消 化器癌 患 者 の末梢 血T cellのHelix pomatia A hemagglutinin結 合
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消 化器癌 患 者 の末梢 血T cellのHelix pomatia A hemagglutinin結 合
消 化 器 癌 患 者 の 末 梢 血T cellのHelix hemagglutinin結 pomatia A 合活 性 の検 討 第2編 臨床検 討 岡山大 学医 学部 第1内 科教 室 安 原 高 士 (昭和61年3月18日 Key word: Helix pomatia 末 梢 血T cell, A 受稿) hemagglutinin ,結 合 活 性,消 化 器 癌, neuraminidase cellに 結 合 す る性 質 を 利 用 し,消 化 器 悪 性 腫 瘍 緒 最 近,諸 言 種 レ クチ ン(PNA, ど)を 用 い て,マ 患 者 を 対 象 に 末 梢 血HP結 LPA, SBAな ウ ス あ る い は ヒ ト リ ンパ 球 を 分 画 す る 試 み が な さ れ て い る.更 に これ 等 レ ク 対 象 1.対 機 能 と の 関 連 性 が 報 告1-5)さ れつ つ あ る. こ の リ ンパ 球 と レ ク チ ン との 結 合 活 性 の 差 が 肝 癌10例,胆 ト末 梢 血T 例 の 計20例(男 (HP)のT markerの1つ と pomatiaの ア ル ブ ミン 腺 よ り単 年 令50.5才),及 例 男 性,平 ine(D-GalNAc)に 瘍 患 者 は2例 結 合 特 異 性 を示 す6-9).ヒ ト リン パ 球 に 対 して は 活 性 化 能 は な い8,10).無処 2.方 se処 理 に よ り リン パ 球 表 面 の シア ル 酸 を除 くこ 1) 対 す るreceptorが receptorを 性6人,平 性14人,女 均 年 令55.1 性 肝 炎9 性2人,平 均 び 健 常 人 コ ン トロー ル11例(全 均 年 令30.1才)を 検 討 した.悪 性腫 を 除 き 残 り18例 は 手 術 不 能 な 進 行 法 [125I]HPの Green 表 出 し, 合 活 性 が 出 現 す る こ と が 示 され て い る8,11). さ ら にHP 癌1 癌 で あ っ た. 理 の リ ン パ 球 に は 結 合 しな い がneuraminida とに よ り, HPに 性14人,女 例,肝 硬 変 症7例),(男 離 さ れ る レ クチ ン でN-acetyl-D-galactosam HP結 腸 癌3例,胃 と消 化 器 癌 以 外 の 悪 性 腫 瘍3 才),良 性 肝 疾 患 コ ン トロ ー ル16例(慢 A hemagglutinin cellに 対 す る 結 合 活 性 を検 討 した. HPはHelix と 方 法 管 癌3例,結 例 の 消 化 器 癌17例 pomatia 変動 象 機 能 に 関 連 して い る事 実 に 注 目 し,著 者 等 は ヒ cellのsurface cellの 化 に つ い て考 察 し た. チ ン の リ ンパ 球 に 対 す る 結 合 活 性 の 有 無 とそ の 考 え られ るHelix 合T を 検 討 し,消 化 器 癌 患 者 で の 細 胞 性 免 疫 能 の 変 有 す る リ ンパ 球 の 大 部 作 成(Fig. Woodの Na-phosphate 125I(Amersham 1) 方 法 に 従 っ た. 50μl 0.5M buffer, pH 7.5にlmci NaIMS 30) , 1mg HP, 30μl 0.1 分 がT cellで あ る こ とが 知 られ て い る12-14). 一 般 に 悪 性 腫 瘍 患 者 に お い て は 免 疫 能 ,特 に %(W/V)chloramine させ た.そ の 後, 0.24%(W/V)sodium 細 胞 性 免 疫 能 が 低 下 して い る と云 わ れ て い る1521) .今 回 の 検 討 で は, HPが ほ ぼ 特 異 的 にT abisulfite 50μlを 加 え 50μl 0.8%(W/V)KI, 465 Tを 順 次 加 え60秒 反 応 met 反 応 を停 止 し,さ 0.5ml 5% BSA(SIG- らに 466 安 原 高 士 EDTA, pH 7.4)で1回 洗浄 し 混 入 す る 赤 血 球 を 溶 血 し た. さ ら にHBSSで3回 後HBSSに 洗 浄の 再 浮 遊(4×106 /ml)し, neuraminidase (SIGMA, type VI)を 度0.05U/mlと 37℃, 最終 濃 な る よ う 加 え, 45分 間incubateし 処 理 後,リ で2回 た. ン パ 球 はHBSS 洗 浄 し, 0.2%BSA, 0.02%NaN3を 含 むHBSS に 再 浮 遊(2×106/ml)し た. こ の リ ン パ 球 浮 遊 液0.5mlに [125I]HP 0.4μgを で90分 振 盪, そ の 後, assay mlを 加 え, た. mixtureの0.4 氷 冷 し たHBSS 重 層 し, 25℃ incubateし 2mlに 2000rpmで15分 間遠 心 し沈 殿 した リ ンパ 球 結 合 放 射 活 性 を γ-counterで Fig. 1. Preparation of 125I-labelled た.な HP. 測定 し おassayはduplicate で 行 っ た. MA, RIA grade)を 加 え た. [125I]HPの 精 製 3)リ ン パ 球subpopulationとneuramini dase処 はAgarose-Aminocaproyl-D-Galactosami ne(P. L biochemicals tographyを inc.)affinity 用 い て お こ な っ た.標 chroma 識 反応 液 を ラ ム(1.5ml)に freeの125Iを の せ, PBSに 十 分 溶 出 さ せ た 後, GalNAcで[125I]HPを D- 識HPの 液 は100μlず assayに な っ た.ま で凍結 4)末 のT (Fig. binding assay 2) =リ Fine Chemicals)を 比 重 遠 心 法 で お こ な っ た,分 4℃ で ト リ ス 緩 衛 化Hank生 (HBSS)で1回 (0.155M 洗 浄 し,次 NH4Cl, 10mM 率 を 測 定 し た. 合 量 理 リ ン パ 球 分 画(1×106) のT cellあ 合 量 を 算 定 し た. 合 量(ng/1×106 ン パ球 分画 のHP結 用 いた 理 リン パ 球 率 よ り 次 式 に て106個 cellのHP結 ヒ ト末 梢 血 リ ン パ 球 の 分 離 はFicoll-Hypa que(Pharmacia cell比 合 量 とneuraminidase処 cell比 T 理 リ ンパ 球 の cellのHP結 neuraminidase処 のHP結 量測定 法 でお こ ,同 様 の 方 法 でneuraminidase処 梢 血T り のHP結 保 存 し た. 梢 血 リ ン パ 球 の[125I]HP bind たneuraminidase処 一 部 を使 用 し で 濃 度 を 決 定 し た. つ 分 注 し-25℃ 率 使 用 し た 同 じ検 体 を 用 い て 橘 ら23) 理 リ ン パ 球 のT し てphenol法 蛋 白 量 を 定 量 し て[125I]HPの 2)末 ing 対 し て 透 析 し た 後, 無 標 識 のHPをstandardと [125I]HP溶 て 0.1M 溶 出 し た.標 放 射 活 性 のpeakをPBSに cell比 の リ ン パ 球subpopulation微 た だ ち にAgarose-Aminocaproyl-D-Galact osamineカ 理 リ ン パ 球 のT リ ン パ 球subpopulationは[125I]HP T cells) 合 量(ng/1×106lymphocytes) /リ ン パ 球 分 画 のT cell比 結 果 率(%) 離 し た リン パ 球 を 理 食 塩 水, にNH4Cl KHCO3, pH 7.4 buffer 0.1mM 1)末 梢 血 リン パ 球 のT cell比(Fig. 3) 末 梢 血 リン パ 球 のT cell比 率 は 健 常 人(81.9 ±8.1%, M±SD)と 良 性 肝 疾 患 患 者(80.3± た 消 化 器 癌 患 者 の 末 梢 血T cellのHelix pomatia A hemagglutinin結 合 活 性の検 討 6.3%)と 467 の 間 に 有 意 差 は な か った. 悪 性腫 瘍 患 者 で は 健 常 人 に 比 し低 い 比 率 を 示 す 症 例 が あ り, 73.4± 11.6%と 低 下 の 傾 向 を示 し た が 有 意 の差 は な か っ た. 2)末 梢 血 リ ンパ 球 のHP結 合量 (Fig. 4) 末 梢 血 リ ンパ 球 の[125I]HP結 合 量 は 健 常 人 で は53.9±8.2ng/1 ×106lymphocytes(M±SD)で っ た.良 あ 性 肝疾 患患者 は健 常 人に 比 しHP結 合量 の高 い症例 が 少数 あ る が 平 均54.7±12.8ng/1×106 lymphocytesと 健 常 人 との 間 に 有 意 の 差 は なか っ た.悪 性腫 瘍 患 者 で は 結 合 量 の 高 い症 例 が 多 く, 平 均62.1±13.7ng/1×106lymp hocytesと 健 常 人,良 性 肝 疾 患 患 者 に 比 しHP結 合 量が 高い傾 向 を 示 し た が 有 意 の 差 は な か っ た.な お 良 性 肝 疾 患 患 者 を肝 硬 変 症 と慢 性 肝 炎 に 分 け て 結 合 量 を検 討 し た が,肝 硬 変 症50.1±6.4ng/1×106 Fig. 2. Assay methods minidase of 125I-labelled treated peripheral HP binding to neura lymphocytes,慢 lymphocytes. 性 肝 炎57.8± 15.3ng/1×106lymphocytesと 慢 性 肝 炎 が 高 い傾 向 を 示 した が 有 意 の 差 は な か っ た.ま た悪 性 腫 瘍 患 者 を 肝 癌 と そ の 他 の 悪 性 腫 瘍 に 分 け て 検 討 し た が,肝 ±14.3ng/1×106lymphncytes,そ 癌60.7 の他 の悪性 腫 瘍63.6±13.6ng/1×106lymphocytesと 差 は な か っ た. 3)末 梢 血T cellのHP結 合 量(Fig. 「方 法 」 で 述 べ た 如 く ,末 梢 血T 結 合 量 を 算 定 し 検 討 し た.健 ±8.4ng/1×106T 5) cellのHP 常 人 の 平 均 は71.2 cells(M±SD)で あ っ た. 良 性 肝 疾 患 患 者 で は 一 部 高 値 を示 す 症 例 が あ っ た が78.9±19.4ng/1×106 T 比 し 有 意 の 差 は な か っ た.悪 99.0±32.6ng/1×106 健 常 人(P<0.01),良 Fig. 3. Ratio of peripheral lymphocytes liver number, in diseases (M•}SD) and T cells to malignancies, normal total 健常 人 に 性 腫 瘍 患 者 で は, cellsと 高 値 を 示 し, 性 肝 疾 患 患 者(P<0.05) と の 間 に 有 意 の 差 を 認 め た.悪 性腫瘍 患 者 を肝 癌 と そ の 他 の 悪 性 腫 瘍 に 分 け て の 検 討 で は,肝 benign subjects. T cellsと N; 癌101.8±38.1ng/1×106 T cells,そ の他 の悪 468 Fig. 安 4. 125I-labelled HP dase peripheral treated malignancies, normal binding N; liver 高 志 neuramini lymphocytes benign subjects. to 原 in diseases number, Fig. 6. Changes of 125I-labelled neuraminidase and cells (M•}SD) in 6 malignant ng/1×106 4) HP結 to T patients. T cellsと 有 意 の らに 良 性 肝 疾 患 を 肝 硬 変 症 と 慢 性 肝 炎 に 分 け て検 討 し たが,肝 18.9ng/1×106 binding peripheral 性 腫 瘍96.3±27.8ng/1×106 差 は なか っ た.さ HP treated T cells,慢 硬 変 症78.5± 性 肝 炎79.1±20.9 T cellsと 有 意 の 差 は な か っ た. 合 量 の 経 時 的 変 化(Fig. 消 化 器 癌 患 者4例,そ 例 の 計6例 6) の 他 の 悪 性 腫 瘍 患 者2 を対 象 に 末 梢 血T cellのHP結 合 量 の 経 時 的 変 化 を測 定 検 討 した. 6例 の うち 経 過 中 に 増 加 を示 し た もの が3例,軽 度 低 下 を示 し た もの が2例,残 低 下 を示 した.以 りの1例 は短期 間に著 明 な 上 の 如 く約40ヶ 月 の 観 察 期 間 に お け る 結 合 量 の 変 化 に は 一 定 の傾 向 を認 め ら れ な か っ た. 5) HP結 合 量 と生 存 期 間 悪 性 腫 瘍 患 者 をHP結 Fig. 5. 125I-labelled dase HP treated ignancies, normal , P<0.01, binding peripheral benign subjects. (M•}SD) T liver N; to cells diseases number, *; in 合 測 定 日 よ り6ヶ 月 以 上 生 存 し た群 と6ヶ 月 以 内 に 死 亡 し た群 とに 分 nearamini mal and P<0.05, ** け,末 梢 血T cellのHP結 合 量 を検 討 し た. 6ヶ 月 以 上 生 存 し た群 の 末 梢 血T (76.4±7.7%, (1010±420/mm3, M±SD),末 M±SD)に 内 に 死 亡 した群 で はT cell比 梢 血T cell比 率 cell数 比 し, 6ヶ 月 以 率(69.3±11.4 消 化 器 癌 患 者 の 末 梢 血T cellのHelix pomatia A hemagglutinin結 合 活 性 の検 討 腫瘍 患 者 の 末 梢 血 リン パ 球 のT 性 肝 疾 患 患 者,健 最 近,リ 469 cell比 率 は 良 常 人 に 比 べ 低 い傾 向 を 示 した. ン パ 球 を諸 種 レ ク チ ン との 結 合 活 性 の 差 に よ り分 画 す る 試 み が な さ れ て い る. Rei sner1)ら は マ ウ ス の リン パ 球 を 用 い, PNAの 高 い 結 合 能 を持 つT1細 胞(末 成 熟T細 低 い 結 合 能 しか 持 た な いT2細 胞)か ら分 離 した. PNAは GalNAcに 胞(成 胞)を 熟T細 β-D-Gal-(1-3)-D- 特 異 的 に 結 合 す る が,末 端 に シ ア ル 酸 が 存 在 す る場 合 に は 結 合 活 性 を 失 う.従 って T1細 胞 の 方 が 表 面 糖 鎖 の シ ア ル酸 が 少 な い と結 論 さ れ た. Nakano4)ら Fig. 7. Correlation binding between 125I-labelled to neuraminidase pheral T cells in malignancies. and treated T cell HP peri で誘 導 し たT はPNAを cellの 用 いCon な か か らsuppressor cellを 分 離 し, PNAがsuppressor 対 し て結 合 活 性 を もつ こ と を示 し た.ま たLcA percentage に よ り誘 導 さ れ たhelper T cell数(660±370/mm3)と 低 下 傾 向 を 示 し た.し 結 合 量 は6ヶ /1×106 T か し末 梢 血T 両 者 ともに isner5)ら は ヒ ト末 梢 血T cellのHP て 細 分 画 し, SBAに 月 以 上 生 存 し た群(95.8±30.8ng cells, M±SD)と6ヶ 亡 し た 群(100.9±38.1ng/1×106 T cellがLPAに HP結 T cell数 との 相 関(Fig. 結 合 量 と末 梢 血T たが,相 cell比 末 梢 血T cell数 月以内 に死 抗 体 産 生 に 対 す るsuppressor機 cells)と 梢血 たHP結 性 肝 疾 患 と悪 性 腫 瘍 を 対 象 にHP結 合量 と 合 量 と年 令 関 を 認 め な か っ た. あ るT cellのsurface 結 合 能 を末 梢 血T であ る 用 いて検 討 し 以 下 の 結 論 を得 た. ① 悪 性 腫 瘍 患 者 の 末 梢 血T 能 をみ いだ し の 識 別 に よ り リン パ 球 を 分 画 し,細 胞 膜 表 面 構 て い る. 一方 , Hammarstrom12,13)ら す るreceptorを の 特 異 的 なsurface て 来 た.こ cellのHPに す る 平 均 結 合 活 性 は 良 性 肝 疾 患 患 者,健 対 常人に に よ りHPに 対 有 す る リン パ 球 が ほ ぼT で あ る こ とが 示 され,こ cell のreceptorがT markerの cell 一 つ と考 え られ の 点 に 注 目 した 今 回 の 検 討 で は 悪 性 receptorの markerの1つ cellを cellのHPに 対する 平 均 活 性 は 良 性 肝 疾 患 患 者,健 常 人 に 比 べ て 上 昇 して い た.悪 性腫 瘍 患者 では 一般 に 細 胞 性 免 疫 能 は 低 下 し て い る と云 わ れ て お り 15-21) ,今 回 の 検 討 で も末 梢 血T cell比 率 が 低 下 し て い た.し か しT cell表 面 のHPに るreceptor活 性 は む し ろ 上 昇 して い た.こ こ とは 細 胞 表 面 構 造 の 変 化 がT cell機 対す 常 に 関 与 して い る可 能 性 を示 唆 して い る.ま 末 梢 血T HP 対 す る結合 活性 は癌 の 進 行 に 伴 う一 定 の 経 時 的 変 化 を 示 さ な か っ た. 従 来 の 報 告 の 如 く15,19),今 回 の 検 討 で も悪 性 receptorがT た cell機 能 発 現 の 為 の 或 る種 の 情 報 獲 得 のreceptorと 性 を 仮 定 す れ ば,著 の 能 の異 比 べ て 有 意 に 高 か っ た, ② しか し悪 性 腫 瘍 患 者 cellのHPに た 上 の 如 くレ クチ ン に よ る細 胞 膜 表 面 構 造 腫 瘍 患 者 で は 末 梢 血T 案 悪 性 腫 瘍 患 者 に お け る 細 胞性 免 疫 担 当細 胞 で HPの 結 合 活 性 を 示 さ な か っ たT 造 と リン パ 球 の 機 能 を む す び つ け る試 が な さ れ cellのHP 率 との 相 関 を 検 討 し 考 cell T との 間 に も相 関 は な か っ た.良 との 関 連 も検 討 し た が,相 結 合 活 性 を示 し たT cell分 画 に 7) 梢 血T 関 を認 め な か っ た.ま 用い SBAに cell比 率,末 悪 性 腫 瘍 患 者 を対 象 に,末 cellをSBAを 能 を,ま た.以 合 量 と末 梢 血T よ ら にRe 分 画 に 抗 体 産 生 に対 す るhelper機 の 間 に 有 意 差 は な か っ た. 6) T T cellに り分 離 可 能 な こ と を報 告 して い る.さ %), A し て 働 い て い る可 能 者 等 の結果 は癌 患 者に お い 470 安 て はT cellの 情 報 獲 得 に お い てpost 原 receptor 高 士 量 の経時 的変 化 では悪 性 腫瘍 の 進行 に伴 った一 の 異 常 が 存 在 す る か も し れ な い と考 え させ る も 定 の傾 向 は 認 め られ ず,ま の で あ っ た. も一 定 の 相 関 は な く悪 性 腫 瘍 の 進 展 に 関 連 した 一方 ,悪 性 腫 瘍 患 者 末 梢 血T markerに cellのHPに 対 す る 平 均 結 合 活 性 が 上 昇 して い た 原 因 と し て は, T cellの な か でHPに 対 して 強 い結 合 活 た 生 存 期 間 との 間 に は な りえ な い もの と考 え ら れ た. 今 回 の研 究 で 悪 性 腫 瘍 患 者 で は 末 梢 血T のHPに cell 対 す る結 合 活 性 の 上 昇 が 確 認 さ れ た が, 性 を もつ 特 殊 なT cell分 画 の 割 合 が 増 加 し, 今 後HP結 そ の 結 果 と してT cellの 平 均 結合 活 性が上 昇 検 討 す る 必 要 が あ る と考 え ら れ た.ま た, HP結 し た か,あ る い は 全 体 的 にT cellの 膜 表面 に 合 活 性 とT cell機 能 の 関 連 を併 せ 合 活 性 の 上 昇 に 現 わ れ るT cellの 変化 が 生体 変化 が お こっ て いるか の いずれ かの 可能性 が 考 の癌 に対 す る免疫機 構 の亢 進 を現 わ して いるの え ら れ た.し か,そ か し,い 者 で は 末 梢 血T 起 こ り,何 ず れ に して も悪 性 腫 瘍 患 cellの らか のT 細 胞表 面糖 鎖 に変化 が cell機 の 逆 で あ る か の 検 討 も今 後 の 課 題 と考 え られ た. 能 の 変 化 が 生 じて 結 い る こ と は 十 分 予 測 さ れ る. 現 在 ま で, HPレ クチ ン を用 い た リン パ 球 の 1)消 化 器 癌 患 者 を 中心 とす る 悪 性 腫 瘍 患 者 を 分 画 と機 能 の 検 討 で は, Haller24)ら は マ ウ ス の リン パ 球 をHP結 対 して比較 的弱 い結 合活 性 を示 す分 画 にNK活 性 が 強 い こ と をみ い だ し て い る.最 近NK活 対 象 に 末 梢 血T 合 セ フ ァ ロー ス カ ラ ム で 分 画 し, HPに 活 性 を 示 す 細 胞 はHPに た め,今 性 腫 瘍 患 者 末 梢 血T り う る可 能 性 が 示 され た.結 腫 瘍 の 進 行 程 度,生 回 の 検 討 で は こ の 細 胞 に 関 連 す る情 報 梢 血T 合活 性 測定 の臨 梢 血 リン パ 球 のHP結 か しHP結 用 し た リ ンパ 球 のT cellのHP結 合 或 い はT 雪 合 量 を算 定 し検 討 す る と,悪 性 腫 な り う る可 能 性 が に 悪 性 腫 瘍 患 者 に お け るHP結 合 文 1. Reisner, pulations 2. Y., Linker-Israeli., M. Sharon, by the use of peanut Imai, Y., Oguchi, Y., Nakano, by a fluorescent-activated Commun. 8, 495-503, cell全 体 の 細 胞 表 面 の 変 化 の い 謝 辞 夫教 授 な らび に終 始 直 接御 指 導下 さっ た有 馬暉 勝 講 な お,本 論文 の要 旨は,第23回 日本消 化 器病 学 会 合 同秋 季 大 会,な らび に 第5回 国 際 免疫 学 会 で発 表 した. 献 N.: Separation of mouse thymocytes agglutinin. Cell Immunol. T., Sawada, J., Osawa, 25, 129-134, T.: Separation cell sorter using fluorescence-labelled 1979. 変 化, 師 に 深 謝致 します. 常 人 に 比 しT cell数 あ た りの 結 合 量 の 有 意 の 上 昇 を示 し,臨 示 され た.更 合 活性 が高 い悪性 稿 を終 るに あ た り,御 指 導,御 校 関頂 い た長 島秀 cell比 率 よ り,末 梢 血T 床 的 に 悪 性 腫 瘍 のmarkerと cellのHP結 ず れ か の 生 じて い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た. 合 実 測 値 と測 定 に 使 瘍 患 者 で は 良 性 肝 疾 患 患 者,健 存 期 間 な どの 間 に 関 連 腫 瘍 患 者 で は, T cellのsubsetの 健 常 人に 比 し軽度上 昇傾 向 を認め たが有 意 の差 は な か っ た.し な 合 活 性 と悪 性 性 は な か っ た. 3)末 量 実 測 値 は 悪 性 腫 瘍 患 者 で は 良 性 肝 疾 患 患 者, 合活 常 人 に 比 し有 意 に 高 値 を示 し,臨 床 的 な 腫 瘍 のmarkerに か しNK は得 られ な か っ た. 床 応 用 に 関 し て は,末 合活 性を検 cellのHP結 性 は 良 性 肝 疾 患 患 者,健 対 す る結合 活性 が低 い ヒ ト末 梢 血 リン パ 球 のHP結 cellのHP結 討 した. 2)悪 性 を もつ 細 胞 の 腫 瘍 細 胞 に 対 す る 障 害 性 が 指 摘 さ れ21,25)注目 さ れ て い る.し 語 into two subpo 1976. of mouse T cell subsets peanut agglutinin. Immunol. 消 化 器 癌 患 者 の 末 梢 血T cellのHelix pomatia A hemagglutinin結 合 活 性の検討 7. Nakano, T., Oguchi. 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The calculated HP binding activity to T cells was significantly higher in digestive tract cancer patients than in benign liver disease patients (p<0.05) and normal subjects (p<0.01). These results suggest that either the subsets of peripheral T cells with high HP binding activity may be significantly in creased or HP receptors of all peripheral T cells may be increased to the same degree in dige stive tract cancer patients. This activity may be a useful index of cellular immunity in digest ive tract cancer patients, although it seems to have no relevance to the progression of cancer.