β ラクタム系抗生物質の消化管吸収に関する研究

Title
Author(s)
βラクタム系抗生物質の消化管吸収に関する研究
井関, 健
Citation
Issue Date
1986-09-30
DOI
Doc URL
http://hdl.handle.net/2115/32598
Right
Type
theses (doctoral)
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3067.pdf
Instructions for use
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
β
ラ ク タ ム 莞 ミ 抗 生 物 質 の 消 化 管
吸 収 に 関 す る 研 究
井
関
鍵
i
由
設定
総論の部
工
諸 百
第
I縞
アミノ
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 消 化 管 吸 収 と
薬物館および内閣性物質の相互作用
第一章
薬物の消化管吸収ならびにそれらに及ぼす他
のアミノ
第 1節
2箆
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 影 響
4
アミノセブァロスポリンの吸収に及ぼす他の
アミノ
第
4
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 影 響
一
一
一
一
一
一
5
一
一
一
一
一
一
8
アミノペニシリンの吸収に及ぼす他のアミ
ノ
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 影 響
第
3節
薬物の消化管組識蓄積における椙互作用
一
一
一
一
一
一
10
第
4節
考 察
一
一
一
一
一
一
12
磁の影響
一
一
一
一
一
一
13
1節
薬物の吸収に及ぼすアミノ援の効果
一
一
一
一
一
13
第 2節
薬物の吸収に及ぽすジペプチド影響
一
一
一
一
一
一
工7
第二章
第
薬物の吸収におよぼすジペプチド、アミノ
第
3節
腸管部位による吸収性の比較
一
一
一
一
一
一
21
第
4節
考 察
一
一
一
一
一
一
23
(ii )
第
E編
第一章
小腸制子縁膜小抱を用いた薬物の膜透過性
一一一一一一
25
小腸捌子縁麗小胞実験法の検討
一一一一一一
26
一一一一一一
26
制子縁膜小胞を用いたアミノ酸類の膜透過桂一一一一一
27
第 1節 小 腸 樹 子 縁 膜 小 抱 の 調 製
第
2節
薬物の小腸瑞子縁膜小胞への取り込み
第二輩
第 1節
第
2節
一一一一一一
28
薬物の制子議膜小臨への取り込み速度の比較一一一一一
30
初期取り込みにおける内向さの H
+
勾配の
34
影響
第
E趨
察
第三章
考
37
小麗上皮繍胞の構成成分への親和性と薬物の吸
収機構
第一章
アミノ
44
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 小 揚 組 識 親 和
一一一一一一世
45
組織への滞留
一一一一一一世
46
性
第 1節
ラット腸管脈管同時還流法による吸収性と
第
2節
薬物の吸収性と粘膜組識蓄積性
一一一一一一世
49
第
3節
薬物の小腸組議内分布の検討
一一一一一一由
49
第
4節
考
一一一一一一ー
53
察
(iii)
第二章
小腸組識可溶性画分中の薬物結合成分の単鑑
﹁べ叫局斗占凋斗ゐ
555
と結合実験
第
1節
可港性画分の分離器製
1)
0 EA Eイ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
2)
セファデックス
G“ 50 ゲ jレ ク ロ マ ト グ ラ フ
F
688114
コロ
コ
イー
3)
S 0Sポ リ ア ク リ
4)
精製の結果
第
2節
fb画 分 へ の 薬 物 結 合 性
第
3箆 考
第 1節
薬物関椙互の結合阻害
第 2節
築 物 の fb
画分への結合に対するアミノ齢、
ジペプチド頚の影響
3節
kufo
fb
画分への薬物結合における椙互作用と結合
特性
第
JF
察
第三章
j
レアミドゲル電気泳動
一一一一一一四
63
一一一一一一回
64
一一一一一一世
67
生 体 高 分 子 結 合 性 蛍 光 プ ロ ー プ A N Sの fb
画分への結合
一一一一一一ー
67
第
4節
薬物の結合様式と吸収特性
一一一一一一司
69
第
5節
考
一一一一一一ー
69
察
結論
73
謝辞
77
(iv)
実験の部
第
I繍
実験の部
第
E縄
実験の部
第
E繍
実験の部
78
84
91
可
ム
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引用文献
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一
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、
訓
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アンピシリン
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アモキシシリン
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ゼン
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- 1-
指怠話詰
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CD 音巳
宣言
近年、尉性醤の出現や日租見感染の増加など起国語の多棒化にと
もない、種々の抗生物質が開発されてきた。とりわけ、
Sー ラ ク タ
ム系抗生物質の場合には、種々の化学欝錨を抵どこすことにより、
数多くの化合物が開発され、これらはその消化管吸収の優劣にもと
ずさ、経口剤、あるいは注射剤として、臨床的にも汎用されてきた。
しかしながら、このように新たな経口用
Bー ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 が
開発されていく一方で、消化管から吸収され得るに必要な要因、す
なわち吸収の擾劣に深くかかわる機構に関しては、十分に解明され
ているとは蓄えず、アミノ酸、語、ペプチド等の内菌性物質につい
1) -
10)
ての研究
と比較しでも報告は少ないのが現状である。
一般にこれまで多く薬物の消化管吸収はいわいる“
theory
溶液の
(pH分 配 仮 説 )
p
H partition
11 )
"によって説明されてきた。すなわち、
p
H変 化 に 伴 な う 薬 物 の 解 離 の 程 度 や 脂 溶 性 の 尺 度 と し て の 水
一油閣の分配係数
(partition coefficiet)
と吸1&性の聞には良好
な相関性が認められてきた。しかしながら、消化管内でイオン型と
して宰在し、その指溶性が極めて置いにもかかわらず、良好な吸収
性を示す薬物の消化管吸収は本仮説では説明できない。
アミノ
ての
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 は 、 両 性 イ オ ン 型 構 造 を と り 、 す べ
p
H領 域 に お い て イ オ ン 型 と し て 存 在 す る 薬 物 で あ る が 、 そ の 消
化管吸収はすぐれており、臨床的にも経口剤として汎用されている。
したがって、これら薬物の吸収には単なる受動拡散や、
p
H分 配 仮 説
一2-
では説明づけられない特殊な韓送機構の穿在している可能性が十分
考えられる。
これまでに、これらアミノ
Bラ ク タ ム 系 坑 生 物 質 に 関 し て は 、
i
n vitro 反 転 腸 管 法 を 用 い て 、
Dixonら
体檎送系の存在を明らかにしている他、
14 )
によって
12 )
がシクラシリンの担
Tsujiら
13 )
Kimura ら
Na+依 存 性 あ る い は 非 低 存 性 の 担 体 韓 送 系 の 寄 与 が 報
告されている。さらに、
Quay ら
15 )
はセファレキシンの吸収に
Glycine の 翰 送 担 体 が 関 与 し て い る こ と を 指 描 し て い る が 、 一 方 、
Yamashita ら
16 )
によって、これら薬物の小腸組識透過における、
アミノ酸翰送担体の寄与の程度は非常に小さいこと等が報告されて
いる。
このように、これら薬物の優れた吸収性を説明づけるため、種々
の機構が議論されているものの、薬物個々で検討されたものが多く、
権めて鶏似した構造を持つこれら薬物に共通した機構を提示しうる
には至っていないのが現状である。このため、これらの吸訳機構を
明らかにすることは、イオン型薬物の吸収勤惑を解明するうえにお
いても、また、薬物吸収の難易度と構造との相関性を考察するうえ
においても、撞めて重要な基礎的知見を得ることになり薬剤学的に
も重要な寄与を成し得るものと考える。
これらのことから、本研究において著者は、アンピシリン、アモ
キシシリン、シクラシリン等の経口ペニシリン誘導体、およびセフ
ァレキシン、セフラジン、セファドロキシール等の経口セファロス
ポ リ ン 類 (Chart.1 ) を 用 い 、 こ れ ら 薬 物 の 吸 収 機 構 を 明 ら か に す
る思的で種々の検討を行った。
すなわち、先ず最初にこれら薬物の吸収挙動の全体像を薬物閤お
よび内閣性物質との相互作用を通じて明らかにした。次いで、ラッ
コJ
ト小腸刷子議膜小抱を用いて、麗透過接講についての被討を加えた。
さらに、これら薬物の吸収挙動を説明できると提案されていた小揚
18 )
粘膜組識の結合成分を、
今回、単鑑精製すると題詩に、本成分
との結合性について検討し、これら薬物のすぐれた吸収性を説明す
るに必要な要因の一つを明らかにすることができた。
以下、得られた結果を三績にわたり論述する。
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物 質 の 消 化 管 吸 収 と 薬 物
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Bラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 小 腸 吸 収 に つ い て は 、 従 来 、 主 に
ラットをもちいた反転腸管法、
1n sit
u還流法、ループ法等により、
17 )- 21 )
その著しい易吸1&性が報告され
Hichae-
一部の薬物では
Iis-Henten の 速 度 式 に し た が っ た 吸 収 性 を 示 す こ と
代謝阻害剤により影響を受けること
22
，
)
23 )
や、
24 )
等が報告されてきた。また、
こ れ ら 薬 物 が そ の 構 造 に ア ミ ノ 基 と 力 jレ ボ キ シ ル 基 を 有 し た
z
witt-
eト ion型 で あ る こ と か ら 、 ア ミ ノ 接 、 ジ ペ プ チ ド 頚 の 小 腸 上 皮 割 強
14 )
韓送担体が、その吸収に寄与していることを示唆する報告
もー
部見られる。しかしながら、これらの薬物の消化管吸収機構の詳細
に関しては未だ不明の点も多く、薬物に共通した吸収過程の実体に
ついて比較検討した例は見られない。
本繕においては、これら薬物の小揚吸収機構におげる共通性を晃
い出すべくこれら薬物相互間での吸収抑制、およびアミノ酸、ジペ
プチド類による吸収抑制について検討した結果を論述する。
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薬物の消化'皆吸~又ならび
に、それらに::&."ますイ也の
ア ミ ノ
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ラ ク タ ム 系 抗 生
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2 警響
牢勿霊童
アミノペニシリン系抗生物質であるシクラシリンとアモキシシリ
RJ
ンは、その消化管吸収において、相互に抑制することが明らかとな
14 )
っている
が、これらペニシリン系薬物とセフラジン、セファレ
キシン等のアミノセファロスポリンとの吸収機構の類似性について
H
u
、 Tsuji ら
げ同日
24 )
12 )
m川
r
aら
o
iX0n ら
、
は不明な点が多い。シクラシリンについては、
25 )- 27 )
によって、飽和性の吸収挙動を示すこ
とが報告されており、アミノ畿、ジペプチド等の担体翰送系の関与
26 )
についても議論されている。
しかしながら、これまでの報告で
は、極めて類似した構造を有する薬物聞においてもその吸収性、あ
るいは吸収抑制効果が著しく異なるなど、共通した吸1&機構を明示
し得るまでには至っていない。したがって、、これら薬物に共通す
る吸収特性を検討するためには、広くペニシリン系薬物、セファ口
スポリン系薬物を用いて、これらに共通する過程の有無を明らかに
することが必要である。
本章ではこのような目的から、ペニシリン系、セファロスポリン
系のアミノ
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 相 互 の 吸 収 抑 制 効 果 を み る こ と に
より、その吸収挙動の共通性について検討した。
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ア ミ ノ
ラ ク タ ム 系 抗
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実験動物は
最多饗翠
Wistar系 雄 性 ラ ッ ト ( 体 重 18ト 230g) を 使 用 し 、 小 腸
からの吸収実験は既に報告されている
た。また、還流溶渡には通常
を用いた。
o
K
a
k
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iら の 方 法
に準拠し
modified Ringer's 溶 液 (pH 6
.
8
)
6
薬物は、 環 在 臨 床 で 慣 わ れ て い る ア ミ ノ セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 類 の な
かから吸収性
レキシン、
と露管内での安定性
等を考捜してセファ
セフラジンを選訳した。 検討した薬物の讃度は、
HMH
m川
3.0
HMH
なった。 共 容 さ せ た 薬 物 は 、
HUS
150
度が薬物濯度に低存する範盟内であっ た
を設定 して行
溶濯の浸透圧、 溶解度等を考置して、
と し て 吸 収 実 験 を 行 な っ た。
その結果、
アンピシリン、
アモキシシリン、
れも有意にこれら薬物の吸収を抑制し、
かつ、
シクラシリンはいず
セフ ア レキシン、
フラジンは椙互にその吸収を抑制しあう ことが認められた
2
吸収遼
セ
(Fi
g.1
I
。このう ちシクラシリンの抑制効果は著しく、 また相互に吸収
抑制が認められたセフラフン、
セファ レキシンの抑制は経時的にそ
の効果が増大する傾向がみられた。
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アミノペニシリン類の消化管吸収のうち、シクラシリンについて
はジペプチド、あるいはアミノ酸の担体を介して吸収が行なわれて
14 )
. 25 )
いるとする説
が多い。
Dixon ら
12 )
は反転腸管法を用いて、
その膜透過速度に飽和現象のあることを明らかにしており、また、
Kimuraら
23 )
、 Tsuji ら
26 )
によってその吸収はジペプチドにより
吸収阻害をうけることが報告されている。しかしながら、周じアミ
ノペニシリンであるアモキシシリン、アンピシリン等に関するこう
12.14.17.22)
した翰送担体の寄与については諸説
があり、必ずしも
続ーされた見解を得てはいない。
本研究においては、アンピシリン、アモキシシリンを用いて、こ
れらの薬物とセファロスポリジ系をも含め、その吸収の類似性を明
ら か に す る 目 的 で 、 第 1節 と 問 様 の 条 件 で 吸 収 実 験 を 行 な っ た 。
Fi
g.3 は ア モ キ シ シ リ ン の 消 化 管 吸 収 の 時 間 的 経 過 を 示 し た も の
である。セファ口スポリン類に比べ吸収量はさほど多くはないが、
第
1節 向 様 の 吸 収 抑 制 効 果 が 共 存 さ せ た 各 薬 物 に よ り 認 め ら れ た 。
ここでシクラシリン共穿下でアモキシシリンの管腔内残容量は
100% を 超 え る 値 を 示 し た が 、 こ れ は 問 時 に 吸 収 さ れ る 水 の 影 響 に
よると考えられ、シクラシリンにより吸収の抑制されたアモキシシ
リンの濃度が結果的に高くなったものと思われる。また、アンピシ
リンの場合には、アミノペニシリン類の中でも吸収性は低く、経時
的な変化を観察することが困難であるため、
60分 還 流 後 の 管 腔 内
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七inal
工 50 p.M) from 工n七es
Lumens a七 pH 6.8 by 七he Simu工
七 aneous Perfusion
Resu工
七 s are expressed as mean of 3-4 experエ
men七S wi七h S.E.M.
.
nddo
ig
n
.L
a
m
e
r
O
ユg
Percen七 01
: dど 1
60
40
20
100
con七ro1
wi七h AC-PC
wi七h CEX
wi七h CED
with t
.
.
l
←PC
Fig.4 Effec七S of Amino β Lac七am An七 ibio七ics on 七he Disappearance
・ 剛
of Ampicillin from Ra七 工n七es七inal Lumens for 60 立1エn
Concen七ra七ions of ampici11in and 0七heど β-lac七am an七ェ b工0七1.C S
weど e 150 pM and 3.0 mM，respec七ive1y.
Resu1七s are expressed as mean of 3-6 8xperimen七S wi七h S.E.M.
- 10 -
残 容 量 を 測 定 す る こ と よ り 吸 収 量 を 比 較 し た (F
ig.4)。
その結果、アンピシリンの吸収はいずれの薬物共存下においても
有意な抑制効果を認めるには至らなかった。
〈 第
3 宣告〉薬物の消化管組織蓄積
4こ
アミノ
dヲ
ft-.:T若~
;t自主主[.
f
乍
F司
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 は そ の 吸 収 過 程 に お い て 、 一 過 性 の
17 )
腸管趨議蓄積性をもっ
にもかかわらず¥吸収機構と組議取り込
みの過程について論じた報告は極めて少ない。そこで次に、著者は
第
1箆 、 第 2節 で 明 ら か に な っ た 吸 収 過 程 で の 薬 物 罰 の 抑 制 作 用 が 、
組織内蓄穣過程においても観察されるかどうかについて検討を加え
た。
すなわち、比較的吸収の護れていたセフラジン、セファレキシン
に対し、これらを椙互に共存された場合、ならびにアミノペニシリ
ンそれぞれ
(Fig.5
を共寄させた場合の認識内への取り込みを測定した
)。結果は
I
ns
i
t
u還流法による吸収実験開始後 3
0分 で の
全 小 腸 粘 膜 盟 議 中 の 薬 物 量 を 蛋 白 質 量 mg当 り で 比 較 し た 。 な お 、 還
流 液 の 薬 物 濃 度 お よ び 阻 害 薬 物 議 度 は 第 1節 と 間 接 、
1
5
0 ~H ， 3
.
0
m
Hで あ る 。
その結果、シクラシリンは両薬物の組議内蓄積を強く抑制し、ま
たセフラジン、セファレキシンは相互に蓄積を押えることが明らか
となった。
11
g
-門
CEX
c
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CED
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86.0
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小
包
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wi七h
CEX
Fig.5 Effec七s of Amino β-Lac七a
r
n An七 ibio七ics on 七he Accumu工a七ion
of Cepha1exin and Cephradine in 工n七es七ina1 Mucosa by 七he
Simu工
七 aneous Perfusion for 30 min
ロ}﹂﹂
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U
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﹂ 一
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RS
expど essed as mean of 3-4 experエmen七s wi七h S.E.M.
difference from con七rol value
安
P<O.OOl，
司
く芸高
アミノ
4
輩官〉手号
12 -
莞零
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 と し て セ フ ラ ジ ン 、 セ フ ァ レ キ シ ン 、
アモキシシリン、アンピシリンを選び、吸収に及 L
ます薬物椙互の影
響を検討した結果、アンピシリンを除きこれら薬物は問じアミノ
3
ラクタム系抗生物質であるシクラシリンによって著しい吸収抑制を
受けることが明らかとなった。また、同時にアンピシリンに対する
飽薬物の影響を除いて、椙互に吸収を抑制することが暁らかとなっ
た
o
N
a
k
a
s
h
i
m
aら
13 )
は、セファレキシンの吸収におよぽすセフ
ラジンの抑制効果が濃度依存性であることを指描している。また、
シクラシリンの消化管からの吸収は他のアミノ
Bラ ク タ ム 系 抗 生 物
質に比べて非常に早いことが知られており、ある穫の担体翰送系が
24 )
吸収に関与することも報告されている
。本研究において使用し
たセフラジン、セファレキシン、アモキシシリンはシクラシリン
3
.0 mH 共 存 下 で 著 し く そ の 吸 収 が 抑 制 さ れ た こ と よ り 、 こ れ ら 薬
物の消化管吸収過程には担体翰送系をも含む何らかの共通した特殊
な機構を有することが示唆された。また、この共通した吸収過程の
事在は、組議内蓄積に対する薬物相互の抑制結果からも一層明らか
となった。なお、アンピシリンにおいては、地の薬物の吸収を抑え
るものの、それ自体の吸収は有意に抑制されなかった。これは、ア
ンピシリンの吸収自体がそれ程大きくないことに起因するものと思
われる。
﹁
J
14
毒
事E
多諾
議室物-a <T) 邸 主 斗 又
L
こ疋;z (..ます一三フ/丈
ア ミ ノ 麗 斐 実 質 の 患5
5
-:7'ヲニド、
墾華
ジペプチド、アミノ援は、小腸にその翰送担体の事在することが
知られており、消化管から効率よく吸 i
反される。これまでに、これ
ら生体由来の成分の小腸吸収に関する研究は数多くなされており、
34 .3 5)
36 )
等が明らかに
や議送担体の基質特異性
鎗送のメカニズム
されてきている。
アミノ
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 は 、 こ れ ら 内 因 性 z
wit
t
e
r
-io
nと講
造上類似しているため、その吸収性を比較検討することは極めて重
要なことと考えられる。
これらジペプチド、アミノ酸類の薬物の吸収に及ぼす影響につい
ては、
Quayら
15 )
、 Kimuraら
14 )
、D
i
x
o
nら
12 )
、 Tsuji
26 )
ら
の
報告があるが、薬物個々について述べられたものが多く、実験手法
の違いにより結果が異なるなど、いまだ定説を得るには至っていな
いのが現状である。
したがって、本章では第一章で検討したと間
様な手法に基づき、これら薬物の吸収に及ぼすジペプチドならびに
アミノ酸の影響を検討し、考察した結果を述べる。
〈
穿高
1
箆官
〉
蓮華物"D <T)
明支叫又
ミノ麓愛
<T) 景5
2 翠欝
Lこ志芸乙(..~安ヲー
フ
ア
アミノ讃は主として小腸上皮溜抱制子縁膜に存在する韓送担体を
介して
N
a依 存 性 の 能 動 翰 送 系 に よ っ て 取 り 込 ま れ る こ と が 既 に 知 ら
37 )
れている。
とりわり、中性アミノ酸は近年までに最もよくその
明
14 -
議送機構が明らかにされており、結合部位の特異性についても報告
38 .3 9)
が見られる。
そこで本研究では、これら中性アミノ援のいくつかを用いて薬物
の 吸 収 に 及 ぼ す 影 響 を 1n si
tu 還 流 法 を 用 い て 検 討 し た ロ こ れ ら の
実験に先だち、アミノ酸どうしでの吸収阻害実験を行なった結果を
Fi
g
. 6に 示 す 。
すなわち、
1.0
m
Hの L
-フ ヱ ニ ル ア ラ ニ ン に 対 し 、 そ の 翰 送 担 体
40 )
を一部共有することが知られている
議度で共揮させ、
L
-フ ェ ニ
的に認定した。その結果、
j
レ
L
幽メチオニンを
10， 0 m
Hの
アラニンの消化管内からの消失を経時
L時 フ ェ ニ l
レアラニンは単独の場合、その
吸 収 は 第 一 章 で 記 し た 薬 物 の 場 合 に 比 べ て 早 く 、 か つ L- メ チ オ ニ ン
の 共 存 に よ っ て 約 40%も の 隈 害 を 受 け る こ と が 認 め ら れ た 。 こ の 結
果より、本実験系においても翰送担体を共有する物質簡では、その
吸収盟害効果を明確に示し得ることを確認した。
そこで、次に各薬物の吸収に対する数種アミノ酸の影響について
検討した。薬物は吸収性の高いシクラシリン、セファレキシン、セ
フラジンを使用し、共存させたアミノ援はいずれも 1
0
.0 限 付 議 度 を
設定した。その結果、
Fig， 7，8，9に 示 す ご と く 、 い ず れ の 薬 物 も こ
れら共存させたアミノ援によっては冊らの影響も受けず、抑制効果
は認められなかった。
工5
Time
n
u
u
円
﹃11
円
U
び戸間 何月間刊の口問む'HUZ2lJhO
﹃
30
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60
40
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60
L-Phe (1.0 rnM)
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七
由
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工 0.0 rnM)
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20
七
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E
Fig.6
m~n
L-Me七hionine (1000 rnM) on 七he Disappearance of
OI
L Pheny1a工anine (工。 O rnM) fど om Ra
七 工n七es
七ina
工 Lumen a七
明
q
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Resu1七s
。
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工
七 aneous Perfusion
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m~n
30
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H びコhH
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80
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40
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H
ω
ω
以
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O
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wi七h L-Pro
wi七h L-Leu
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ム
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戸工
y
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Absorp七 ion
。
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七
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Tム
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七
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Fig.7
(
工 50 戸M)
respec七ive1y)
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﹂
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w~ 七 h
S.E.M.
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人
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experirnen七S wi七h S.E.M.
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) Perfused
(
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M
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expressed as rnean 。工
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of
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七七
n
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ln Cornbina七ion
Resul七S
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油
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Fig.8 工n七es七inal
見4
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M
ω
川
相
ロω
0
W l七h L P
he
wi七h L-Cys
wi七h L-Leu
con七ro1
wi七h L-Pro
司
向
50
工 50 戸M) Perfused
Fig.9 工n七es七ina工 Absorp七ion of Cephradine (
工 0.0 m
M
， respec七ively)
ln Cornbina七ion wi七h Arnino Acids (
U
﹁
﹄
Aで
Resul七S are expressed as mean or
experimen七S wi七h S.E.M.
J
﹁
l
〈第箸
2
謹官〉薬物の坊主斗又に主主乙ぽすジ
ペ プ チ ド の 影 響
多くのジペプチドは消化管において、小腸制子縁膜表面のジベプ
チダーゼの作用により速やかにその構成アミノ酸に加水分解され、
1
. 41 )
アミノ鼓として吸収される。
しかしながら、グリシルグリシ
ン ( Gly-Gly)、 L“ カ ル ノ シ ン ( L-Ca
けなどの一部ジペプチドに対し
ては、消化管腔内では分解されずそのままの形で取り込まれている
42 .4 3)
担体機構が存在するとの報告も見られる。
したがって、本実
験ではこれらジペプチドの消化管鹿内での安定性、及び薬物との構
造 類 似 性 を 考 慮 し て L網 ブ エ ニ jレ ア ラ ニ ル グ リ シ ン ( い P
he GI
y)、
蛸
Gly Gly 、 ト C
a
rを選び第一軍と詞様の実験手法を用いて検討を加
由
えた。薬物は、前箆と同じ三種のアミノ
Bラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 ( シ
クラシリン、セフラジン、セファレキシン)を用いた。共事させた
ジペプチドの濃度は
3
.0 mM か ら
10‘o
m
Mの範囲に設定し、得られ
た 結 果 を ま と め て Fig.10 ( セ フ ァ レ キ シ ン ) 、
Fig.11 ( セ フ ラ ジ ン )
Fig.12( シ ク ラ シ リ ン ) に 示 し た 。
その結果、薬物閣では有意な抑制効果の得られた
3
.0 mM 共 事 下
においては、いずれのジペプチド共存の場合も何ら影響は認められ
なかった。次いで、
6.0 r
n
H のジペプチド類を共存させた場合には、
Gly-Glyに よ っ て シ ク ラ シ リ ン の 吸 収 は 抑 制 を 受 け (Fig.12) 、 ま
たセファレキシンは
LC
a
rによって吸収が抑制されることを認めた
哨
(Fig.10)
しかしながらセファレキシンに対するいC
a
rの吸叙抑制効果はそ
の 共 存 濃 壌 を 10.0 m
H に増大させても、
6
.0 mH 共 存 の 時 と ほ ぼ 間
程 度 の 効 果 し か 示 さ な か っ た ( Fig.10) 。 ま た い C
a
rは他の薬物に
工8
対 し て 有 為 な 抑 制 を 示 さ な か っ た こ とから、
これらジペプチドの抑
制効果は先にみられた薬物関の吸収抑制ほどには強くないこ とが示
唆された。
r
n
i
n
)
Tirne (
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、
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・叶
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(6.0 rnM)
L-Phe-G工y
(6.0 rnM)
L-Car
ω
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(3.0 rnM)
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七es
七ina1 Absorp
Fig.工O In
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.
M
) Perfused ~n
七ides
Combina
七ion w~ 七 h Dipep
，
0: con七ro工
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口: wi七h
叩
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L-Phe-G工Y (6.0 rnM)
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expど essed as mean O工
ペベ
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Resu工
七S
ム: wi七h G1y G工y (6.0 rnM)，
wi七h L Car (3.0， 6.0，工0.0 rnM)，
experlments wi七h S.E.M.
工9
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wi七h L Car (6.0 rnM)
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PU-J1J
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工 50 pM) Perfused ェ
n
Fig.エ 工n七es七inal Absorp七ion of Cephradine (
七ides
Cornbina
七ion wi
七h Dipep
0: con七rol， ム= wi七h L Car (6.0 rnM)，
wi七h Gly.G工Y (3.0， 6.0 rnM)，
口
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工
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wi七h S.E.M.
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Fig.工2 In七es七ina工 Absorp七ion of
(
工 50 戸M)
Perfused l n
B
)
Combina七ion W l七h Gly-G1y (A) and L Car (
由
Concen七ご a七ions of dipep七ides '
t
l
e
:
:
:
:
e 6.0 mM.
Resu1七s are expressed as mean of 5 6 expeご iments W l七h S.E.M
対** Pく 0
.01
Significan七 D
i
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:
:
:
:
e
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e fごom con七ご。 L va1ue
叩
- 21
く穿詰
3
叩
宣告〉舷議官苦音βf立による明~
1
1
又 f
生
qコ 上 ヒ 車 交
これまで用いてきた I
n situ 還 流 法 で は 、 ほ ほ 全 揚 ( 胃 幽 門 直 下
よ り 思 腸 一 盲 腸 接 合 部 の 10C
I
i
l手 前 ま で ) を 用 い て 吸 収 実 験 を 行 な っ
ているため、薬物吸収に関与する議送担体が特定の部位に局在して
いる場合には、その効果を明らかにし得ない可能性が考えられる。
そ こ で 本 実 験 で は 、 ラ ッ ト 消 化 管 の 吸 収 部 位 を 4つ に 区 切 り ( 十
二指腸部、空腸上部、空腸下部、回腸部)、それぞれについて
1n
situ還 流 法 に よ り 吸 収 抑 制 実 験 を 行 な い 、 部 位 に よ る 抑 制 効 果 の 違
いを検討した。
Fig.1
3は セ フ ラ ジ ン に 対 す る シ ク ラ シ リ ン 、 及 び GIY-Gly の 影 響
を検討した結果である。セフラジンの吸収に対する
GIY-Gly の 抑 制
効果は、空揚上部でのみ認められたのに対し、シクラシリンは十二
指腸部、空腸上部にわたって著しく吸収を抑制することが明らかと
なった。
これらの結果より、薬物椙互の吸収抑制は、ジペプチドの翰送系
を介して行なわれるものではないことが強く示唆された。
4
﹁
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Dis七a1 Jejunurn
工
工e
u
r
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核P
Fig.13 Comparison of In
七es
七ina1 Absorp
七ion Charac
七eris
七ics of
Cephradine (
工 50 J
l
M
) a七 Four Differen七 Segmen七S
o
con
七ro1， 口
す
wi七h AC守 C (3.0 mM)
wi七h G1y G1y (6.0 mM)，
叩
Resu1七s are expressed as mean of 2-5 experimen七s wi七h S.E.M.
*
* Pく 0.025
Significan七 difference from con七ど 01 va1ue
Each 10 cm of in七es七ina1 segmen七 was used. Deuodenum se守men七
was prepared under 七he py1orus. Proxima1 and dis七a1 jejunum
segmen七 were prepared a七 七 he beginning of 15 and 30 cm be10w
七he py10
どus，respec
七ive1y. And i1eum segmen
七 was prepa
どed
.a七
七ion.
七he beginning O.芝工 5 cm above 七he i1eo-ceca1 junc
4
﹁
4
露目〉手号
司J
〈穿諾
莞要
薬物どうしの吸収抑制効果と異なり、ペプチド、アミノ援の薬物の
吸 収 に 対 す る 抑 制 効 果 は 、 シ ク ラ シ リ ン に 対 す る Gly“ Gly 、 セ フ ァ
レ キ シ ン に 対 す る L-Car で 認 め ら れ た に 過 ぎ ず 、 そ の 効 果 も 薬 物 に
よる抑制効果に比べ大きなものではないことが明らかとなった。即
ち、小腸管腔からの透過速度が担体輸送系による経路と単純鉱散に
よ る 経 路 の 紹 で 表 わ さ れ る と 考 え た 場 合 、 そ の 透 過 速 度 (J )は次
13 )
の式に従うことになることは良く知られている
Jmax.C
J
Kt
ここで
物議度、
k• C
C は 管 控 内 薬 物 議 度 で あ り 、 K t は 担 体 が 50%飽 和 す る 薬
Kは 一 次 の 速 度 定 数 で あ る 。 こ れ に 対 し て 括 抗 的 に 担 体 と
50%飽 和 濃 度 を K
iと し 、 そ の 物 質 が 担 体 輸 送 さ れ る
とした時、
Jは 次 式 で 示 さ れ る 。
Jm ax • C
J=
K t (1+ I / K
+k • C
(2 )
)+ C
一 方 、 ジ ペ プ チ ド の 小 腸 吸 収 に 関 し て 、 Himukai ら
ツ ト 小 露 に お け る Gly Gly の K t は 約
3S )
はモ jレモ
1.7 mH で あ る こ と を 示 し て
俗
おり、
(1 )
C
十
の結合を盟害する物質の譲度を
時の
十
。
Tsuji ろ は ラ ッ ト 小 腸 に お い て Gly Gly 、 L-Car は そ れ ぞ れ 、
6
.0 mH 、 13.0 r
n
Hの
岨
Kt 憶 を 示 す
13
，
26)
ことを報告している。
由
24 -
したがって、シクラシリン、セブァレキシン等の吸収過翠において
そ の 主 た る 吸 収 の 経 銘 が Gly Gly 、 L
-Car の 翰 送 担 体 を 介 し て 透 過
働
す る 場 合 に は 、 シ ク ラ シ リ ン の 吸 収 は Gly GIy 6
.0 限
付
蝿
共存下で
約 50%の 阻 害 が 生 じ 、 一 方 セ フ ァ レ キ シ ン の 阻 害 さ れ る 寝 度 は 、
L
-
Car の 共 存 譲 度 に 依 害 し て 増 大 す る こ と が 予 想 さ れ る 。 し か し な が
ら、本研究で得られた結果はこの予想に反したものであり、これら
ジペプチド、アミノ磁の鎗送系がアミノ
Bラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 主
たる吸収経器ではないことが強く示唆された。
また、吸収部伎を隈定して・行なった第
3節 で の 実 験 結 果 は 、 セ フ
ラ ジ ン の 吸 収 に 及 ぼ す シ ク ラ シ リ ン と GIY-Gly の 彰 饗 度 の 違 い を 明
示するものであり、従来論議されてきたシクラシリンの担体議送系、
すなわちジペプチド翰送系が必ずしもアミノ
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質
に共通した吸収経銘であるとは言い難いことを示唆する知見と思わ
れる。
なお、本績で用いた I
n situ 還 流 法 は 、 生 体 の 誠 管 系 を 生 か し た 、
よ り 生 理 的 条 件 に 近 い 系 で あ る と は い え 、 比 較 的 Hacro な 実 験 系 で
あるため、薬物閣で認められた著しい吸収抑制が吸収過程のどの段
階で生じているのかは明らかではない。しかしながら、吸収抑制の
傾向は小腸粘膜組識への取り込みにおいても認められ、かつ、セフ
アレキシン、セフラジンの椙互抑制効果は、還流開始後 2
0分 以 降 に
強く環われ、その効果も経時的に増大する傾向を示したことから
(Fig.1，2) 、 こ れ ら 薬 物 関 の 吸 収 に お け る 共 通 す る 過 程 は 、 薬 物
が蓄額する部位に穿在している可能性のあることが推察される。
q
d
ι
勺
多詰
E
結議
小 薦 議 席 目 子 縁 膜 小 胞 を 用 心 、
た 薬 物 の 膜 透 過 性
一般に、薬物の吸収、分布等の生体内移行過程は、種々の形態か
ら成る生体膜を介しての薬物膜透過現象の集積された結果であり、
特に消化管からの吸収を考える場合には、小腸上皮縮腹の摸透過性
を考慮することが重要である。
著者は、間性イオン型構造を有するアミノ
の消化管吸収機構を解明する目的で、.第
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質
I議 に お い て 、 薬 物 と そ の
構造類似体であるアミノ酸、ジペプチドを取りあげ、その吸収抑制
効果を検討し、それらの吸収性の共通性、相違点について考察を加
えてきた。これに加えて、薬物吸収の律速段階と考えられている小
腸 樹 子 縁 膜 (intestinal brush border r
nembrane;BBH) に 対 す る 薬
物の透選特性を検討することは、薬窃吸収機構に関する基礎的知見
を得るうえからも重要と考えられるが、第
I纏 で 言 及 し た よ う に 、
I
n situ 吸 収 実 験 法 で は 議 々 な 生 体 制 の 要 因 が 関 与 す る た め に 、 こ
の手法を用いて膜透過性を考察することは技術的にも困難な問題が
多い。
これらのことから本麗では、小鹿上皮璃臆の樹子縁小胆
( B B M小 抱 ) を 調 裂 し 、 こ の 小 胞 内 へ の 薬 物 の 取 り 込 み 速 度 、 及
び特性について換討し、同時にアミノ穣等の透過性と比較すること
より薬物の膜透過性について考察した結果を詳述する。
- 26 -
寧
第
小 腸 輔 自 子 縁 膜 実 験 宇 去 の 検
言寸
担体議送系の寄在するグルコース、アミノ接、ペプチドの
過性を検討した報告には、
Ganapathy ら
U.Hopferら
44 )・・ 46 )
、
Kessler ら
、その也多くの研究
も小腸粘膜より
B BM透
47 )
があり、いずれ
BBM小 胞 を 讃 製 し 、 そ れ に 対 す る グ ル コ ー ス 、 ア
ミノ酸等の取り込みについて種々の検討を行なっている。
一方、薬物については、腎上皮翻抱
報告
B B M 小 胞 を 用 い た Inuiら の
があるが、小腸に関しては
てそれぞれセファドロキシール
K
i
r
n
u
r
aら、 Okano ら に よ っ
、セフラジン
の鎗送特性が
検討されているに選ぎず、精製嬢小胞を用いた報告は極めて少ない
のが現状である。
したがって、本研究では、先ず最初に、調製した
BBM小 E
きが、
従来報告されているアミノ酸等の担体議送機能を維持していること
を確認した後、各薬鞠の小盟内取り込みの特性について検討した結
果を述べる。
第苔
く
1 盟百
〉
ノj、
鹿謁席現ヨ三薬事主題襲
)
'
J、 島 包 改 〉 言 閤
謹話
B B M小 胞 の 語 製 は Kessler
らの方法
に準拠した。すなわち、
ラット小腸より得た結額望書過物ホモジネートに c
aCI
2
とによって
小麗
を添加するこ
BBM以 外 の 成 分 を 凝 集 さ せ 、 次 い で 段 階 遠 沈 を 行 な い
B BM 穣 品 を 得 た 。
Table 1 に 得 ら れ た 接 接 品 を 用 い て B B M に 局 在 す る
Alkaline-
﹁
ノ
日
ゥ
，
phosphatase 及 び 側 底 形 質 膜 に そ の 大 半 が 分 布 し て い る と 考 え ら れ
ている N
a
K ATPase活 性 を 澗 定 し た 結 果 を 示 す 。
B B M の 精 製 度 の 指 標 で あ る Alkaline phosphatase活 性 は 、 最 初
噌
のホモジネートに比べ約 1
2信 に 比 活 性 が 増 大 し 、 一 方 側 底 形 賞 醸 の
指壌となる N
a
・
+
K ATPaseは 約
1/5に 議 少 し た 。 こ の こ と か ら 、 本
調 製 法 に よ り 得 ら れ た 膜 薗 分 の 大 部 分 が B B Mで あ る こ と を 確 認 し
た。
Table 1 Marker Enzyme Ac七ivi七y of 工n七es七ina工 Membrane
1.0
工0.265
12.2
0.029
0.2
や ah
0.136
1
) ~rnoles of pheno1 produced per r
nin perrng of protein at 370 C and pH 10.0
2) ~rno1es of phospha
七e produced per r
nin per r
n
g of pro七ein at 370 C pH 7.5
〈第誓
2
箆百::>
B
B
M
ノj¥
居留を用し、たア
ミ ノ 酸 奨 寅 の B
襲 透 過 半 寺 性
前節の方法にしたがって讃裂した膜罷品が、担体韓送機能を維持
14
14
しているかどうかを確認する目的で
G-L-ア ラ ニ ン 、
C L由 フ ヱ ニ
崎
ル ア ラ ニ ン を 用 い て B BM 小 鹿 に 対 す る 取 り 込 み を 換 討 し た 。 実 験
は、
Hopferら の 迅 速 議 過 法
6
7)
に し た が い 、 メ ン ア レ ン フ ィ jレ タ ー
(O
.45μm，HAWP02500，Hillipore) に 捕 護 さ れ た 放 射 活 性 を 謝 定 す
n
1.0
a
0.847
o
--
yc
t
・
・工 AZ
V 工
}
-lr
A
tu
cp
p&-L
at
e2
5y
七
KA
TV
A-l
+C
-L
M山 手 ム
p‘
+c
a
-
c
Brush Borders
q
M
Homogenate
e
A1ka1ine Phosphatase Activity
Sf
?
邑 cific Activi
七Y1
) P
urification
一 28 -
ることにより、各物貿を定量した。
Fi
g
.1
4は そ れ ぞ れ
アラニン(
1
.
0m
H
14
C
L
-ア ラ ニ ン ( 1
.
0m
H)
)について
に測定した結果である。
14
C
L
-フ ェ ニ ル
B B M小 胞 へ の 取 り 込 み 量 を 経 時 的
L幽 ア ラ ニ ン 、 L
-フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン は B B M
小砲を用いた検討では、 N
a
の議室度知恵(藤外渡>摸内液)存在下
で、一次的な取り込み蓄積、すなわち o
ver shoot現 象 を 示 す こ と が
+
知られているが、これには N
a
の electrochemical p
otential を 主
たる駆動力としている説が支配的である。
本実験においても、これらの物質は N
a
現象を呈し、議整した
勾配依様性の o
ver shoot
BBM小 臨 の 穣 品 に 担 体 輸 送 の 機 能 を 保 持 し
ていることが確認された。また、
Fig.14.Aの 右 上 に 示 し た ご と く 、
ト ア ラ ニ ン の 取 り 込 み 平 髄 鐘 は 、 Hediu国 外 液 の 浸 透 圧 の 逆 数 に 比 例
したことにより、調整した
BBMは 確 実 に 小 抱 化 し て い る こ と が 確
認された。
以上の結果より、得られた
B BM は 小 胞 は 、 そ の 担 体 翰 送 機 能 を
十分に維持していることから、薬物の膜透過における特殊性を考察
するうえにおいて、充分にたえ得る穣品であることを確認した。
穿諾
薬 物 の 小 腸 刷 子 縁 膜 小 島 包
室事変
J ¥ OJ 耳 又 り
J
Z
込読点
薬 物 の B BM 小 胞 へ の 取 り 込 み を 検 討 し た 倒 は 前 述 し た よ う に 撞
めて少ない。
Iuniら は 、 ラ ッ ト 腎 尿 細 管 上 皮 細 胞 の B B M 小 胞 を 謂
裂 し 、 有 機 カ チ オ ン で あ る テ ト ラ エ チ jレ ア ン モ ニ ウ ム の 鎗 送 が 基 質
の韓送方向と対向する持
勾留によって能動的に駆動されることを
68 .6 9)
報告している。
また、彼らはアミノ
Bラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の
29
A.
L-Alanine
口
，.
叶
G
0.8
ω
{GJ
明
G
M
2.0
日e
、
u
コ
o
E
門
凶
けH O h H
0
.
'
4
E
Z
コ
ザ
主
j
f
旬
以
且4
2
o
I人﹂ j
2
6
10
l/OsmolariヒY
1.0
T
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m
司J
2
5
4
m
~
宇
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工
O
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g¥Hoaロ) ωリ工{勾以内凶ロ
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，
-Phenylalanine
B. E
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るザ
ヤふ問
丁ll傘
ogc}
門凶小国同¥同
ω判OM
{ 同 M J明
2.0
むぷ旬以内凶ロ
工.0
ωぷ凡同!凶
・工
3
T i ロ1 e
Z
m
l
4
O
5
ドーす。
n
Fig.14 Up七ake of LAmino Acids by ヱロ七 es
七inal Brush Border Membrane
Vesicles
日u
p
r
u
'
1 HEPES/Tris
7.5)
Membrane vesic1es were prepaど ed ln 20 r
and 100 mM D ペnann~ 七 0 1.
Final concen七ra亡 ions were 100 mM NaC1(
or 100 mM KC1(
0)
and 1.0 mM L .amino acids.
Each poin七 ど epresen七S 七he mean 之 S.E.M. of 七日10 or 七hree
expeどiments performed in dup1ica七e de七ermina七ions.
鴫
﹁
J
n
u
セファレキシン、セフラジンの腎尿細管翰送に関しでも廊様の手法
で 検 討 し 、 こ れ ら の 鎗 送 が 有 機 カ チ オ ン 翰 送 系 (H
ペ プ チ ド 韓 送 系 (H
62.
対向鎗送)とジ
共輸送)を介していると結論づけている。
64)
一 方 、 小 腸 B BM 小 胞 を 用 い て の 報 告 は 少 な く 、
よ っ て セ フ ァ ド 口 キ シ ー jレの N
a
kimura
らに
非依穿性の担体議送系が一部穿在
することが報告されている他、 O
kano ら
66 )
による、セフラジンの
H 共韓送系の報告があるのみである。
したがって、本研究では、前章で得られた結果に基づき、アミノ
3ラ ク タ ム 系 の 消 化 管 吸 収 に お け る 膜 系 の 寄 与 を 確 認 す る 目 的 で 、
こ れ ら の 薬 物 の 小 腸 B BM小 胞 へ の 取 り 込 み 挙 動 に つ い て 検 討 し た 。
薬物はセフラジン、セファレキシン、アンピシリンを用いたが、定
量には当研究室で開発した蛍光一
〈舞客
H
P
L
C法 に て 行 な っ た 。
1 震 自 〉 薬 物 自 の 樹 弓 三 議 室 主 踏 襲 ノj、 島 包 へ
o
耳又
り
3z込担当L3
主題控室E
o
上ヒ車交
前 章 に 記 し た 膜 謂 製 法 に 従 っ て 、 ラ ッ ト 小 蕗 よ り B BM小 胞 を 調
製し、各薬物の取り込み実験を行なった。
Fi
g.15に セ フ ラ ジ ン 、 セ
ファレキシン、アンピシリンの経時的な取り込みの結果を示す。
アミノ酸の場合と間接に
1
.
0m
Hの薬物議度で行なったが、前章
第 2節 で 示 し た ア ミ ノ 殻 に 比 べ 取 り 込 み 平 衡 ! 直 に 達 す る 時 間 は 遅 く 、
かつ、 N
a
依存性の o
ver shoot現 象 も 認 め ら れ な か っ た 。 ま た 各 々
の薬物簡でその取り込みの経時的変化はほとんど同様の傾向を示し、
吸 収 性 の 擾 劣 (A
BPCく C
E
X豆
性は認められなかった。
C
E
D
)と 膜 透 過 性 の 聞 に は 何 ら 有 意 な 椙 関
31
↓
1.0
414
(に刊の川一 OMG 小 包¥
J{ogロ}
0.5
ωυ{ の け 刊 ( 凶D
2
3
で 工
立l
e
4
q
d
O
舟
マ
。
mln
Fig.工5 Up七ake of Amino β Lac七am An七 ibio七ics by 工n七es七ina工 Brush
叩
border Membrane Vesic工es
Membrane vesic1es weど e prepared ln 20 mM HEPES/Tど is (pH 7• 5)
and 100 mM O-manni七01.
The vesic1es (100 p工) weどe incuba七ed a七 2s0 C wi七h 七he
ど e (10
0 p工) con七aining 20 mM HEPES/Tris
subs七ra七e mix七1ユ
(
p区 7.5)， 100 mM 0 manni七01， 200 mM NaC1(圏， A
.，鯵) or KC1
(口，ム， 0
)， and ei七heど 2 rru'1 CEX (圏 口)， CED (A.， ム) 0ど
AB-PC (畿， 0)
.
司
F
Fina1 concen七ど a七エ on
100 mM NaC1 or KC1， 1 mM an七ibioセics.
Each poin七 represen七S 七he mean 土 S
.O. or 七wo or 七hどee
experimen七s perrormed in 七ど ip1ica七e 0ど dup1ica七e de七eどmina七ions，some S.D. va1ues 1ie wi
七hin 七he symbo1 aどea.
﹁ノ﹄
司J
また、
Fi
9.16に セ フ ラ ジ ン 、 セ フ ァ レ キ シ ン の 取 り 込 み 平 衡 櫨 と
He
di
U1
1外 渡 の 浸 透 庄 の 関 係 を 示 し た が 、 ト ア ラ ニ ン の 場 合 と 同 様 に
取り込み量は浸透圧の逆数に比例して増加しており、これら薬物の
場合も小胞内への取り込み豊を測定していることは明らかである。
なお、ここで得られた麗壊を寵軸へ外挿した鑑は、理論的には小
抱内容種がぜ口となった時の取り込み量、すなわち、
B BM へ の 吸
着量を示す。したがって、両薬物の膜への吸着量はいずれも
O
.1
5
n
r
n
o
l
/
r
n
g protein と 実 質 的 な 小 胞 内 へ の 取 り 込 み 量 と 比 べ て 比 較 的
小さいことが認められた
o
こ れ ら の 結 果 は 、 薬 物 の B BM透 通 過 程 に お い て 、 ア ミ ノ 畿 や 謡
で報告されている N
a
依存性の担体翰送の寄与は小さいことを示唆
するものであるが、このような膜小抱を用いた取り込み実験の場合、
その N
a
依 存 性 が そ れ 程 大 き く な い 場 合 に は 、 見 か け 上 over s
hoot
現 象 が 明 確 に 観 察 で き な い こ と も 考 え ら れ る 。 そ の 場 合 、 拘 edium中
の薬物議度をより母讃度にして行なうことによって、全議送に対す
るN
a
寄在性の寄与をより明らかにすることが可能となる。
し た が っ て 、 著 者 は 次 に 薬 物 の Hedi
um中 濃 度 を
B BM へ の 取 り 込 み を 検 討 し た 。
O
.1 1
1H と し て
33
B. CED
A. CEX
工.
0
一
ω
{C4
。
制
川
。
hH 角川凶
F
M 向勾川判門凶ロ
g¥HOZM
ロ} ω
0.5
/
J
，
/
r
J
J
，
，
J
J
J
〆
，
f
f
，
/
/
f
，
f
O
2
4
8
6
工
S
七
zム
c
e
E
f
Fig.工6
。
ェ
O
/ Osmo工ari七y
2
4
6
8
工0
工1
M
of Medium Osmo1ari七y on 七he Up七ake of Cepha1exin(A)
and Cephradine(B) by 七he Brush Border Membrane Vesic工es
Resu1七s are exoressed as mean of 3-3 exoerimen七s '
N
i七h S.E.M.
日embrane vesic1es weど e prepared in 100 @~ D-ce11obiose
ins七ead of D-manni七。1.
工ncuba七ion media con七ained 1 @'1 CEX 。ど CED， 100 mM-200 mM
D-ce11obiose and 20 mM HEPES/Tど is (pH i
.5). The incubation
time '
N
a
s 60 min.
34 -
叩
Fi
g
.17に O
.1 mH 濃 度 で 行 な っ た セ フ ァ レ キ シ ン
j
レ ア ラ ニ ン (B) の 結 果 を 示 す 。
(A)
、
L国 フ ェ ニ
1.0mH翠 度 で 行 な っ た 場 合 、 ア ラ ニ
ン に 比 べ て 明 確 な over shoot現 象 が 見 ら れ な か っ た L咽 フ ェ ニ jレ ア ラ
+
O
.1m
H と い う 低 湿 度 で 顕 著 な Na
ニンは
の に 対 し 、 セ フ ァ レ キ シ ン は Na
勾配の効果が確認された
勾配存在時と
K 勾配存在時とで
何ら有意な差異は認められなかった。
また、各薬物の
BBM小 路 外 濠 中 の 薬 物 濃 度 を 変 化 さ せ た 場 合 の
小 臆 内 へ の 取 り 込 み 初 期 速 度 は Fi
9.18に 示 し た ご と く 、 直 嬢 的 に 増
加し、薬物議度
1.0 mH か ら 1
5
.0 IH の 範 囲 で 鐙 箱 過 程 を 示 さ な い
ことが明らかとなった。また、これら薬物の取り込み速度は吸収性
の異なるアンピシリン、セファレキシン、セフラジンでほぼ間程度
であり、これら薬物の吸収量の差異を反映するものではなかった。
く穿搭
2
箆官〉者刀翼用耳叉り
内 向 さ の
3込~にお(，=1-る
→
i
→
崎
主
主
ヨ
酉[!tZ) 欝5
2
墾華
Nakashima ら
26 )
はテブロンチュープを挿入した反転腸管法を用
い て 、 セ フ ァ レ キ シ ン 、 セ フ ァ ド 口 キ シ ー jレ の 初 期 取 り 込 み が 30.0
mHと い う 高 議 度 の GIY-GIY に よ っ て 阻 害 さ れ る こ と を 報 告 し て い る 。
また、
Ganapathy ら
70 .7 1
)
は L Car 、 GIY-L-Pro 、 Gly-Sar 等 の ジ
欄
ペプチドの翰送系が、組抱内への刊
を見い出しており、
Na -H
勾配によって促進されること
対向翰送系により生じた
H
勾配がそ
の誼接的な駆動力となっていることを報告している。
前節で示した結果はこれら薬物の膜透過に対する担体論送の寄与
は極めて小さいことを示唆するものであったが、第工纏において、
i
A
γ
-
35
O
.工
U
(周回一二
A.
判。︼周回
。話回¥問。沼田信}
~
0.05
Tl愈Oiム
︺V
ω
一
一dJaz
警
斗
υ
}向日間
1=盟国~，k田===:d
O
工
0.2
5
2
60
(
:.
m
in
ω 判。同仏 mg¥同 。 昌 広。
M
白川叫パ叫色。
}
{周回明
長 優 / ¥ ¥ ¥ヘ段、
"
'
一
一
ザ
片
山
→
O
.工
。
/V
。ぷ臼lA
兵 = ム = ザ 戸 = 田d
O
工
5
2
60
m~n
工ncuba
七i
on
で ~me
Fig.17 Up七ake of Cephalexin(A) and L-Phenyla工anine(B) by Brush
七ra
七e
Border Membrane Vesicles a七 Low Concen
七ra
七エ on of Subs
F-l
。
(
0.
工 mM).
﹄
a sinα 工e or 七wo
Each poin七 ど epresen七S 七he mean 一 S.E.M.
experimen七s done in duplica七e.
Concen七ra七ion or CEX and L-Phe was 0.1 mM， ど espec七ive1y.
Fina1 incuba七ion media prepared in 20 mM HEPES/Tris (pH 7.5)
.
con七aining 100 mM NaC1( 畿 ) or KC1(0 )
d
36
Tー橋間﹀穴一
3.0
}i
(周囲
J
。
ω
明む
/
小
g¥ 同OEZ)
/密
仏
-M
2.0
/
J笹山
勾以内凶ロ
ωM{
工.
0
O
5
工5
10
Drug Concen
七ra
七エ ons (mM)
七
c
?
ぃ
日
e
手
ム
z
z
Fig.工8
七ia
工 Up七ake by
七ra
七エ ons on 七he 工ni
of Drug Concen
工n七es七ina
工 Brush Border Mernbrane Vesicles
同
ア
由
u
e
k
a
﹄
﹂
p
Solid line indica七es 七he
and AB-PC( ム ).
。
The up七ake for 30 sec a七 concen七ど a七ion be七ween エ and 20
mM was de七ermined.
CEX(
o，
)
CED(
七S
Resul七S aど e expressed as mean of I
:our experlmen
S.E.M.
Wl七h
﹁苛︾
ゥ
，
セファレキシンの吸収は一部
L
C
a
rによって抑制されており、これ
ら薬物の鰻透過性におけるジペプチド輸送系の関与については、さ
らに検討する必要があるものと考えられる。
したがって、本節ではこれらジペプチド翰送系の関与について、
H
勾配依存性の観点より検討した。
T
a
b
l
e 2に セ ブ ア レ キ シ ン の
1分 間 で の 初 期 取 り 込 み を H
e
d
i
u
m中 の p
Hを 変 化 さ せ て 検 討 し た 結 果
を示す。薬物議度
1
.
0
m
H、 2
.5
m
Hの い ず れ の 場 合 も 内 向 さ の プ ロ ト
ン 勾 配 寄 在 下 で 約 2稽 程 度 の 初 期 取 り 込 み 促 進 が 認 め ら れ 、 セ フ ァ
H. 勾 配 依 存 性
レキシンはその膜透過において、一部ジペプチドの
担体論送系を介している可能性も示された。
一方、セファレキシンの膜透過に対して電荷の移動を伴っている
か否かを検討する目的で、パリノマイシン議加によって形成される
K
(Fig.19) 、 セ フ ァ
の拡散電位の効果について検討したところ
レキシンの取り込みには有意な変化は認められず、膜電位によって
は 影 響 さ れ な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 一 方 、 同 時 に 行 な っ た D司グ jレコ
ースの場合には顕著な取り込み増加が観察され、
c
t
r
og
e
n
i
cな 8備グ
喝
N
a
依存性の
e
l
e
-
44 )
j
レコース輸送系
が機能していることが確認さ
れたことから、セファレキシンの膜透過は、電荷の移動を伴ねない
e
l
e
c
t
r
o
n
e
u
t
r
a
l
なものであることが示唆され、
の薬物の取り込み促進の結果
+
H
勾配によるこ
(Table 2) と は 対 応 し な い も の で あ
った。
芸高
室事歪
手号
算要
72 .7 3)
制子縁膜の調製法はいくつかの手法
S
c
h
m
i
t
zら
が知られていたが、
74 )
により報告されたこ価カチオン沈澱法は
K
e
s
s
l
e
rら
38
an 工nward Pro七on Gradien七
。
n 七he Ra es
七
5ム
ぃ﹃
01
:
。
S
七
c
e
F
ア一
手ム
V
Tab1e 2
Cepha工exin Uptake エn七0 七he 工n七es七ina工 Brush Border
Membrane Vesic工es
(r
n
M )
工.
0
2.5
q
d
工n七erna1 p廷
e 品川
kl
ao
七m
u(
七erna
工 pH
Ex
pn
Drug Concn.
pro七ein min)
7.5
7.5
0.472 土 0.29
5.5
7.5
工.098 土 0.43
7.5
7.5
0.993
5.5
7.5
2.工34 土 工.27
土
0.25
Membrane vesicles were orepared ln 100 mM D-manni亡
。
ェ r 100 ょ甘4 KC1 anc
10 r
r
u
'
1 HEPES/
でご土 s (pH 7.5).
The 亡 ど anscort assav was inin亡 la亡 ed by adding 100 f
ユ1 of membrane
マesic1e suspension in亡。 200 p
.l of 亡 ご anscort buffeご con七alロln守 C
E
)
C，
100 mM D manni亡 01， 100 mM KC1 and 10 mM HEPES/でごエ s， pH 7.S 之江七 he
七
三:
rnal pH
case of ex亡 ernal pH 7.5) or 10 mM MES (in 七he case of ex
司
zム
S.E.M.
r
aaturn represen亡 the mean
in dup1ica七e.
o
5
.S)•
.
c
.
:acロ
刊
亡 rNO
experJ.r
n
e
n七s done
39
{
口
一
一
心
判
。
D-Glucose
Cephalexin
明
。
“
。
{ZJ
0.3，
.
3.0
hH︿凶
.
.
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.
ー
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・
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1
D
勾川恒用凶
m
w
ロ﹂明x
・
・
・
・
・
・
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ー
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・
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・
・
・
ー
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・
・
・
・・
••••••••••••••••••
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ト
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1
同市戸白川凶
ωU
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O
Con
七rol
Con
七rol + Va
工inornycin
i
同t院且 E
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一{勾パザ(凶ロ
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M
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小包
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0
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・
・
・
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.
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.
.
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・
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.
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.
・
・
.
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.
・
・
・
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・
・
・
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・
・
・
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・
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・
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・
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・
・
・
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・
・
・
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・
・
・
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・
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・
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・
・
・
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・
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・
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・
・
・
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・
・
・
.
・
.
+ Va工inornycin
Fig.19 Effec七 of Valinornycin-工nduced PO七assiurn Diffusion PO七en
七ial
on D-Glucose and Cephalexin Up七ake
工nside Nega
七エ ve
Membど ane vesic工es were prepared in 100 mM D manni七01， 100 mM
po七assium glucona七e and 20 mM HEPES/Tris (pH 7.5).
， 50 mM
The incuba七ion media con七ained 100 ~~ D-manni七01
po七assium glucona七e，and 20 mM HEPES/Tris (pH 7.S).
ロ disso1ved in absolu七e ethano1 was added 七0 七he
Va1inomycエ
membrane suspensエon，wi七h 七he addi七ion of e七hano1 a10ne 七0
七he con
七ro1. Fina1 concen
七ど a七ions エ
n 七he incubation medi~m
of va1inomycin and e七hano1 were 10 f
ユ
守 /mg of membrane pro
七ei
口
and 0.2 %，ど espec七ive1y，。ど 0.2 % e七hano1 alone.
The incuba七ion 七ime was 30 seconds.
Resu1七s are expressed as mean of 3 5 experimen七s wi七h S.E.M.
叩
司
明
Evers ら
40 -
の改農による簡便な調製法が報告されて以来、
広く用いられるようになった。
今 回 用 い た Kessler ら の 方 法 は 翰 送 系 の 検 討 に 適 当 な も の と し て
既に確立されたものであり、今回の実験でも、
や
L
-フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン
D
-グ ル コ ー ス 、 L幽 ア ラ ニ ン の 取 り 込 み に お い て 、 そ の 担 体 論 送 機
能の保持が確認された。一方、セファレキシン、セフラジン、アン
ピシリン等のアミノ
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 は 、 担 体 翰 送 系 を 介 し て
透過する物質とは異なり、むしろ単純拡散系化合物としての透過性
を示すものであった。
Inuiら は ラ ッ ト 腎 上 皮 翻 胞 の B B M 小 砲 を 用 い て 、 セ フ ァ レ キ シ
ン等のアミノセファ口スポリン類が担体議送により再吸収されるこ
と を 報 告 し て お り 、 両 性 イ オ ン 構 造 を 持 た な い 悶 ono-basicな セ フ ァ
ロスポリンにくらべて、小胞内取り込み平擬値に達する時閣は極め
て早いことを指摘している。また、小鹿 BBM による検討には
日i
muraら
の 報 告 が あ り 、 セ フ ァ ド ロ キ シ ー jレの N
a
依害性担体
輸送系の存在を明らかにしている。本研究において行なった小腸
B
BM小 抱 へ の 取 り 込 み に お い て は 、 そ う し た 傾 向 は 見 ら れ ず 、 同 時
に行なったアミノ醸の取り込み速度と比較しでも、遅いものであっ
た。またこのことは、比較的溶性の高いフェノパルピタールを用い
て予備検討した擦の小胞内取り込み平衡値到達時間と比較しても潤
様に遅いものであったことより、これらアミノ
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物
質の遅い膜透過性は、主に脂溶性等の物理化学的性質に基づいてい
ることが推察された。これらの結果の違いは、一つには鎮小胞を調
製した駿器(腎と小腸)の違いに起因することも考えられるが、
詳組な検討は行なっていない。また、同じ小腸においてもセファ
時
4工一
ド ロ キ シ ー jレ と 他 薬 物 で 担 体 へ の 親 相 性 が 大 き く 異 な る こ と も 擢 察
されるが、
K
i
m
u
r
aら の 報 告 で は 初 期 取 り 込 み に お け る 濃 度 依 存 性 に
ついてはふれていないため、現時点で詳しい比較はできない。しか
しながら、これら薬物の担体論送系が吸収の主経路であるとするな
ら誌、セフラジン、セファレキシンに比べ、セファドロキシールの
吸収性はよりすぐれたものとなるはずである。ところが実際には、
これら薬物はいずれも吸収性は良好であり、
b
i
o
a
v
a
il
a
b
iIi
t
yも大
きな差はないことが知られている。したがって、これら薬物の吸収
において、その主たる共通経路として担体議送を考えることは難し
いと思われる。
O
K
a
n
o らは
小 腸 B B Mを 用 い て セ フ ラ ジ ン の 吸 収 に
送系が一部関与していることを報告しており、
H
共議
H 勾配の効果につ
いては興味のもたれるところである。本研究においても、セファレ
キシンの取り込みに対する内向きの
H 勾配の影響は有意にその取
り込みを促進するものであったが、一方、パリノマイシン添加によ
って生じた
K 拡散電位(内部負)の効果に対しては伺ら変化がみ
られず、この薬物の嵐透過には電荷の移動を伴なわないことが示唆
された。
この椙反する結果に対する考案のーっとして、以下の可能性が考
え ら れ る 。 す な わ ち 、 セ フ ァ レ キ シ ン の 本 実 験 条 件 ( pH 7
.4の 港 液
中 ) に お け る 分 子 麓 の 割 合 は 、 そ の pka (pka1=2.67.pka2=7.3)
77.
から
76)
、アニオン型がその 6
0
"
'70%を 占 め 、 両 性 イ オ ン 型 は
30%程 度 で あ る こ と が 想 定 さ れ る ( カ チ オ ン 型 は 無 視 で き る ) 。 今 、
この薬物の摸透過が単純拡散であり、各イオン種で膜の透過速度に
大きな差はないと仮定した場合、本条件下で内部が負となるような
藤篭位を付加すれば、小胞内取り込み量は減少することが考えられ
由
42 -
る。しかしながら、バリノマイシンを用いた実際の結果では偲ら有
意な差は認められなかったことより、この薬物の摸透加速度におい
ては、アニオン型よりも両性イオンの方がかなり速いものであると
推察される。
また、このような観点に基づき、
を再考するならば、
比率は、
H 勾配の影響を検討した結果
pH5
.5 と pH7
.5 の 条 件 下 で の 両 性 イ オ ン の 存 在
[
S
]p
H
5
.5/[S]p
H
7
.5
=
2
.0
76 )
程度であり、その小胞内取り
込みの比率と良く一致している。したがって、初期時留での小胞内
への取り込みが、もつばら両性イオン種の取り込みを反映している
H 勾配位存性の担体韓送が関与するとした場
とするならば、仮に
合には、今回得られた結果以上の促進効果が克られるものと考えら
れる
o
以上のことより、これら薬物の膜透過において、
H 勾配依存性
の担体論送の寄与は小さいと考えられるが、これに関しては匁配容
在時での取り込み飽和性等、より詳細な検討が今後必要であると考
えられる。しかしながら、本纏での検討結果と第
効果を合わせて考えた場合、アミノ
I績 で の 吸 i
反抑制
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 主 た る
吸収機構としてはアミノ酸やジペプチドの担体翰送系の寄与は小さ
く、むしろ別の特殊な機構が共通する吸収経路として関与している
可能性が示唆された。
Yamashit
aら
16.
80)
は、最近ラット小麗を用いて短絡状惑での
薬物膜透過の研究を行ない、セファレキシンの吸収のうち飽和過程
を示す割合はアミノ酸や績に比べ非常に小さいことを明らかにして
いる。さらに、彼らは上皮細胞内への蓄積性について着目し、これ
は膜透過の飽和性とは別の
K
m値 を も っ 過 程 が 事 在 す る こ と を 報 告 し
ている。これらのことから、粘膜組織への蓄積に対し、さらに詳細
時
43
・輸
な検討を加えることは、これら薬物の吸収機講を考撮するうえにお
いて極めて重要なことであり、以下第班績ではこれらについての麗
々の実験結果を論述する。
時
多帯血悲痛
44 ・"
小 腸 J二 皮 細 胞 の 構 成 成 分
へ の 親 子 間 性 と 薬 物 の 吸 収
桟護者韓
薬物が消化内から吸収され紙管系に移行するまでには種々の過程
が含まれることより、吸収を論じる場合にはその各過程、すなわち
膜透過性の他、上皮組組内での挙動及び、血議中への出現などを総
合的に考慮することが重要である。第
はアミノ
I籍 、 第 E綴 に お い て 、 著 者
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 吸 収 に 管 し て 、 そ の 消 化 管 か ら の
吸収抑制効果、及び膜透過性の観点より考察を加えてきた。その結
果、これら薬物が上皮紹胞を通過する上で、最初の過程と考えられ
る小腸
BBMの 透 過 性 に は 薬 物 閣 で 大 き な 差 異 は な く 、 吸 1 & 性 に お
いて明らかにされた差異や吸収抑制効果は摸透過性のみで説明でき
うるものではないことが示唆された。
一方、第工題、第一章で議述したごとく、これら薬物の相互の抑
制効果は結膜組織中での蓄積においても間接に認められ、この両者
に何らかの関連性のあることが示唆された。また、近年、川
y
a
z
a
k
i
18 )
はアミノペニシリンであるアンピシリン、アモキシシリンが、
小腸上皮細胞中の可溶性高分子画分のーっと親和性を有することを
明らかにしており、
Y
a
m
a
s
hit
aら
80 )
はセフラジン、セファレキシ
ンの小腸吸収において、組識への蓄積が膜透過時とは別の
K
m値 を も
った飽和過程を有することを見い出している。
また、
H
e
t
zら
81 )
によって牛稗議中の可溶性画分に
L
i
p
i
dの組抱
内輪送に寄与するタンパクの寄在が明らかにされており、
82 )
、
O
c
k
n
e
rら
L
e
v
iら
83 )
によってその寄在が認められたラット貯蔵およ
び小腸組織中の遊離脂肪酸結合タンパクは、種々の有機アニオンと
- 45 -
結合することも明らかになりつつある。この識に物質の生体内移行
に際しては、ある麓の生体成分がその物質に対しての貯議庫あるい
は運擾体として寄与している例が知られており、薬物とその親和性
成分との相互作用を検討することは薬物の吸収機構を解明するうえ
で重要と考えられる。以上のことから、本穏では、小麗粘膜組識の
構成成分と薬物との窺租性を検討し、消化管吸収との関連性につい
て考察した。
章
第
ア ミ ノ
ro
牢勿墨書
β
ラ ク タ ム 系 抗 生
/
J、 毘 易 予 言 且 事 襲 来 見 不 口 1
'
主
主
既に記述したごとく、本研究で用いたアミノ
Bラ ク タ ム 系 抗 生 物
質器の吸収に見られる相互吸収寵害効果は、小腸組織内に取り込ま
れる翠において認められるものであることが、第
I、 E纏 に お け る
検討結果から推察される。
薬物の消化管吸収性を、粘膜中の種々成分との結合性によって関
連づけ、より詳縮に説明しようとする試みは、その生体膜成分の単
離、精製の手法が改良されるにつれてより多くの検討がなされてき
84 )- 88 )
た。
しかしながら、アミノ
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の よ う に 脂 溶 性 が 極
めて劣っており、吸収されにくいと考えられる構造をもっ薬物に関
して、そのすぐれた吸収性を粘膜組議中の成分との親和性の観点か
ら検討し、考察を加えている報告は極めて少ない。
このようなことから、本軍では第
I舗 で 明 ら か に し た 粘 膜 組 議 内
の蓄積性に対し、さらに詳細な検討を加える目的でこれら薬物の結
膜中での蓄積程度を、血渡中への移行量と比較することによって、
一 46 -
一麗暁らかとし、あわせて蓄積性と吸収機構の関連性について考察
した。
〈
多詰
1
箆恒
〉
ラ ッ ト 腸 管 、 脈 管 同
時 還 流 法 に よ る 吸 収
す 生 と 車 旦 特 定 / ¥ 改 : > ?帯鷲昌
89 .9 0)
薬物の吸収実験法に管しては、目的に応じて穣々の手法が
考案され、使い分けられている。このうち、血管関を還流する手法
は、管腔側から組議への移行と組識から血渡側への移行を問時に把
握できるためこれらアミノ
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の よ う な 蕗 管 趨 犠
滞留性の薬物の場合には有用な吸収実験法であると考えられる。
そこで本研究では、セファレキシン、セフラジン、アンピシリン
の吸収についてこの瞭管問時還流法を用いて検討し、消化管腔から
消失、粘膜中での蓄穣および血液側への移行速度の関連性について
考察した。本手法を用いた場合の小腸の生理機能の維持に関しては、
、 走 査 型 電 子 顕 徴 鏡 ( 日 立 S・4
50 型 ) に よ る 観 察 で 撤 緩 毛 に 形 態 学
的 変 化 は 認 め ら れ な い こ い と 、 及 び L嶋 フ ェ ニ jレ ア ラ ニ ン の 能 動 輸 送
91 )
系が保持されていること等によって確認した。
その結果、
Fi
g.20に 示 す よ う に 、 空 揚 部 を 用 い 、 人 口 血 譲 で あ る
フ jレ オ ロ カ ー ボ ン
FC-43 を 血 管 制 還 流 液 に 使 用 し た こ の 手 法 に お い
ても、これら薬物の消失は全揚管を用いた場合の結果とよく一致し、
かつ血液側への移行速度も、セフラジン>セファレキシン>アンピシ
リンの醸であり、その管控内からの消失挙動をよくあらわしている
ことが明らかとなった。
次に、小腸管控内、組寝中、血液側の薬物量を比較する目的で、
ω
匂
47
門川
{df明記¥小口}
門
口υω 必﹀。川ザロ刊 ωじロ沼
hHdJ
0.8
0.6
0.4
ω
hH
勾
門凶門凶。
0.2
込4
む川判岬川尚
0
O
10
20
30
Tエme
O
工0
20
30
40
50
60
50
60
m~n
40
100
圏一一一
、
ヮ
d
.
，
.
.
j
ロ
H
ー
d
g
ω
90
小口
~
hHMU
斗4
B
0
ω
o
h
H
ω
パ
判
ロ
80
凡問
Fig.20 工n七es七ina工 Absorp七ion of Am
pici工
工 in(
or Cephradine(0
工n 七he
Cepha1exin(
Vascu1ar1y PerfusedRa七 Jejuna工
七S
Segmen
1
℃
S
r
-
n
e
m
e
p
x
e
Each dど ug (150 pM) was recircu1a七ed 七hrough 七he in七es七ine、
Appearance in venous eff1uen七 (A) and Disappeaど ance fど om
1umen(B) are shown.
Resu1七s aど e expressed as mean of 七'¥10 or 七hree
¥
o
J
I
七 h S.E.M.
時
48
叫
本血管還流法をループ吸収実験法に適用し、これら各コンパートメ
ン ト 中 の 薬 物 量 を 認 定 し た 。 Table 3 に せ フ ァ レ キ シ ン の 結 果 を 示
す。
60分 の 吸 収 実 験 に お い て 、 車 管 制 へ の 移 行 量 の 2信 以 上 が 粘 膜
組議内に蓄積していることが明らかとなった。また、この領向は、
吸 収 実 験 30分 の 場 合 に は さ ら に 顕 著 で あ り 、 投 与 量 の
7割 が 組 議 中
に存在していることを確認している。
Table 3 Recovery and Dis七ribu
七ion of Cepha
工exin in
七he
Vascu工ar
七
Perfused 工n七es七inal Loop of 七he Ra
Percen
七 of drug
Rernained in in
七es
七inal
lurnen
23.6 土工。 5
ユ
工 a七ed in in七es七ina工
ACCurnl
rnucosa
52.0 土工 .2
u
.l
r
a
-
c
s
a
v
n
e
c
n
a
r
a
e
ゐ
D¥d
pe
Ab
23.2 土 工 .2
q
u
r
d
z
工
。
七
n
e
c
r
ム
ey
pr
Tr
e
1v
ao
七 C
oe
98.8 土 工 .0
Resul七s aど e expど essed as mean of five expeど irnen七s w工七 h
S.E.M.
Absorp七ion 七ime was 60 min. Dose in七0 七he 100p was
of cephalexin (1.0 ml).
150.~M
- 49 -
〈第
2
露首〉薬物の明支斗又'性と耳宿題莫~Jì
和議毒事雫費十生
これら薬物の吸収性と組議蓄積性との関連を明らかにする目的で、
さらにアミノ
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 吸 収 と そ の 蓄 積 に つ い て
プ吸収実験法により検討した。
j
レー
Fig.21に 示 し た よ う に 、 各 薬 物 と も
に、粘膜組織中への蓄議が見られ、かつ、吸収の擾劣と組織蓄積の
簡には良い椙関性が認められ、これら薬物の易吸収性には小腸組議
への蓄議過程が冊らかの寄与をしていることが示唆された。
〈
多諾
3
箆師
〉
蓮華物?J
o
ノj、
臨詰*且撰識がヨ
7
:
T ギ匹
の 検 討
前 節 で 認 め ら れ た 組 議 内 取 り 込 み を 更 に 詳 翻 に み る 目 的 で 、 jレー
プ吸収実験法により薬物を組畿中に取り込ませた後、結膜中に蓄額
した薬物の細胞内分布について検討した
(Table 4) 。 そ の 結 果 、
核、ミトコンドリア、鰯底形質膜及び捌子縁膜を含む酒分に分布し
ている薬物量は少なく、主として翻抱質画分にその大半が寄在して
いることが認められた。
また、小腸結膜組織の援過物をホモジナイズし、
105，000xg の 遠
心分離により、可認性画分と不溶性沈毅物に分離した後、沈毅物に
対する薬物の結合性を検討した。その結果、セフラジンのみ若干の
観相性が認められたに過ぎず、しかもこのこの親和性は次章に述べ
ら れ る 可 薄 性 画 分 に 比 べ 、 著 し く 小 さ い も の で あ っ た ( Fig.22)
さ ら に Fi
g
.23に 示 し た よ う に 、 小 腸 粘 膜 ホ モ ジ ネ ー ト を t
r
iton Xぺ
0
0で 処 理 し 、 可 港 北 さ せ た 場 合 と 未 処 理 の ホ モ ジ ネ ー ト の
105，000
50
申
叩
(完)
ロ
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)
8
0(
Fig.21 Re工a七ionship be七ween 七he Accumula
七ion in Mucosa and 七he
Disappearance or 七he Ne七 A bsorp七ion from 工n七es七inal Loop
Absorp
七ion 七ime was
30 min from jejuna1 100p (10 cm).
Doses weど e 1 m1 of 300 pM CEX(マ，す)， CED(
口 欝 )，
AB-PC(0 ，惨)， AM-PC( ム， A ) or CEZ( 惨 ).
Disappeaど ance and Ne七 Absorp七ion are shown by 七he closed
symbol and 七he opeロ symbo1，respec七ively.
.
Resu1七s are expressed as mean of 3-8 experimen七s
、
F
一 51
叫
Tab1e 4 Drug Dis七ribu七ion in 七he Various Componen七s of 工n七es七ina工
Mucosa
1a
Ih
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.
7
8
O
.判i
Drug in 1 m1 of 300 pM in modified Ringer's solutエon was
adminis七erd.
Absorp七ion 七ime was 30 min from jejuna1 100p (10 cm)。
Resu1七s are expressed as mean of four expeど lmen七s. Pro七eェ
n
was de七ermined by Lowry's me七hod.
B
i
n
d
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ga
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x
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d
i
n
e
Fig.22 The Resu工七 s of Binding Experimen七s using 七he Suspension of
工05，
000
xg pe工1et from Ra七 工 n七es七ina工 Mucosa
Resu1七s aど e expressed as mean of 七hree experimen七s wi七h
S.E.M.
勺
ι
F3
xg上 清 に つ い て 、 セ フ ァ レ キ シ ン 、 セ フ ラ ジ ン の 結 合 性 を 比 較 検 討
したところ、両者で結合能に差異は認められなかった。
Binding
o
.Am
oun
七s (戸mo
工e )
0.2
0.4
e)
n
・
工
x
悼む
4WA
C
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non 七rea
七men
七
Tri七on X-IOO
七rea
七men
七
non 七rea
七
立l
en
七
cephradine
(CED)
Tri七on X-IOO
七rea
七men
七
Fig.23 Effec七 of Tri七on X-工00 Trea
七men
七 on Binding of Cephalexin
Cephradine
Res1
.
ユ
工
七 s are expressed as mean of 七'No experェ
men七s.
宍J
アミノ
4
宣告〉善惹
つJ
〈穿露
莞寄
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 吸 収 過 程 に お い て 、 こ れ ら 薬 物 は
一過性の結援組識への蓄韻が生じていることが明らかとなった。さ
らに、この組議内へ蓄積する謹度の差がそのまま吸収の差異を反映
するものであったことより、この組識への蓄績が吸収における共通
の過程であることが示唆された。
さらに、腸管蹴同時還流法による結果において、血管倒への薬物
出現速度が定常状態に達するまでに 3
0
4
0分 要 し た こ と は ( Fig.20)
第
I議 で 示 し た セ フ ラ ジ ン 、 セ フ ァ レ キ シ ン 閣 の 相 互 吸 収 抑 制 が
2
0
.
.
.
.30分 以 降 で 強 く 認 め ら れ た こ と と 対 応 し て お り 、 か つ 組 織 蓄 積
における薬物閣の抑制効果に対しても説明しうるものと考えらえる。
また、この薬物糧議蓄積性は、第
3節 で 述 べ た ご と く 、 可 溶 性 画
分への親和性に由来するものであることが示唆された。従って次章
では、これら薬物と細胞質成分との結合性について検討した結果を
述べる。
尊霊
重詰
小 腸 組 織 可 溶 性 画 分 の 薬
物 D 皐吉舌きr月定壬うr-
o
尊 重 荷 量 と 車 高 歪 きr
多芝馬食
前章において、薬物の吸収と小揚組識への蓄積には良い相関があ
り、この組識への蓄積性が吸収過翠の中で河らかの寄与をしている
ことが示唆された。
。
c
l
<
n
e
rら
83 )
は小腸糧識可潜性画分の中に遊離脂肪酸と結合する
Z讃 自 の 存 在 を 明 ら か に し た が 、 こ の Z蛋 白 は 、 近 年 、 ス ル ホ プ ロ
- 54 -
モフタレイン等の色素やピリルピン等、種々の有機アニオンと結合
することが報告され
、その結合様式や生理的意義に関して
もしだいに明らかにされつつある。また F
eher
存 性 の 機 構 に よ っ て 吸 収 さ れ た Ca
96 )
はビタミン
D依
の組腿内結合タンパクに関して
検討し、その吸収における役割について考察しているが、近年この
ような細胞内輪送や貯議蛋白として機能する生体制の留子が数多く
報告されている。
本研究において、アミノ
Bラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 は 消 化 管 か ら 体 掻
環へ移行する過程で小腸組織内に一過性に蓄議することが明らかと
なったが、この点について、さらに結合性成分と物質吸収との関連
性を検討することは、水溶性薬物の吸収機構を解明するうえで、撞
めて重要な基礎的知見を与えるものと考えられる。したがって、本
研究では前章で得られた結果をもとに、ラット小腸粘膜組織可溶性
成分について薬物結合性成分の単離精製を行ない、次いでこのもの
への薬物の結合性について按討した。
多諾
〈
1
盤師
>- PJ 詫翠 1
'
並 立 翻 チ 示 。 〉 チ ヨp 露 盤 持 靖 塾 忌
1 ) 0 EA Eイ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
ラット小麗結摸組織ホモジネートより得た
し、
oEA Eセ jレ ロ フ ァ イ ン ( AHタ イ プ 、
1
0
5，0
0
0x
g上清に対
i.d.1.6X70c
認)カラ
ムを用いて分画し、吸着画分と非吸着画分を得た。すなわち、上清
をカラムに窓加し、
を溶出させた後、
1
0m
Hリ ン 酸 援 笥 譲 (pH 8.0) に て 非 吸 着 成 分
O
.5 Hの KC1 を 含 む 緩 笛 寂 に て 吸 着 成 分 を カ ラ ム
より溶出させた。
その結果、
Fi
g.2
4に 示 し た よ う に タ ン パ ク 量 及 び 280nm に お り る
55
Gl
10.0
1.0
@
G5
{刊号¥川
KCl
ふJ
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U
1.0
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G4
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工n七es七inal 工05，
000
q
工 U 工ofine 工on Exchange Chroma
七ography of Ra
七
Fig.24 DEAE Ce工
Superna
七an
七
He
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占
U01 O 口七
・LW1
一七
qa--or--e
zFcpbm
r
u
'
1
buffeど was 10 r
40 ml/hr and 4.0
8.0).
by Lowry me七hod and cephalexin
de七ermined by equilibrium dialysis
F
コ
f
o
吸光度より求めたクロマトグラムは、非吸着甑分として G
1か ら G3、
吸 着 画 分 と し て は G4か ら G6の 6 つ に 分 画 さ れ た 。 さ ら に 、 薬 物 結 合
G2画 分 に
活性の指標として測定したセファレキシンの結合活性は、
その大半が認められた。また、この条件で吸着成分を溶出させた後、
2
.0H ま で KC1 護 度 を 上 げ て カ ラ ム を 涜 揮 し て も 諮 出 さ れ る タ ン パ
ク成分はなく、かつ窓加した上請の鎗
o0
280nmの 85% 以 上 が こ の
条件で港出されることを確認したことより、上請に含まれる大半の
成分が本実験条件下で回収、分離され、カラムに吸着し溶出されな
い成分は少ないことが推察された。また、セフラジン、アンピシリ
ン 、 ア モ キ シ リ ン の 結 合 活 性 も G2圏 分 に そ の 大 部 分 が 認 め ら れ 、 他
の画分には結合しないことも確認している。
したがって、次にこの G
2薗 分 を 集 め 、 セ フ ァ デ ッ ク ス G 50に よ る
輔
ゲル謹過を行なった。
2) セ フ ァ デ ッ ク ス G 50ゲ ル ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
帽
前 項 で 得 ら れ た セ フ ァ レ キ シ ン 結 合 性 画 分 (G
2蕗 分 ) に 対 し 、 ス
ペクトラ/ポア
6 (m.w
.cutoff 2.000) 透 折 援 を 用 い て 脱 塩 、 凍 結
乾 操 後 、 セ フ ァ デ ッ ク ス G・5
0 (Fine. i
.
d
. 2.5
x65cm
)カラムに
てゲル議過を行なった。
Fig
.25に そ の 結 果 を 示 し た
が、溺定波長
280nm、 215nmで の 吸 光
度 、 及 び Lowry 法 に よ る タ ン パ ク 濃 度 の ク ロ マ ト グ ラ ム か ら f
a、 fb、
f
cの 三 つ の 蕗 分 に 分 離 す る こ と が で き た 。 こ れ ら 三 つ の 画 分 の う ち 、
f
a、 f
bは 280n扇
、
215nmで の 吸 光 度 及 び タ ン パ ク 濃 度 と も に そ の ク
口マトグラムが一致することからタンパク性の物質であることが示
唆された。
一方、これら三酷分をそれぞれプール、そのセファレキシン結合
57
C
F
T
-
b
r
z
0.3
ー
0.2
け
0.5
ヰJ
o
.工
。
」
ー
ベ
信 明 。 パ 40hM
仏
mwucdAMOωAd
~
50
30
Frac七ion
ω
{
。
同
O
dMc
m
v
υ
c
o
υ
明パ叫
)沼田ロ。∞内
(七回目¥⑦祭) C C
IL-
0.4
人
)
i
(
γ
人
}gcm 円 内 、 {
工.0
30
.
.
.
.
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90
工
工0
V喝.
.
.
.
ZMg}
ロ
明 X C門勾ぷぬcu
工0.0
t
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.
4
0
勺 -
:
s2
-0.0
。
a
:
J
ど oma
七ography of Ra
七 工n七es
七ina
工 工05，
000
工on Exchange Ch
q
x
七ion Chroma
七ography of G2 Frac
七エ on from D
EAE
Fig.25 Ge1 Fi工七 ra
Superna
七an
七 on Co
工umn of Sephadex G-50
F10w ra七e was 10-12 m1/hr and 七he eff1uen七 was co11ec七ed
in 4.0 m工 fど ac七ions.
Eff1uen七 was 10 mM phospha七e buffer (pH 7.4) con七aining
0.1 M NaCl. pro七ein was de七erm工ned by Lowry method.
ー
活性を検討した結果、
58 ・
f
b画 分 に 最 も 大 き な 活 性 が 認 め ら れ た こ と よ
り、 G
2薗 分 で 得 ら れ た 薬 物 結 合 活 性 は fb画 分 に 由 来 す る も の で あ る
ことが明らかとなった。
また、
H
i
y
a
z
a
k
iら
18 )
は、ラット小腸組織可溶性画分をセファデ
ツ ク ス G-75に て 分 画 し 、 そ の 中 の 低 分 子 量 フ ラ ク シ ョ ン F1に こ れ ら
薬 物 が 結 合 す る こ と を 見 い 出 し て い る 。 そ こ で 本 研 究 で 得 ら れ た fb
麗分とこのれの相向性を検討するため、セファデックス G 7
5に よ り
岨
分 取 し た F1を さ ら に セ フ ァ デ ッ ク ス G-50カ ラ ム に て ゲ ル 謹 過 を 行 な
ったところ、
fb薗 分 の 溶 出 す る 位 置 に そ の 大 半 が 溶 出 さ れ 、 加 え て
高い結合性を有することが認められた。この結果より、今回得られ
た fb極 分 は F1中 の 主 要 成 分 で あ る こ と が 明 ら か で あ る 。
3) S 0 S ポ リ ア ク リ jレ ア ミ ド ゲ ル 竃 気 泳 動
得 ら れ た fb画 分 に つ い て S 0 S ポ リ ア ク リ jレ ア ミ ド ゲ jレ 電 気 泳 動
(808
輔
P
A
G
E
)を行ない、分子量の推定と純度検定を行なった。
P
A
G
Eは 8
t
a
n
kら
808-
97 )
の方法に準拠し、染色はクマシープリリアント
ブルー染色法を用いた。
その結果、
fb画 分 は 推 定 分 子 量 1
5，000の 単 一 な 主 要 バ ン ド と し て
検 出 さ れ た ( Fig.26)
4) 精製の結果
105，000 xg 上 清 か ら の fb薗 分 の 詣 製 結 果 を Table 5 に ま と め て
示した。
L
o
w
r
y法によって求めたタンパク質量を分母とする結合比
活性は、上請に比べ最終的に約
製されていることを確認した。
100倍 の 上 昇 が 認 め ら れ 、 高 度 に 精
F
QJ
コ
2.5K 6.2K 8K 工4.4K 17K
型 宇竺空空竺竺
S七andard
Protein
fb Frac七ion
1.5K
Fig.26 SDS PO工yacry1amide Ge1 E工ec七rophoresis of fb Frac七ion
ob七ainedby Ge1 Fi工七 ration on Sephadex G-50 Co1umn
12.5 % acど y1amide gel (acry1amide:Bis，20:1) con七ained
8 M urea. Running buffer was 0.1 宅 SDS，0.1 M H3P04/Tris
(pH 6.8).
Mo1ecu1ar Weight Marker 工
ロ (
Fu11
くa A
G，) was used as s七andaど d
pどO亡 ein. Samp1e was disso1ved in O.OlM H3P04
/
Tris (
pW6.8l
con七aining 1 % SDS，8 M urea and 1 宅 2-mercap七oe七hano1 and
hea七ed 七o 600 C for 10 min.
一 60 -
Tab1e 5 Purifica
七ion of Cepha1exin-Binding Pro
七ein from 七he Ra
七
工n七es
七ina
工 Solub工e Frac七ion
工
工6.47
工0.6
Lyophi1ized prepn.
4.76
18.5
工8.49
工
工 .9
0.52
エ8.0
工68.0
工07.7
zeJ
F30
--l
G七
hb
C}rt
e
、
on
エ9.4
c
xa
er
df
a
5 6工
pf
DEAE-Ce工1u工ofine
( G2 frac七ion
匂
七)
1.56
Specific ac七ivi七y was measured by equilibrium dialysis using 七he
七ion of pro
七eエ
ロ was de七ermined by 七he
dialysis cel1. The conen七ra
me七hod of Lowry e七 al.
n
o
a
占
-
・工手ム
cd
・
品
工
f0
、
uf
r
P
占
J
工00.0
cy
q
，
、
305.2
(き)
-L七 m
ム・エ//
g
・工 V 1
Yie工d
SA(
105，
000 xg Sup.
To七a工
Pro七eln
( mg )
C o
eエ
七m
・
ph
cn
Purifica
七ion s
七ep
・- 61 -
2
〈第苓
箆 官 > - f b酷 雪 分 へ の 薬 物 事 吉
前 節 で 得 ら れ た fb頭 分 へ の 薬 物 結 合 の 特 異 性 を 、 種 々 の
~、
E二
コ
1
'
さ
を
3ラ ク タ
ム系抗生物質を用いて検討した。
それらの結果を F
ig，27に 示 す 。 消 化 管 か ら 容 易 に 吸 収 さ れ る 両 性
イオン型
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 は 、 ペ ニ シ リ ン 系 、 セ フ ァ 口 ス ポ リ
ン系ともに高い結合性を示すことが認められた。一方、これに対し
てj
帯化管からの吸収が悪く、臨床的には注射剤として使用されてい
るセファゾリン、セファロリジンの結合は全く認められなかった。
このことより、これら薬物の消化管吸収遺程において認められた
結膜組織内への蓄積は、この f
b函 分 と の 結 合 に 起 因 す る も の で あ り 、
照時にこの結合性は薬物吸収の難易性を良く反映することが強く示
唆された。
く重詰
3
露釘〉手号
察
署Z
薬物の小腸粘膜組簸可溶性爵分への親和性について検討した結果、
これら両性イオン型のアミノ
3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 は 、 可 溶 性 画 分
中の一つである f
b画 分 に 高 い 結 合 性 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た 。
この f
b薗 分 は 、 可 溶 性 画 分 か ら D E A E イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ
イ一、セファデックス
G5
0ゲ jレ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に て 高 度 に 精 製
暢
され得る、推定分子量約 1
5，0
00の ポ リ ペ プ チ ド で あ り 、 こ の も の と
の薬物結合が、吸収機構に大きな役割を担っていることが充分に推
察された。また、この結合性は、アミノ
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 に 共
通 し た も の で あ る こ と も 第 2節 の 結 果 に よ り 示 さ れ 、 こ れ ら 薬 物 の
吸収機構を明らかにするうえで極めて重要な知克と考えられる。
ウム
r
o
Binding Ac七ivi七y ( nmo工ejmg pro七ein
エ00
O
200
a
1
AB-PC
AM-PC
-f・ ff~:~:~:;:・.・:::・.
.
・.
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AC-PC
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CEX
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;
3
5
j
j
認j
j
3
2
5
3
3
3
j
j
j
j
言
動
CEZ
N.D.
CER
N.D.
-
Fig.27 Binding Behaviour of β-Lac七am An七 ibio七ics 七o fb frac七ion
Resu1七s are expressed as rnean of 6-12 experirnen七s wi七h
S.E.M.
司
r
o
d
しかしながら、結合のみられた薬物聞において、結合選と吸収性
との題に明確な相関性は見られず、吸収程度の差異を一部反映して
いない誼も認められた。すなわち、アンピシリン、アモキシシリン
の結合量は、その吸収性から考えた場合、セフラジン、セファレキ
シンよりも小さくなることが予想されるが、実際の結果はほぼ間程
度 の 結 合 性 を 示 し た 。 こ の こ と よ り 、 薬 物 に 対 す る fb頭 分 の 最 大 結
合能、及び結合定数の違い等、結合の特性をさらに考察する必要が
あるものと考え、次の第三草において、結合特性の点より検討を加
えた。
多諾
尊重
f b画 分 へ の 薬 物 結
~
f
乍 用 と 結
~
け る 相 互
第
E二3
Cコ
4
こ
d三
宝
特 性
I露 、 第 E騒 に お い て 、 著 者 は ア ミ ノ Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の
消化管吸収で認められた薬物相互の吸収抑制の主要因が、アミノ酸
やジペプチドの担体翰送系を介した現象とは考えにくい点について
言及した。これらのことについて、さらに、本研究で明らかとなっ
た
f
b麗 分 へ の 薬 物 結 合 性 の 観 点 か ら 検 討 を 加 え る こ と は 、 吸 収 に お
ける共通した機構を明らかにするうえで極めて重要と思われる。
また、それと同時にこの結合性に関する特異性、すなわち、最大
結合能や、結合定数等のパラメーターを得て、その親和性を定量的
に解析することは、これら薬物の溜胞内移行過程を解明する一助と
なり得るものと思われる。
こ れ ら の こ と よ り 、 本 研 究 で は 薬 物 の fb画 分 の 結 合 特 性 に つ い て 、
主に薬物関相互の結合阻害及びジペプチド等の影響等の観点より検
討した。また同時に、結合定数等の算出を通じて吸収に及ぼす結合
明
64
・ 愉
性の寄与についても考察した。
多誇
〈
1 宣告
先ず最初、第
蓮 華 物D 毘 雪 キ 自 主 主
〉
o
串吉
~
c
コ
二
長思 害容
I糧 に お け る 吸 収 実 験 で 、 相 互 に そ の 吸 収 を 顕 著 に 抑
制したセファレキシン、セフラジンを用いて結合阻害実験を行なっ
た。すなわち、セフラジンを阻害物質とし、共穿護度を種々変化さ
せて、セファレキシンの
f
b画 分 へ の 結 合 に 及 ぼ す 隠 害 効 果 を 検 討 し
た 。 そ の 結 果 を Fi
g
.28に 示 す 。
セファレキシン濃度
倍、
20μ" に 対 し 、 セ フ ラ ジ ン を そ の 5倍、 10
2
5倍 量 (100μ 付、 200μ 問、 500μIII ) 共 存 さ せ た 時 、 セ フ
ァ レ キ シ ン の fb頭 分 へ の 結 合 は 有 意 に 抑 え ら れ 、 か つ 、 そ の 阻 害 は
共事セフラジン謹度に強く低寄することが認められた。
したがって、次に各薬物閣における結合阻害について検討を進め
た。阻害薬物の濃度は、セファレキシンに対するセフラジンの抑制
結果に基づき、各々
500μ" と し て 行 な っ た 。 ア ン ピ シ リ ン 、 ア モ
キシシリン、セブラジン、セファレキシンの各々について検討した
結 果 を Fi
g
.29に 示 す 。
f
b画 分 に 対 す る 各 薬 物 の 結 合 は 、 i
n situ 還 流 法 に よ る 吸 収 実 験
の結果と同様に、いずれの薬物も相互に結合を隠害することが明ら
かとなった。一方、
fb画 分 に 対 し 情 ら 結 合 性 を 示 さ ず 、 か つ 、 消 化
管から吸収されないセファゾリンは、セファレキシンの結合に関し
て全く影響を及ぼさないことが認められた。これらの結果は、吸収
抑制をみた第
I縞 に お け る 実 験 事 実 を 説 明 し う る も の で あ り 、 ま た
同 時 に 、 吸 収 性 と fb画 分 へ の 結 合 能 の 有 意 な 相 互 関 係 を 裏 づ け る も
のとして非常に興味ある知見と思われる。
- 65 -
Binding ac七ivi七y ( nmol/mg pど 0七ein
O
50
100
150
200
con七rol
CED
CEX
500(~ユ M):20(1ユM)
200
20
100
20
Fig.28 Effec七s of Various Concen
七ra
七ions of Cephradine on 七he
Binding of Cepha工exin 七o fb Frac七ion
Resul七s are expressed as mean of 3-4 expeど imen七s wi七h
S.E.M.
Binding ac七ivi七y was measured by equilibrium dialysis me七hod.
明
66 -
Binding activiヒy ( nmo1jmg pro七ein
200
100
O
con七ど。 l
CEX
(
20 ~ユM)
.
]M
)
wi七h AC-PC (500 ユ
¥
"
i七h CEZ
(500 ロ
M)
)M
)
wi七h CED (500 ユ
ェ
。
con七r
CED
with AC-PC
(500~)
(
"
2
0 ~)
W l七h
AM PC
四
(20ユ
.
]M)
CEX (500 ユ
.
]M
)
con七ro1
wi七h AC-PC
(500 .p.M)
wi七h CEX (500 }
l
M
.
)
wi七h CED (500 ユ
)M)
AB-PC
c
( 七ど 01
wi七h AC-PC
(500 P
.
M
)
(20p-~
土七 h
CED(
500 凶1)
土七 h
CEX (
5
0
P
.
M
)
Fig.29 工nhibi七ion Behaviour among 出 nino s Lac七am An七 ibio七ics
司
rimen七S '
N
ith
Resu1七s aど e expressed as mean of 3 8 exue:
叩
S.E.M.
- 67
申
2 宣 告 〉 薬 物 の f b画 分 へ の 結
く 第
.
.
L
:
:
>
.
、
Eご3
に 対 す る ア ミ ノ 酸 、 ジ
〆 丈 ブ ー ヲ 二 ド 実 質 改 〉 鷺5
2 墾華
薬 物 の 吸 収 特 性 と fb酒 分 へ の 結 合 性 と の 関 連 を よ り 明 ら か に す る
目 的 で 、 セ フ ラ ジ ン 、 セ フ ァ レ キ シ ン の fb結 合 に 及 ぼ す
2.3の ア ミ
ノ畿、ジペプチドの影響について検討を加えた。その結果、
Fi
g
.30
に示したように、セファレキシンの結合に対してジペプチドの L
闇
C
a
r、 G
l
yG
l
yは共穿漉度 2
.5 IH 、 500μ" と も に 著 し い 結 合 抑
‘
最jを 示 し 、 ア ミ ノ 酸 で あ る
LP
h
e、G
l
yは殆ど影響を与えないこと
帽
が認められた。一方、セフラジンの結合に関しては、セファレキシ
ンと同様な傾向は示すものの、その阻害の程度については、大きい
ものではなく、むしろ吸収実験の結果と対応することが認められた。
(Fig.31)
〈
芸高
3
貿信
〉
主主三イ本語雲~
- n - 守 三 事 高 歪 さi ~l主主蛍安全世
コ
Y由 仁3
つ
ア
A N S O f bi!罰タミ?
へ の 結 合
fb酒 分 と 薬 物 の 結 合 様 式 を 明 ら か に す る 目 的 で 、 近 年 、 こ の よ う
な種々の生体高分子との結合性について検討されている蛍光性プ口
ー プ A NS
検討した。
98 .9 9
)
(1Anilino-8ωnaphthalene-sulfonate)を 用 い て
幽
ANSは高分子の諜水性鎮域に結合することにより、そ
98 )
の蛍光強度を増大させる
ことから、種々の高分子一程分子閣の
92 )
相互作用を解析する手投として汎用されている
これらの結果、
。
ANSは 他 の 生 体 高 分 子 同 様 に fbに 結 合 し た も の の 、
これら薬物を高濃度に存在させた場合でも、その結合に由来した蛍
- 68 -
Binding activity (
n
r
n
o
l
/
r
n
g protein)
O
100
50
150
200
CEX con七rol
(20 uM)
with L Car
叫
(2.5 mM)
VA
Tム
G、j
r閥
4
ぺ
rt
、
ム
UCJ
円
n
.工
﹂
↑W
with L-Car
(500 uM)
VA
可
ム
G)
V4U
円U
-M
可
ム
'nqd
GO
七(
.工
W
with Gly
(500 uM)
with L Phe
叩
(500 uM)
Fig.30 Effec七s of L Car，G工y-Gly，Gly and L-Phe on Binding 七o fb
叩
Frac七ion of Cephalexin
Resu工七 s are expressed as mean of 3-4 expeど irnen七s wi七h S.E.M.
Binding ac七ivity (
n
m
o
l
/
r
n
g proヒein)
O
50
100
150
200
CED control
(20 uM)
wi七hL-Car
(2.5 mM)
Y
1
-
G)
ウ
ゐ
r捌
τム
円
bqd
n
、
Ltf
.
工
W
with L Car
申
M
司
Y
Yム
G)
噌
ム
γ-u
Funu
nu
-nqd
W
七(
エ
.
(500 uM)
with L Phe
叩
(500 uM)
Fig.31 Effec七s of L-Ca
，
ど Gly G工y，Gly and L-Phe on Binding 七o fb
叩
Frac七ion of Cephradine
Resul七s are expressed as mean of 3-6 expeど lrnen七s wi七h S.E.M.
QJ
r
o
光強度変化量の増大は認められず、これら薬物の結合議式は
ANSの
結合様式とは異なるものであることが明らかであった。
く第寄
4
宣 告 〉 薬 物 の 車 吉 舌 きr オ 意 是 正 丈 と 邸 主 斗 又
特 性
第
E 議 、 第 二 軍 に お い て 援 に 述 べ た よ う に 、 fb薗 分 へ の 各 薬 物 の
結合性は、その吸収の難易性をよく反映するものの、薬物間での吸
収性の差異との相関においては一部相違していることが認められた。
この理由として、
f
b画 分 の 薬 物 に 対 す る 結 合 特 異 性 ( 最 大 結 合 能 、
義組性)が異なることに基づく可能性が考えられる。そこで薬物と
してセファレキシン、アンピシリンを選び、麗々の薬物謹度におけ
る結合最を求めることにより、これら薬物の f
b画 分 に 対 す る 結 合 能
に つ い て 定 量 的 な 解 析 を 行 な っ た 。 そ の 結 果 Fi
g
.32に 示 す 。
スキャッチヤードプロットにより示されたこれらの結果において、
セファレキシンはその結合に二椙性が認められたのに対し、アンピ
シリンにはセファレキシンの低い親相性に椙当する結合様式のみが
存在していることが明らかとなった。このことは、両薬物における
吸収性の優劣をよく説明し樽るものと思われる。
く算事
5
室釘〉若雪
霧零
本章では、先ず初めに薬物の相互吸収抑制に対する機構を解明す
ることを目的として、
fb画 分 を 用 い て 薬 物 の 椙 互 結 合 阻 害 に つ い て
検討を加えた。
In situ 吸 収 実 験 で 相 互 に 吸 収 を 抑 制 す る こ と が 認 め ら れ た こ れ
70
CEX
工.
0
、
@
E
議
'
!
i
\~
0.8
陰
•
、
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F叫
0.6
~
=7.29X 工o 5 (M-1)
¥明
工 /Kd1
~
々
悶
~
c
悶ゆ
】
与4
、
、
0.4
ロ
P
匂
=6.52X 10 4 (M-1)
唱
工 /Kd
2
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1
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3
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0.2
長
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長~
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恐喝@司、
2
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l
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1.0
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々川崎
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8.93x工O 4(M
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繭盟、
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繭凶鳳凶
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坦
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札市繭凶
鳳凶開制
禍噛
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仇町
明妙
闘洲、府噌
拘
1
82﹄
'sstE
C20伺
¥@
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円
¥円以
由
工 /Kd
E
塁
2
3
4
Bound ( )
1
M
/
l
ユM protein
5
Fig.32 Sca
七chard Plo
七s of Am
pici工
工 in and Cephalexin Binding 七。
ぷ
ムs e
oσfn
ue亡
nr
n
勾
O qdd
AZ L
ロロ d
d
七σ
℃
e-LO
QL
ロ
C、
0 ・
le
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CBm
七
・
一
・
aos
ru
fb Frac七ion
1
M
.
AB PC or CEX was 3 100 1
'
t
l
eど e de七ermined bv equi1ibrium dia1vsis
dia1γsis ce11.
叩
司
I
勺
1
4
ら薬物においては、いずれも相互に f
b画 分 へ の 結 合 を 臨 害 し 、 か つ 、
その閤害の程度は障害物質の議度に依存していることが示唆された。
さらにまた、
fb画 分 へ の 結 合 が 全 く 認 め ら れ ず 、 そ の 吸 収 性 も 著 し
く劣っているセファゾリンは、これら結合阻害効果に対して全く影
警を与えないことも暁らかとなり、椙
E
Iの 吸 収 抑 制 効 果 を 良 く 説 明
し得るものであった。これらの結果より、薬物の吸収機構における
fb画 分 へ の 結 合 が 大 き く 寄 与 し て お り 、 か つ 、
共通する過程として、
吸収の霞劣に対し重要な役割を担っていることが強く示唆された。
一方、セファレキシン及びセフラジンに対し、
L Car 、 Gly-Gly
幽
が高濃度共存下で、著しい結合阻害を示したことより、第
I縞 で 明
ら か と な っ た セ フ ァ レ キ シ ン に 対 す る L-Car の 吸 収 抑 制 は 、 こ の fb
画分との結合を抑制したことに基づいている可能性も考えられる。
ここで、
L-Car 、 Gly Gly は 消 化 管 内 で 加 水 分 解 を 受 け に く い ジ ベ
削
100.101)
プチドであるが
、このうち、
Gly Gly は 管 腔 か ら 上 皮 縮 臆
働
内 に 取 り 込 ま れ た 後 、 ジ ペ プ チ ダ ー ゼ に よ っ て 、 速 や か に Gly に 分
10 0)
解されることが知られている
の形で存在する割合は少なく、
。 し た が っ て 、 細 胞 内 に Gly-Gly
i
n vivo に お け る 実 験 で は 、 結 果 的
に Gly“ Gly に よ る 吸 収 抑 制 は 生 じ 得 な い と 考 え ら れ る 。 こ の 点 、
i
n vitroに お け る GIY-Gly 及 び Gly の 結 合 実 験 の 結 果 は 、 空 踊 上 部
での結果を除き吸収実験の結果と矛盾するものではない。
し か し な が ら 、 セ フ ァ レ キ シ ン に 対 す る い Car の 吸 収 抑 制 効 果 は
6.0mH共 存 時 と 10.0mH共 穿 時 で 間 程 度 で あ り 、 明 確 な 濃 度 依 存 性 は
見られていないこと、また第
セファレキシンは
この
H
E穏 で の 震 小 鹿 を 用 い た 換 討 に よ り 、
H 勾配による取り込み促進が認められ、かつ、
勾配の効果はジペプチドにおいても報告されていること等
勺 Jh
，
守
を考慶すれば、セファレキシンは一部ジペプチドの韓送系によって
吸収される可能性もあり、現段階では明確に結論づけることはでき
ない。
し た が っ て 、 本 研 究 で 得 ら れ た fb圏 分 へ の 薬 物 結 合 に 対 す る ジ ペ
プチド高濃度共存時の影響については、今後吏に詳細な検討が~\要
であると思われる。
さ ら に 、 こ の fb画 分 へ の 結 合 を 薬 物 謹 度 を 変 え て 結 合 能 を 求 め た
実験結果において、セファレキシンとアンピシリンでその結合様式
に違いが晃られたことは、
20μm 濃 度 に お い て fb画 分 と の 結 合 性
が吸収性の差異を一部反映していないことに関して、一つの説明を
成し得るものであった。
ま た 、 こ れ ら 薬 物 の fb
へ の 結 合 様 式 は 、 蛍 光 性 プ ロ ー プ A NSの
結合に代表される諜水性の椙互作用とは異なるものであったこと、
さらに、両性イオン型薬物に特異的なものであったことより、解離
基の双方がその結合にあずかっている可能性も考えられ、極めて興
味ある知見と思われる。
勺，
可J
壬
，τま = 雲 L : : : . .
fl'1QロFm
以上、著者は三編にわたり、アミノ
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 消 化
管吸収機構を明らかにする目的で鍾々検討した結果を記述したが、
以下にこれらを要約する。
I. ア ミ ノ Bラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 吸 収 に お け る 相 互 作 用
薬物の吸収機構を解明する目的で、薬物の吸収に及ぼす種々の物
質 の 影 響 に つ い て In si
tu 腸 管 還 流 法 を 用 い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 、
薬物関栂互において吸収抑制効果が認められ、とりわけシクラシリ
ンによる抑制効巣は極めて著しいものであった。また、この椙互作
用は薬物の粘膜組識内への蓄積においても問時に認められ、これら
の薬物は組織内への蓄積過程において、何らかの共通した機構を有
すると考えられた。
一方、これら薬物の吸収に対してアミノ援やジペプチドは一部を
除さ有意な影響を及ぼさなかった。一般に担体翰送系においては、
物質の吸収阻害を速度論的に解析する場合、臨書物質の護度はその
K
i値 を 考 躍 し て 選 択 し な け れ ば 、 顕 著 な 阻 害 効 果 を 観 察 で き な い と
考えられる。本研究で用いた盟害物質の議度は、文献値からではあ
るが、充分にその効果を確認できうる譲度であり、この条件で紐害
効果が見られなかったことは、これらアミノ援やジペプチドの議送
系を介して薬物が吸収される可能性は掻めて小さいことが示唆され
た。加えて、小腸部位を湿定して各部位での吸収性を検討した結果、
十二指鶴、空揚上部でシクラシリンセフラジンの吸収を著しく抑制
したのに対し、
Gly-Gly は 空 腸 上 部 に お い て の み セ フ ラ ジ ン の 吸 収
- 74
時
を阻害したに過ぎなかった。
以上の結果から、薬物極々にみた場合若干の違いはあるとしても、
これら一連のアミノ
Sラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 吸 収 に お け る 共 通 し た
過程には、ジペプチド等の担体輸送系とは異なった機構の存在する
ことが示唆された。
I. 小 蕗 樹 子 議 膜 小 胞 を 用 い た 薬 物 の 摸 透 過 性
次に、これら薬物の膜透過における担体翰送系の関与についてさ
らに詳翻に考麗する目的で、小腸劉子縁膜小胞を用いて薬物の取り
込みについて検討を加えた。本手法は翻胞成分のうち麗系だけを取
り出して検討できる点で直接的に膜透過性を考察できる方法である
ことが認められている。
その結果、従来より担体輸送系の寄在が明らかとなっているト
Ala 、 L-Phe に 比 べ 、 検 討 し た 薬 物 は い ず れ も 担 体 韓 送 系 の 存 在 を
示すものではなく、むしろその脂溶性等物理化学的佐賀に依存し
た単純拡散により膜を透過するものであることが強く示唆された。
この結果は、第
I績 で 得 ら れ た 結 果 と 合 わ せ て 考 察 し た 場 合 、 薬 物
の相互吸収抑制は、担体鎗送系とは異なった別の機序を想定しなけ
れば説明し得ないことを示唆するものであった。
i
l
l
. 小腸上皮細胞の構成成分への親和性と薬物の吸収機構
薬物の吸収抑制効果が粘膜組議内取り込みにおいても認められた
ことより、薬物の組織蓄積性と吸収との関連について、ループ吸収
実験法、腸管蹴管同時還流法を用いて検討を加えた。その結果、
﹁J
F
ゥ
，
アミノ
Bラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 は い ず れ も 消 化 管 控 よ り 速 や か な 消 失
を示す一方、その
2/3近 く が 組 織 内 に 蓄 積 す る こ と が 明 ら か と な っ
た。また、この蓄額はその大半が組識ホモジネート 1
05，000 xg上 清
(可溶性画分)に由来するものであったことより、この可溶性画分
について薬物結合性成分の単離を試みた。その結果、最終的にセブ
ァ デ ッ ク ス G寸 Oに よ り ゲ jレ 漣 過 を 行 な い 、 分 離 し た 画 分 ( fb画 分 )
に高い結合活性が見いだされた。また、このものに対する各薬物の
結合性は、その吸収実験の結果を良く説明し得るものであった。こ
れ ら の 結 果 よ り 、 こ の fb臨 分 と 薬 物 の 相 互 作 用 が 、 こ れ ら 薬 物 の 吸
収機構において、共通した特性であると考えられた。
即 ち 、 こ の fb画 分 と の 結 合 性 は 、 小 腸 組 識 へ の 薬 物 の 蓄 積 の 大 き
く寄与していることが認められたが、このことは問時に薬物簡椙互
の 吸 収 抑 制 効 果 と fb薗 分 へ の 結 合 特 性 が 、 良 く 一 致 し て い た こ と に
よ っ て も 裏 づ け ら れ た 。 一 方 、 吸 収 性 の 劣 る mono-basicな
ム系抗生物質は、
Sラ ク タ
fb画 分 に 対 し て 殆 ど 結 合 を 示 さ ず 、 こ の 点 か ら も
fb薗 分 と の 結 合 性 が こ れ ら 薬 物 の 吸 収 性 に 大 き く 寄 与 し て い る 要 思
の一つであることが強く示唆された。
以上、著者は両性イオン型構造を有するアミノ
Sラ ク タ ム 系 抗 生
物質の消化管からの吸収性を支配する要閣に関して種々の検討を行
ない、その結果について考察してきたが、想定しうる吸収機構につ
い て Fig.33に 模 式 留 と し て 示 し た 。
既に述べたように、近年、物質の組臆内移行に擦し、ある撞の生
体高分子が物質の貯議、あるいは翰送に大きく寄与する倒が多く認
め ら れ て き た 。 本 研 究 に お い て 得 ら れ た 薬 物 と fb画 分 と の 結 合 に 関
する種々の結果は、こうした薬物の細胞内移行過翠を考察するうえ
で 極 め て 重 要 な 知 克 で あ り 、 薬 物 の 吸 収 性 や bioavail
abiIity の
76
評価、並びに消化管吸収機講の解明に、貢献し得るものと考える。
Zwi七七 erionic s-工ac七出立 @
，
an七土bi。七 ics;
ICEX，ACPC，CED，
I
ICDX，
Fig.33 Schema
七ic Diagram of Possible Absorp
七ion Mechanism
七
ノ
J
BLOOD
﹃
.¥、
O
O寸
、
乃(盟︿にす
O
一
三
十
一
ロO¥.
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〆
2
LλTERALBASAL
。
MUCOSAL CELL
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4
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一
B
C l、
，
一
ナム一
M
一
f1・P
LUMEN
ー 77 -
議す
舌辛
譲りに臨み、本研究に際して隷始榔懇駕なる翻指導、錦鞭達を賜
わりました北海道大学
有国隆一教授、並びに北海道大学
石井信
一教授に衷心より深甚なる謝意を表します。
また、種々の有誌な槌教示と御指導を戴いた北海道大学
宮崎勝
己助教授に深謝いたしますとともに、多くの榔助言卸翠達をいただ
きました北海道大学医学部附属病院薬剤部の諸先生方に厚く御礼申
し上げます。
さらに、実験の一部に劉協力戴いた宮本美恵学士、家村明宏箆士、
世良仁美学士、砂田恭子修士、森
感謝いたします。
健一欝士、古川卓哉学士に潔く
- 78 -
言芝
多
言2 馬食
算事工和語
馬食
コ
。
音B
OJ 音β
[I] 薬 物 の 消 化 管 吸 収 な ら び に 他 の ア ミ ノ Bラ ク タ ム 系 抗 生 物 質
の影響
(1 ) 薬 物 ラ ッ ト 小 腸 か ら の 吸 収 と 薬 物 閣 の 吸 収 抑 制
a) 試 薬 及 び 試 料 の 譲 製
アンピシリン
(Ampicillin anhydrous) 、 シ ク ラ シ リ ン (Cycla-
Ii
n anhydrous) は 武 田 薬 品 よ り 供 与 さ れ た も の 、 ア モ キ シ シ リ
c
iI
ン
(Amoxicillin trihydrate) 、 セ フ ァ レ キ シ ン (Cephalexin m
o
-
n
o
h
y
d
r
a
t
e
)、 セ フ ラ ジ ン (Cephradine dihydrate) は そ れ ぞ れ 協 和
発酵、塩野義製薬、三共より供与されたものを用いた。他の薬物、
試薬は全て局方品あるいは市販特級品を用い、その溶液は蒸留水
(比抵抗約
500x1
0
Q ・調以上)にて調製した。通常薬物は
H
o
d
i
f
i
e
dR
iト ger.
s溶 液 に 溶 解 し 、 試 料 溶 渡 と し た 。
b) I
nS
i
t
u吸収実験法
体 重 160-220gの 引
s
t
a
r系 雄 性 ラ ッ ト を 実 験 前 1
6
2
0時 間 絶 食 し 、
エ ー テ ル 及 び ペ ン ト パ jレ ピ タ ー ル ( 30 4
5 mg/kg) で 臨 酔 後 固 定 す
幽
る 。 腹 部 正 中 譲 に 沿 っ て 開 捜 し 幽 門 部 と 回 雷 接 合 部 よ り 10CT
l手 前 に
明
79 -
カ テ ー テ jレ を 挿 入 し 、 結 索 す る 。 臨 汁 の 影 響 を 除 外 す る た め 胆 管 も
同時に結禁しておく。生理食塩水で小腸内を洗習後、カデーテルを
還流ポンプ(東京理化器域社製ガラス鍛量定量ポンプ)に接続し、
薬 物 を 含 ま な い Hodified Ringer's 30m i 2 で 腸 管 控 内 を 洗 j
争する
(流速
毎分
5.0m
Q/min) 。 次 い で 、 37" c に 加 温 し た 薬 物 試 料 溶 液 50m
Qを
5 mi
nの 速 度 で 連 続 還 流 す る 。 還 流 開 始 10、 20， 30， 45、 60分
後 ま た は 10、 20、 30、 40、 50、 60分 後 に 譲 溜 め よ り
O
.2m
Q採 取 し 、
薬物の定量に供した。
尚 、 ア ン ピ シ リ ン の 吸 収 実 験 で は 、 還 流 開 始 60分 後 に 腸 管 内 の 還
流渡をできるだけ回収し、次いで生理食塩水で装置及び腸管内を洗
静後、洗液を還流液に加え全量を
100m
Qと し 定 量 に 供 し た 。 吸 収 量
は、原渡と回収液中の薬物量の差から算出した。
実 験 中 は 、 ラ ッ ト 背 部 を ヒ ー タ ー に て 加 温 し 、 体 温 を 37"c前後に
保った。
c) 薬 物 の 定 量 法
採取した還流渡試料は、それぞれの薬物の内部課準溶接と
混 合 し た 後 、 メ ン プ レ ン フ ィ ル タ ー ( TH 2，
四
1:1に
O
.45μm，TOYO，Co.，
)
にて謹過し定量した。
薬物は全て、以下の条件下、
u
vモ ニ タ ー ( 目 立
器とした高速液体クロマトグラフィー
以下にその分析条件を示す。
638・ 4
1型 ) を 検 知
(HPLC) に て 分 離 定 量 し た 。
・
-
appara七us
申
Hi七achi 638-50 high performance liquid chroma七ography
s七a七ionary phase
column 七emp.
flow ra七e
de七ec七or
80
ODS reversed phase c.olumn
550 C
0.7 m工Imin
Hi七achi 638
・
・4
1 七ype variable waveleng七h UV moni七or
n
ne
a
--nn
1
x・1
工工
ed- エ
・1
占
・
エ
ェ
・
a
o
c
arz ca
・-工- 1ム
占
-n
、n
、a エ
pPZム
Dc
eee m“y
ccc ac
condi七ions of mobiエ
e phase and waveleng七h for drug separa七ion
ERC-ODS (3u，i.d. 6 x 100 mm) column
mobile phase; 0.1 M ace七a七e:MeOH (83:17)
pH 6.0
waveleng七h; 262 nm
品
占
Hi七achi が3053 (5u，i.d. 4 x 250 mm) column
mobile phase; 0.05 M KH~P04:MeOH (85:15)
pH 6.0
waveleng七h; 210 nm
amoxicillin
cefadroxil
Zorbax ODS (5u，i.d. 4.6 x 250mm) column
mob工e phase; 0.05 M KH2PO~MeOH (88:12)
pH 6.0
r
n，262 n
r
n
waveleng七h; 210 n
cephaloridine
Hi七achi #3056 (5u，i.d. 4 x 250 mm) column
mobile phase; 0.1 M ace七a七e:MeOH (7:3)
pH 6.8
waveleng七hi 240 nm
Char七. 1 HPLC Condi七ion on Analysis of s-Lac七a
r
n An七ibio七ics
d)薬物の小蕗からの吸収
b) の 方 法 に 従 っ て 、
pH 6
.8に お け る 各 薬 物 の
1時 間 ま で の 吸 収
率を経時的に測定した。薬物共寄下での吸収抑制実験は、試料讃度
150μH 、 国 害 薬 物 語 度
3
.0 mH と し て 試 料 を 議 整 し 、 同 様 の 手 法
に て 行 な っ た 。 結 果 は 議 論 の 部 Fi
g
. 1、 Fi
g
. 2、 Fi
g
. 3、 Fi
g
. 4に
示した。
一 81 -
(2) 薬 物 の 消 化 管 組 識 へ の 蓄 議 に お け る 相 互 作 用
a)試薬
牛 血 清 ア ル ブ ミ ン は Sigma 社 製 を 用 い た 。
b)InSitu 吸 収 実 験 法 に よ る 粘 摸 内 蓄 槙 性
[IJ-b) に 記 載 し た 方 法 に 従 っ て 、 セ フ ァ レ キ シ ン 、 セ フ ラ
ジンを用いて
3
0分 の 還 流 実 験 を 行 な っ た 後 、 速 や か に 吸 収 部 位 に 使
用した麗管を描出した。腸管内を冷生理食塩水で洗害後、粘膜糧援
をスライドグラスでかきとり、ホモジナイズ後、生理愈塩水にて全
2mQを 用 い て 粘 膜 中 の 薬 物 量 を 定 量 し た 。 以 下 に
容 10m
Qと し 、 そ の
その方法を示す。
Mucosa suspension(2 mQ)
3m
Q of HeOH added
stood at 40
C
centrifuged at 1
2，000xg a
t 40
C for 15min
目
由
+L 町 内
n
H
目
nd
t
聞
目
目
岡山
μ
向日υ
r
n
u
a川守
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み
凸u
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pg
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十L
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U
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J円
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nl
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・
m+L
内
nd
凸
U
ni
nHV 四
HU
“
cu-EI
20μI injected into HPLC
HPlCの 条 件 は ( 1 ) - c ) に 従 い 、 ホ モ ジ ネ ー ト 中 の 蚤 白 量 は 、
牛 血 清 ア jレ プ ミ ン を 探 準 と し て Lowry
10 2)
らの方法により定量した。
勺 fh
QU
粘膜内に蓄積した薬物量は蚤自~当たりとして求めた。結果は、総
識 の 部 Fi
g
. 5に 示 し た 。
[I
1] 薬 物 の 吸 収 に 及 援 す ア ミ ノ 接 、 ジ ペ プ チ ド の 影 響
(1 ) ア ミ ノ 酸 、 ジ ペ プ チ ド 共 存 に よ る 影 響
a) 試 薬
グ j
レシ j
レグリシン、
もの、
ω
L フ ェ ニ ル ア ラ ニ ル グ リ シ ン は Sigma 社 裂 の
L輔 カ ル シ ノ ン は Fluka 社 製 の も の 、 ト シ ス テ ィ ン は 半 井 化 学 、
L- フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン は 協 和 発 酵 の 製 品 を そ れ ぞ れ 用 い た 。 ま た L園口
イシン、
L- メ チ オ ニ ン 、 L- プ 口 リ ン は 和 光 純 薬 の も の を 使 用 し た 。
b ) 薬 物 及 び L伺 フ ェ ニ jレ ア ラ ニ ン の 定 量
薬 物 の 定 量 は [ I ] 一 ( 1)- c ) に 記 載 し た 方 法 に よ り 定 量 し
た。
L
-フ ェ ニ jレ ア ラ ニ ン の 定 量 は り Vモ ニ タ ー を 用 い た HPLC法 に よ っ て
行 な っ た 。 固 定 掴 は HITACHI GEL
ては、
した。
~3053 カラムを用い、移動指とし
O
.05 H リ ン 醸 援 箆 譲 : メ タ ノ -)
レ (85:15，p
H 6.0) を 龍 用
u
v測 定 波 長 は 254 n
mとしセフテゾー
j
レを内部擦準としたピ
ー ク 高 さ 比 よ り l嶋 フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン の 濯 度 を 求 め た 。
守
J
DO
c) ア ミ ノ 霊 長 、 ジ ペ プ チ ド 共 存 下 で の 薬 物 の 吸 収
[IJ-(1)-b) に 記 し た 方 法 に 従 っ て ジ ペ プ チ ド 、 ア ミ ノ
鼓共存時におけるセファレキシン、セフラジンの吸収実験を行なっ
た。通常、共存させるアミノ酸は
1
0m
Hと し 、 ジ ペ プ チ ド は 6 m
Hと
し た 。 尚 、 い 力 jレ ノ シ ン に つ い て は そ の 共 寄 濃 度 を
3.0，6.0， 10.0
m
Hと 変 化 さ せ て 行 な っ た 。
結 果 は 総 論 の 部 Fi
g
. 7、 Fig
. 8、 Fig
. 9、 Fi
g
.1
0、 Fi9.1
1、 Fig.
-フ ニ ル ア ラ ニ ン の 吸 収 に 及 ぼ す L鴎 メ チ オ ニ ン の
12に 示 し た 。 ま た L
影 響 に つ い て は Fi
g
. 6に そ の 結 果 を 示 し た 。
(2 ) 腸 管 部 位 に よ る 吸 収 特 異 性 の 比 較
[I] ー ( 1 )- b ) に 記 載 し た 方 法 に 基 づ き 、 ラ ッ ト 小 露 部 分
還流法を行ない、薬物の吸収量を比較した。
吸 収 部 位 は 翻 門 直 下 か ら 10c
mを 十 二 指 腸 部 ( duodenum) 、 そ こ か
ら約
5c
m離 れ た 次 の 10c
況 を 空 腸 上 部 (proximal jejunum)
、趨門下
30cmの と こ ろ か ら 10c
mを 空 揚 下 部 (distal jejunum) と し 、 回 腸 部
(ileum)と し て は 、 回 盲 接 合 部 よ り 10c
m手 前 ま で を 使 用 し た 。
環流液は全腸管連続環流の場合と同謹度の試料
10 ，
R
m を用いて、
毎 分 4，
R
mの速度で環流する。経時的に採取する試料容積は
とし、
0.1
，
R
m
[I] に 記 載 し た 方 法 に よ り 定 量 に 供 し た 。 結 果 は 総 論 の 部
Fi9.1
3に 示 し た 。
84 -
時
芸高
E
弱詰
多宅島食
o
音広
[I ] 小 腸 樹 子 縁 膜 実 験 法 の 検 討
(1 ) 小 腸 尉 子 隷 膜 小 胞 の 調 製
a) 試 薬
N 2制 ヒ ド ロ キ シ ピ ベ ラ ジ ン 骨 十 ・ 2晒 エ ス タ ン ス
幽
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
j
レホン援
(HEPES )
(Tris) 2輔( N-モ jレ ホ リ
ノ ) エ タ ン ス jレ ホ ン 鼓 ( HES) は 、 い ず れ も 半 井 化 学 の も の 、 パ リ ノ
マイシンは
D剛[ U
刷
Sigma 社 裂 を 用 い た 。
c] グ jレ コ ー ス ( 274mCi/mmol)、 L-[U-
(1
6
5
m
Ci/m
m
o
l
)、 L“[ U
帽
C
]アラニン
C] フ ヱ ニ ル ア ラ ニ ン ( 504mCi/mmol)は
R
.C
.C
. Amarsham 裂 を 使 用 し 、 非 放 射 性 の 周 一 試 薬 で 適 宜 希 釈 し て
用いた。
その也の試薬は市販特設、生化学用を使用した。
b) ラ ッ ト 小 腸 刺 子 縁 膜 調 製 法
瑞子縁膜の調整は
Kessler ら
47 )
の方法に準じた。体重
1
8
0・2
6
0
g
の ラ ッ ト を ベ ン ト パ jレ ピ タ ー jレ 蘇 酔 下 、 小 腸 を 描 出 し 、 腸 管 内 外 を
冷生理食塩水で洗浄し、スライドグラスで粘膜麗を剥離する。通常、
ラット
3 ， 4匹 分 の 小 腸 粘 膜 療 過 物 に 対 し
100m
Qの
5
0m
H
Dm
a
n
n
i
t
担
0
1を 含 む 緩 衝 液 に て 懸 濁 し 、 W
a
r
i
n
g Blendor( 日 本 精 器 ) を 用 い て
ホモジナイズ後、最終
1
0m
Hと な る よ う 塩 化 力
j
レシウムを器加し、
- 85 -
制子縁膜以外の成分を;護集、沈設させる。次いで、低速遠心により、
成分を除き、その上清を高速遠心分譲し、制子縁膜擦品
た。この
peIIetを 得
pelletに 実 験 に 用 い る 援 笛 液 を 加 え 、 十 分 に 懸 濁 後 、 種 々
の実強に洪した。
尚、調製法の概略を C
hart. 2に 示 す 。
Rat in七es七inal m1
.
ユc
osa scraped (3-4 ra七s)
suspended in 100 ml of 50 mM D-manni七01 and 2 mM Tris/HC1
(pH 7.1)
500 rpm for 4 min.
homogenized wi七h Waring blender a七 工 6，
added 2 ml of 0.5 M CaC12 and 1ef七 for 20 min
000 xg for 15 min
cen七rifuged a七 3，
Superna七an七
cen七rifuged a七 27，
000 xg foど 30 min
Pe11e七
resuspended in 40 m1 of experimen七a1 buffer
using Dounce-七ype homogenizer
000 xg for 30 min
cen七rifuged a七 27，
Pe11e七
resuspended in 七he experimen七a工 buffer wi七h Dounce-七ype
homogenizer
Bどush bordeど membど ane vesic1es
2 Pど ocedure for 七he Prepara七ion of Brush Border Membrane
Char七.
Vesicles from Ra七 In七es七ine
86
C
摸欝素活性を指標とした精製度の検定
Alkaline Pho-
調裂した膜製品の精製度は、 制子縁膿に帯在する
a
sharase と 側 窓 形 質 膜 に 局 在 す る N
ATPase の 酵 素 活 性 を 灘
定ずるこ とによっ て確認した。
Alkaline phosphatase活 性 の 測 定 は 市 販 潤 定 キ ツ ト
ホスフ
Kテ ス
ア
を用いて行ない、
トワコ
アルカリ性
蛋白噂当たりの活性憧
として精製前のホモジネー トと比較した。
+
N
a -K
ATPase の 潤 定 は 、 Proverbio と'Castilloの 方 法
ウ ワ パ イ ン 添 加 時 ( 1.0mH) と 非 常 議 加 時 で 精 製 す る り
準挺した。
Fiske-Subbarow法
ン援を、
に
10 4)
によ つ て定量し、
活性を翻定した。 結果は議誌の部
その差より本欝素
+
Table
N
a
尚、
に示した。
ATPase澗 定 手 顧 に つ い て 以 下 に ま と め て 示 す 。
。工.
: samp1e s
0.1 m1 01
JI担
substra七e sol (pH 7.5)*
15 立un
acid 1
.0 ml
q
ヲ
ぞ
﹃
ニ
ム
。
申
Z#
F
L
門
川
口}
℃
C
2}
'一亡
a
.叫
7
喝
q
・
1ム
亡
a
・ロ司門川
℃・L
嶋
・1-
n
4
0
ム
ー
ヲ叩
品
044
q
d
司
γ
a
S
A
Z
l
f
。
..:..占
場
唱
Na -K ATPase
0.2 q
NaHS04
1.2
Na2804
工.
2q
add H20
Chaど亡 .
3 Procedure
-0
At
n1
﹃
a-
-Lu
ms
品
Absorbance ac
: 660 nm
r
Reduc七ion
-
r
o
ゥーヲぞ
15 立un
e 'nc
q Da
a a
e ロC
reagen七 台 *
ZL
ac
: 30 C
0
.0
ロ
o
m
m
u
.
L
n
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hm
0
4﹄
・
L
今
企
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c
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廷宅
エロ cu .tJ a c: ~on
N50d
・2 e
425R
ニム子但月ZaZ
0.5 m1
0.5 m1
3.0 m1
0.1 m1
su.
t
Js
c
:rac
:e so1.
4• 0 r
r
u
'
1 ATP・
2Na in 100 mM
Tris/HC工 (pH 7.5) buffer
con亡 aining 6 mM EDTA，
160 r
r
u
'
1 NaCl， 1
6 mM KC1，
and 12 mM MgC工2
suoeどnac
:an七
。
。
。
。
1.0 m1
ど
Z
苦 七rich
工
。 roace七ic
e
q
d
u
3
ム
ー
ac
: 37。己
incuba 七 ~on
。
1
.0 m1
。
O
.工 m1 of 12 :
て
1
M ouabain or H20
七o七a1
100 m1
叫
87 -
(2) ア ミ ノ 設 の 樹 子 議 膜 小 抱 内 へ の 淑 り 込 み
a) 小 臆 内 取 り 込 み 実 験 法
実 験 方 法 は Hopferら の 迅 速 漣 過 法
46 )
に準 Uた。操作手贈の擬態
を Chart. 4に 示 す 。 麗 小 抱 サ ス ペ ン ジ ョ ン 諮 液 ( 3-4mg/mI protei
n
)
は通常、
100mH D-rnannit
oI 、 20mH“
日 EPES/Tris(pH 7.5) を 用 い て
幽
謂 裂 し 、 基 質 溶 渡 (transport solution) と
1:1で 濃 詔 す る こ と に
よ り 反 応 を 開 始 す る 。 一 定 時 間 後 に 8 ~の氷冷した 150
I
I
I
H
N
a
C
I
1 mH Tris/HC1(pH 7.5)bufferを 加 え 、 た だ ち に メ ン ア レ ン フ ィ jレ
司
ター( O
.45μ 図、
2
.5崎、 Hillipore) で 謹 過 す る 。 そ の 後 速 や
か に フ ィ jレ タ ー を 5 ~の氷冷 buffer にて洗浮した後、フィ jレターに
捕獲した膜小胞内の基質量を潤定する。取り込み量は全て、別途に
行 な っ て 求 め た フ ィ jレ タ ー へ の 吸 着 量 を 差 し 引 き 、 膜 小 臨 含 有 蛋 由
貿当たりの量として示した。
工00 1
1工 of vesic1e suspension
0
七ion a
七 25 C
preincuba
工00 1
1工
of 七he 七ranspor七 so工1ユ
七 ion a
七 25 C
Q
0
incuba
七ed a
七 25 C
8.0 m1 of ice co1d buffer
(100 mM NaC1， 1 mM Tris/HC工 (pH 7.5))
叩
rapid1y fi1七ered 七hrough 七he membrane fi工七 er
Vesic1es 七rapped on 七he fi工七 er
washed wi七h 5.0 m1 of ice-co1d buffer
Assay
Char七 .4 Procedure of 七he Up七ake Experimen
七 in
七o Brush Border
Membrane vesic1es
- 88 -
b)アミノ畿の小胞内取り込み量の翻定
[I
1 ] ー ( 1 ) - b) に し た が っ て 調 撃 し た 膜 小 胞 を 用 い て
C
-
標識した L
-ア ラ ニ ン 、 ト フ ニ jレ ア ラ ニ ン の 取 り 込 み を 測 定 し た 。
方 法 は ( 2)- a) に 準 じ た 。 恒 し 、 反 応 停 止 に 加 え る 氷 冷
b
u
f
f
e
r
中に非標識アミノ援を器加して使用した。
ア ミ ノ 畿 の 定 量 は 取 り 込 み 実 験 後 の フ ィ jレ タ ー を 液 体 シ ン チ レ ー
シ ョ ン カ ク テ ル (1
%
剛
D
P
O、 O
.0
5完勝 POPOP i
nt
o
l
u
e
n
e
T
r
i
t
o
n X1
0
0
雌
(2:1))に 浸 し 放 射 活 性 を 測 定 す る こ と に よ り 行 な っ た 。 結 果 は 議 論
の 部 Fi
g.1
4、 Fig.17 (B) に 示 し た 。
[I
1] 薬 物 の 小 腸 樹 子 縁 模 小 胞 へ の 取 り 込 み
(1 ) 薬 物 の 鶴 子 縁 膜 小 鐙 へ の 取 り 込 み 速 度 の 比 較
a) 試 薬 の 調 製
クエン援護衛液は
O
.1H ク エ ン 鼓 ー ナ ト リ ウ ム と 0.1H-HC1 を 遊
当な比率で混合し、それぞれ p
H 2.0 ( セ フ ァ レ キ シ ン 、 ア ン ピ シ リ
ン用)、
pH 2
.5 ( セ フ ラ ジ ン 用 ) と な る 様 調 製 し た 。
b) 薬 物 の 定 量 法
小胞に取り込まれた薬物の定量法は、
H
i
y
a
z
a
k
iら の 方 法
に準
拠 し た 。 [ 工 〕 ー ( 2 ) - a) の 方 法 に 準 じ て 行 な っ た 取 り 込 み 実
験後のフィルターを試験管に投じ蒸溜水 1
m
Aを 加 え る 。 次 い で
89
申
叩
O
.1完 過 酸 化 水 素 を 含 む ク エ ン 援 護 笛 譲 5 m P . を 加 え 沸 麓 水 港 中 で 加
10 6
. 10
7)
温し、蛍光物質
へと変換させる。加温時閣はアンピシリン
の場合 4
0分 、 セ フ ァ レ キ シ ン で は 70分 、 た フ ラ ジ ン は 55分 と す る 。
その後、流水で冷却後、
1 mR.の
点 で フ ィ jレ タ ー を 除 く 。 次 い で
0.5 河 川 a
2
H
P
O
.
!を 窓 加 し 、 こ の 時
7m P . の ア セ ト ン : ク ロ ロ ホ
で蛍光物質を抽出し、有機麗の一定量を乾閤
j
レ ム (2:
3)
H
P
L
Cの 試 料 と し た 。
H
P
L
Cの 条 件 を C
h
a
r
t
. 5に 示 す 。
sta七ionaど y phase
rnobile phase
flow rate
waveleng七h
HzO (45:55)
MeOH
0.7 r
n
l
/
r
n
i
n
r
n
pどa七ure
colurnn 七e
de七ec七。 r
HITACH工 GEL #3053(i.d.4x250rnrn)
550 C
H工TACH工 F-1000 fluororne七ric de亡ec七or
Ex. 345nrn
，Ern.
420nrn
Char七. 5 HPLC Condi七ion for Drug Assay Trapped Brush Border
Mernbrane vesicles
c) 薬 物 の 膜 小 路 へ の 取 り 込 み 速 度 の 比 較
[1 ] ー ( 1 ) - b )、
[ 1] 一 ( 2 )-
a)に従ってアンピシ
リン、セフラジン、セファレキシンの取り込み経時変化を潤定した。
思り込み平衡櫨と浸透圧変化の関係を測定する場合には、
D個師 annト
t
o
l の 代 わ り に 額 不 透 過 性 の D cellobioseを 用 い て 行 な っ た 。 結 果
姻
は 議 論 の 部 Fi
9.1
5、 Fi
9.16、 Fi
g
.17、 Fi
9.1
8に 示 し た 。
d)初期取り込みにおける内向き
[1] ー ( 1 ) - b)、
H+ 勾 配 の 影 響
[ 1] 一 ( 2)- a ) に 従 っ て 内 向 き の
- 90 -
H 勾配の影響、及びパリノマイシン窓加によって形成される
K
拡 散 電 位 の 効 果 を 測 定 し た 。 セ フ ァ レ キ シ ン の 定 量 は [I] ー (1
- b ) に 記 載 し た 方 法 に 従 っ て 行 な い 、 C綱グ jレ コ ー ス の 定 量 は 、
[ 1 ]ー
(2) - b ) 記 載 し た 放 射 活 性 の 潤 定 方 法 に 準 拠 し た 。
尚、パリノマイシンの添加量は
2
0
μ.
g/ ，
R
i
1
l (最終反応夜中)として
行った。
結 果 は 総 論 の 部 Fi
g
.1
9、 Table. 2に 示 し た 。
叩
多詰
E
弱詰
穿芝臆食
91
四
t
J
:
) 音β
[1] ア ミ ノ 3ラ ク タ ム 系 抗 生 物 質 の 小 島 認 識 翠 相 性
(1 ) ラ ッ ト 腸 管 探 管 局 時 選 流 法 に よ る 吸 収 性 と 認 識 へ の 滞 留
a )フ
j
レオロカーボン港液はミドリ十字社製
した。その謹成を
F
C・
- E
rnulsionを 使 用
Table.1 に 示 す 。 F
C Emulsion， Annex solution
噂
A 、 Annex solution Bは 使 用 時 、 40:3:7の 比 で 混 合 し 、 1
HH
C
1に て
蜘
D
H7
.4に 調 整 し た 。
Tab工e 1 Composi
七ion of F1uorocarbon FC 43 Em
u工sion
骨
FC 43 emu工sion
叩
FC-43(perf1uoro七ribu
七y1amine) 2
5.Owjv宅
P1uronic F-68
3.2 wjv宅
(po工yoxypropy工ene po工yoxye七hy1ene
copo1ymer)
四
in dis七i1工ed wa
七er
Annex solu
七ion A
Annex solu
七ion B
KC工
O.56wjv宅
NaHC03
3.50wjv宅
NaC工
4.28wjv宅
CaC12
O.20wjv宅
MgC工2
O.14wjv宅
Hydroxye七hy1s七arch
in pyrogen free dis七i工
工 ed wa
七er，au
七oc1ave-s
七rri1ized.
司
21.43wjv宅
- 92
叩
b)ラット腸管源管同時還流法
体重
2
0
0
g前 後 の ラ ッ ト を ベ ン ト パ
j
レ ピ タ ー jレ 隣 酔 下 、 腹 部 正 中 韓
に 沿 っ て 開 腹 し 、 趨 門 よ り 20CI
i
l下 部 の 空 蹟 1
0CI
i
lを 生 理 食 塩 水 1
0m
Qで
洗浄する。次いで、洗車した腸管近隣に流入する不必要な血管を結
禁し、目的部の腸題膜動脈及び静脈を鹿辺組識より剥離する。頚詩
眠からヘパリン(
0
.
0
5n
Z
Q、 5
0units
)を注入し血液をへパリン化
した後、鴎題膜勤既の門蹴に近い部位を結禁した後、腸管制の腸間
膜 動 脈 に カ テ ー テ jレ ( ヒ ピ キ ポ リ エ チ レ ン 細 管 N0.3} を 挿 入 国 定 す
る。この際カテーテ j
レは送液ポンプ(東京理化器域社製マイク口チ
ュ ー ア ポ ン プ ) に 接 続 し て お き 、 カ テ ー テ jレ 先 場 か ら 出 管 還 流 液 が
流れている状態で挿入し、血管内に空気がはいらない様にする。こ
の状態で一度血管還流液の流速を落とし、麗簡膜語版の門騰に近い
方を結紫し、露管鰯にカテーテルを挿入した後、流速を元に戻し血
管制の還流を開始する。血管還流は通常
I
nS
it
u
一回還流により行
な い 、 流 出 し て き た 還 流 液 を 10分 館 に 集 め 、 薬 物 の 定 量 に 供 し た 。
腸管控側は
I
ns
i
t
u 連 続 還 流 法 で 吸 収 実 践 を 行 な う 場 合 は 、 第 I糧、
[ I ] - ( 1 ) - b ) に 記 載 し た 方 法 に 準 拠 し 、 薬 物 還 流 液 は 10m
Q
として行なった。また、ループ吸収実践に適用する場合は
Levineら
10 7)
の方法
に準じて行なった。
c) 薬 物 の 定 量
血管同時還流法を用いた場合の管腔側残害薬物量、組織内蓄積量
の定量は、第
I繍 [ 1] ー ( 1 ) - c ) 及 び [ 1] ー ( 2)-b)
に記載した方法に従った。血管還流液中の薬物定量は、採取した遼
﹁べ
J
QJ
流読を
2
5，0
0
0 xgで 2
0分 遠 沈 し た 後 、 そ の 上 清 2 m R . を ク 口 口 ホ ル ム
2m
R
.と 援 護 し 、 遠 沈 分 離 し て 得 た 水 槽 を H
P
L
Cの 試 料 と し た 。
d)薬物の吸収と血管還流
結果は総論の部
Fig
.2
0、 Table 3 に 示 し た 。
(2) 薬 物 の 吸 収 性 と 粘 膜 組 識 蓄 積 性
a ) 1n Situ ) レ ー ア 吸 収 実 験 法
吸収実験は、
L
e
v
i
n
eら の 方 法
に準じた。吸収部位は、空腹部
とし、ーヶ所またはこヶ所の 1
0c
潟
， ループを作成し、薬物溶液
(
H
o
d
i
幅
f
i
e
dR
i
n
g
e
r
'
s 溶 液 で 調 製 ) 1m
R
.を jレ ー プ 内 に 注 入 す る 。 一 定 時 潤
後、小腸 l
レープを摘出し、回収した内容液と涜液を合わせ、全
2
5m
R
.と し た 後 定 量 に 供 し た 。 腸 管 ル ー プ は 粘 膜 を 剥 離 し 、 ホ モ ジ
ナイズ後、常法に従って各画分に遠沈分離し、それぞれ定量に供し
た。
b)薬物の小腸ループからの吸収と組議蓄積
[ 1 ]一
(2) - a ) に 記 載 し た 方 法 に し た が っ て 行 な っ た 。 結
果は総論の部
Fig
.2
1、 Table 4 に 示 し た 。
- 94 -
(3 ) 薬 物 の 小 腸 組 議 内 分 布 の 検 討
a) 試 料 の 調 製
議製は全て
O
.1 H N
a
c
1
暢
を含む
10mHリ ン 磁 器 笥 液 (pH 7
.
4
)を
用いた。
b) 薬 物 の 結 合 実 験 法
(i) 限 外 謹 遇 法
装置はアミコン社の援持式限外謹過用セル 1
2型 ( 10 ~)を用い
て透析チュープを装着して行なった。窒素圧は
2・ 3 Kg/C1lI以下とし、
37" c に 保 っ た 状 態 で 趨 譲 を 採 取 し 定 量 に 供 し た 。 結 合 量 は 議 遇 さ れ
る前の窓加薬物濃度との差より求めた。定量は第
I綴 [ I] ー ( 2)
- b)に準拠した。
(ii) ゲ ル 平 衡 法
H
u
m
m
e
lら の 方 法
G
e
l P2(100-200mesh)
に準拠した。ゲル趨過用の担体は、主に
B
i
o・
を道い、一定薬物濃度で平衡化した後、全薬
物 濃 度 が 平 衡 薬 物 議 度 と 等 し く な る 様 調 製 し た 試 料 を 最 大 2 mR.まで
カラムに添加する。溶出液を分画(
1.5-2.0ml/tube ) し 、 各 t
u
b
e
中の薬物濃度を定量し平衡議度からの減少分を結合量として算出し
た。
(iii
)平衡透析法
透 析 セ ル ( 5連 式 、 ア ベ 科 学 ) を 用 い て 行 な っ た 。 透 析 膜 は
s
p
e
-
QJ
cJ
ctrum 社 の ス ペ ク ト ラ / ポ ア 6( 分 画 分 子 量 8，000) を 龍 用 し 、 両
サイドの溶接中の薬物量の差から結合量を求めた。通常、試料はマ
イ ク ロ シ リ ン ジ を 用 い て 高 護 度 の 薬 物 溶 譲 を 小 容 量 ( 5 20μI)蛋自
鍋
試料側に加え、よく撹持し、
3
7" c に 調 整 し た 援 と う 器 中 で 約 120サ
イクル/分で援とうし平衛に達させた後、緩寵液倒と蛋白試料側の
薬物量を第
I縞 [ 1 ] ー ( 2 )ー b ) に 従 っ て 定 量 し た 。
c) 薬 物 の 組 識 成 分 へ の 結 合
ラット小腸粘膜組識ホモジネートを
分離後、上清、
1
0
5，0
0
0x
g、 1.
5 hrの 超 遠 沈
peII
etに つ い て 薬 物 の 結 合 量 を 翻 定 し た 。 上 清 に つ
い て は 前 項 b ) 一 (ii
)に記載した方法に従い、
更に超遠沈した後の
pelet
pe
II
etは皇室濁させ、
について再懸濁した試料を用いて
b)ー
(i) に 従 っ て 行 な っ た 。 結 果 は 総 誌 の 部 Fi
g.
2
2、 Fi
g
.2
3に 示 し た 。
[I ] 小 蕗 組 議 可 溶 性 画 分 の 薬 物 結 合 成 分 の 単 鍾
(1 ) 小 腸 可 溶 性 画 分 の 分 離 精 製
a) 試 薬
イオン交換担体は
oEAEセ jレ ロ フ ァ イ ン ( AH， 生 化 学 工 業 ) を
用 い 、 ゲ ル 趨 過 用 担 体 は フ ァ jレ マ シ ア 社 の セ フ ァ デ ッ ク ス
G 75(sup
醐
erfine) G-50(fine)を 使 用 し た 。 薬 物 は ア ン ピ シ リ ン 、 セ フ ラ ジ ン 、
セブァレキシン、アモキシシリン、シクラシリン、については、第
I績、
[ 1] ー ( 1 ) - a ) に 記 載 し た 各 社 よ り 提 供 を 受 け た も の
QJ
f
o
を用い
た 。 尚 、 セ フ ァ ド ロ キ シ ー ル (CefadroxiI monohydrate) は 寓 有 製
薬 よ り 、 セ フ ァ 口 リ ジ ン ( Cephaloridine Na) は 壌 野 義 製 薬 、 セ フ
幽
ア ゾ リ ン (Cefazoli
n anhydrous)は 藤 沢 薬 品 よ り 供 与 さ れ た も の を
用いた。その飽の試薬は全て市販生化学用、文はそれと間等の純度
のものを用いた。
b ) 0 EA Eイ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
oE A E セ jレ ロ フ ァ イ ン カ ラ ム
(i.d. 1.6 x 70c
認)は
10 磁村リン
議 選 箆 液 (pH 8.0) に て 初 期 平 箇 化 す る 。 ラ ッ ト 小 島 盟 議 ホ モ ジ ネ
ー ト よ り 得 ら れ た 105.000 x
y
上請をカラムへ窓加し、初期緩箆液
にて非吸着画分を溶出させる。その後
0.5H の KC1 を 含 む
リン酸緩箇液を用いて吸着麗分を港出させる。流速は通常
10 mH
4
0i
d
./
h
r に 設 定 し 、 す べ て の 操 作 は 4" C で 行 な う 。 分 画 は フ ラ ク シ ョ ン コ
レ ク タ ー を 用 い て 一 定 容 量 ず つ 分 麗 し 、 各 tube内 容 に つ い て 280
n隠
におりる吸光度、蛋白質濃度、セファレキシンの結合活性を測定し
た。
c) ゲ ル 濯 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
[I
1 ] 一 ( 1 )- b ) に よ っ て 得 ら れ た 薬 物 結 合 活 性 画 分 G
2に つ
い て セ フ ァ デ ッ ク ス G 50カ ラ ム (
i.d. 2.5 x 65c
沼)によるゲル謹還
岨
を行なった。
O
E
A
Eセ ル ロ フ ァ イ ン カ ラ ム に よ り 得 ら れ た G
2醤 分 を ス
ベクトラ/ポア
6( 分 画 分 子 量
2.000) チ ュ ー プ を 用 い て 蒸 溜 水 中
で透析後、凍結乾燥する。凍結乾操粉末を
0.1 H-Nac1 を 含 む 10隠H
QJ
7
リン麓緩衝諜
(pH 7
.
4
) に再溶解する。
離により得た上清を G
姐
2
0，0
0
0x
g、 2
0分 の 遠 心 分
5
0カ ラ ム に 添 加 す る 。 溶 出 は 間 じ 援 筒 液 で 行
ない、フラクションコレクターにて分画した各フうクションについ
て、吸光度、タンパク質量、薬物結合活性を測定した。セファデツ
クス
s7
5を 用 い て の
四
1
0
5，0
0
0x
g、 上 清 分 離 に つ い て も 同 様 の 方 法 で
行ない目的とする蕗分を集めて定量に供した。
d ) S 0 S ポ リ ア ク jレ ア ミ ド ゲ jレ 電 気 議 動 法
Swank 、 Hunkres ら の 方 法
に準挺した。泳動装震はディスク
電 気 泳 動 装 置 C0-1 ( 東 洋 科 学 産 業 ) を 用 い 、
8c
認畏のゲル管(i
.d.
5m
m
)を使用する。泳動用 b
'
ufferは O
.1%
暢S
O
S、 0
.
1H
- H3P04 /
Tris (pH 6.8)
と し 、 ゲ jレ 組 成 は 、 ア ク リ ル ア ミ ド
1
2
.5 % 、 ピ ス
(N，N
'・ 国 e
thylene b
i
s acrylamide) 、 0
.
6
2
5%となるよう
O
.1%
S
O
S 8HUrea 0
.
1H
- H3P04 ITris (pH 6
.
8
)を用いて調製する。
輔
岨
通常、試料は
1 %-SDS ，8H-urea，1 %
幽 2・ m
ercaptoe t
h
a
n
a
l
0
.
0
1 H -H3P04 ITris(pH 6
.
8
)に溶解し、泳動ゲ
10・ 30μ! と し 、 ゲ ル 当 た り
を含む
j
レへの添加量は
4
.5 5 田A で 泳 動 さ せ る 。 泳 動 後 の 染
剖
色 は ク ー マ シ ー プ リ リ ア ン ト プ jレ ー に よ る 蚤 自 染 色 法 で 行 な い 、 分
子量既知の蜜自の椙対泳動度から分子量を算出した。標準とした分
子 量 既 知 蛋 白 は 市 販 の 電 気 泳 動 用 分 子 測 定 マ ー カ ー (S
DS-PAGE H
a
r
ker 111
、
F
u
l
k
a，A
G
.
)を用いた。
e) セ フ ァ レ キ シ ン 結 合 成 分 の 分 離 精 製
結果は総論の部
Fi
g
.2
4、 Fi
g
.2
5、 Fi
g
.2
6に 示 し た 。 ま た こ れ ら の
QU
QJ
結 果 を 総 論 の 部 Table 5 に ま と め て 示 し た 。
尚、セファレキシンの活性は
20μM に お け る 結 合 を み る こ と よ
り求めた。
(2 ) fb画 分 の 薬 物 結 合 性
[I
I ]ー
(1)-b) ， C) に記載した方法に従い、得られた f
b
画分について、
[ I ]一
(3) - b ) ， (iii) に 記 し た 平 衡 透 析 法
を 用 い て 各 薬 物 の fb画 分 へ の 結 合 性 を 讃j定 し た 。 通 常
20μN 平 笥
時での結合活性としてあらわし、スキャッチヤードプロットを行な
う場合は
3か ら
100μH ま で の 範 聞 で 結 合 量 を 求 め た 。 結 果 は 鎗 設
の 部 Fi
g
.27、 Fi
g
.32に 示 し た 。
[m]fb画 分 へ の 薬 物 結 合 に お け る 椙 互 作 用 と 薬 物 結 合 特 性
(1 ) 薬 物 龍 椙 互 の 結 合 阻 害
[I ]一 (3) -b) ， (iii)
に記載した方法に準拠して倍薬物
共 存 時 で の fb画 分 へ の 結 合 量 を 測 定 し た 。 共 存 さ せ る 薬 物 は 透 析 セ
ルの緩箆液側、蛋白試料側の両方に初めから加えて行なった。結果
は 総 誌 の 部 Fi
g
.28、 Fi
g
.29に 示 し た 。
(2 ) ア ミ ノ 酸 、 ジ ペ プ チ ド の 影 響
〔 直 ] ー ( 1) の 方 法 に 従 っ て ア ミ ノ 援 、 ジ ペ プ チ ド 共 序 下 で の
薬物結合活性を溺定した。共存させるアミノ霊長、ジペプチドは
500
QJ
QJ
μN 、 2
.5 mH を 設 定 し 透 析 セ jレ の 両 方 に 共 事 さ せ た 。 結 果 は 総 論
の部
Fi
g
.3
0、 F
i
g，3
1に 示 し た 。
(3) A N Sを 用 い て の 高 分 子 結 合 実 験
a) 試 薬
ANS Hg壊 は 半 井 化 学 の も の を 用 い た 。
副
b )A N S結 合 実 験 法
結合実験は
Sugiya図aら の 方 法
に準じた。試料薄液
2 mR.を石英
製 蛍 光 溜 定 用 キ ュ ベ ッ ト に 入 れ 2mH あ る い は 4mH A N S 溶 液 を マ イ
クロシリンジにて 5μ￨ ずつ加え、マグネチックマイクロスターラ
ー パ ー で 1分 間 撹 拝 し た 後 、 蛍 光 強 度 を 瀦 定 し た 。 蛍 光 の 測 定 は 自
立 650サ O型 分 光 蛍 光 光 度 計 を 使 用 し 、 励 起 波 長
400nm、 測 定 渡 長
4
レホ jレ ダ ー を 用 い て 2
5"cまたは
80nmで 測 定 し た 。 潤 定 温 度 は 檀 混 セ l
37" c に 設 定 し た 。 最 終 的 に 加 え る
ANS謬 渡 の 全 容 積 は 40μi ま で と
し 、 試 料 容 積 の 2%を 超 え な い よ う に し た 。
ま た 、 薬 物 共 存 下 で の ANS の 結 合 実 験 は 、 タ イ ト レ ー シ ョ ン 法 を
98 )
用いた
。試料溶液 2m
R
.
に
2
.5 関H ANS 溶 液 を
10μl 加 え 、 AN
S議度 1
2
.5
μ 刊 に お け る 蛍 光 強 度 を 制 定 す る 。 次 い で 、 26.0mHの 薬
物溶液を 5μi ずつ添加し蛍光強度変化を測定した。加えた薬物溶
接 は 全 体 の 3%以 下 と な る よ う に し た 。 結 果 は 、 総 論 の 部 、 第 E 籍、
第三章第
3節 に 記 述 し た 。
エ00
引用文献
n
o
s
e-
-
同 調
，
N)
コ
申
﹄﹂﹁/
F
}fo
・1-AH，
sqd
il
ど(
q
d
・ ﹁j
K5
2)
、
円
D.M.Ma七七 hews， Physio1. Rev.，コ
コ
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