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マキシムバイオ社 マルチプレックス PCR（M
マキシムバイオ社 マルチプレックス PCR（M-PCR）技術情報 目 次 ■イントロダクション ■日常的なスクリーニング法として使用するマルチプレックス PCR ■利点と特徴 ■特徴付けと定量 ■MPCR に関わるキーとなるファクター ■Dual、real PCR ■マルチプレックス PCR (M-PCR) キット トラブルシューティングガイド ■マルチプレックス PCR (M-PCR) キット Q & A 集 イントロダクション PCR テクノロジーの進歩は遺伝子分析や重要な医学的手段をプロファイルさせる手助けとなっています。核酸をベースとした 分析テクニックというのは高感度で信頼でき、なおかつ定量結果も簡単に得られるべきものです。ゲノム配列データの前進は 次第にラージスケールの遺伝学的分析を招き、臨床の場に置いても有効になることでしょう。そして実際、DNA マイクロアレイ を含む膨大な遺伝子配列の分析に適用する手段となっています。しかし、運用費や感度、データ分析の効果等の限界がありま す。重要なことは、殆どの生物学的過程において決定的な役割を担う遺伝子は 50 個以下ということです。一度に 20∼30 個 の遺伝子サンプルを数百から数千解析し始める際は、DNA チップテクノロジーが最適なアプローチであるとは言えません。従 来の PCR で、同時に遺伝子 1 個ずつの発現を分析することがよいとも言えません。マルチプレックス PCR (MPCR) は同時 に数十個の遺伝子を分析できるため、ターゲット遺伝子の特徴付けや遺伝子発現のプロファイリングに有用です。 MBI 社の膨大な数の目的遺伝子を検出するための方法開発のストラテジーは、PCR の増幅能力と 1 本のチューブで行える 膨大な数の目的遺伝子検出の能力を併せもつ MPCR に基づいています。プライマー1 ペアの代わりに、MPCR は複数ペア のプライマーで様々な DNA サイズを一度に増幅します。つまり、1 つの PCR チューブで 5∼10 個あるいはそれ以上のサイ ズが異なる 短い DNA を増幅します。私たちの特許技術 (US patent 5, 582, 989) は 1 個のスタンダード DNA に多数 のペアプライマーがアニールし、一度に多様な配列を増幅させるというものです (図 1)。各ペアの一方のプライマーは配列の センス鎖と相補し、もう一方のプライマーは同じ配列のアンチセンス鎖と相補しています。交互にアニールし、プライマーを伸長 させることで増幅は行われます。従来の MPCR には非特異的増幅産物を引き起こす可能性があるミスプライミングやプライ マー二量体のような諸処の問題や、プライマーセットの違いで増幅効率の違いを引き起こす可能性、GC 含量の違いや熱力学 的構造の違いそしてハイブリダイゼーションカイネティクスなどの考えさせられる問題がありました。MBI 社の特許技術では MPCR アッセイにおけるこれらの多様な要因で起こる誤ったシグナルを全て排除することが可能です。 日常的なスクリーニング法として使用するマルチプレックス PCR 遺伝子がいつ・どこで・どの程度まで発現されているかといった分析・比較は一般的に発現プロファイリングとして知られていま す。発現プロファイリングはよく分かっているコントロールや個々の遺伝子産物の作用形態を提供します。低感度で高コストの ため、DNA チップは日常的なアッセイとしてよりも検出方法としてもちいるべきツールです。おおくの場合、一部分の遺伝子が たいていの生物学的過程に関わっています。そういった遺伝子の解析には、内在的コントロールとしてハウスキーピング遺伝 子を用い、一度に 2 個以上の遺伝子を定量化することが望ましいでしょう。一度にできる増幅や定量化は経済的で、より高い 処理能力を生み出します。MBI 社の MPCR キットはマルチ遺伝子発現の日常的なスクリーニングを目的としており、迅速で信 頼性があり且つ経済的です。内在的コントロールを使用することで、一つのトータル RNA 中の、あるいは一つのサンプル中の 様々な mRNA の定量を行うことができます。この方法はサンプル内の異なる mRNA 種の競合分析にも適応できます。ハ ウスキーピング遺伝子を用いることで個々の mRNA 種のレベルをサンプル間で比較します。この技術の解釈は分裂停止期 の時でさえ、増幅反応が相対遺伝子率を支持するということです。加えて、ハウスキーピング遺伝子を取り入れることが遺伝子 間で起こるエラーを排除します。 Real-Time PCR は転写の定量を行う方法のスタンダードとなっていますが、一つの反応、言い換えれば複数の遺伝子の分 析にはコストが大きく不向きです。Real-Time PCR は MPCR を行った後、確認として遺伝子の定量に使用する方がよいで しょう。 利点と特徴 MPCR 技術はさらなる実験効率を提供します。MPCR は従来の PCR のような目的の遺伝子の数に応じて試薬や機材を分 けて行う方法に比べて、一つの反応で多様な遺伝子を増幅することが可能なので必要な機材の節約にもなります (Fig.2)。 MPCR と通常の PCR との比較した図が Table1 になります。MBI 社の MPCR キットは操作手順、生物学的汚染、ゴミを 減らすためにあらかじめ混ぜてある試薬が提供されています。複数の遺伝子の品質結果が得られており、数時間内のうちで一 度に定量化し、次の実験に進行することが可能です。 MPCR は実験室の時間と労力の節約のための強力なスクリーニング方法です。図 3 では MPCR が中程度もしくは高感度 を必要とする膨大な mRNA 種の相対的濃度を決定するのにいかに向いているかを表しています。MBI 社の MPCR キットは 逆転写反応によって生じた未精製の cDNA をそのままお使いいただけます。 ■MPCR の利点 ・ 使用が簡単 ・ 生物学的汚染の排除 ・ 高感度 図3 ・ 高特異性 ・ 手軽 ・ 時間・労力・試薬の節約 ・ 1 回の反応で全てを検出 ・ 簡単な定量化 ・ オリジナルの遺伝子サンプルの節約 ・ 簡単なデータ解析 ・ Short Hand on Time MBI 社の MPCR キットは生物学的過程の制御に関わっている遺伝子だけでなく研究者が興味をもつ遺伝子の特徴付けの 手助けをします。例えば、細胞制御経路、細胞制御に関わる成長因子の形質転換、細胞増殖や細胞死 (アポトーシス)等で す。図 4 参照。MBI 社は細胞制御回路を分析するのに必要な鍵となる遺伝子全てを組み合わせた 3 つの MPCR キットを提 供しています。MBI 社は細胞制御回路で主要な役割を果たす遺伝子の広い総覧を研究者に提供しております。 MBI 社はパスウェイ遺伝子発現のプロファイリングから病原体識別の診断までのアプリケーションをカバーする多様な MPCR を提供しています (図 5)。MPCR キットには異なる生物学的パスウェイの分析用に、様々な既知遺伝子の組み合わせ たセットを用意しています。また、カスタマイズされた遺伝子増幅のための研究者独自の遺伝子を付け加えた特別な MPCR キ ットも提供しています。 特徴付けと定量 PCR は選択的に DNA の不連続部分を増幅します。PCR の主なアプリケーションの一つは高感度で特異的な増幅による mRNA 種の検出と定量です。MPCR キットは PCR 増幅技術と一つのチューブで多様な目的遺伝子の検出を可能にした技術と を組み合わせています。MBI 社の特許技術は各プライマー間で同じような増幅キネティックスをもたらし、PCR 産物の非特異 的増幅を排除しています。MPCR は生物学的パスウェイの特徴や薬剤耐性アイソフォームの解析、SNP 解析そして遺伝子発 現プロファイリングの定量といったゲノミクスの多様なアプリケーションに使用可能なハイスループット方法です。 ■特徴付け 1. HPV ウィルスタイプ MPCR は多くの臨床学的・疫学的な環境における病原体の特徴付けのための有効方法です。MPCR は各ウィルス及び ウィルスが関係した兆候を調べるために使用できます。そして様々な病気におけるウィルス感染との関係を調べることが できます。さらに、MPCR は疫学的研究におけるウィルス株のタイプやサブタイプの決定においてコスト効率が良い方法 となります。ヒトパピローマウィルス (HPV) は、世界で 2 番目に一般的な癌である子宮頸癌と関係があることが分かって います。40 タイプ以上もの HPV が性感染します。これらの HPV は臨床学的関係や in vitro 形質転換能力を基に高 リスクタイプ (HPV16、18) 、中程度リスクタイプ (HPV31、33) そして低リスクタイプ (HPV6、11) にグループ分け されています。 MBI 社はリスクが異なる全ての HPV を組み合わせた MPCR キットを開発しました (Fig6)。MBI 社の HPV MPCR キットは Dr. Chudzio 等により女性用異型細胞診の迅速な診断方法として承認されています。医師等は MBI 社の HPV MPCR キットが数時間のうちに HPV 感染やウィルスのサブタイプの確認を容易に行えるということに気づくでしょ う。 2. 変異検出 : 挿入、欠損そして部位特異的変異 MPCR キットは病原体サブタイピングや遺伝子アイソフォームに使用されるだけでなく、挿入や欠損そして部位特異的 変異を含む多様な変異分析にも使用されています。MBI 社は Linden やプロトロンビン遺伝子 (Factor II) の点突然 変異 G20210A をワンステップで検出する MPCR キットを開発しました。Figure7 には検出システムにおけるプライ マーデザインの基本的な原理を記しています。Factor V 遺伝子 G1961A 変異 (Arg506 → Gln) は 1994 年に Bertina グループによって初めて検出されました。この変異は重篤な静脈血栓症を引き起こす最も一般的な欠損変異で す。prothrombin 遺伝子 (factorII) G → A (20210) 変異は静脈血栓症の高リスクに関わっています。ASA PCR には二つの異なる PCR 反応が不可欠で、そして正常・変異遺伝子型のアレル特異的プライマーが必要です。ネガティブ コントロールの正当性を立証するために factor IX は PCR 内在性コントロールとして共増幅されました。Figure7 は 遺伝子変異をもつ患者ごとからの血液 DNA の結果を表しています。MBI 社の Factor V Linden や G20210A MPCR キットは Kaiser Permanent North Regional Laboratory Blood Bank で日常的な患者スクリーニングテ ストとして使われています。 ＊欠損 デュシェーヌ型、ベッカー型筋ジストロフィー (DMD/BMD) は効果的な処置がない X 染色体連鎖型致死遺伝子疾患 です。重要なことは DMD/BMD の防止にあたることです。防止には、遺伝学的カウンセリングや出生前診断を通して患 った男児を妊娠していそうな女性の同定も含まれています。正確なキャリア検出や遺伝学的カウンセリングは発端者の変 異自体の同定に依存しています。DMD 遺伝子中の変異は、欠損・重複・点突変異といった 3 つの異なるカテゴリーに分 類することができます。DMD 遺伝子の 70 エキソン中の欠損は全 DMD 変異の ∼60% を占めます。Beggs や Chamberlain によって改変された MBI 社 DMD/BMD MPCR キットを使ってその 98% が検出できます。MPCR の プロトコールを使用する出生前診断は家族に欠損変異があると分かっている妊娠中の男児に同じ欠損があるかどうかを 決定します。 ■定量 1. アイソフォーム検査/定量：Toll-Like Receptors について 細胞内での遺伝子発現は、一時的なものや正常な細胞増殖・分化を維持する組織特異的に綿密に制御されています。 細胞外カルシウムはケラチノサイトの分化を促進し、そしてその過程は皮膚の表皮部分を保護する主要な細胞過程の一 つです。他の細胞システムにおいて、CD14 や TLR-4 (Toll-like receptor-4) は細胞増殖に関わる遺伝子発現に制 御されていないということが言われています。TLR シグナリングパスウェイに関わるケラチノサイトの分化をテストするた めに、私たちは、MBI 社の MPCR キット (MP-70190) を使って異なる Toll-like receptor の遺伝子発現における 細胞外カルシウム (Cao) の影響を評価しました。CD14 と TLR-4 の遺伝子発現は低細胞外カルシウム (0.03mM) ではなく高細胞外カルシウム (1.2mM) 状況下で検出されました。TLR-4 と CD14 はそれぞれ、 631bp と 203bp に検出され、内在性コントロール GAPDH 遺伝子でノーマライズした後の遺伝子発現の相対数が 図 8 に載っています。標準イメージングシステムを使うことで、私たちは MPCR 結果の semi-quantitate な遺伝子発 現の半定量を可能にしました。 2. 薬剤耐性遺伝子 Dr. Ruediger Salowsky 氏 (Agilent Technologies Deutschland GmbH) の協力で、候補遺伝子の迅速な発現 スクリーニングのために、RT-MPCR と microfluidic amplicon end-point 分析とを組み合わせたアッセイの開発を しました。 近年、私たちは薬剤耐性腫瘍のうち 11 つを選び、メラノーマモデルシステムでの規制が解除を実証しました。アッセイの パフォーマンスを評価するために、Dr. Salowsky 氏がアレイとノーザンブロット分析からこれまでの結果を比較し、そし て悪性メラノーマ細胞株４つまで実験の手を広げました (図 9)。両アッセイは RT-MPCR アッセイが多様な候補遺伝子 において発現パターンが再現可能な信頼性のあるスクリーニング方法であるということを実証しました。(図 9 の結果は Dr. Ruediger Salowsky と Rainer Wittig グループによるもの)。どんな市販のゲルイメージシステムでも MBI 社 の MPCR キットの結果を定量するために使用できます。私たちは Agilent 2100 Bioanalyzer が素早く、クリアなそ して遺伝子アンプリコン毎の定量を必要とせずに自動定量化できることを実証しました。Agilent 2100 Bioanalyzer に は広い線形力学範囲があり、選択された数の遺伝子に関するデータを呈し、自動化された方法で簡単に他の機器とデー タを共有できます。 各プライマー間の干渉を最小限に抑えることが MPCR 増幅を成功させる重要なファクターになります。また、反応効率 を最大にすることは鋳型の初期濃度の範囲をより広め、正確な定量が可能ということです。増幅を目的とした 2 つの遺伝 子の PCR 産物間の初期コピー数が大きく異なるというのは、ハウスキーピング遺伝子や興味ある珍しいメッセージをもつ サンプルをスクリーニングする時には共通に言えることです。それ故に、鋳型の初期濃度を変えることが PCR 効率を最 適化するために不可欠でし。MPCR では、最初のコピー数に関わらず指数関数的に個々の遺伝子を増幅することも重要 です。図 10 には、異なる量の cDNA を使って MPRCR を行い、連続的なサイクルを試行することで増幅サンプルが視 覚化できることが示されています。ここで 2 つのキーポイントがあります。1) MPCR で表される個々の遺伝子全てが PCR サイクルの回数に応じて比例的に増幅される。 2) 初期材料 5ng の total RNA (10 倍希釈) を用いると、マル チプル遺伝子の intensity は初期材料 50ng (25 サイクル) を用いたものに比較するとおよそ 1/10 レベル (28 サ イクル) で表されます。この結果は MPCR が増幅状況下でどんなターゲットの増幅でも変化せず一度にマルチプル遺 伝子発現を定量するということを示しています。 MPCR に関わるキーとなるファクター マルチプル遺伝子の定量は一度に遺伝子全ての正確な増幅を必要とします。プライマーデザインやバッファーシステム、そし てアニーリング温度などのキーとなるファクターがあります。MPCR 実験を成功させるために、各反応の効率を最大且つ均一 にし、個々の反応のいかなる交差活性も最小にしなければなりません。プライマー間の 3’ 側のオーバーラップの排除が非特 異的増幅を避ける重要な要因となります。多様な反応のコンポーネントが混ざる際にどんな違いも増幅されるので個々の反応 が同じような効率になることが重要です。遺伝子定量がより簡単に、より正確に、そして時間が節約されるようにそして再現不 可能な定量のせいで試薬コストがかからないように、MPCR 実験の反応動態もまた同じ個々の PCR 実験の反応動態に近 づける必要があります。PCR 増幅効率は各シングル PCR と MPCR とを比較するとわずかに異なります。各ターゲットの反応 動態を近似のものにするにはプライマー濃度の調製が必要になるでしょう。 MPCR では同じ増幅反応で異なるプライマーペアーを使用します。MPCR では異なるプライマー鋳型システムの増幅効率 を最適化するためにアニーリング条件を最適化する必要があります。異なる PCR バッファーシステムは異なる増幅効率を示 すおそれがあります (図 11)。これらの結果は、サイクリング条件でさえ個々のプライマー鋳型システムの効率的な増幅をもた らすということを示しています。この影響は、恐らくプライマー分子自身やプライマーと MPCR で生じた PCR 産物間での非特 異的ハイブリダイゼーションによるものです。これらの影響をなくすために、異なるサイズの PCR 産物の効果的な同時増幅の ためにバッファーシステムを用いて MPCR キットを最適化しました。また、私たちがもつ特許 MPCR バッファー組成は非特 異的ハイブリダイゼーションを減らし、同一条件下で異なるプライマーの効果的増幅を可能にします。 PCR ターゲット配列の二次構造は増幅成功率や PCR 産物の下流使用においてマイナスの影響があります。プライマーデザ インは二次構造の形態を排除するための重要なファクターです。さらに、最適なアニーリング温度が二次構造を排除する手助 けをします。そして PCR のローバスト性を上昇させる手助けをします。 Dual、real PCR 遺伝子同定や定量の他に、MPCR や Real PCR、Dual quantitative PCR もまた遺伝子発現の定量に使用されていま す。前述のように、Real Time PCR は病気の予後診断あるいは MPCR で得られた遺伝子定量の追認に有用です。しかしな がら Real-Time PCR は日常的なアッセイとして使用されるには選ばれやすくはありません。MBI 社は特許技術を適用して 関連ある遺伝子発現レベルを決定するために Dual Quantitative PCR 技術を開発しています。MBI 社の Dual Quantitative PCR キットというのは一つのチューブで特異的なハウスキーピング遺伝子とそれぞれのターゲット遺伝子を共 増幅して Quantitative PCR 増幅するものです。最適化された Dual Quantitative PCR 技術は標準 PCR として簡単に 行えます。そして高発現ハウスキーピング遺伝子の増幅は低発現ターゲット遺伝子あるいはその反対においても干渉はしませ ん。図 13 では、パネル A で示されてある 5 倍希釈毎のヒト脳 cDNA の Real-Time PCR 分析と関係する Dual Quantitative PCR の結果がパネル B に示されています。パネル B においてもまた、内在性コントロールはターゲットとする 遺伝子発現を干渉しません。この結果は、MBI 社の特許技術が通常の Real-Time PCR と同じくらいの簡単さでハイスルー プットアッセイを必要とする研究者に大きな利点をもたらします。 MBI 社の Dual quantitative PCR 増幅キットはユーザーによる最適化を要せず、使いやすく、信頼性のある有用な定量技 術です。ユーザーはトリートメントによって変化しないくらいの発現レベルを有する適切なハウスキーピング遺伝子を選ぶだけ です。加えて、MBI 社は、研究の際、適切なハウスキーピング遺伝子の特徴づけを行うユーザーのために GAPDH (G)、 18S (S)、T-Transferin Receptor (T)、P-Phospholipase A2 (P) そして L32 (L) を含む様々なハウスキーピング遺伝 子を提供しています。選択したハウスキーピング遺伝子とターゲット遺伝子の共増幅は定量的結果をもたらします。遺伝子発 現レベルの変化はサンプルからサンプルへのローディング変化を避けながらモニターされます この Dual quantitative PCR 増幅キットは Real-Time PCR 遺伝子発現に必要な試薬一式を提供しています。 Dual、real PCR 遺伝子同定や定量の他に、MPCR や Real PCR、Dual quantitative PCR もまた遺伝子発現の定量に使用されていま す。前述のように、Real Time PCR は病気の予後診断あるいは MPCR で得られた遺伝子定量の追認に有用です。しかしな がら Real-Time PCR は日常的なアッセイとして使用されるには選ばれやすくはありません。MBI 社は特許技術を適用して 関連ある遺伝子発現レベルを決定するために Dual Quantitative PCR 技術を開発しています。MBI 社の Dual Quantitative PCR キットというのは一つのチューブで特異的なハウスキーピング遺伝子とそれぞれのターゲット遺伝子を共 増幅して Quantitative PCR 増幅するものです。最適化された Dual Quantitative PCR 技術は標準 PCR として簡単に 行えます。そして高発現ハウスキーピング遺伝子の増幅は低発現ターゲット遺伝子あるいはその反対においても干渉はしませ ん。図 13 では、パネル A で示されてある 5 倍希釈毎のヒト脳 cDNA の Real-Time PCR 分析と関係する Dual Quantitative PCR の結果がパネル B に示されています。パネル B においてもまた、内在性コントロールはターゲットとする 遺伝子発現を干渉しません。この結果は、MBI 社の特許技術が通常の Real-Time PCR と同じくらいの簡単さでハイスルー プットアッセイを必要とする研究者に大きな利点をもたらします。 MBI 社の Dual quantitative PCR 増幅キットはユーザーによる最適化を要せず、使いやすく、信頼性のある有用な定量技 術です。ユーザーはトリートメントによって変化しないくらいの発現レベルを有する適切なハウスキーピング遺伝子を選ぶだけ です。加えて、MBI 社は、研究の際、適切なハウスキーピング遺伝子の特徴づけを行うユーザーのために GAPDH (G)、 18S (S)、T-Transferin Receptor (T)、P-Phospholipase A2 (P) そして L32 (L) を含む様々なハウスキーピング遺伝 子を提供しています。選択したハウスキーピング遺伝子とターゲット遺伝子の共増幅は定量的結果をもたらします。遺伝子発 現レベルの変化はサンプルからサンプルへのローディング変化を避けながらモニターされます この Dual quantitative PCR 増幅キットは Real-Time PCR 遺伝子発現に必要な試薬一式を提供しています。 マルチプレックス PCR (M-PCR) キット トラブルシューティングガイド ※以下、マルチプレックス PCR を MPCR と呼びます。 I. マルチプレックス PCR キット使用時のよくある問題点 1. 目的のバンドが見られず、余分なバンドが出現 2. バンドがスメア状になっている 3. バンドのサイズまたは(及び)分子量がはずれている II. 問題点は、PCR 操作にあるのか、cDNA 調整にあるのか？ 1. 必ずポジティブコントロールを流してください。 • キットを使用する前に添付のプロトコルをご一読下さい。本キットで最適な結果を得る為のポイントが 記載されています。 • ポジティブコントロールは、問題が PCR 操作に由来するか、cDNA サンプルに由来するかを判定する 最適な方法です。 2. ポジティブコントロールのバンドが検出された場合、問題が PCR 操作、あるいは cDNA 調整法にある可能 性があります。 3. cDNA サンプルのバンドが見られた場合、問題点は PCR 操作法にある可能性があります。 III. ポジティブコントロールについての問題点 1. ポジティブコントロールのバンドが見えない。 • アニーリングの温度を徐々に(2℃ずつがお薦めです)下げてみましょう。 反応条件の緩和がアニーリングを促進させます。温度が高すぎるためにアニール出来ず、バンドが出 現しない場合もあります。 • PCR 反応に使用する cDNA テンプレート量をふやしてみましょう。 反応チューブに、より多くのテンプレートの追加が可能でしたら、より簡単にプライマーがアニーリング サイトを見つける事が可能になります。 • PCR のサイクル数を増やしてみましょう。 サイクル数が少ないとゲル上で見えるほど十分な DNA を複製することが出来ませんので、サイクル数 を増やすことは対数的に PCR 産物量を増やすことになります。 • アニーリング時間を延長してみましょう。 より感度の高いプライマー/cDNA 相互作用のアニーリングを促進させます。 • Taq polymerase 濃度を調整してみましょう。 これはキット中には含まれていませんので、Taq の濃度を最適化する必要があります。バンドが見えな い時は、一般的に濃度を上げる必要があります。 • dNTP によって起こる問題もテクニカルサービスでは調査済みです。使用するまで dNTP サンプルは分注 し、凍結してください。溶解しないように−20℃で保存してください。凍結融解を繰り返すと、活性の低下 を招きます。 Note ：バンドが見られないことは、プライマー間の相互作用によって起こる可能性があります。この影響はプライマーの選択とバッファー の調整にもとづいたキットの開発/最適化によって最小限に抑えられています。プライマー間の相互作用が疑われる場合には、このガイドの セクション V に記述してある"hot-start"法を利用してください。 2. ポジティブコントロールの結果で、余分なバンドが出現した。 • アニーリングの温度を徐々に下げましょう(2℃ずつがお薦めです) 反応条件を大幅に緩和すると、生じている非特異的結合を減らすことが出来ます。 • テンプレート量を減らしてみましょう。 少量のテンプレートであれば、プライマーがアニーリングサイトを見つけることが困難になるために、非 特異的結合の可能性が減少します。 • プライマー量を減らしてみましょう。 個々のプライマー濃度は調整できません。相対的濃度は、最適化テストにおいて最高の結果を得るた めに最終的に調整されています。反応溶液に、より少ないプライマー成分の量を加え、全体のプライマー 濃度を下げましょう(5uL 以下がお薦めです)。 • Taq polymerase 濃度を下げてみましょう。 反応条件をさらに緩和すると、非特異的結合の可能性を低下させます。 • ミスプライミングを避けるために、このガイドのセクション V に記述してある"hot-start"法を利用してくだ さい 3. バンドの分子量が、プロトコル内で述べられている予想される分子量と一致しない。 • バンドのサイズが DNA ラダーと比較して、サンプルバンドの分子量が大きい。 →電気泳動の際の PCR 産物量を減らしましょう。PCR 産物量が多すぎると、ＤＮＡラダーサンプルよりも 遅くゲルマトリックスを通過するので、バンドサイズの相関上、不一致の原因となります。 • バンドのサイズが DNA ラダーと比較して、サンプルバンドの分子量が小さい。 →電気泳動の際の PCR 産物量を増やしてみましょう。電気泳動サンプル量が少なすぎると、DNA ラダ ーサンプルよりも速くマトリックスゲルを通過するので、バンドサイズの相関上、不一致の原因となりま す。 4. Taq polymerase について (キット中には含まれておりません) 使用ブランドにより、実施方法が多少異なります。 • お薦めのブランド →Perkin-Elmer AmpliTaq (AmpliTaq Gold ではありません。バッファーに関しては Perkin-Elmer に添付のバッファーを使用してください。) • お薦めできないブランド →Gibco-BRL (反応に 2 倍の容量が必要になります) →BMB 5. 温度について プロトコル内に記載されている通り、2 段階の温度サイクルを使用してください。これは PCR 反応で見られる 3 段階のサーモサイクルとは異なり、マル チプレックス PCR では良い結果が期待できます。 • マルチプレックス PCR における変性段階では、94-96℃に設定してください。 • このキットは複数のプライマーペアを使用して良い結果を得る為に開発されました。最適な特異性はアニ ーリングと伸長の温度が統合する時に得ることができ、2 段階サイクルを作り出しています。この 2 段階 サイクルにおいては、アニーリング温度の平均値より少し上で、より低い伸長温度は、厳密な反応条件や プライマーテンプレートとテンプレート cDNA サンプル間の特異性をより促進する為に併用し、良い結果 をもたらします。 • これらの温度パラメーターの補正により、結果の反応収率向上が期待できます。 6. サーマルサイクラーについて Perkin-Elmeｒ サーマルサイクラーをお薦めします。 III. cDNA サンプルについての問題点 cDNA サンプルでおかしな結果がでた場合は、PCR の手技または cDNA サンプルの精製に問題があると思われ ます。ポジティブコントロールを含めて実施して下さい。まだポジティブコントロールを実施していないのであれば、 適切な PCR 手技を確認するためにも、ポジティブコントロールを実施して下さい。 1. DNA サンプルでのバンドがでない。 予想される DNA サンプルのサイズがわかっていればテクニカルサービスに連絡した時に役立ちます。 最初に下記の解決策を試して下さい。 • dNTP 溶液を分割し、凍結したことを確認する. • アニーリング温度を下げる。 • アニーリング時間を増やす。 • Taq polymerase の濃度を上げる。 • ｻｲｸﾙ数を増やす。 • ｴﾀﾉｰﾙ沈殿法で、cDNA サンプルからインヒビターを取り除く。 2. サンプル cDNA の結果で、余分なバンドが出現している 予想される DNA サンプルのサイズがわかっていればテクニカルサービスに連絡した時に役立ちます。 最初に下記の解決策を試して下さい。 • アニーリング温度を上げる。 • テンプレート量を減らす。 • 反応に加えられているプライマー量を減らす。 • 酵素量を減らす。 • 他のターゲット RNA/DNA で実験自体がｺﾝﾀﾐをしている。実験場所を点検して下さい。実験作業の流れ は一方向性ですか？増幅前と増幅後の分業エリアによるクロス−コンタミネーションを最小限度にするよ う心がけてください。 • 反応と反応の間の DNA クロスオーバーを防ぐ為に、dUTP/UDG のような無菌手技を利用して下さい。 • 余分なバンドが現れる原因である、ゲノム DNA のコンタミネーションである可能性があります。このことが 疑われる場合は、RNA サンプルを RNase-free Dnase 処理して下さい。 • cDNA が MPCR を妨げている場合は、フェノール／クロロフォルムで cDNA を再抽出することを考慮して 下さい。 3. cDNA サンプルのサイズが予想していたものと一致しない。 • 予想サイズよりも大きいサイズの場合。 →電気泳動する PCR 産物量を減らす。PCR 産物が多すぎると DNA ladder サンプルよりも遅くゲルマト リックスを通過するので、バンドサイズの相関上、不一致の原因となります。 • 予想サイズよりも小さいサイズの場合。 →電気泳動する PCR 産物量を増やす。PCR 産物が少なすぎると DNA ladder サンプルよりも速くゲル マトリックスを通過するので、バンドサイズの相関上、不一致の原因となります。 • cDNA サンプルのゲノム DNA コンタミネーションの可能性があります。この場合は、サンプルのバンド分 子量は予想されるものよりも大きくなります。問題解決のために、RNA サンプルを RNase-free Dnase 処理して下さい。 4. 実験サンプルとコントロールが同じサイズである。 • 特異的遺伝子の PCR 増幅が上限を超えてしまっている可能性があります。PCR ｻｲｸﾙ数または入れた DNA を減らす。 • サンプル調製、RT 反応、入れる cDNA 量における相違は、変異を除去する為に、ハウスキーピング遺伝 子で平行に PCR を実施することにより分離されるでしょう。 5. 様々な種類の cDNA での実験結果について 異なる種類からの cDNA では、偽の結果を招くことがあります。いくつかの細胞では mRNA を産生しない場合も あります。バクテリアのプラスミドは、mRNA 塩基を放出するとして知られてきました。テクニカルサービスは cDNA 抽出源を研究することが可能で、過去の研究で見られる散発的な結果ではあるが、調べることが可能で す。 • cDNA は直接組織から抽出された RNA ですか？ • cDNA はプライマリーカルチャーから抽出された RNA ですか？ • cDNA は株化細胞から抽出された RNA ですか？ • Human/mouse/rat/その他のゲノム DNA の遺伝子導入されたバクテリアから抽出された RNA です か？ • Human/mouse/rat/その他の cDNA の遺伝子導入されたバクテリアから抽出された RNA ですか？ Ⅴ. 補足 Hot start 法について 反応液成分を室温で混合する場合は、反応が始まってしまうのに十分な温度となってしまいます。低い温度では あるが、非特異的な増幅及びプライマーダイマー形成のような、不必要なサイド反応を促進します。これらのサイ ド反応は、反応における Hot start PCR 法を取り入れることにより、避けることが可能です。Hot start 法は、一 般的に 60℃以上に達するまでに、特定の反応成分の有効性を制限することによって働きます。下記に今現在、リ サーチコミュニティーにおいて使用されているいくつかの方法を示してあります。 • Hot start 法はマニュアルで実施して下さい。反応混合液がより高い温度に達した時に、重大な成分を加 えることにより実施されます。これは集中的な仕事であり、コンタミネーションの可能性を減らす Hot start 法を組み込む経済的な方法です。 • 他の方法では 60℃以上で溶解するワックス成分を取り入れています。ワックスが溶解すると同時に、成 分は混合液に放出され、そして反応が始まります。この方法には、AmpliTaq Taq polymerase と一 緒に Ampliwax の使用をお薦めします。（Perkin-Elmer 社） • 3 番目の方法として polymerase に対する抗体（temperature-sensitive）があります。これは酵素が 働かない低い温度に限り結合します。温度が達した時に、この抗体は酵素からそのもの自体を放出し、 反応は進みます。この方法には、Clontech の Taq antibody をお薦めします。 マルチプレックス PCR (M-PCR) キット ※ 以下、マルチプレックス PCR キットを Q & A集 MPCR と呼びます。 Q1. MPCR と通常の PCR との違いは？ A1. 一般的な PCR は通常、特異的な配列を増幅するプライマーを 1 組しか使用していません。 一方、MPCR は同時に多くの配列を増幅するための複数組のプライマーを使用しています。1 つのチューブ中に多数の PCR プライマーが存在することは、ミスプライミング PCR 産物、プラ イマーダイマー、短い DNA 断片に偏った増幅などの多くの問題の原因になる可能性があります。 Q2. MPCR バッファーと通常の PCR バッファーの違いは？ A2. 主として MPCR バッファーには Taq polymerase 付加剤(Additive)が含まれています。 これは増幅産物間の競合を減らし、MPCR 中の長い DNA 断片の増幅を増やす働きがあります。 その他のバッファー組成は、MPCR と通常 PCR とで同様です。 Q3. MPCR により増幅された DNA 断片が、目的の遺伝子に特異的であるかを、どのように測 定できますか？ A3. MPCR 産物は、遺伝子特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出が可能 です。ほとんどすべての PCR 産物に対して通常のプローブとビオチン標識プローブの両方を用 いて証明されています。 Q4. MPCR キットを使用した結果から何の情報を得ることができますか？ A4. これらのキットは各キット特異的に目的の mRNA を検出し、研究目的だけに使用します。 ここ結果の解釈は、研究している特異的システムによります。 Q5. MPCR で使われているプライマーの配列を入手できますか？ A5. 配列は企業秘密ですのでお教えすることは出来ません。どうかご了承下さい。 Q6. 2 段階 PCR サーマルサイクラーとは？また、通常の 3 段階 PCR 法をどのように編集すれば良 いですか？ A6. 一般的な PCR 条件は、変性反応： 94℃/1min.、アニーリング反応：40-60℃/2-5min.、 伸長反応： 70℃/2-5min.となっています。これは 3 段階 PCR 法とも呼ばれています。2 段階 PCR 法では、アニーリングと伸長温度は併合されており、変性反応： 94℃/1min.とアニーリ ング/伸長反応： 60-70℃/2-5min.となっています。Taq polymerase によるプライマーの伸 長反応は 72℃でもっとも効果的な結果が期待できます。2 段階 PCR 法において、60-70℃の温 度範囲が伸長には十分で、逆に PCR の結果には影響はありません。2 段階 PCR 法は炎症関連性 のサイトカイン MPCR を含む、多くの適用として成功しています。一般的に特異的なターゲッ トを 100 倍に増幅するには 25-40 サイクル数が必要です。 Q7. MBI 社の PCR ポジティブコントロールを自分の PCR プライマー用に使用することがで きますか？ A7. RT-PCR においては、いくつかのコントロールは全長の cDNA クローンです。この場合に は特異的遺伝子のプライマーに使用可能です。また、いくつかのポジティブコントロールは特異 的な RT-PCR 産物です。この場合は MBI 社プライマーに限り使用できます。 Q8. なぜ MPCR で ampli-Taq Gold が使用できないのでしょうか？ A8. Taq Gold には独自のバッファーが必要になるのでお薦めできません。 Q9. MBI 社ポジティブコントロールのバンドが検出出来ないのですが、どうしたら良いです か？ A9. MBI 社ポジティブコントロールは、特に MPCR ｷキットに含まれている MPCR プライマー とバッファーでの使用用としてデザインされています。異なる機械では操作性も違いますので、 マニュアルにおいてアニーリング温度の参考範囲をご提供しています。アニーリングの至適温度 は使用しているサーマルサイクラーにより決定しなければなりません。バンドの消失は PCR 条 件が厳しい、及びアニーリング温度が低いということを示唆します。 Q10. MBI 社ポジティブコントロールで余分なバンドや、非特異的なバンドが出現した時、ど うしたら良いですか? A10. 一般的には、アニーリング温度はプライマーの Tm 値が基本となっています。非特異的 なバンドﾞが検出されたら、余分なバンドが消失するまでアニーリング温度を 2-5℃上げて下さ い。テンプレート、プライマー、Taq polymerase 条件も最適化することが出来ますが、この 場合には各容量を増加するようにして下さい。 Q11. 反応中のすべての産物はもろくなっています。どのように回収量を増やすことができま すか？ A11. 回収量を増やすにはいくつかの方法があります。 • 徐々にアニーリング温度を下げる。（2℃ずつをお薦めします） • アニーリング時間を延長する。 • テンプレート濃度を上げる。 • 反応に加えるプライマー量を増やす。 • Taq polymerase 濃度を調整する。 • PCR サイクル数を増やす。 • 上記に示したことを組み合わせて実施してみる。 Q12. 反応で非特異的産物が出現しました。これを取り除くにはどうしたら良いでしょうか? A12. いくつか解決法があります。 • 徐々にアニーリング温度を上げる。（2℃ずつ上昇をお薦めします） • テンプレート量を減らす。 • プライマー量を減らす。 • 酵素量を減らす。 • 上記に示したことを組み合わせて実施してみる。 Q13. MPCR キットには、どのくらいの RNA サンプルが必要ですか？ A13. 下記の表を参照してください。 サンプル 最終容量 希釈 106-107 細胞 (RNA) 100uL - cDNA に転写された RNA 5uL 50uL 1:20 PCR に使用される cDNA 1uL - 1:50 ＊106-107 細胞個から抽出された RNA の最終希釈倍率は 1:1000 です。106-107 細胞個からの total RNA は、Maxim Multiplex PCR Kit 使 用で十二分な cDNA 量を提供します。