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微生物内で産生されたポリペプチドのグルコノイル化を防止する方法に
JP 2006-520609 A 2006.9.14 (57)【 要 約 】 本発明は、微生物内で産生されたポリペプチドのグルコノイル化を防止する方法に関する 。 (2) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【特許請求の範囲】 【請求項１】 豊富な培地内で微生物を成長させることを含む、微生物中で発現されたポリペプチドの グルコノイル化を防止するための方法。 【請求項２】 前記微生物が最小培地内で成長させられた場合には有意な６−ホスホグルコノラクトナ ーゼ活性を示さない、請求項１に記載の方法。 【請求項３】 前記微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１に記載の方法。 【請求項４】 10 前記大腸菌がＢ菌株である、請求項３に記載の方法。 【請求項５】 前記豊富な培地が複合窒素供給源を含む、請求項１に記載の方法。 【請求項６】 前記豊富な培地が、細胞密度に対する複合窒素供給源の濃度について１：１という比率 に細胞成長を維持する能力を有する、請求項５に記載の方法。 【請求項７】 前記複合窒素供給源がトリプトンである、請求項５に記載の方法。 【請求項８】 前記複合窒素供給源がペプトンを含む、請求項５に記載の方法。 20 【請求項９】 前記複合窒素供給源が酵母エキスである、請求項５に記載の方法。 【請求項１０】 前記培地がスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）である、請求項１に記載の方法。 【請求項１１】 前記スーパーブロス培地が２倍に濃縮されている、請求項１０に記載の方法。 【請求項１２】 前記微生物が、異種ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を形質移入する、請求 項１に記載の方法。 【請求項１３】 30 ポリペプチドの発現のため大腸菌のＫ菌株変種を発酵することを含む、大腸菌内で発現 されたポリペプチドのグルコノイル化を防止する方法。 【請求項１４】 前記Ｋ菌株が、同じ条件下で成長させられたＢ菌株と比較した場合に１００倍高いホス ホグルコノラクトナーゼ活性を示す、請求項１３に記載の方法。 【請求項１５】 前記Ｋ菌株がＫ−１２である、請求項１４に記載の方法。 【請求項１６】 微生物中にＤＮＡを導入することを含む、微生物内で発現されたポリペプチドのグルコ ノイル化を防止するための方法であって、該ＤＮＡが、６−ホスホグルコノラクトナーゼ 40 活性を示すポリペプチドをコードする方法。 【請求項１７】 前記微生物が大腸菌である、請求項１６に記載の方法。 【請求項１８】 前記ＤＮＡが、６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡを含む、請求 項１６に記載の方法。 【請求項１９】 前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡがシュードモナス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡに 対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。 50 (3) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【請求項２０】 前記シュードモナスが緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、請求項１９に記載 の方法。 【請求項２１】 前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡが配列番号７に対し 少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。 【請求項２２】 前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡが配列番号７に対し 少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。 【請求項２３】 10 前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素が、配列番号８に対し少なくとも９０％の配 列同一性をもつアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の方法。 【請求項２４】 前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素が、配列番号８に対し少なくとも９５％の配 列同一性をもつアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の方法。 【請求項２５】 前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡが、配列番号７に記 載の配列を含む、請求項１８に記載の方法。 【請求項２６】 前記ＤＮＡが組換えＤＮＡである、請求項１６に記載の方法。 20 【請求項２７】 前記ＤＮＡが前記微生物のゲノムＤＮＡに形質転換される、請求項１６に記載の方法。 【請求項２８】 ポリペプチドのグルコノイル化を防止する能力を有する微生物。 【請求項２９】 ６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、 請求項２８に記載の微生物。 【請求項３０】 ６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項２８に記載の微生 物。 30 【請求項３１】 ６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡがシュードモナス由来の６−ホス ホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し 、シュードモナスではない、請求項２８に記載の微生物。 【請求項３２】 ６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡがシュードモナス由来の６−ホス ホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡと少なくとも９５％の配列同一性を有し 、シュードモナスではない、請求項２８に記載の微生物。 【請求項３３】 ６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡが、緑膿菌に由来する、請求項３ 40 １に記載の微生物。 【請求項３４】 大腸菌の一菌株である、請求項２８に記載の微生物。 【請求項３５】 大腸菌の一菌株であり、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡが微生物 のゲノム内に取込まれている、請求項３１に記載の微生物。 【請求項３６】 配列番号７に記載のポリペプチドに対し少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレ オチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。 【請求項３７】 50 (4) JP 2006-520609 A 2006.9.14 配列番号８に対し少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸を含むポリペプチドを コードするポリヌクレオチドに対し少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド を含む、請求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチド。 【請求項３８】 前記ＤＮＡが６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すタンパク質をコードする、請 求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチド。 【請求項３９】 前記ＤＮＡ配列が配列番号７に記載されている、請求項３６に記載の単離されたポリヌ クレオチド。 【請求項４０】 10 前記ＤＮＡ配列が、緑膿菌由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡ に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３６に記載の単離されたポリヌク レオチド。 【請求項４１】 ヒト−インターロイキン−１８をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３ ５に記載の単離されたポリヌクレオチド。 【請求項４２】 配列番号７に記載されているポリヌクレオチドに対し少なくとも９５％の同一性を有す るポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。 【請求項４３】 20 請求項１に記載の方法による前記ポリペプチドを発現することを含む、ポリペプチド結 晶形成を改善する方法。 【請求項４４】 請求項１６に記載の方法による前記ポリペプチドを発現することを含むポリペプチド結 晶形成を改善する方法。 【請求項４５】 前記ポリペプチドがグルコノイル化されたポリペプチドと比べて発酵段階で増大した力 価収量を示す、成長効率を改善することをさらに含む、請求項１に記載の方法。 【請求項４６】 前記ポリペプチドがグルコノイル化されたポリペプチドと比べて発酵段階で増大した力 30 価収量を示す、成長効率を改善することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。 【請求項４７】 ６−ホスホグルコノラクトナーゼ（「ｐｇｌ」）活性をもつ酵素と共に微生物内のヒト インターロイキンを同時発現させることを含む、ヒトインターロイキンを産生する方法。 【請求項４８】 前記ヒトインターロイキンがＩＬ−１８である、請求項４７に記載の方法。 【請求項４９】 前記微生物が大腸菌である、請求項４７に記載の方法。 【請求項５０】 前記ｐｇｌが、前記大腸菌のゲノムへと形質転換されるポリヌクレオチドによりコード 40 されている、請求項４９に記載の方法。 【請求項５１】 豊富な培地の中で成長させられる微生物内でヒトインターロイキンを発現することを含 むヒトインターロイキン産生方法。 【請求項５２】 前記ヒトインターロイキンがＩＬ−１８である、請求項５１に記載の方法。 【請求項５３】 前記微生物が大腸菌である、請求項５１に記載の方法。 【請求項５４】 前記豊富な培地がフィトンペプトンを含む、請求項５１に記載の方法。 50 (5) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【請求項５５】 前記豊富な培地がバクト酵母エキスを含む、請求項５１に記載の方法。 【請求項５６】 感染性ラムダファージ発現を全く含まない微生物。 【請求項５７】 ラムダファージカプシド構造タンパク質ｇｐＥが欠失又は分断されている、請求項５６ に記載の微生物。 【請求項５８】 前記微生物が大腸菌である、請求項５６に記載の微生物。 【請求項５９】 10 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む、請求項５６に記載の微生物。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 本発明は、生化学工学の分野に関する。より特定的に言うと、本発明は、ポリペプチド を産生するための発酵プロセスに関する。 【背景技術】 【０００２】 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）」）は、研 20 究、診断、治療及び工業目的でのタンパク質の発現用として一般的に使用される宿主であ る。近代の発現系は、高水準の多様なタンパク質を達成する能力を有する（非特許文献１ ）。 【０００３】 しかしながら、発現されたタンパク質の品質は往々にして、数量と同じ位又はそれ以上 に重要である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されたタンパク質は、不溶性凝集体とし て形成されてもよいし、又は、誤って取込まれたアミノ酸を有する（非特許文献２）か又 はＮ末端メチオニンを保持していてもよい（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５ ）。さらに、例えば酸化（非特許文献６、非特許文献７）又はα−Ｎ−６−ホスホグルコ ノイル化（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０「ヤン（Ｙａｎ）ら、Ｉ」、非 30 特許文献１１「Ｙａｎ ら、ＩＩ」）といったような望ましくない翻訳後修飾も発生し得 る。 【０００４】 これらの修飾は、発現されたタンパク質の活性、安定性、構造又は免疫原性に不利な影 響を与え、ポリペプチド発現用の宿主としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の有用性を大幅に 低減する可能性がある。 【０００５】 ヘキサヒスチジン親和性タグ（「ｈｅｘａ Ｈｉｓ−ｔａｇ」に融合された複数の組換 え型タンパク質のアルファ（α）−Ｎ−６−ホスホグルコノイル化が記述されてきている （非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。これらの研究にお 40 いては、グルコン酸誘導体は、組換え型タンパク質の末端部に付着することが発見された 。これらのタンパク質は全て、ｐＥＴベースのベクター（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）） を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢ菌株の中で発現された。報告されている場合には、 ＬＢ培地が使用された。付加体は、６−ホスホグルコノラクトン（６−ＰＧＬ）の付加を 表わす２５８ダルトン（「Ｄａ」）の、又はリン酸塩の無いグルコノラクトンの存在を表 わす１７８Ｄａのポリペプチドと会合させられた追加質量として検出された。ホスホグル コノイル化は、ペントースリン酸シャントの中間体である内因性６−ＰＧＬとの反応を通 してＮ末端α−アミノ基において発生すると推測された。＋１７８Ｄａの付加体は、リン 酸塩を除去するべく＋２５８Ｄａの付加体に酵素活性が作用した結果となるよう提案され た。付加体の形成はＨｉｓタグに隣接するＮ末端におけるアミノ酸配列に特異的であるこ 50 (6) JP 2006-520609 A 2006.9.14 とが示された。 【０００６】 ＸＸがＳＳ、ＳＡ、ＡＳ又はＡＡであるＧＸＸＨＨＨＨのポリペプチド配列は、最もα −Ｎ−６−ホスホグルコノイル化を受けやすく、一方ＳＨＨＨＨＨＨはさほど受けやすく なく、ＰＨＨＨＨＨＨ及びＰＦＨＨＨＨＨＨは、全く修飾されなかった（非特許文献８） 。タンパク質上のその他の場所のその他のアミノ酸における修飾は、高レベルの付加され たグルコノラクトンを使用したインビボ又はインビトロ実験では検出されなかった（非特 許文献８）。 【０００７】 Ｎ末端ホスホグルコノイル化は、タンパク質の結晶化を阻害することが示された（非特 10 許文献９）が、タンパク質機能、安定性又は免疫原性に対するその効果については、他に 比較的わずかしかわかっていない。６−ＰＧＬは、強力な求電子物質であることから、イ ンビボでの糖化反応に関与しうると予想されている（非特許文献１２）。タンパク質の糖 化は広く研究されてきており、糖尿病合併症に関連する疾病状態及び加齢において重要な 役割を果たすことがわかっている（非特許文献１３）。外因的に添加されたデルタ−グル コノラクトンが、糖尿病の血管合併症における１つの因子でありうる、へモグロビンの糖 化をひき起こすことが示されてきた（非特許文献１４）。さらに、Ｌｙｓ３１３のイプシ ロン−アミノ基におけるアラニンアミノトランスフェラーゼの糖化が、その触媒活性を著 しく低下させる（非特許文献１５）。 【０００８】 20 ６−ホスホグルコノラクトナーゼ（「ｐｇｌ」）は、特に６−ＰＧＬの６−ホスホグル コン酸への加水分解において、ペントース−リン酸経路の必須酵素であることが示されて きた（非特許文献１６）。この酵素をコードする遺伝子は、ヒト（非特許文献１７）、緑 膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍａｎｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（非特許文献１８）及びトリパノ ソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）及び熱帯熱マラリア原虫 （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｓ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）（非特許文献１６）の中で同定されて きた。ｐｇｌ活性は長い間大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で観察されてきた（非特許文献１９ 「クポール（Ｋｕｐｏｒ）Ｉ」及び非特許文献２０「クポール（Ｋｕｐｏｒ）ＩＩ」）が 、この活性をもつ酵素をコードすることを担当する遺伝子配列は全く同定されていない（ 非特許文献２１）。ペントースリン酸シャントを通した代謝流束を可能にすることに加え 30 て、細胞内部のｐｇｌ活性は、６−ＰＧＬの蓄積及びその結果としての細胞内求核試薬と の損傷性反応を防止することが示唆されてきた（非特許文献１６）。Ｎ末端でのタンパク 質のホスホグルコノイル化の報告された観察は、経路内で産生された６−ＰＧＬがタンパ ク質を修飾できるという仮説を裏づけしているが、ｐｇｌ活性の変調が修飾済みタンパク 質のレベルに影響を及ぼしうることの報告済みの証拠は全く存在しない。 【０００９】 さらに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、研 究、診断、治療及び工業目的でのタンパク質の発現のために一般的に使用される宿主であ る（非特許文献２２）。この菌株は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーの発現と問 題の組換え型タンパク質上のプラスミドベースのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータの使 40 用を組合わせることにより組換え型タンパク質の非常に高い発現レベルを達成することか ら、商業的に魅力あるものである。従って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはきわめて選択的で かつ活性なＲＮＡポリメラーゼであることから、組換え型タンパク質の転写は非常に高い レベルまで、往々にして宿主細胞の写しが減少するほどにまで蓄積する。 【００１０】 残念なことに、菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、検出可能ではあるが、それでも約１０∼２ ０プラーク形成単位／ｍｌ（ＰＦＵ）と非常に低い感染性ラムダファージ粒子を放出する （非特許文献２３）。おそらく、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、ラムダｉｎｔ遺伝子 内に挿入されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持する欠損ラムダファージＤＥ３での 形質導入によりＢＬ２１宿主細胞染色体の中に導入されている（非特許文献２２）。結果 50 (7) JP 2006-520609 A 2006.9.14 としての欠損プロファージは、ｉｎｔ遺伝子の中断に起因して正常に複製できない。ＤＥ ３プロファージの染色体切除は、感染性のファージ粒子のパッケージング及び放出に先立 つプロファージの複製のための１つの必要条件であり、ｉｎｔ遺伝子の産物により指示さ れる相同的切除組換えによって左右される。本書に記述されている通り、放出された非常 に低レベルのファージ粒子は、異常なｉｎｔ独立型ランダムプロファージ切除事象に起因 している。低レベルの感染性ファージ粒子の放出は、一部の研究所では受容可能であり得 るが、感染性ファージの放出は全て、患者の安全性に対する考慮のためと同時に感染性因 子の放出がその他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベースの製造プロセスを危険にさらし得るこ とから、生物医薬品製造工場では全く受容できない。 【００１１】 10 【非特許文献１】バネックス（Ｂａｎｅｙｘ）、生物工学の最新情報（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１０：４１１−４２１（１９９９ ） 【非特許文献２】ボゴシアン（Ｂｏｇｏｓｉａｎ）ら、生物化学報（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６４；５３１−５３９（１９８９） 【非特許文献３】シャウドユリ（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ）ら、生物工学報（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）２８５；１１７９−１１９４（１９９９ ） 【非特許文献４】バッシレヴァ−アタナッソヴァ（Ｖａｓｓｉｌｅｖａ−Ａｔａｎａｓｓ ｏｖａ）ら、生物工学報（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）６９；６ 20 ３−６７（１９９９） 【非特許文献５】ヤマシタら、タンパク質の発現及び精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）１６；４７−５２（１９９９） 【非特許文献６】バーティ（Ｂｅｒｔｉ）ら、タンパク質の発現及び精製（Ｐｒｏｔｅｉ ｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）１１；１１１−１１８（１ ９９７） 【非特許文献７】コンツ（Ｋｏｎｚ）ら、生物工学の進歩（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ）１４：３９３−４０９（１９９８） 【非特許文献８】ジェオゲーガン（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．２６７：１６９−１８４（１９９９） 30 【非特許文献９】キム（Ｋｉｍ）ら、アクタ・クリスタログラフィカ、第Ｄ部、生物学的 結晶学（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ−Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）５７：７５９−７６２（２００１） 【非特許文献１０】ヤン（Ｙａｎ）ら、生物化学・生物物理学研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ ｎｓ）２６２：７９３−８００（１９９９） 【非特許文献１１】ヤン（Ｙａｎ）ら、生物化学・生物物理学研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ ｎｓ）２５９：２７１−２８２（１９９９） 【非特許文献１２】ラキツィス（Ｒａｋｉｔｚｉｓ）及びパパンドレウ（Ｐａｐａｎｄｒ 40 ｅｏｕ）、化学・生物学的相互作用（Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅ ｒａｃｔｉｏｎｓ）１１３：２０５−２１６（１９９８） 【非特許文献１３】ベイン（Ｂａｙｎｅｓ）及びモニア（Ｍｏｎｎｉｅｒ）、加齢、糖尿 病及び栄養におけるメイラード反応（Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉ ｎ Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、アラン・アール・ リス（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８９） 【非特許文献１４】リンゼイ（Ｌｉｎｄｓａｙ）ら、クリニカ・ケミカ・アクタ（Ｃｌｉ ｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ）２６３：２３９−２４７（１９９７） 【非特許文献１５】ベラネック（Ｂｅｒａｎｅｋ）ら、分子細胞生物化学（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２１８：３５−３９（２０ 50 (8) JP 2006-520609 A 2006.9.14 ０１） 【非特許文献１６】ミクレ（Ｍｉｃｌｅｔ）ら、生物化学報（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ）２７６：３４８４０−３４８４６（２００１） 【非特許文献１７】コラード（Ｃｏｌｌａｒｄ）ら、エフイービーエス・レターズ（ＦＥ ＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）４５９：２２３−２２６（１９９９） 【非特許文献１８】ヘイガー（Ｈａｇｅｒ）ら、細菌学報（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１８２：３９３４−３９４１（２０００） 【非特許文献１９】クポール（Ｋｕｐｏｒ）及びフレンケル（Ｆｒａｅｎｋｅｌ）、細菌 学報（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１００：１２９６−１３０１ （１９６９） 10 【非特許文献２０】クポール（Ｋｕｐｏｒ）及びフレンケル（Ｆｒａｅｎｋｅｌ）、生物 化学報（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２４７： １９０４−１９１０（１９７２） 【非特許文献２１】コードウェル・エス・ジェー（Ｃｏｒｄｗｅｌｌ Ｓ．Ｊ．）、Ａｒ ｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．１７２：２６９−２７９（１９９９） 【非特許文献２２】スタディア・エフ・ダブリュー（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．）、及び モファット・ビー・エー（Ｍｏｆｆａｔｔ、Ｂ．Ａ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８ ６年５月５日；１８９（１）：１１３−１３０ 【非特許文献２３】スチュアート・シューマン（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｓｈｕｍａｎ）、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９；８９；３４８９−３４９３ 20 【発明の開示】 【発明が解決しようとする課題】 【００１２】 発酵中のホスホグルコノイル化の発生率が低減した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）といった ような微生物内でポリペプチドを発現又は過剰発現するための方法が、大いに必要とされ ている。さらに、ファージを全く含まないＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞の構築も、大腸菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ）形式での治療用組換え型タンパク質の製造のためにきわめて望ましいと 思われる。 【課題を解決するための手段】 【００１３】 30 本発明は、豊富な培地内で微生物を成長させることによって発現されるポリペプチドの グルコノイル化を防止するための方法を提供する。 【００１４】 本発明は同様に、ｐｇｌ活性を示すポリペプチドを微生物内にコードするＤＮＡを導入 （例えば形質転換、感染又は形質移入）するステップを含む、微生物により発現されたポ リペプチドのグルコノイル化を防止する方法をも提供している。このポリペプチドは、ホ スホグルコノラクトナーゼ酵素であり得る。本発明のもう１つの態様においては、ホスホ グルコノラクトナーゼ酵素は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含む（ただしこれ に制限さえるわけではない）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）により産生され たホスホグルコノラクトナーゼ酵素に対し少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸 40 配列を有していてよい。 【００１５】 本発明は同様に、タンパク質のグルコノイル化を防止する能力をもつ微生物をも提供し ている。１つの実施形態においては、微生物は、ｐｇｌ活性を示すポリペプチドをコード するＤＮＡを含み得る。 【００１６】 本発明は同様に、配列番号７に記載のポリヌクレオチドに対し少なくとも９０％の同一 性をもつ単離されたポリヌクレオチドをも提供する。 【００１７】 本発明は同様に、検出可能な感染性ラムダファージ発現を含まない微生物をも提供する 50 (9) JP 2006-520609 A 2006.9.14 。 【００１８】 用語集 「宿主細胞」というのは、単離されたポリヌクレオチド配列により導入された（例えば 形質転換、感染又は形質移入された）又はそれによる導入（形質転換、感染又は形質移入 ）能力をもつ細菌細胞又は微生物細胞を含めた（ただしこれらに制限されるわけではない ）細胞である。 【００１９】 当該技術分野において既知の通りの「形質転換された」というのは、外部ＤＮＡ又はＲ ＮＡの導入を介した又は外部ＤＮＡ又はＲＮＡのその他の任意の安定した導入に対する１ 10 つの生体のゲノム又はエピゾームの特異的修飾のことである。 【００２０】 当該技術分野において既知の通りの「形質移入された」というのは、組換えＤＮＡ又は ＲＮＡを含む（ただしこれらに制限されない）微生物内への外部ＤＮＡ又はＲＮＡの導入 である。 【００２１】 当該技術分野において既知の通りの「同一性」というのは、配列を比較することによっ て決定されるような、場合に応じて２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌク レオチド配列の間の関係である。当該技術分野においては、「同一性」は又、その配列ス トリング間の整合によって決定される通りの、場合によってポリペプチド又はポリヌクレ 20 オチド配列の間の配列同系性の度合をも意味する。「同一性」は、コンピュータ分子生物 学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、レスク・エ ー・エム（Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８８年；バイ オコンピューティング：情報科学とゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉ ｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、スミス・ディー・ ダブリュー（Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．）編、アカデミープレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ ｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９３年；配列データのコンピュータ解 析、第１部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ 、Ｐａｒｔ１）、グリフィン・エー・エム（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．）及びグリフィン 30 ・エイチ・ジー（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマンプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐ ｒｅｓｓ）、ニュージャージー（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）１９９４年；分子生物学におけ る配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ）、フォン・ハインジ・ジー（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．）アカデミックプレ ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９８７年；及び、配列分析プライマー（Ｓｅｑｕ ｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、グリブスコフ・エム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ 、Ｍ．）及びドベルー・ジェー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．）編、エム・ストックマンプレ ス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９９１ 年；及び、カリロ・エイチＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ．）及びリップマン・ディー（Ｌｉｐｍａ ｎ、Ｄ．）、エスアイエーエム応用数学報（ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ． 40 ）４８：１０７３（１９８８年）内に記述されているものを含む（ただしこれに制限され るわけではない）既知の方法によって、容易に計算可能である。同一性を決定する方法は 、テスト対象の配列の間に最大の整合を与えるように設計されている。その上、同一性を 決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラム内で体系化されている。 ２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログ ラムパッケージ（ドベルー・ジェー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１２（１）：３８７（１９８４年））、ＢＬＡ ＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（アルトシュル・エス・エフ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ 、Ｓ．Ｆ．）ら、分子生物学報（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）２１５：４０３−４１０ （１９９０年））が含まれるが、これらに制限されるわけではない。ＢＬＡＳＴＸプログ 50 (10) JP 2006-520609 A 2006.9.14 ラムは、ＮＣＢＩ及びその他の供給源から公的に入手可能である（ブラスト・マニュアル （ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ）、アルトシュル・エス（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．）ら、Ｎ ＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４；アルトシュル・エス（Ａ ｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．）ら、分子生物学報（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２１５：４０３− ４１０（１９９０年））。周知のスミス・ウォータマン（Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ ）アルゴリズムも同一性を決定するために使用可能である。 【００２２】 ポリペプチド配列比較のためのパラメータには、以下のものが含まれる。 アルゴリズム：ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）及びブンシェ（Ｗｕｎｓｃｈ）、 分子生物学報（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）、４８：４４３−４５３（１９７０年）。 10 比較マトリクス：ヘンティコフ（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２及び ヘンティコフ（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ 、８９：１０９１５−１０９１９（１９９２年）。 ギャップ・ペナルティ；１２ ギャップ長ペナルティ；４ これらのパラメータで有用なプログラムはジュネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、ウイスコンシン州マジソン（Ｍａｄ ｉｓｏｎ、ＷＩ）から「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。上述のパラ メータは、（エンドギャップについてのペナルティ無しと併せて）ペプチド比較のための デフォルトのパラメータである。 20 【００２３】 ポリヌクレオチド比較用のパラメータは、以下のものを含む。 アルゴリズム：ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）及びブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、 分子生物学報（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）４８：４４３−４５３（１９７０年） 比較マトリクス：整合＝＋１０、不整合＝０ ギャップ・ペナルティ；５０ ギャップ長ペナルティ；３ ジュネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒ ｏｕｐ）、ウイスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのギャッププログラ ムとして入手可能。 30 これらは、核酸比較用デフォルトのパラメータである。 【００２４】 場合によって、ポリヌクレオチド及びポリペプチドについての「同一性」の好ましい意 味は、以下の（１）及び（２）で提供されている。 【００２５】 （１）ポリヌクレオチド実施形態はさらに、配列番号７の基準配列に対し少なくとも７ ０、８０、８５、９０、９５、９７又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列 を含む単離されたポリヌクレオチドを含んでおり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配 列番号７の基準配列と同一であってもよいし又は基準配列に比べて或る整数の数までのヌ クレオチド改変を内含していてよく、前記改変は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、 転位及び塩基転換を含む置換、又は挿入から成るグループの中から選択され、前記改変は 基準ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位で、又はこれらの末端位置間のいずれかの場 所で、基準配列内のヌクレオチドの間で個別か又は基準配列内で１つ以上の隣接基の中の いずれかで点在した形で発生していてよく、又ヌクレオチド改変の前記数は、同一性百分 率を定義する整数を１００で除したもので配列番号７のヌクレオチドの合計数を乗じるこ とそして次に配列番号７内の前記合計ヌクレオチド数からその積を減算することによって 決定され、或いは又、 40 (11) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【数１】 であり、式中、ｎｎ はヌクレオチド改変数であり、ｘｎ は配列番号７中の合計ヌクレオチ ド数であり、ｙは９５％については０．９５、９７％については０．９７、又１００％に ついては１．００であり、・は乗算演算子の符号であり、又ここでｘｎ 及びｙの非整数積 は全て、それをｘｎ から減算する前に、最も近い整数に端数は切捨てられる。１つのポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、このコーディング配列内でノンセ ンス、ミスセンス又はフレームシフト突然変異を作り出し、かくしてかかる改変の後にポ 10 リヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを改変することができる。 【００２６】 （２）ポリペプチド実施形態はさらに、ポリペプチド基準配列に対する少なくとも７０ 、８０、８５、９０、９５、９７又は１００％の同一性を有するポリペプチドを含む単離 ポリペプチドを含んでおり、ここで前記ポリペプチド配列は基準配列と同一であってもよ いし又は基準配列に比べて或る整数の数までのアミノ酸改変を内含していてよく、前記改 変は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、同類置換及び非同類置換を含む置換、又は挿入か ら成るグループの中から選択され、前記改変は基準ポリペプチド配列のアミノ−又はカル ボキシ−末端位で、又はこれらの末端位置間のいずれかの場所で、基準配列内のアミノ酸 の間で個別にか又は基準配列内で１つ以上Ｎ隣接基の中のいずれかで点在した形で発生し 20 ていてよく、又アミノ酸改変の前記数は、同一性百分率を定義する整数を１００で除した ものでアミノ酸の合計数を乗じることそして次に前記合計アミノ酸数からその積を減算す ることによって決定され、或いは又、 【数２】 であり、式中、ｎａ はアミノ酸改変数であり、Ｘａ は配列中の合計アミノ酸数であり、ｙ は９５％については、０．９５、９７％については０．９７、又１００％については１． ００であり、・は乗算演算子の符号であり、又ここでｘａ 及びｙの非整数積は全て、それ をｘａ から減算する前に、最も近い整数に端数は切り捨てられる。 30 【００２７】 「単離された」というのは、その天然の状態から「人間の手により」改変されているこ とすなわち、それが自然の中で発生した場合、そのもとの環境から変更又は除去されてい るか又はその両方であることを意味する。例えば生体内に天然に存在するポリヌクレオチ ド又はポリペプチドは「単離されない」が、そのポリヌクレオチド又はポリペプチドが１ つの細胞内に導入し戻される場合を含めて（ただしこれに制限されるわけではない）、そ の天然の状態の共存する材料から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単 離される。 【００２８】 「ポリヌクレオチド」は一般に、未修飾のＲＮＡ又はＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ又は 40 ＤＮＡであり得るあらゆるポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意 味する。「ポリヌクレオチド」は、制限的意味なく、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及 び２本鎖領域又は１本鎖、２本鎖及び３本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖及び２本 鎖ＲＮＡ及び１本鎖及び２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖そしてより標準的には ２本鎖又は３本鎖領域又は１本鎖及び２本鎖領域の混合物でありうるＤＮＡ及びＲＮＡを 含むハイブリッド分子を含む。さらに、本書で使用されている通りの「ポリヌクレオチド 」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む３本鎖領域を意味する。かかる 領域内のストランドは、同じ分子由来でも異なる分子由来でもよい。領域は、分子のうち の１つ以上のものの全てを内含し得るが、より標準的には分子の一部分の領域のみが関与 する。３重らせん領域の分子の１つは、往々にしてオリゴヌクレオチドである。本書で使 50 (12) JP 2006-520609 A 2006.9.14 用されている通り、「ポリヌクレオチド」という語は、同様に１つ以上の修飾された塩基 を含む上述の通りのＤＮＡ又はＲＮＡをも内含する。かくして、安定性又はその他の理由 で修飾された主鎖をもつＤＮＡ又はＲＮＡは、その語が本書で意図されている通りの「ポ リヌクレオチド」である。その上、単に２つの例のみ挙げるだけでもイノシンといったよ うな普通ではない塩基又はトリチル化塩基といった修飾された塩基を含んでいるＤＮＡ又 はＲＮＡは、その語が本書で使用される通りのポリヌクレオチドである。当業者にとって 既知である数多くの有用な目的に役立つきわめて多様な修飾がＤＮＡ及びＲＮＡに対して 行なわれてきたということがわかるだろう。本書で利用されている通りの「ポリヌクレオ チド」という語は、化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形のポリヌクレオチドならび に例えば単細胞及び複合細胞といったものを含むウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡ及び 10 ＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は同様に、オリゴヌクレオチド」 と往々にして呼ばれる短かいポリヌクレオチドをも包含している。 【００２９】 「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合により互いに接合され た２つ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチド又はタンパク質をも意味する。「ポリペプ チド」は、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと一般に呼ばれる短鎖及びタンパク 質と一般に呼ばれる長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは遺伝子コードされた２０個の アミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」は、プロセシング及びその他の翻 訳後修飾といったような天然のプロセスによってのみならず化学的修飾技術によって修飾 されたものを内含する。かかる修飾は、基本的テキストの中及びより詳細なモノグラフ中 20 、ならびに大量の研究文献の中で充分に記述されており、当業者にとっては周知である。 同じタイプの修飾は、一定の与えられたポリペプチド内の複数の部位で同じ又は変動する レベルで存在しうるということがわかるだろう。同様に、一定の与えられたポリペプチド は、数多くのタイプの修飾を含み得る。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ 又はカルボキシ末端を含めたポリペプチド内のどこにでも発生し得る。修飾には、例えば 、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビン共有結合付着、ヘム 部分の共有結合付着、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付着、脂質又は脂 質誘導体の共有結合付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合付着、架橋、環化、ジス ルフィド結合形成、ジメチル化、共有結合架橋形成、システイン形成、ピログルタミン酸 塩の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化 30 、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化 反応、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガ ンマ−カルボキシル化、水酸化及びＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギ ニル化といったようにタンパク質に対するアミノ酸のトランスファＲＮＡが媒介する付加 及びユビキチン化が含まれる。例えば、タンパク質−構造と分子特性（ＰＲＯＴＥＩＮＳ −ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ）、第２版 、ティー・イー・クライトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、ダブリュー・エイチ・フ リーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）及び共同研究者、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）（１９９３年）及びウォルド・エフ（Ｗｏｌｄ、Ｆ．）、翻訳後タンパク質修飾：展望 と予想（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ 40 ｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）、タンパク質の翻訳 後共有修飾（ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣ ＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）中１−１２頁、ビー・シー・ジョンソン（Ｂ．Ｃ ．Ｊｏｈｎｓｏｎ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニュー ヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８３年）；セイフター（Ｓｅｉｆｔｅｒ）ら、酵素学 的方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１８２：６２６−６４６（１９９０年）及びラッ テン（Ｒａｔｔａｎ）ら、タンパク質合成：翻訳後修飾と加齢（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎ ｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａ ｎｄ Ａｇｉｎｇ）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９ ２）を参照のこと。ポリペプチドは、分枝であっても、又は分枝を伴う又は伴わない環状 50 (13) JP 2006-520609 A 2006.9.14 であってもよい。環状、分枝及び分枝環状円形ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの 結果であり得、完全な合成方法によっても作製可能である。 【００３０】 「組換え型発現系」は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生のために宿 主細胞又は宿主細胞溶解物へと導入又は形質転換された本発明の発現系又はその一部分又 はポリヌクレオチドを意味する。 【００３１】 本書でその語が用いられている通りの「変異体」という語は、それぞれ基準ポリヌクレ オチド又はポリペプチドとは異なるものの不可欠な特性は保持しているポリヌクレオチド 又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの標準的変異体は、ヌクレオチド配列におい 10 てもう１つの基準ポリヌクレオチドと異なっている。変異体のヌクレオチド配列の変化は 、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変する場 合としない場合がある。ヌクレオチド変化の結果として、以下で論述するように、基準配 列によってコードされたポリペプチド内のアミノ酸置換、付加、欠失、融合タンパク質及 び切形がもたらされる可能性がある。ポリペプチドの標準的変異体は、アミノ酸配列にお いてもう一方の基準ポリペプチドと異なっている。一般に、差異は、基準ポリペプチド及 び変異体の配列が全体的に密に類似し、数多くの領域で同一であるように制限されている 。変異体及び基準ポリペプチドは、任意の組合せでの１つ以上の置換、付加、欠失によっ てアミノ酸配列が異なっていてよい。置換された又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子 コードによってコード化されたものであってもなくてもよい。本発明は同様に、本発明の 20 ポリペプチドの変異体、すなわち同類アミノ酸置換によって対象から変動しかくして１つ の残基が同様の特性をもつもう１つの残基によって置換されているポリペプチドをも内含 している。標準的なこのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間；Ｓｅｒ 及びＴｈｒの間；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの間；Ａｓｎ及びＧｌｎの間；及び塩基性残 基Ｌｙｓ及びＡｒｇの間；又は芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒの間のものである。特に好ま しいのは、複数の５∼１０、１∼５、１∼３、１∼２又は１個のアミノ酸が任意の組合せ で置換、欠失又は付加される変異体である。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体 は、対立遺伝子変異体といったような天然に発生するものであってもよいし、又は天然に 発生するものとして知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペ プチドの天然に発生しない変異体は、突然変異誘発技術、直接的合成によって及び当業者 30 にとって既知のその他の組換え型方法によって作ることができる。 【００３２】 「微生物」というのは、（ｉ）ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、 スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌ ｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィラス（ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アクチノマイセート（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、スト レプトマイセート（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ） 、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、 ファンシセラ（Ｆａｎｃｉｓｅｌｌａ）、パスチュレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）、モラ 40 キセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エ リジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍ ｅｌｌａ）、アクチノバシルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトバシルス （Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カリマトバク テリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、 バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、トレポ ネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉ ｂｒｉｏ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ボレリ ア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、スピリルム（Ｓｐｉ 50 (14) JP 2006-520609 A 2006.9.14 ｒｉｌｌｕｍ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇ ｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ） 、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）及びマイコプラズ マ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の成員を含み（ただしこれらに制限されるわけではない） 、かつさらにＡ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｂ群ストレプト コッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｃ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ）、Ｄ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｇ群ストレプ トコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔ ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオジーン（ 10 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・フェカ リス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェシ ウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・デュラン ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、ネイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓ ｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、ネイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒ ｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈ ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、コリネバクテリウム・ディプテリエ（ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、ガルドネレラ・バギナリス 20 （Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、マイコバクテリウム・チュベルキュ ローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリ ウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ウル セランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・レ プレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、アクチノミクテス・イスラエリイ （Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｔｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、リステリア・モノシトジーン（Ｌｉ ｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ボルデテラ・ペルチュシス（Ｂｏｒｄｅ ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルダテラ・パラペルチュシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌ ａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプテイカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌ ｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） 30 、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ヘモフィラス・インフル エンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・エジプティ ウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）、ヘモフィラス・パラインフルエ ンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・デュ クレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ ａ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、シトロバクター・ フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、プロテウス・ミラビリ ス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、 クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、セラ 40 ティア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｓｅｎｓ）、セラティア・リケ ファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖ ｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、シゲラ・ディセンテリイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅ ｎｔｅｒｉｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、緑膿菌 （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フランシセラ・チュラレンシス（ Ｆｒａｎｓｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・アボルティス（Ｂｒｕ ｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｉｓ）、バシルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈ ｒａｃｉｓ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジ ウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロス トリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ボ 50 (15) JP 2006-520609 A 2006.9.14 ツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、トレポネーマ・パリダム（ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、リケッチャ・リケットシイ（Ｒｉｃｋｅｔｔ ｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）及びクラミジア・トラコミティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）といった種又は群の成員を含む（ただしこれらに制限される わけではない）原核生物、（ｉｉ）アルケバクター（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒ）を含む （ただしこれらに制限されるわけではない）古細菌及び（ｉｉｉ）原生動物、真菌、サッ カロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルベロマイセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙ ｃｅｓ）又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の成員及びサッカロマイセス・セリビシエ（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓｅａｅ）、クルベロマイセス・ラクチス（ Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、又はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉ 10 ｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）種の成員を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）単 細胞又は糸状真核動物を意味する。 【００３３】 「細菌（の）」というのは、（ｉ）ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔ ｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィラ ス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アクチノマイセート（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、 ストレプトマイセート（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉ ａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ 20 ）、ファンシセラ（Ｆａｎｃｉｓｅｌｌａ）、パスチュレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）、 モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ） 、エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈ ａｍｅｌｌａ）、アクチノバシルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトバシ ルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カリマト バクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ト レポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモ ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ）、ビブリオ（ Ｖｉｂｒｉｏ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ボ 30 レリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、スピリルム（Ｓ ｐｉｒｉｌｌｕｍ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢菌（Ｓｈ ｉｇｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、リケッチャ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）及びマイコプラ ズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の成員を含み（ただしこれらに制限されるわけではない ）かつさらにＡ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｂ群ストレプト コッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｃ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ）、Ｄ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｇ群ストレプ トコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔ 40 ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・フェカ リス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェシ ウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・デュラン ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、ネイセリア・ゴノレ（Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、ネイセリア・メニンギティデイス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ ａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、コリネバクテリウム・ディプテリエ（Ｃ 50 (16) JP 2006-520609 A 2006.9.14 ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、ガルドネレラ・バギナリス（ Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、マイコバクテリウム・テュベルキュロ ーシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウ ム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセ ランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・レプ レ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、アクチノマイセス・イスラエリイ（ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｔｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、リステリア・モノサイトジン（Ｌｉｓ ｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ボルデテラ・ペルチュシス（Ｂｏｒｄｅｔ ｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルダテラ・パラペルチュシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ 10 ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、志 賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ヘモフィラズ・インフルエン ゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・エジプティウス （Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）、ヘモフィラス・パラインフルエンゼ （Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・デュクレ イイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、シトロバクテル・フ レウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、プロテウス・ミラビリス （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、ク 20 レブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、セラチ ア・マクレセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｓｅｎｓ）、セラチア・リケファシ エンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒ ｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、シゲラ・ディセンテリイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅ ｒｉｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、緑膿菌（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フランシセラ・チュラレンシス（Ｆｒａ ｎｓｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・アボルティス（Ｂｒｕｃｅｌ ｌａ ａｂｏｒｔｉｓ）、バシルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃ ｉｓ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・ ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジ 30 ウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ボツリヌ ム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、トレポネーマ・パリジウム（Ｔｒ ｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、リケッチャ・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）及びクラミジア・トラコミティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒ ａｃｈｏｍｉｔｉｓ）といった種又は群の成員を含む（ただしこれらに制限されるわけで はない）原核生物、及びアルケバクター（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒ）を含む（ただしこ れらに制限されるわけではない）古細菌を意味する。 【００３４】 本書で用いられる「異種ポリペプチド」という語は、問題の形質転換された宿主細胞又 は微生物によって天然に合成されておらず組換えＤＮＡにより宿主細胞又は微生物内に導 40 入されたポリペプチドを意味する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、形質転換されて いない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発生しないインターロイキンの発現のための宿主微生 物として作用し得る。異種ポリペプチドは、単離を容易にするために修飾されたポリペプ チドを含み得る。 【００３５】 本書で用いられる「親和性タグ」というのは、前記分子に対しもう１つの物質又は分子 に対する選択的親和性を与え得る分子と会合されたあらゆる部分を意味する。例えば、カ ラムのパッキング材料に対する選択的親和性をもつ分子を提供することにより分子の精製 を容易にするために親和性タグを使用することができる。親和性タグの制限的意味のない 例がｈｉｓタグである。 50 (17) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【００３６】 本書で用いられる「Ｈｉｓタグ」は、ヒスチジンアミノ酸の反復を意味し、工学処理技 術を通してポリペプチド内にコードされたその他のアミノ酸を含み得る。標準的にはＨｉ ｓタグは、少なくとも６つ（「ヘキサ」）のヒスチジン反復を含み、ポリペプチドのＮ末 端近くに位置設定される。Ｈｉｓタグは、Ｎｉ−カラム全体にわたる異種ポリペプチドの 精製を容易にするために使用可能である。 【００３７】 本書で用いられる「最小培地」というのは、リン酸緩衝液といった緩衝液、硫酸マグネ シウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム又は硫酸マンガンといった塩、鉄、亜鉛、銅、 コバルト又はモリブデンといった鉱物、グルコース又はグリセロールといった炭素供給源 10 及び硫酸又は硝酸アンモニウムといった窒素供給源を含む（ただしこれらに制限されるわ けではない）化学的に定義された成分を含む細胞成長培地を意味する。一例としてはＭ９ 培地（キム・ワイエス（Ｋｉｍ ＹＳ）、ジェーエイチ・セオ（ＪＨ Ｓｅｏ）及びエイ チワイ・チャ（ＨＹ Ｃｈａ）、酵素及び微生物工学（Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒ ｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３３（２００３年）；４６０−４６５））がある。 【００３８】 本書で用いられる「豊富な培地」というのは、未定義の成分を含み、緩衝液（例えばリ ン酸緩衝液）、塩（例えば硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム又は硫酸 マンガン）及び例えばグルコース又はグリセロールでありうる炭素供給源などの追加の成 分を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）細胞成長培地を意味する。窒素供給 20 源は、酵母エキスといったようなタンパク質加水分解物、食肉加水分解物又は大豆加水分 解物で構成され得る。窒素供給源は、１：１以上という複合窒素供給源（１リットルあた りのグラム単位）対最大細胞密度（ＯＤ単位）の比で細胞成長を支持する能力をもつ濃度 で提供され得る。豊富な培地の例としては、スーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）（ アトラス・アール・エム（Ａｔｌａｓ ＲＭ）、微生物学培地便覧（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｓｄｉａ）；パークス・エル・ディー（Ｐ ａｒｋｓ ＬＣ）編；シーアールシー・プレス：フロリダ州ボカラートン（ＣＲＣ Ｐｒ ｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ）、２８１、５２３、５２９、８５９の各頁）、テ リフィックブロス（Ｔｅｒｉｆｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）（アルファバイオサイエンシーズ、 米国メリーランド州ボルチモア（Ａｌｐｈａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒ 30 ｅ、ＭＤ ＵＳＡ））、ターボブロス（Ｔｕｒｂｏ Ｂｒｏｔｈ）（アテナエンザイムシ ステムズ、米国メリーランド州ボルチモア（Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ ＵＳＡ））又はハイパーブロス（Ｈｙｐｅｒ Ｂｒｏｔ ｈ）（アテナエンザイムシステムズ、米国メリーランド州ボルチモア（Ａｔｈｅｎａ Ｅ ｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ ＵＳＡ））が含まれる（ただ しこれらに制限されるわけではない）。 【００３９】 本書で用いられる「グルコノイル化」というのは、１つのタンパク質に対するグルコン 酸誘導体の付着を意味する。グルコノイル化は、６−ホスホグルコノラクトン（６−ＰＧ Ｌ）付加体の形成、アセチル化、ホルミル化、脱ホルミル化、グルコノラクトン化又はグ 40 ルコン酸誘導体化を含みうる（ただしこれらに制限されるわけではない）。 【００４０】 本書で用いられる「力価収量」というのは、溶液（例えば培養ブロス又は細胞溶解混合 物又は緩衝液）中の産物（例えば異種発現されたポリペプチド）の濃度を意味し、通常ｍ ｇ／Ｌ又はｇ／Ｌとして表現される。力価収量の増加は、２組の定義済みの条件の下で産 生された産物の濃度の絶対的又は相対的増加を意味し得る。 【００４１】 本書で用いられる「ｐｇｌ活性」という語は、６−ホスホグルコノラクトン（「ｐｇｌ 」）のあらゆる活性を意味する。かかる活性は、６−ＰＧＬから６−ホスホグルコン酸へ の加水分解を含み得る。有意なｐｇｌ活性は、少なくとも０．２ＩＵ／分／ｇの加水分解 50 (18) JP 2006-520609 A 2006.9.14 活性として定義することができる。 【００４２】 本書で用いられる「ストリンジェント条件」及び「ストリンジェントハイブリダイゼー ション条件」という語は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、ただし特に 好ましくは少なくとも９５％の同一性が配列間に存在する場合にのみハイブリダイゼーシ ョンが発生することになることを意味する。ストリンジェントハイブリダイゼーション条 件の一例は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのク エン酸３ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶 液、１０％の硫酸デキストラン及び２０マイクログラム／ｍｌの変性された剪断サケ精子 ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベートし、その後約６５℃で０．１×ＳＳＣ 10 中でフィルタを洗浄するというものである。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知 であり、その開示全体が参考として本書に内含されているサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版、コールドスプリングハーバー、ニュ ーヨーク（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（１９８９年）、特にそ の中の第１１章の中に例示されている。 【発明を実施するための最良の形態】 【００４３】 なかでも最小培地上での成長、高い細胞密度及び高レベルの異種ポリペプチド発現から 生じる細胞ストレスは、異種ポリペプチドのグルコノイル化に貢献するかもしれない。従 20 ってこれらのストレッサーのうちの１つ以上のものを軽減することが、微生物内で発現さ れるタンパク質のグルコノイル化のレベルに影響を及ぼすかもしれず、今度はそれが所望 のポリペプチドの純度及び力価収量に影響する可能性がある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の 一部の菌株は、その他のものに比べてｐｇｌ活性レベルが高い可能性があるが、この活性 の原因である遺伝子はコードウェル・エス・ジェー（Ｃｏｒｄｗｅｌｌ Ｓ．Ｊ．）１９ ９９年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７２；２６９−２７９の、大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）中で同定されていなかった。その上、ポリペプチドのグルコノイル化は、これらの ポリペプチドの構造的判定及び結晶化に影響を及ぼし得る。 【００４４】 本発明は、豊富な培地内で微生物を成長させるステップを含む、微生物中で発現された 30 ポリペプチドのグルコノイル化を防止するための方法を提供している。本発明のもう１つ の態様においては、微生物は、最小培地内で成長させられた場合には有意な６−ホスホグ ルコノラクトナーゼ活性を示さない。微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株であってよ い。本発明のもう１つの態様においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、Ｂ菌株である。本 発明のもう１つの態様においては、豊富な培地は、複合窒素供給源を含む。豊富な培地は 、細胞密度に対する複合窒素供給源の濃度について１：１という比率に細胞成長を維持す る能力を有する。複合窒素供給源は、トリプトン、ペプトン又は酵母エキスであり得る。 本発明のもう１つの態様においては、培地はスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）で ある。スーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）培地は２倍に濃縮されていてよい。本発 明のもう１つの態様においては、微生物は、異種ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ 40 分子を形質移入する。 【００４５】 本発明のもう１つの実施形態においては、ポリペプチドの発現のため大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）のＫ菌株変種を発酵するステップを含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された ポリペプチドのグルコノイル化を防止する方法が提供されている。本発明のもう１つの態 様においては、Ｋ菌株は、実質的に同じ条件下で成長させられたＢ菌株と比較した場合に 少なくとも約１００倍高いホスホグルコノラクトナーゼ活性を示す。本発明のもう１つの 態様においては、Ｋ菌株はＫ−１２である。 【００４６】 本発明のもう１つの実施形態においては、微生物中にＤＮＡを導入するステップを含む 50 (19) JP 2006-520609 A 2006.9.14 、微生物内で発現されたポリペプチドのグルコノイル化を防止するための方法において、 前記ＤＮＡが、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すポリペプチドをコードする、 方法が提供されている。本発明のもう１つの態様においては、微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）である。ＤＮＡは、６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡを含 む。本発明のもう１つの態様においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコード するＤＮＡは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であり得るシュードモナス（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡに対する 少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性 を有する。本発明のもう１つの態様においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素を コードするＤＮＡは、配列番号７に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９ 10 ５％、９７％又は１００％の配列同一性を有する。本発明のもう１つの態様においては、 ６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素は、配列番号８に対し少なくとも７０％、８０％、 ８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有する 。６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡは、配列番号７に記載の配列 を含む。ＤＮＡは、組換えＤＮＡであってよく、かつ／又は微生物のゲノムＤＮＡに形質 転換され得る。 【００４７】 本発明のもう１つの実施形態においては、ポリペプチドのグルコノイル化を防止する能 力を有する微生物が提供されている。微生物は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を 示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。微生物は、６−ホスホグルコノラクトナー 20 ゼをコードするＤＮＡを含む。本発明のもう１つの態様においては、６−ホスホグルコノ ラクトナーゼをコードするＤＮＡはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来の６ −ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡと少なくとも７０％、８０％、８ ５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性を有しており、ここで該微生物 は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ではない。本発明のもう１つの態様にお いては、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕ ｇｉｎｏｓａ）に由来する。本発明のもう１つの態様においては、微生物は、大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）の一菌株である。本発明のもう１つの態様においては、微生物は、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）の一菌株であり、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡは 、該微生物のゲノム内に取込まれている。 30 【００４８】 本発明のもう１つの実施形態においては、配列番号７中に記載されているポリヌクレオ チドに対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の 同一性を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドが提供されている 。本発明のもう１つの態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号８に対 し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一 性をもつアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し少なくとも７ ０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性を有するポリ ヌクレオチドを含む。本発明のもう１つの態様においては、ＤＮＡは、６−ホスホグルコ ノラクトナーゼ活性を示すタンパク質をコードする。本発明のもう１つの態様においては 40 、ＤＮＡ配列は配列番号７に記載されている。本発明のもう１つの態様においては、ＤＮ Ａ配列は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼ をコードするＤＮＡに対し相同である、本発明のもう１つの態様においては、単離された ポリヌクレオチドは、ヒト−インターロイキン１８又はその変異体をコードするポリヌク レオチドをさらに含む。 【００４９】 本発明のもう１つの実施形態においては、ポリペプチドのグルコノイル化を削減するた め本発明の方法によりポリペプチドを発現するステップを含む、ポリペプチド結晶形成を 改善する方法が提供されている。 【００５０】 50 (20) JP 2006-520609 A 2006.9.14 本発明のもう１つの実施形態においては、微生物内のポリペプチドの成長効率及び発現 を改善する方法が提供されている。１つの態様では、ポリペプチドは、グルコノイル化さ れたポリペプチドと比べて増大した発酵段での力価収量を示す。 【００５１】 本発明のもう１つの実施形態においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（「ｐｇｌ 」）活性をもつ酵素と共に微生物内のヒトインターロイキンを同時発現させるステップを 含む、ヒトインターロイキンを産生する方法が提供されている。１つの態様では、ヒトイ ンターロイキンは、ＩＬ−１８タンパク質又はその変異体である。１つの態様では、微生 物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。１つの態様では、ｐｇｌは、制限的な意味なく、ゲ ノム又はエピゾームへと形質転換することを含め大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へと形質転換又 10 は形質移入されるポリヌクレオチドによりコードされている。 【００５２】 本発明のもう１つの実施形態においては、豊富な培地の中で成長させられる微生物内で ヒトインターロイキンを発現するステップを含むヒトインターロイキン産生方法が提供さ れている。１つの態様では、ヒトインターロイキンはＩＬ−１８タンパク質又はその変異 体である。１つの態様では、微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。１つの態様では、 豊富な培地がフィトンペプトンを含む。１つの態様では、豊富な培地はバクト酵母エキス を含む。 【００５３】 本発明のもう１つの実施形態においては、検出可能な感染性ラムダファージ発現を全く 20 含まない微生物が提供されている。１つの態様では、ラムダファージカプシド構造タンパ ク質ｇｐＥは微生物内で欠失又は分断されている。タンパク質の欠失又は分断は、複数の 制限的ではない要領で達成可能である。タンパク質をコードする遺伝子を、微生物から部 分的又は完全に除去することができる。タンパク質をコードする遺伝子を、点突然変異又 はランダム突然変異といった制限的意味のない技術により遺伝子的に修飾することが可能 である。その構造又は機能を分断するべくタンパク質を化学的又は酵素的に分割又は修飾 することもできる。遺伝子発現を調節するプロモータを分断又は欠失させて、遺伝子発現 を削除又は低減させることもできる。タンパク質の構造又は機能を達成するために、溶液 の条件又は温度を調節することが可能である。１つの態様では、微生物は大腸菌（Ｅ．ｃ ｏｌｉ）である。もう１つの態様では、微生物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む 30 。 【００５４】 以下の例は、本発明のさまざまな態様を例示している。これらの例は、添付の請求の範 囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない。 【実施例】 【００５５】 実施例１ 主要ラムダファージカプシド構造タンパク質ｇｐＥをノックアウトすることにより検出 可能な感染性ラムダファージ発現を含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３） 菌株の改良型菌株を作り出した。この菌株を、本書で提示されている実施例の中で使用し 40 た。 【００５６】 ｇｐＥコーディング領域の４１３塩基対内部フラグメントを、 5' AGCTGGCCATTGCTCAGGTCGAAG 3' （ 配 列 番 号 １ ） 5' GTACTGTCCGGAATACACGACGATG 3' （ 配 列 番 号 ２ ） というプライマ対及び鋳型としてのＢＬ２１（ＤＥ３）染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ増 幅した。結果として得られたフラグメントは以下の通りである。 AGCTGGCCAT TGCTCAGGTC GAAGAGATGC AGGCAGTTTC TGCCGTGCTT AAGGGCAAAT ACACCATGAC CGGTGAAGCC TTCGATCCGG TTGAGGTGGA TATGGGCCGC AGTGAGGAGA ATAACATCAC GCAGTCCGGC GGCACGGAGT GGAGCAAGCG TGACAAGTCC ACGTATGACC 50 (21) JP 2006-520609 A 2006.9.14 CGACCGACGA TATCGAAGCC TACGCGCTGA ACGCCAGCGG TGTGGTGAAT ATCATCGTGT TCGATCCGAA AGGCTGGGCG CTGTTCCGTT CCTTCAAAGC CGTCAAGGAG AAGCTGGATA CCCGTCGTGG CTCTAATTCC GAGCTGGAGA CAGCGGTGAA AGACCTGGGC AAAGCGGTGT CCTATAAGGG GATGTATGGC GATGTGGCCA TCGTCGTGTA TTCCGGACAG TAC （配列番号３） 【００５７】 ＰＣＲ増幅産物をＴＡクローニングし、配列を標準的な技術を用いて確認した。次に、 クローニングされたｇｐＥ配列内に太字で示されている中央にあるＥｃｏＲＶ部位の中に 、クロラムフェニコール耐性遺伝子の機能的コピーを導入した。その後、クロラムフェニ コールで中断したｇｐＥフラグメント構成体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主菌株ＢＬ２ 10 １内に常駐するラムダ（ＤＥ３）ｇｐＥ遺伝子の遺伝的ノックアウトのための線状相同的 組換えノックアウトベクターとして使用した。このノックアウトベクターは、本書に記述 されたベクターが使用されたという点を除いて、キリル・エー・ダッセンコ（Ｋｉｒｉｌ ｌ Ａ．Ｄａｔｓｅｎｋｏ）及びバリー・ワーナー（Ｂａｒｒｙ Ｗａｎｎｅｒ）、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００；９７；６６４０−６６４５によ って記述されている通りに宿主細胞内に導入された。推定上のｇｐＥノックアウトは、６ μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下で成長する能力により予備的に同定され、そ の後ＰＣＲ分析により確認された。ＢＬ２１（ＤＥ３）の１つのかかるｇｐＥノックアウ トは、バンクに寄託され、ＥＣＣ−０２３というＧＳＫ呼称が与えられた。 【００５８】 20 非常に高感度のプラーク検定において感応性ファージ粒子の存在について、ＥＣＣ−０ ２３をテストした。表１に示されているように、親ＢＬ２１（ＤＥ３）は、そのように誘 発されていない場合、約２０ｐｆｕというかろうじて検出可能な量しかファージを発現し なかったが、遺伝子損傷（ＵＶ照射）に対するＳＯＳ応答によって誘発された場合、ほぼ ３ケタ大きい量を発現した。しかしながら、ｇｐＥノックアウト誘導体ＥＣＣ−０２３は 、ＳＯＳ応答を誘発するべく処理された場合でも、感染性ファージの徴候を全く生み出さ なかった。データから、ＢＬ２１（ＤＥ３）誘導体ＥＣＣ−０２３が検出可能な感染性フ ァージ粒子を全く生み出さず、従って生物医薬品製造に適した宿主細胞菌株であることが わかる。 【００５９】 30 【表１】 【００６０】 40 実施例２ この実施例は、豊富な培地中で細胞を培養することにより、最小培地と比較した場合に 、Ｈｉｓタグ付けされたタンパク質の６−ＰＧＬ付加体の形成を妨げることができるとい うことを示している。 【００６１】 Ｈｅｘａ−ｈｉｓ−ＦａｂＺのための遺伝子をコードするプラスミドｐＥＴ２８Ｆａｂ ＺＳａで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１．０のＯＤ６ ０ ０ が達成されるまで３７℃でＭＣＪＫ（最小培地）又はＭＣＪＫＬＢ（豊富な培地）内 で成長させた。ＭＣＪＫ及びＭＣＪＫＪＢのための培地組成は表２に記述されている。 【００６２】 50 (22) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【表２】 10 【００６３】 最終濃度１ｍＭとなるまでイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「Ｉ ＰＴＧ」）を添加し、収獲するまで４時間にわたり３７℃に細胞を維持した。１０分間１ ６，０００×ｇで遠心分離により細胞を収集し、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ 20 のＮａ２ ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍＬのリゾチーム及び２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｂｅ ｎｚｏｎａｓｅ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で穏やかに撹拌することでこれを溶解させ た。１０分間１６，０００×ｇで遠心分離により細胞残屑を除去し、組換え型タンパク質 を、メーカーの推奨事項（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従ってバッチモードでＮｉ−ＮＴＡ樹脂で可溶性 抽出物から精製した。ＬＣ／ＭＳ分析によりグルコノラクトン修飾の存在について異種タ ンパク質を分析した。 【００６４】 表３に示されている通りに最小培地（ＭＣＪＫ）内で培養を実施する場合、合計組換え 型タンパク質の３４％のレベルで、ＭＧＳＳＨ４ Ｈｉｓタグ異種ポリペプチドをグルコノ 30 イル化する。培地を酵母エキス及びトリプトンで補完又は富化させる場合、グルコノイル 化されたタンパク質は、同じく表３に示されているように、検出可能ではない。かくして 、より豊富な培地を使用することで、６−ＰＧＬ付加体の形成を防止することができる。 【００６５】 【表３】 40 【００６６】 実施例３ この実施例は、組換え型ＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔとしても知られている 50 (23) JP 2006-520609 A 2006.9.14 ）の内部リジン残基が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された場合にグルコノイル化さ れた状態になり得るということを実証している。ヒトＧｒｏ−ベータ−ＴのｃＤＮＡ及び アミノ酸配列は、その全体が参考として本書に内含されている国際特許出願公開国際公開 第９２／００３２７号パンフレット（１９９２年１月９日）ならびに米国特許第６，０４ ２，８２１号明細書及び米国特許第第６，４１３，５１０号明細書の中で提供されている 。 【００６７】 定量的高生産性逆相検定を用いて、ＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔ）の産生中 の異種タンパク質の蓄積を日常的に監視した。産物関連変異体の形成を日常的に監視する 手段を提供するべく、高性能エレクトロスプレー飛行時間（「ＥＳＩ−ＴＯＦ」形質量分 10 析計とこの分離をインタフェースした。 【００６８】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主内で発現された場合に、２つのユニー クな産物修飾が観察された。質量スペクトルの解析が、７，５４２Ｄａでの未変性産物に 比べて、＋１７８Ｄａ及び＋２５８Ｄａの質量シフトを示すものとして変異体を特徴づけ した。 【００６９】 これらの発酵に由来する産物を、精製手順に通過させた。微量の産物変異体を解像する 能力をもつ高解像度の逆相検定を用いて仕掛り標本を特徴づけした。液体クロマトグラフ ィ質量分析（「ＬＣＭＳ」）を用いた分析により、新しい産物変異体が＋２５８Ｄａ（保 20 持時間約１４．８分）及び＋１７８Ｄａ（保持時間約１５．２Ｄａ）の質量シフトを示す ことが確認された。 【００７０】 公開されている文献は、これらの＋２５８Ｄａ及び＋１７８Ｄａの質量シフトが、Ｎ末 端残基に対する６−ＰＧＬ又はグルコノラクトンの添加の結果得られたヘキサＨｉｓタグ で発現されたタンパク質の中で以前に観察されていたということを示した。ＣＸＣケモカ イン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔ）はヘキサＨｉｓタグを使用して発現されなかった。さらに、 分子はいかなるヒスチジン富有領域も示していない。種が産物関連のものであることを確 認するため、各々の変異体を単離し、Ｎ−末端配列決定に付した。配列決定は、適正な産 物配列を確認し、ヘキサＨｉｓタグが全く存在しないことを保証した。 30 【００７１】 変異体をトリプシン消化及びペプチド地図作製に付した。製品基準を用いて生成された ペプチド地図との比較は、４５．８分（ｍ／ｚ１０９４）で溶出する第１のピークと４６ ．５分（ｍ／ｚ１１７４）で溶出する第２のピークという２つの新しいピークをトリプシ ン地図内で明らかにした。新しいペプチドを単離し、Ｎ末端配列決定に付し、この配列決 定は両方が同じ配列（ＮＩＱＳＶＫＶＫ（配列番号４１）を有することを示した。配列相 同性及び８０Ｄａの質量差の存在は、種がリン酸化の存在によってのみ異なっていること を示唆していた。 【００７２】 ＬＣＭＳ質量分光分析をｍ／ｚ１１７４でのピークに対し実施した。ＭＳ／ＭＳ実験は 40 ピークがＮＩＱＳＶＫＶＫ（配列番号４）の配列を有することを確認した。さらに、ｙ３ 、ｙ４、ｙ５及びｙ６を含むｙ３から出発したｙ系列のフラグメントイオンは、２５８Ｄ ａの質量増加を示した。しかしながら、ｙ２イオンは２５８Ｄａの質量増加を示さなかっ た。このデータは、修飾が２５８Ｄａの質量増加を伴ってリジン（配列中２３番目）上に あることを示した。 【００７３】 観察された修飾が、産物のグルコノイル化に起因したことを確認するため、反応性Ｌ− グルコノ−１，５−ラクトン又はガラクトン酸を利用したインビトロ反応が開発された。 以前の研究作業は、これらの種がヘキサＨｉｓタグに対するグルコノイル種の添加を誘発 する能力を有することを示していた（グオックヘガン（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ）ら）。 50 (24) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【００７４】 精製したＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔ）をｐＨ８．０でＴＲＩＳ緩衝液へと 緩衝液交換した。４５０ｍＭの濃度までＬ−グルコノ−１，５−ラクトン又はガラクトン 酸を添加し、２０分間室温で標本をインキュベートした。両方のラクトン共、大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）内での発現中に見られたものと同じ＋１７８ＤａのＣＸＣケモカイン修飾を 誘発した。 【００７５】 実施例４ この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された組換え型ヒトインターロイキン （ヒトＩＬ−１８）の内部リジン残基のグルコノイル化を例示している。 10 【００７６】 ６−ＰＧＬ付加体についてインターロイキン産物をスクリーニングするために、ＥＳＩ −ＴＯＦ質量分析法と組合わされた高解像度の逆相ＨＰＬＣを利用した。Ｂ菌株で発現さ れたインターロイキンの分析は、＋１７８Ｄａという質量差を示す産物関連の種を生成し た。タンパク質は、ヘキサＨｉｓタグ無しで発現されたことから、ＣＸＣケモカインで観 察された通り（実施例３参照）修飾は内部リジン残基において発生している確率が高かっ た。 【００７７】 インターロイキン分子の高解像度逆相ＨＰＬＣ分析により、ＲＴ２１．０、２２．０、 ２３．０分で＋１７８Ｄａの質量シフトを示す多数の産物種及び＋２５８Ｄａのシフト（ 20 ＲＴ約２７．５分）を示す付加的な微量の種を同定することができた。 【００７８】 インターロイキンのインビトロ修飾は、同様に、先行実施例において記述されている通 り、ｐＨ８．０でＬ−グルコノ−１，５−ラクトンで評価された。この反応も又、大腸菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢ菌株内でインターロイキンが発現された時点で見られたものと同じ ＋１７８Ｄａの修飾を生成した。 【００７９】 実施例５ この実施例は、豊富な培地内で細胞を培養することにより組換え型タンパク質の内部リ ジン残基のグルコノイル化又はＰＧＬ付加体の形成が妨げられることを示している。この 30 研究において３つの供給バッチ発酵プロセスが比較された。発酵ラン間の差異は、産生段 階の間に使用されたバッチ培地と供給物の組成にあった。プロセスＩの発酵では豊富な培 地が使用され、一方第２及び第３のバッチ（プロセスＩＩ及びＩＩＩ）は最小培地で実施 された。プロセスＩ及びＩＩにおいて、供給培地としてグリセロールが使用され、一方プ ロセスＩＩＩでは、グルコースが用いられた。 【００８０】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で組換え型インターロイキンを産生するための発酵プロセ スは、１５リットルの発酵装置の中で供給−バッチモードで実施された。発酵はバッチプ ロセスとして開始された。表４に示されているように、２．８Ｌ入りのフラスコ内でＰＹ Ｅ培地１０００ｍｌ中に０．５ｍＬのグリセロール保存培養を無菌状態で移送することに よって接種材料を調製した。 【００８１】 40 (25) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【表４】 10 【００８２】 培養を回転式振とう機の上で２７．５℃で一晩成長させた。その後、５Ｌのバッチ培地 の入った発酵装置内に振とうフラスコ培養を移した。産生培地は、塩、アミノ酸及び硫酸 カナマイシンから成る。さらに、豊富な培地を、表５に示されているような高濃度の酵母 エキスとフィトンペプトンで補完する。 【００８３】 【表５】 20 30 40 【００８４】 各培地のｐＨを、水酸化アンモニウムを用いて約７．３に維持した。温度を約２７．５ ℃に制御した。供給培地、グリセロール又はデキストロースを別々に滅菌し、シリコーン ゴム管類を用いて発酵装置にこれらを無菌状態で連結した。 【００８５】 供給培地の補給は、培養中の初期バッチ量が使い果たされた時点で開始された。ポーラ ログラフ酸素電極が、発酵装置内の溶解酸素張力を監視した。２０％を超える一定の溶存 酸素分圧を保つため、炭素供給速度をカスケードモードで制御した。曝気を１０ｓｌｐｍ 50 (26) JP 2006-520609 A 2006.9.14 に、圧力を７．０ｐｓｉｇの過剰圧力に維持した。発酵の実施当初から終了時まで８００ ｒｐｍという攪拌速度を使用した。約４０単位のＯＤ５ ５ ０ で、１００ｍＬの１ｍＭのＩ ＰＴＧを培養中に注入して組換え型遺伝子発現を誘発した。 【００８６】 ＩＰＴＧ添加から２４時間後に収集した標本の逆相ＨＰＬＣ分析は、産物中のグルコノ ラクトンレベルの低下を示した。プロセスＩにおける６−ＰＧＬ付加体の不在及びプロセ スＩＩ及びＩＩＩにおけるその存在は、グリセロール炭素源ではなく豊富な培地を使用す ることが６−ＰＧＬ付加体の削除の原因であったということを表わしている。表６は、該 分析の結果を要約している。 【００８７】 10 【表６】 20 【００８８】 実施例６ この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫ−１２菌株がＢ菌株よりも１００倍高いｐ ｇｌ活性を有することを示している。 【００８９】 親菌株としてＢＬ１２（ＤＥ３）をもつ２つの異なる菌株ＥＣＣ００５及びＥＣＯ６８ ０及びＫ−１２遺伝子型に由来する２つの他の菌株ＥＣＯ７０６及びＡＴＧ３９９５の抽 出物の中で、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を測定した。 30 【００９０】 菌株を培養するために、１ＬのＰＹＥ培地＋１％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナ マイシンを含有する２Ｌ入りの振とうフラスコに、凍結バイアルから０．４ｍＬの細胞懸 濁液を接種した。インキュベーションは、６時間又は７．５時間２２０ｒｐｍで攪拌しな がら３０℃で行なった。標本を指示された時点で取り上げ、５５０ｎｍで光学密度を測定 し、ペレットを収集してｐｇｌ活性を測定した。ｐｇｌ活性を測定するためのインビトロ 検定の詳細が以下に提示されている。 【００９１】 ｐｇｌ活性を、細胞を含まない抽出物の中で３４０ｎｍ、２５℃で螢光光度法によって 検定した。細胞を含まない抽出物を、以前に記述されたように（マイトラ（Ｍａｉｔｒａ 40 ）及びロボ（Ｌｏｂｏ）、生物化学報（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２４６；４７５−４８８（１９７１年））、５ｍＭのＥＤＴＡ及び ５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有するｐＨ７．３の５０ｍＭのＨＥＰＥＳという 基本的に同じ再懸濁緩衝液を用いて調製したが、細胞は音波処理（２０秒、５サイクル） によって破断させた。 【００９２】 幾分かの修正を加えて、以前に公開された方法（シンハ（Ｓｈｉｎｈａ）及びメイトラ （Ｍａｉｔｒａ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、１９９２年；１３８；１８６５−１８７３）を用いてｐｇｌを検定した。該検定は、２ ５ｍＭ−ＫＣｌ及び１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２ を含有するｐＨ６．５の１００ｍＭのＭＥＳ緩 50 (27) JP 2006-520609 A 2006.9.14 衝液の中で、５０μＭのグルコース−６−ホスフェート、０．５ｍＭ−ＮＡＤＰ＋及び１ 単位のグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを含有する１ｍＬの混合物を予備 インキュベートすることから成っていた。反応がひとたび安定期に達した時点で、ひき続 き２単位の６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを添加し、その結果、予備インキュ ベーションステップ中に形成された６−ＰＧＬの自然発生的加水分解に起因して吸収度が ゆっくりと増大した。細胞を含まない抽出物を添加した時点での螢光の著しい増分がある 場合、それはホスホグルコノラクトナーゼ活性のせいである。全てのｐｇｌ活性は、細胞 を含まない抽出物の添加の後の吸収度の増加の線形範囲内で推定された。 【００９３】 酵素活性は、６−ＰＧＬの自然発生的加水分解速度を減算することによって推定された 。酵素活性は、合計タンパク質１ｍｇ１分あたりのｍｍｏｌ ＮＡＤＰＨで表現された。 合計タンパク質は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質検定（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ） 、米国イリノイ州（ＵＳＡ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））によって決定された。 【００９４】 親としてＫ−１２遺伝子型をベースとしている菌株においては、Ｂ菌株に比べ１００倍 高い活性が検出された。 【００９５】 表７は、２つの菌株バックグラウンドについての酵素検定の結果を要約している。 【００９６】 10 (28) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【表７】 10 20 30 【００９７】 実施例７ この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１菌株内で異種ポリペプチド、ＣＸＣケ モカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔとしても知られている）を発現させた結果として６−ＰＧ Ｌアダクトがもたらされる一方、Ｋ−１２菌株内で同じポリペプチドを発現させると内部 リジンのグルコノイル化が妨げられる、ということを示している。 【００９８】 ＣＸＣケモカインを組換えにより発現するように構築された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の 異なる４つの菌株を用いて、１０回の発酵ランを実施した。この実施例は、各々の宿主細 胞バックグラウンドをもつ２つの発現系を用いることにより組換え型タンパク質の６−Ｐ ＧＬ付加体の形成の有無に対する宿主バックグラウンド対プロモータ系の効果を実証して いる。表８は、使用された菌株について記述している。 【００９９】 40 (29) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【表８】 【０１００】 10 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔ）を産生するため の発酵は、１５リットル入りの発酵装置内で供給バッチモードで実施した。バッチプロセ スとして発酵を開始した。５００ｍＬ入りバッフル付きフラスコ内の１００ｍＬのＰＹＥ 培地中に０．７５ｍＬのグリセロール保存培養を無菌状態で移すことにより、接種材料を 調製した。回転式振とう機上で３２．０℃で７時間培養を成長させた。振とうしたフラス コ培養を次に１．０ＬのＰＹＥ培地と混合し、８．０Ｌのバッチ培地の入った発酵装置内 に移した。産生培地は、塩及びプロモータに応じてカルベニシリンか又は硫酸カナマイシ ンのいずれかで構成されていた。表９中に、シード拡張用の培養組成が提供されており、 表１０には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＣＸＣケモカインの産生のための培地処方が提 供されている。 20 【０１０１】 【表９】 【０１０２】 30 (30) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【表１０】 10 20 【０１０３】 各培地のｐＨは、水酸化アンモニウムを用いて約７．０に維持した。温度を約３２．０ ℃に制御し、誘発時に約３７．５℃まで上昇させた。供給培地及びデキストロースを別々 に滅菌し、シリコーンゴム管類を用いて発酵装置に無菌状態で連結した。 【０１０４】 供給培地の補給は、培養中の初期バッチ量が使い果たされた時点で開始された。ポーラ ログラフ酸素電極が、発酵装置内の溶解酸素張力を監視した。約２５％を超える一定の溶 解酸素張力を保つため、炭素供給速度をカスケードモードで制御した。曝気を約１０ｓｌ ｐｍに、圧力を約７．０ｐｓｉｇの過剰圧力に維持した。始めに約４００ｒｐｍという攪 30 拌速度を用い、約２５％の溶解酸素張力を維持するべく必要に応じてこれを増大させた。 約１４単位のＯＤ５ ５ ０ で、１００ｍＬの１．０ｍＭのＩＰＴＧを培養中に注入するか又 は温度を３７．５℃まで上昇させて組換え型遺伝子発現を誘発した。 【０１０５】 Ｋ−１２宿主バックグラウンドを用いて実施した発酵はいずれも、組換えにより発現さ れたポリペプチド上の検出可能な６−ＰＧＬ付加体の形成を有しておらず、一方Ｔ７プロ モータと合わせてＢ菌株を用いて実施したものは全て、組換えにより発現されたポリペプ チド上の検出可能な６−ＰＧＬ付加体の形成の存在を示した。Ｂ菌株及びｐＬプロモータ を用いた３回の実施は、検出可能な付加体の形成を有していなかった。これらのデータは 、例えばＫ−１２といったｐｇｌ活性を有する宿主菌株内で組換え体タンパク質を発現す ることにより、この修飾を受ける可能性のある組換え型タンパク質内での６−ＰＧＬ付加 体の形成を妨げ得ることを実証している。実施例３を参照のこと。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）Ｂ及びＫ−１２菌株中で発現されたＣＸＣケモカイン内での６−ＰＧＬ付加体の形成の 存在は、表１１中で各発酵について提示されている。 【０１０６】 40 (31) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【表１１】 10 20 【０１０７】 実施例８ この実施例は、Ｋ−１２菌株内で異種ポリペプチド、ヒトインターロイキン（ヒトＩＬ 30 −１８）を発現させることにより内部リジンの６−ホスホグルコノイル化が妨げられるこ とになるのに対して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１菌株内での同じポリペプチドの発 現が結果として６−ＰＧＬ付加体の形成をもたらすということを示している。 【０１０８】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＫ−１２菌株は、ヒトインターロイキ ン（ＩＬ−１８）を発現するように構築された。実施例で記述された通りに最小培地内で 培養を成長させた。実施例で記述された方法を用いて、培地全体を通してさまざまな時点 で６−ＰＧＬでの産物修飾についての監視を行なった。 【０１０９】 結果は、修飾された産物に対する未修飾産物のピーク面積比として表現されている。数 字が大きくなればなるほど、グルコノイル化された産物の割合は小さくなる。ＢＬ２１（ ＤＥ３）菌株内のグルコノイル化の範囲がＫ−１２菌株内よりも著しく大きいことは明白 である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢ及びＫ−１２菌株内で発現されたヒトインターロイ キン（ＩＬ−１８）のホスホグルコノイル化が表１２に要約されている。 【０１１０】 40 (32) JP 2006-520609 A 2006.9.14 【表１２】 10 【０１１１】 実施例９ 20 この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞内での異種ｐｇｌの過剰発現が６−Ｐ ＧＬからその産物６−ホスホグルコネートへの代謝変換の増大を導きかくして付加体の形 成に利用可能な６−ＰＧＬのプールが削減される、ということを示している。緑膿菌（Ｐ ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌ遺伝子が、複製ベースのプラスミドのｃｏｌＥ１起源と 相容性のあるプラスミドベースの誘発可能な発現ベクターヘとクローニングされ、工学処 理され、かくして２つの異なるプラスミドは同じ宿主細胞内に維持され得ることになる。 緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌの誘発可能な発現レベルは、内因性大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）代謝経路とは独立してかつ問題の組換え型タンパク質の誘発可能な発現と は独立した形で、意のままに調節可能である。従って、６−ＰＧＬのプールが付加体の形 成に必要とされるレベルより低く、ただし宿主細胞資源が実質的な影響を受ける程に至ら 30 ずに減少するような形で、組換え型ｐｇｌ発現を調節することができる。従って、非常に 高い発現レベルを提供するべく、所望の組換え型タンパク質のレベルを別途調節すること が可能である。 【０１１２】 緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌのクローニング 緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌを以下のようにクローニングした。緑膿菌 （Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ、 １２３０１の米国標準培養収集機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１，Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ ＭＤ ２０８５２−１７７６）：緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎ 40 ｏｓａ）菌株ＡＴＣＣ２７８５３から入手した。５’及び３’ＰＣＲ増幅プライマは、開 始コドンＡＴＧのすぐ上流側の領域を含め、ｐｇｌ遺伝子全体のＰＣＲ増幅を指示するよ うに設計され合成された。センス及びアンチセンス増幅プライマの配列はそれぞれ以下の とおりである。 5' GGCCTCGAGCTCGGTGGCCCTGGTGGCCC 3' (配 列 番 号 ４ ) 及び 5' GCCCTCGAGTCCGCCACTCAGGGGTACCAAT 3' (配 列 番 号 ５ ) 太字の配列は、その後のクローニングステップを可能にするため遺伝子内に導入されたＸ ｈｏｌ部位を表わしている。 【０１１３】 50 (33) JP 2006-520609 A 2006.9.14 さらに、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）遺伝子は、ＧＣをきわめて豊富に有して おり、通常の増幅条件下ではＰＣＲ増幅しない。ＰＣＲ増幅には、ＧＣ富有鋳型、特定的 には米国カリフォルニア州パロアルトのＢＤバイオサイエンスクロンテック社のアドバン テージ−ＧＣｃＤＮＡポリメラーゼミックス、カタログ番号８４１９−１（Ａｄｖａｎｔ ａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ｃａｔ．８４１９−１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ：ＵＳＡ）に ついて最適化されているＰＣＲ増幅条件を使用することが必要である、ということが発見 された。ポリペプチド配列番号８をコードする対応するｐｇｌＤＮＡ配列（配列番号７） は、３０秒間９４℃とそれに続く１．５分間６８℃の２５サイクルの後、全緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞からＰＣＲ増幅された。このとき、３分間６８℃で単一のイ 10 ンキュベーションにより、増幅を完了した。アガロースゲル電気泳動及び米国カリフォル ニア州バレンシア、キアゲン社（カタログ番号２８７０４）のＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出 キット（ｃａｔ．２８７０４、Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；ＵＳＡ）上のカ ラムクロマトグラフィにより、ＰＣＲ産物を単離した。水中に増幅したゲル精製されたｐ ｇｌＤＮＡを溶出させ、米国カリフォルニア州カールスバッド、インビトロゲン社（カタ ログ番号Ｋ４５５０−４０）のＴＯＰＯＴＡクローニング（登録商標）キット（ｃａｔ． Ｋ４５５０−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｅｓｂａｄ，ＣＡ；ＵＳＡ）を用い てクローニングベクターｐＣＲ２．１へと直ちにクローニングさせ、米国カリフォルニア 州カールスバッド、インビトロゲン社（カタログ番号Ｃ４０４０−０６）のＯｎｅ Ｓｈ ｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピーテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ｃａｔ．Ｃ 20 ４０４０−０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＵＳＡ）へと形質転 換させた。結果としてのａｍｐ ｒ コロニーを、産物のＥｃｏＲＩ消化と電気泳動によりイ ンサートについてスクリーニングした。配列確認済みインサートをＸｈｏｌ消化によりク ローニングベクターから解放させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した。 米国ペンシルバニア州キングオブプルシャ、グラクソ・スミス・クライン社の（バイオカ タログ７３５５３２）ｐＥＣＯ−１発現ベクターＤＮＡ（Ｂｉｏ Ｃａｔ７３５５２，Ｇ ｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ；ＵＳＡ）をＳ ａｌｌで切断し、米国マサチューセッツ州ビバリー、ニューイングランドバイオラボ社（ カタログ番号ＭＯ２２９０Ｓ）の子牛腸内アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（ｃａｔ Ｍ０２９０Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；ＵＳ 30 Ａ）で処理し、次に、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した。基本的にメー カーにより記述されている通りにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｘｈｏｌ消化されたイン サート及びＳａｌｌ処理されたｐＥＣＯ−１をライゲートした（米国マサチューセッツ州 ビバリー、ニューイングランドバイオラボ社（カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）（ｃａｔ．Ｍ ０２０２Ｓ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；ＵＳＡ ））。メーカーにより記述されている通りにＯｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化 学的コンピーテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に２マイクロリットル（２μｌ）の ライゲーション反応を形質転換した（カタログ番号Ｃ４０４０−０６、米国カリフォルニ ア州カールスバッドのインビトロゲン社、（ａｔ．Ｃ４０４０−０６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇ ｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＵＳＡ））。ＰＣＲにより正しい配向でのｐｇｌインサ 40 ートの存在についてコロニーをスクリーニングした。以下で記すように、クローンｐＥＣ Ｏ−１ｐｇｌｃｌ２−１３をさらなる研究用に選択した。 【０１１４】 結果としての構成体はｐＡＣＹＣ１８４プラスミド主鎖に基づいており、以下の遺伝的 機能的要素を含む。（１）ｃｏｌＥ１−型ｏｒｉ要素と共に異種プラスミドと同じ宿主細 胞内でのプラスミドエピソーム維持を可能にするｐ１５Ａｏｒｉ；（２）クロラムフェニ コール ｒ 選択性マーカー；（３）多重クローニング部位の上流側のテトラサイクリン誘発 性プロモータ；（４）全長緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌ遺伝子。 【０１１５】 さらなる研究のため、ヒトインターロイキンを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内に上 50 (34) JP 2006-520609 A 2006.9.14 述の通りに最終構成体ｐＥＣＯ−１ｐｇｌｃｌ２−１３を形質転換した。ｐＥＣＯ−ｌｐ ｇｌｃｌ２−１３配列のＤＮＡ配列は配列番号９として提示され、ｐＥＣＯ−１ｐｇｌｃ ｌ２−１３の制限地図は図１に提示されている。 【０１１６】 実施例３に記述した通りに培養を実施した。６−ＰＧＬ付加体についての分析は、実施 例４中に記述されている通りに実施した。ホスホグルコノラクトナーゼ活性は、実施例６ に記述した通りに測定した。研究の中で検査したヒトインターロイキン（ＩＬ−１８）を 発現する付加的な菌株には、ｐＥＣＯ−１ｐｇｌｃｌ２−１３無しのＢＬ２１（ＤＥ３） 及びＫ−１２が含まれる。ｐｇｌプラスミドを伴う菌株は、２０ｎｇ／ｍＬでのアンヒド ロテトラサイクリンの添加を伴って又は伴わずに検査された。ｐｇｌを発現する細胞内の 10 ６−ＰＧＬ付加体の形成の有無は、以下に示される通りの表１３にまとめられている。 【０１１７】 【表１３】 20 【０１１８】 実施例１０ ヒトインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、腎細胞癌及び悪性黒色種の治療のため 30 の抗癌剤として開発されつつある免疫調節性サイトカインである。ヒト及びマウスのＩＬ −１８についての記述は、本書にその全体が参考として内含されている以下の米国特許で 提示されている：米国特許第６，５８２，６８９号明細書、米国特許第５，９１４，２５ ３号明細書、米国特許第５，８７９，９４２号明細書、米国特許第５，９１２，３２４号 明細書、米国特許第５，９１４，２５３号明細書、米国特許第６，０６０，２８３号明細 書、米国特許第６，０８７，１１６号明細書及び米国特許第６，２１４，５８４号明細書 。ＩＬ−１８は、免疫系を刺激し、Ｆａｓ誘発された腫瘍細胞死及び細胞媒介型免疫を促 進するものと考えられている。ＩＬ−１８のポリペプチド配列（配列番号１０）は、大腸 菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の中で産生され得る。それは、ｐｒｏ−ＩＬ１８ についてのポリヌクレオチド配列（配列番号１１）から発現され得、この配列はさらに同 40 じ細胞内で同時発現されるプロセシング酵素カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）５により成熟 ＩＬ−１８へとさらにプロセシングされる。 【０１１９】 グラム陰性菌緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の６−ホ スホグルコノラクトナーゼは、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株内にクローニングされた。この菌 株内のＩＬ−１８の産生は、所望の産物の収量の直接的増加を結果としてもたらすように 検出可能な付加体の形成が全く存在しない状態でＩＬ−１８を産生する。その上、ｐｇｌ 欠損の補正も同じく、特定生産性の１０％を上回る増加を結果としてもたらした。かくし て、この修飾された産生菌株の使用による産物の品質及び特定生産性の改善の組合わさっ た効果は、発酵段での力価収量の２５％を上回る増大の形で現われた。付加体の形成の削 50 (35) JP 2006-520609 A 2006.9.14 除は、精製プロセスに対する直接的なプラスの影響を有し全体的プロセス収量をさらに増 大させることになると予想される。 【０１２０】 実施例１１ ＩＬ−１８のグルコノイル化を、ｐｇｌの同時発現を伴って及びこれを伴わずにＢＬ２ １（ＤＥ３）細胞内で産生されたＩＬ−１８についてのＨＰＬＣ分析によって監視した。 精製されたＩＬ−１８から約２分後に溶出するショルダーピークとして、付加体の形成を 検出した。ＩＬ−１８が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＢＬ２１ＤＥ３（ｐｇｌマイナス） 内で発現されここから精製された場合、ＩＬ−１８についての主ピーク面積（すなわち、 検出可能なグルコノイル付加体の形成を全くもたないＩＬ−１８についてのピークの面積 10 ）は約５６％であった。一方、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐｇｌプラス）細胞中のＩＬ−１８ の発現及び精製は、約８８％の主ピーク面積を生成し、高解像度ＨＰＬＣ検定”に基づい ていかなる付加体の形成も示さなかった。 【０１２１】 実施例１２ ｐｒｏ−ＩＬ−１８（配列番号１１）、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）５（配列番号１ ２）をコードするポリヌクレオチドを含む２つのベクターが作り出された。その両方が、 Ｔ７プロモータを用いてポリペプチド産生が誘発されるｐＥＴベクターであった。１つの ベクターは同様に、ｐｒｏ−ＩＬ−１８と同じプロモータによって誘発された緑膿菌（Ｐ ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（配列番号７）からのｐｇｌをコードするポリヌクレオチドを 20 も含んでいた。ｐｒｏ−ＩＬ−１８及びカスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）５を含むｐＥＴベ クターの配列全体が配列番号１３中に提示されている。このベクターの制限地図が図２に 提示されている。ｐｒｏ−ＩＬ−１８、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）５及びｐｇｌを含 むｐＥＴベクターの配列全体は、配列番号１４に提示されている。このベクターの制限地 図が３に提示されている。これらのベクターを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ ＤＥ３）細胞内にＩＬ−１８が発現された場合、回収可能なＩＬ−１８の量は、ｐａｇ無 しでのＩＬ−１８の発現と比べてポリペプチドがｐｇｌと同時発現された場合に大幅に増 大した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内の各々の発現ベクターから得 た回収済みＩＬ−１８の量は、表１４に提示されている。 【０１２２】 30 【表１４】 【０１２３】 40 本明細書中で引用された特許及び特許出願を含め（ただしこれらは制限されることはな い）全ての刊行物及び参考文献は、各々の個別刊行物又は参考文献があたかも完全に本書 に参考として内含されるものとして特定的かつ個別に指示されているかのごとく、その全 体が本書に参考として内含されている。本出願が優先権を請求するあらゆる特許出願が同 様に、刊行物及び参考文献について上述した要領でその全体が参考として本書に内含され る。 【図面の簡単な説明】 【０１２４】 【図１】ベクターｐＥＣＯ−１−ｐｇｌ−２−１３の制限酵素地図を示す。 【図２】ベクターｐＥＣＯ−１−ｐｇｌ−２−１３についてのポリヌクレオチド配列を示 50 (36) JP 2006-520609 A 2006.9.14 す（配列番号９）。 【図３】ベクターｐＥＴ２８ＰｒｏｌＬ１８Ｃａｓｐ５の制限酵素地図を示す。 【図４】ベクターｐＥＴ２８ＰｒｏｌＬ１８Ｃａｓｐ５についてのポリヌクレオチド配列 を示す（配列番号１３）。 【図５】ベクターｐＥＴ２８ｐｒｏｌＬ１８ｃａｓｐ５＋ｐｇｌの制限酵素地図を示す。 【図６】ベクターｐＥＴ２８ｐｒｏｌＬ１８ｃａｓｐ５＋ｐｇｌについてのポリヌクレオ チド配列を示す（配列番号１４）。 【図７】ポリヌクレオチド配列、配列番号７を示す。 【図８】ポリペプチド配列、配列番号８を示す。 【配列表】 10 (37) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (38) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (39) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (40) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (41) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (42) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (43) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (44) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (45) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (46) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (47) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (48) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (49) JP 2006-520609 A 2006.9.14 10 20 30 40 (50) 【図１】 【図２】 JP 2006-520609 A 2006.9.14 (51) 【図３】 【図４】 JP 2006-520609 A 2006.9.14 (52) 【図５】 【図６】 JP 2006-520609 A 2006.9.14 (53) 【図７】 【図８】 【手続補正書】 【 提 出 日 】 平 成 17年 11月 1日 (2005.11.1) 【手続補正１】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】配列表 【補正方法】変更 【補正の内容】 【配列表】 2006520609000001.app JP 2006-520609 A 2006.9.14 (54) 【国際調査報告】 JP 2006-520609 A 2006.9.14 (55) JP 2006-520609 A 2006.9.14 (56) JP 2006-520609 A 2006.9.14 (57) JP 2006-520609 A 2006.9.14 フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 (2006.01) (2006.01) Ｃ１２Ｎ テーマコード（参考） 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ (81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP( AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI, CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE, DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA,M D,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US ,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW (72)発明者 アラン・アール・ガードナー アメリカ合衆国ペンシルベニア州１９４０６、キング・オブ・プルシア、スウェードランド・ロー ド７０９番 (72)発明者 トーマス・ディ・スワイツァー アメリカ合衆国ペンシルベニア州１９４０６、キング・オブ・プルシア、スウェードランド・ロー ド７０９番 (72)発明者 アレキサンダー・エイチ・テイラー アメリカ合衆国ペンシルベニア州１９４０６、キング・オブ・プルシア、スウェードランド・ロー ド７０９番 (72)発明者 プラマテシュ・エス・ペイテル アメリカ合衆国ペンシルベニア州１９４０６、キング・オブ・プルシア、スウェードランド・ロー ド７０９番 Ｆターム(参考) 4B024 AA01 AA03 AA11 BA10 BA11 BA26 BA80 CA02 DA06 EA04 GA11 HA03 4B064 AG01 AG03 CA01 CA02 CA19 CA21 CC03 CC24 CD20 CD30 CE12 CE15 DA01 DA13 DA16 4B065 AA26X AA41Y AB01 AC14 BA02 BB19 BB28 BB40 CA24 CA44 CA46 CA60