールである、請求項１記載 10
スカロライナ州だけでも1年間に約5千万本と非常に大量
の方法。
の苗が植付けられており（K.Roeder, Forestry and Tre
【請求項４】
e Planting in North Carolina, Tree Planters’ Note
エチレン作用阻害剤がSTS剤である、請求項１記載の方
s, 2011年, Volume 54, No. 2, pp12-22）、新規樹木品
法。
種・系統等の大量増殖法として本方法の実用化が大いに
【請求項５】
期待されている。
エチレン生合成阻害剤がアミノエトキシビニルグリシン
【０００４】
である、請求項１記載の方法。
しかしながら、本方法においては、現状で全ての細胞か
【請求項６】
ら植物体が再生するわけではなく、植物体再生効率を最
前記培地が液体培地である、請求項１∼５のいずれか１
大化できていない。特に、多くの場合、培養細胞からの
項記載の方法。
20
不定胚誘導効率が十分に高くないことに課題があり、実
【請求項７】
用レベルの植物体増殖に不定胚を用いることの大きな障
不定胚形成細胞を、エチレン作用阻害剤及び/又はエチ
害となっている。
レン生合成阻害剤を含む液体培地で培養する工程を含む
【０００５】
、不定胚の製造方法。
不定胚の誘導に影響を与える要因としては植物ホルモン
【請求項８】
が挙げられる。植物ホルモンは植物の生長調節・形態形
エチレン作用阻害剤が銀イオンである、請求項７記載の
成に重要な役割を果たしている事が知られており、オー
方法。
キシン、サイトカイニン、ABAなどの種々の植物ホルモ
【請求項９】
ンが不定胚誘導へ与える影響についても検討されている
エチレン作用阻害剤がクリザールである、請求項７記載
（非特許文献１）。
の方法。
30
【０００６】
【請求項１０】
エチレンも植物ホルモンの1つであり、生長抑制、成熟
エチレン作用阻害剤がSTS剤である、請求項７記載の方
促進、細胞肥大促進等の活性を有することが知られてい
法。
る。生長抑制に関わる活性は、特に培養条件を用いた植
【請求項１１】
物増殖の場面にて影響が大きい。培養容器の中でエチレ
エチレン生合成阻害剤がアミノエトキシビニルグリシン
ンが発生/蓄積することで植物体が褐変し、生長が阻害
である、請求項７記載の方法。
される。その解決策として、エチレン作用阻害剤やエチ
【請求項１２】
レン生合成阻害剤の利用が検討されている。特に、エチ
請求項１∼１１のいずれか１項記載の方法に従い、不定
レン作用阻害剤の1つである硝酸銀を培地に添加する方
胚を製造する工程と、
前記不定胚から植物体を再生する工程と、
法が様々な植物種で試みられている。培養細胞からの不
40
定胚誘導場面においても適用された例(非特許文献２及
を含む、植物体の製造方法。
び３)があるが、結果は様々であり効果の検証は十分で
【発明の詳細な説明】
はない。また、その検討は固体(寒天)培地で行われてい
【技術分野】
るものの、固体培地で通常用いられるシャーレあたりの
【０００１】
不定胚形成数は限られており（US patent 5294549, 199
本発明は、培養細胞からの不定胚誘導率を改善し、より
4年）、膨大な苗需要に固体培地による培養で対応する
効率的な植物体生産方法を提供する。
ことは不可能である。一方、大量増殖に適した液体培地
【背景技術】
における効果の検証例は殆どない。更に、硝酸銀以外の
【０００２】
エチレン作用阻害剤については検討自体が殆ど行われて
植物の栄養体は、挿し木、株分け、塊茎、りん茎等を利
いない。
用し増殖されるが、植物種によってはインビトロ培養に 50
【先行技術文献】
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【非特許文献】
ずれか１記載の方法。
【０００７】
（７）不定胚形成細胞を、エチレン作用阻害剤及び/又
【非特許文献１】V.M.Jimenez, Involvement of plant
はエチレン生合成阻害剤を含む液体培地で培養する工程
hormones and plant growth regulators on in vitro s
を含む、不定胚の製造方法。
omatic embryogenesis, Plant Growth Regulation , 20
（８）エチレン作用阻害剤が銀イオンである、（７）記
05年, Vol.47, pp. 91-110
載の方法。
【非特許文献２】V. Kumar, et al., Influence of dif
（９）エチレン作用阻害剤がクリザールである、（７）
ferent ethylene inhibitors on somatic embryogenesi
記載の方法。
s and secondary embryogenesis from Coffea canephor
a P ex Fr., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 2007
（１０）エチレン作用阻害剤がSTS剤である、（７）記
10
載の方法。
年, Vol. 43, pp. 602-607
（１１）エチレン生合成阻害剤がアミノエトキシビニル
【非特許文献３】A.E. Meskaoui and F.M. Tremblay, E
グリシンである、（７）記載の方法。
ffects of sealed and vented gaseous microenvironme
（１２）（１）∼（１１）のいずれか１記載の方法に従
nts on the maturation of somatic embryos of black
い、不定胚を製造する工程と、前記不定胚から植物体を
spruce with a special emphasis on ethylene, Plant
再生する工程とを含む、植物体の製造方法。
Cell, Tissue and Organ Culture, 1999年, Vol. 56, p
【発明の効果】
p. 201-209
【００１２】
【発明の概要】
本発明によれば、不定胚形成細胞をエチレン作用阻害剤
【発明が解決しようとする課題】
及び/又はエチレン生合成阻害剤を含む培地で培養する
【０００８】
20
ことにより、産業上有用な不定胚の誘導率を高めること
上述のように、細胞から不定胚を経由して植物体を再生
が可能である。
する方法によれば、大量の植物体を効率良く得ることが
【図面の簡単な説明】
できるが、しかしながら、当該方法は十分に確立されて
【００１３】
いない。
【図１】クリザールがテーダマツの不定胚誘導に及ぼす
【０００９】
影響(液体培地)を示すグラフである。
そこで、本発明は、培養細胞からの不定胚誘導率を高め
【発明を実施するための形態】
ることにより、従来法に比してより効率的な不定胚によ
【００１４】
る植物体生産を可能とする方法を提供することを目的と
本発明に係る不定胚の製造方法(以下、「本発明に係る
する。
方法」と称する)は、不定胚形成細胞を、エチレン作用
【課題を解決するための手段】
30
阻害剤及び/又はエチレン生合成阻害剤を含む培地で培
【００１０】
養する工程を含む方法である。本発明に係る方法によれ
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、エチレ
ば、従来法に比して、不定胚形成細胞からの不定胚の誘
ン作用阻害剤及び/又はエチレン生合成阻害剤を含む培
導効率を高めることができる。
地で不定胚形成細胞を培養することにより、不定胚の誘
【００１５】
導効率を高め得ることを見出し、本発明を完成するに至
一般に、不定胚を経由する植物体再生の工程は、(1)植
った。
物組織(外植片)から不定胚形成能を有する細胞(不定胚
【００１１】
形成細胞)を誘導・維持・増殖する工程、(2)不定胚形成
すなわち、本発明は以下を包含する。
能を有する細胞(不定胚形成細胞)から不定胚を誘導する
（１）不定胚形成細胞を、エチレン作用阻害剤及び/又
工程、及び(3)不定胚からの植物体再生工程から成る。
はエチレン生合成阻害剤を含む培地で培養する工程を含 40
これらの中で、本発明に係る方法では、(2)の工程にお
む、不定胚の製造方法。
いて、不定胚形成細胞を、エチレン作用阻害剤及び/又
（２）エチレン作用阻害剤が銀イオンである、（１）記
はエチレン生合成阻害剤のうち1種又は複数種を添加し
載の方法。
た培地で培養することにより不定胚誘導効率を改善する
（３）エチレン作用阻害剤がクリザールである、（１）
ことができる。
記載の方法。
【００１６】
（４）エチレン作用阻害剤がSTS剤である、（１）記載
本発明では、エチレン作用阻害剤として、銀イオン、具
の方法。
体的には硝酸銀の他、STS(チオ硫酸銀錯塩)剤、及びSTS
（５）エチレン生合成阻害剤がアミノエトキシビニルグ
剤を含む市販のエチレン作用阻害剤(クリザール：商品
リシンである、（１）記載の方法。
名クリザールK-20C等)を用いることができる。夫々のエ
（６）前記培地が液体培地である、（１）∼（５）のい 50
チレン作用阻害剤の添加濃度は、植物種、不定胚形成細
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胞の状態及び培養条件等によって最適な値を選択する。
1）2,：727-732；農林水産研究文献解題No. 17 植物バ
以下の濃度に限定されるものではないが、例えばテーダ
イオテクノロジー 平成3年；国際公開WO2007/064028；E
マツの液体培養条件での不定胚誘導においては、下記の
. Maruyamaら, 「Embryogenic cell culture, protopla
実施例で用いているクリザールK-20CやSTS剤の場合、銀
st regeneration, cryopreservation, biolistic gene
イオン濃度50μM∼130μMで用いることができる。一方
transfer and plant regeneration in Japanese Cedar
、硝酸銀の場合は、固体(寒天)培地では同様の濃度帯に
」, Plant biotechnology (2000) 17: 281-296；GS. Pu
て各種検討が行われているが、液体培養条件においては
llmanら, 「Improving loblolly pine somatic embryo
それら濃度帯では細胞の成長が過度に抑制され、条件に
maturation : comparison of somatic and zygotic emb
よっては枯死してしまう。そこで、硝酸銀の場合、液体
ryo morphology, germination and gene expression」,
培養条件での好ましい濃度はかなり低く、銀イオン濃度 10
Plant Cell Rep. (2003) 21 : 747-758等に記載されて
で0.02∼5μMである。
いる方法を用いることができる。
【００１７】
【００２３】
一方、エチレン生合成阻害剤としては、アミノエトキシ
＜不定胚形成細胞から不定胚を誘導する工程＞
ビニルグリシン(AVG)を用いることができる。添加濃度
次いで、本発明に係る方法では、上述のように準備した
は、エチレン作用阻害剤の場合と同様に、植物種、不定
不定胚形成細胞を、エチレン作用阻害剤及び/又はエチ
胚形成細胞の状態及び培養条件等によって最適な値を選
レン生合成阻害剤を含む培地で培養する。
択する。下記の実施例で用いているAVGの場合は、0.01
【００２４】
∼20μMの濃度で用いることができる。
エチレン作用阻害剤及び/又はエチレン生合成阻害剤を
【００１８】
含む培地における培養を除き、当該工程における不定胚
以下、本発明に係る方法において、上述したエチレン作 20
の誘導方法は特に限定はなく、公知の方法を使用するこ
用阻害剤及び/又はエチレン生合成阻害剤の施用に用い
とができる。例えば、上記文献(すなわち、農林水産研
得る植物及び用い得る培養工程を例示する。
究文献解題No. 17 植物バイオテクノロジー平成3年；国
【００１９】
際公開WO2007/064028；E. Maruyamaら, 「Embryogenic
＜植物＞
cell culture, protoplast regeneration, cryopreserv
本発明に係る方法は、不定胚を提供する植物に適用可能
ation, biolistic gene transfer and plant regenerat
である。植物としては、以下のものに限定されないが、
ion in Japanese Cedar」, Plant biotechnology (2000
好ましくはマンサク科、ヒノキ科、マツ科、マメ科、フ
) 17: 281-296；GS. Pullmanら, 「Improving loblolly
トモモ科、ヤナギ科、クワ科、セリ科、サトイモ科、イ
pine somatic embryo maturation : comparison of so
ネ科、ユリ科及びヒルガオ科に属する植物が挙げられる
matic and zygotic embryo morphology, germination a
。
30
nd gene expression」, Plant Cell Rep. (2003) 21 :
【００２０】
747-758等)に記載されている方法を用いることができる
上記植物の例は以下のとおりである。マンサク科(スイ
。なお、固体培地と液体培地の何れの条件も適用可能で
ートガム等）、ヒノキ科(ヒノキ等）、マツ科(マツやト
あるが、大量増殖に適した液体培地(液体培養)が好まし
ウヒ等）、マメ科(アルファルファやアカシア等）、フ
い。また、光条件にも特に限定はない。
トモモ科(ユーカリ等）、ヤナギ科(ポプラ等）、クワ科
【００２５】
(ゴムノキ等）、セリ科(ニンジン、セロリ等）、サトイ
＜不定胚の脱水工程＞
モ科(スパティフィラム等）、イネ科(イネ等)、ユリ科(
上記のようにして誘導した不定胚はそのまま発芽工程に
アスパラガス等）、ヒルガオ科(サツマイモ等）。
供試することができる。ただし、不定胚を脱水や乾燥に
【００２１】
＜植物組織(外植片)から不定胚形成能を有する細胞(不
供することによりその後の植物体再生率が向上する場合
40
があることが知られている。また、保存が必要な場合は
定胚形成細胞)を誘導・維持・増殖する工程＞
、不定胚に脱水や乾燥処理を施すことで一定期間の保存
本発明に係る方法では、先ず不定胚形成能を有する細胞
が可能となる。
(不定胚形成細胞)を準備する。
【００２６】
【００２２】
＜不定胚からの幼植物体再生工程＞
本発明に用いる各種植物における未熟胚、葉、葉柄、根
上記のようにして得られた不定胚又は脱水不定胚は固体
等の各種植物組織(外植片)からの不定胚形成細胞の誘導
培地上でも液体培地中でも高効率で発芽する。発芽に用
、維持及び増殖方法は、特に限定はなく、公知の方法を
いる培地は、MS培地等を基本培地とし、糖源としてショ
使用することができる。例えば、A. Jiら, 「Advances
糖を1∼6％、好ましくは2∼4％添加する。発芽した不定
in Somatic Embryogenesis Research of Horticultural
胚は発根も伴い、そのまま幼植物体へと生育する。また
Plants」, American Journal of Plant Sciences（201 50
、生育した幼植物体を、通常の方法に従い生育させるこ
( 5 )
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とで、植物体を生産(製造)することができる。
均不定胚数を算出した。結果を以下の表２に示す。
【実施例】
【表２】
【００２７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、
本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるもので
はない。
【００３１】
【００２８】
表２に示すように、クリザールを添加した全ての濃度条
本実施例で使用する培地の組成を以下の表１に示す。
件で、対照(クリザール非含有培地)に比して細胞塊当た
【表１】
りの不定胚誘導数が増加した。特に銀イオン濃度67μM
10
の試験区では対照比2倍を超える不定胚が得られた。ま
た得られた不定胚のサイズも対照に比して大きくまた形
態も良好であった。
【００３２】
〔実施例２〕各種エチレン阻害剤がヤツガタケトウヒの
不定胚誘導に及ぼす影響(液体培地)
実施例１と同じヤツガタケトウヒの不定胚形成細胞を用
いて、以下の実験を実施した。
液体増殖培地(LP)100mlを含む300ml三角フラスコに不定
胚形成細胞0.4gを置床し、暗所、25℃、80rpmの条件に
20
て2週間浸盪培養を行った。増殖した細胞を培地と共に
ピペットで2ml吸い取り、硝酸銀、STS(チオ硫酸銀錯塩
）剤、市販のSTS剤であるクリザールK-20Cを夫々銀イオ
ン濃度が30、44、67、100、200μMになる様に添加した
液体不定胚誘導培地(LPS、100ml/300ml三角フラスコ)に
置床し、暗所、25℃、80rpmにて5週間浸盪培養を行い不
定胚の誘導を行った。培養後、各試験区の培地1ml中に
含まれる不定胚数を計測し、対照(エチレン阻害剤非含
有培地)比の不定胚誘導効率を算出した。結果を以下の
表３に示す。
30
【表３】
【００２９】
〔実施例１〕クリザールがヤツガタケトウヒの不定胚誘
【００３３】
導に及ぼす影響(固体培地)
表３に示すように、銀イオンを硝酸銀の形態で添加した
ヤツガタケトウヒの未熟種子から常法に従って誘導し(
条件では不定胚は殆ど得られなかった。特に、44μMの
丸山ら, 「絶滅危惧種ヤツガタケトウヒの不定胚形成」
濃度では置床した細胞は枯死した。STS剤として添加し
, 日本森林学会大会学術講演集（2007）118巻）、固体
た試験区では、対照比1.3倍の効率にて不定胚が誘導さ
増殖培地(EM)で2∼3週間毎に継代培養されている不定胚
れた。更に、クリザールK-20Cとして添加した試験区で
形成細胞(森林総合研究所保有)を用いて、以下の試験を 40
は、対照比1.3∼1.7倍と顕著に高い不定胚誘導効率が得
実施した。
られた。この様に、銀イオンの添加形態が不定胚誘導効
【００３０】
率に大きな影響を及ぼすことが判明した。
クリザールK-20C(クリザールジャパン(株)、大阪、日本
【００３４】
国)の最終濃度が1/3000倍（銀イオン濃度67μM）、1/20
〔実施例３〕クリザールがテーダマツの不定胚誘導に及
00倍（同100μM）、1/1000倍(同200μM)になる様に添加
ぼす影響(液体培地)
した固体不定胚誘導培地(MP)を作製し、直径9cmのシャ
テーダマツの未熟種子から常法に従って誘導し(GS. Pul
ーレに20mlずつ分注した。それら培地に不定胚形成細胞
lmanら, 「Improving loblollypine somatic embryo ma
を置床し(約100mgの細胞塊をシャーレあたり9個ずつ置
turation : comparison of somatic and zygotic embry
床）、暗所、25℃にて5週間培養し、不定胚の誘導を行
o morphology, germination and gene expression」, P
った。培養の後、置床細胞塊毎に不定胚数を計測し、平 50
lant Cell Rep. (2003) 21 : 747-758）、固体増殖培地
( 6 )
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10
(LPSA：LP培地にゲルライトを0.25％濃度で添加した培
【表４】
地)で2∼3週間毎に継代培養されている不定胚形成細胞
を用いて、以下の試験を実施した。
【００３５】
【００３８】
液体増殖培地(LP)100mlを含む300ml三角フラスコに不定
硝酸銀は、不定胚誘導場面での使用が幾つかの事例で検
胚形成細胞0.4gを置床し、暗所、25℃、80rpmの条件に
討されている(寒天培地）。
て2週間浸盪培養を行った。増殖した細胞を培地と共に
表４に示すように、用いられている濃度は数十μMであ
ピペットで3ml吸い取り、クリザールK-20Cの最終濃度が
るが、実施例２と同じくそれら濃度では細胞は全て枯死
1/4000倍（銀イオン濃度50μM）、1/3000倍(同67μM）
した(液体培地）。一方、非常に薄い濃度で添加した試
、1/2000倍(同100μM）、1/1500(同134μM）、1/1000倍 10
験区では、対照に比して大きく改善された不定胚誘導が
(同200μM)になる様に添加した液体不定胚誘導培地(LPS
認められた。大量培養に適した液体培地では、硝酸銀の
)に置床し、暗所、25℃、80rpmにて4週間浸盪培養を行
場合、非常に薄い濃度での使用が必須である。
い不定胚の誘導を行った。培養後、各試験区の培地1ml
【００３９】
中に含まれる不定胚数を計測し、フラスコ当たりの不定
〔実施例５〕アミノエトキシビニルグリシン(AVG)がヤ
胚数を算出した。結果を図１に示す。
ツガタケトウヒの不定胚誘導に及ぼす影響(液体培地)
【００３６】
実施例１と同じヤツガタケトウヒの不定胚形成細胞を用
図１に示すように、クリザールの添加によって、不定胚
いて、以下の実験を実施した。
誘導数が顕著に増加することが確認された。特に、銀イ
液体増殖培地(LP)100mlを含む500ml三角フラスコに不定
オン濃度67μM及び100μM区では、対照(クリザール非含
胚形成細胞0.4gを置床し、暗所、25℃、80rpmの条件に
有培地)比4倍以上の不定胚が形成された。得られた不定 20
て2週間浸盪培養を行った。増殖した細胞を培地と共に
胚のサイズも対照に比して大きく、形態も良好であった
ピペットで2ml吸い取り、アミノエトキシビニルグリシ
。また、銀イオン濃度によっては、不定胚の分化段階が
ン(AVG)を0.5、1.0、2.5、5.0、10.0μMの濃度で添加し
より進むことが観察された。
た液体不定胚誘導培地(LPS、100ml/300ml三角フラスコ)
【００３７】
に置床し、暗所、25℃、80rpmにて5週間浸盪培養を行い
〔実施例４〕硝酸銀がテーダマツの不定胚誘導に及ぼす
不定胚の誘導を行った。培養後、各試験区の培地1ml中
影響(液体培地)
に含まれる不定胚数を計測し、対照(AVG非含有培地)比
実施例３と同じテーダマツの不定胚形成細胞を用いて、
の不定胚誘導効率を算出した。結果を以下の表５に示す
以下の実験を実施した。
。
液体増殖培地(LP)100mlを含む300ml三角フラスコに不定
【表５】
胚形成細胞0.4gを置床し、暗所、25℃、80rpmの条件に
30
て2週間浸盪培養を行った。増殖した細胞を培地と共に
ピペットで3ml吸い取り、銀イオン濃度が0.018、0.06、
0.6、50、67、100μMになる様に硝酸銀を添加した液体
【００４０】
不定胚誘導培地(LPS、100ml/300ml三角フラスコ)に置床
表５に示すように、AVGはエチレンの生合成阻害剤であ
し、暗所、25℃、80rpmにて4週間浸盪培養を行い不定胚
るが、硝酸銀等のエチレンの作用阻害剤と同様に、不定
の誘導を行った。培養後、各試験区の培地1ml中に含ま
胚形成効率を高める効果が確認できた。最良の不定胚誘
れる不定胚数を計測し、対照(硝酸銀非含有培地)比の不
導は、0.5μM区で認められた。
定胚誘導効率を算出した。結果を以下の表４に示す。
【図１】
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(72)発明者
安野
紀子
東京都中野区中野四丁目１０番２号
Ｆターム(参考) 2B030 AA03
CA28
キリン株式会社内
CB01
CD02
CD06
CD07
4B065 AA88X AA89X BA12
BD22
BD33
CA60
JP
2015-123014
A
2015.7.6