（7）Dried blood spot (DBS)を 用いる薬物濃度測定

●[特集]医薬品分析(7)Dried blood spot(DBS)を用いる薬物濃度測定
［特集］医薬品分析
（7）Dried blood spot (DBS)を
用いる薬物濃度測定
薬物動態研究部　神田　壮紀
野口　隆典
クを打ち抜く。③内標準物質を含んだメタノールやアセ
トニトリルなどでディスクから薬物を抽出する。④抽出
液を必要に応じて適切な溶媒で希釈後、LC-MS/MS（液
体クロマトグラフ－タンデム質量分析計）などの分析機
器で測定する。
DBS用のカード（ろ紙）は、GE Healthcare社など数
社から発売されているが、ろ紙に塗布されている薬剤の
有無や種類によって、ろ紙上での安定性やろ紙からの回
1.はじめに
収率、LC-MS/MS測定時のマトリックスの影響が異な
医薬品の開発では開発薬物やその代謝物の体内濃度と
選択が重要なポイントとなる。
る場合があるので、分析法確立の際には適切なカードの
薬効や毒性との関係を明らかにすることが必須であり、
血漿、血清、全血や尿をはじめとする生体試料中の薬物
や代謝物の濃度を正確に定量する技術が重要である。生
体試料には目的物質の定量を妨害する脂質、タンパク
質、塩などの多様な内因性物質が多量に存在するため、
前処理の成否が信頼性の高い定量法構築のキーポイント
となる。生体試料中の前処理法としては、一般的に①除
DBS
タンパク、②液液抽出、③固相抽出が用いられるが、近
年ろ紙を用いたDBS（Dried blood spot）法が簡便かつ
有用な手法として欧米を中心に利用が広がりつつある。
DBS法は全血をそのまま使用するため、血漿を分離する
操作が不要となるだけでなく、採血量が少なくて済むた
め、試験に必要な動物数を削減できるなど、動物愛護や
コスト削減の観点でも優れており、今後、日本国内でも
徐々に利用が進む可能性が高い。すでにDBSの利用が始
まっている欧米では、議論も盛んに行われており、詳細
はEuropean Bioanalysis Forum［EBF］のconference（2009
LC-MS/MS
年 バルセロナ）や workshop（2010年 ブリュッセル）な
どの資料をご参照頂きたい。本稿ではDBS法の概略や有
用性と、DBS法を用いて昨年弊社で実施した分析法バリ
デーション及びTK測定の結果を紹介する。
図1　DBS 法による血中薬物濃度測定
3.DBSの利点
2.DBSとは
DBS法の主な利点を下記する。
動物やヒトの血液をろ紙にスポットして保存・輸送す
る方法は40年以上も前から利用されている技術であり、
・必要採血量が少量のため、動物数削減やサテライト群
が省略可能。
現在でも新生児スクリーニングや遠隔地でのtherapeutic
・小動物から経時採血が可能。
drug monitoring（ 例：HIV、B型・C型 肝 炎、 梅 毒 な ど
・幼弱動物を用いた試験の実施が可能。
の各種検査）で利用されている。一方で医薬品開発への
・血漿分離操作（遠心分離、移し替え）が不要。
適用は比較的新しく、血中濃度測定用技術として広く利
・室温での検体輸送・保存が可能。
用・紹介されるようになったのはここ数年である。DBS
・酵素活性を阻害し薬物変換を回避できる。
法は読んで字のごとく、全血を用いるのが一般的である
・微生物・ウィルスを不活性化できる。
が、血漿や尿、髄液などのマトリックスにも応用できる
ことが知られている。
DBS法の手順は極めて簡便である。以下に代表的な手
4.分析法バリデーション
順を紹介する（図1）
。①全血試料（10～20μL）をDBS
用のろ紙にスポットし、室温で2時間以上乾燥させる。
DBS法を用いてラット全血中のバルサルタン（図2）
②ろ紙の全血スポット部から直径3mm又は6mmのディス
濃度測定法を開発した。ラット全血（ヘパリンナトリウ
・31
東レリサーチセンター The TRC News No.114（Nov.2011）
●[特集]医薬品分析(7)Dried blood spot(DBS)を用いる薬物濃度測定
ム処理）
にバルサルタン溶液を添加し、
FTA DMPK-Aカー
ド®（GE Healthcare）に20μLをスポットして2時間風
乾した。次にスポット部分から直径3mmのディスクを打
ち抜き、内標準物質含有のアセトニトリルで抽出した。
抽出液に0.1%ギ酸を加えて希釈し、LC-MS/MSで測定し
た。本分析法について、選択性、直線性、再現性、マトリッ
クス効果、カード上の安定性などの確認を行った。
図3　全血中濃度推移(DBS vs. blood/water)
表2　血中濃度- 時間曲線下面積(DBS vs. blood/water)
AUC0-24h
(ng·h/mL)
図2　バルサルタンの構造式
Sex
Animal
その結果、定量に影響を及ぼす妨害物質やマトリック
ス効果は認められなかった。全血中のバルサルタン濃度
10～10000ng/mLの範囲における直線性は良好であり、
日内再現性は、真度99.5～106.0%、精度1.4～7.3%であっ
Male
Female
た（表1）。また、カードにスポットした全血中のバルサ
01
02
03
04
DBS
(A)
14856
20876
30476
14948
Blood/water
(B)
14965
19171
31882
14970
(A)/(B)
0.99
1.09
0.96
1.00
ルタンは室温乾燥状態で7日間安定であった。また、ス
ポット血液量が10～25μLの範囲内で正確な定量値が得
られることを確認した。
表1　日内再現性（DBS）
6.DBSの課題と期待
以上の結果から、DBS法がTK測定に有効な方法であ
ることが確認できた。一方、DBS法ではヘマトクリッ
ト値（血液中の血球の割合）の異常が定量値に影響を及
ぼしたり、一部の不安定な化合物には適用できない可能
性があることが知られている。こうした事象への対応や
DBSカードからの抽出作業の自動化などが課題として挙
げられる。しかしながら、前述のように、DBS法は良質
なデータの取得、動物愛護、検体輸送・保存などの観点
から極めて利点の多い有用な手法であり、生体試料中の
薬物濃度測定に今後広く活用されるようになることが期
5.DBSを用いたTK測定例
次にラット（Crl：CD（SD）
）にバルサルタンを経口
投与（60mg/kg）して経時採血し（採血時点：投与後0.5、
1、2、4、8、24時 間 ）
、DBS法 とBlood/water法（ 全 血
を冷水で溶血させた後に固相抽出する方法）の二通りの
待される。
■神田　壮紀（かんだ　そうき）
薬物動態研究部
専門：薬物動態分析
趣味：野球、nano block
方法で前処理後、LC-MS/MSで全血中のバルサルタン
濃度を測定した。DBS法とBlood/water法で得られた結
果について、全血中濃度推移（動物番号01）を図3に、
■野口　隆典（のぐち　たかのり）
薬物動態研究部
雌雄各2個体の血中濃度-時間曲線下面積（AUC）を表
主任研究員
2にそれぞれ比較して示す。いずれの方法でも同等の結
専門：薬物動態分析
果が得られ、前処理に要した時間は、DBS法がBlood/
water法の半分以下であった。
32・東レリサーチセンター The TRC News No.114（Nov.2011）
趣味：旅、産業遺構、子供とテニス