次抗体の選び 抗体の実験にきっと役 つ基礎知識 - Sigma

抗体の実験にきっと役⽴つ基礎知識
⼆次抗体の選び⽅
⼆次抗体とは
抗体そのものに標識などされていない場合、⽬的のタンパク質に結合した抗体はそのまま検出や可視化することができません。そこで、抗体を認識する抗
体つまりイムノグロブリンに対する抗体に標識をして、最初の抗体を検出する⽅法が⾮常によく利⽤されています。⽬的のタンパク質に対する抗体は⼀次
抗体、⼀次抗体に対する抗体 (抗イムノグロブリン抗体) は⼆次抗体と呼ばれます。
⼆次抗体の標識 (ラベル) として発⾊⽤の酵素や蛍光⾊素、ビオチンなどがあり、アフィニティ精製⽤にアガロースなどの担体を結合させた抗体も利⽤され
ています。
⼀般的に発⾊系の場合はアルカリホスファターゼ(AP)やホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)といった酵素が⽤いられ、検出⽤の試薬を与えると標識
された酵素と反応して発⾊が起こります。ビオチン標識はストレプトアビジンを介してAPやHRPによる発⾊の増幅に利⽤されています。また蛍光⾊素として
FITC、ローダミン、TRITC、Cy3やR-フィコエリスリン(R-PE)などが⼀般的ですが、そのほかに様々な波⻑の蛍光⾊素が利⽤されています。
⼆次抗体は⼀次抗体が何の動物種で作られているか、あるいは⼀次抗体がモノクローナル抗体の場合はイムノグロブリンのクラスは何かによって選び、検
出する⽅法によって⼆次抗体の標識を選択します。
さらにバックグランドを抑えるために吸収済みの⼆次抗体やフラグメント化された⼆次抗体を使⽤することもあります。
⼆次抗体を選ぶ基本ポイント
 ⼀次抗体の宿主動物 (免疫動物)
 ⼆次抗体の標識の種類
検出する⽅法に応じて標識を選びます。
選び⽅の例
⼀次抗体の宿主
ウサギ (ポリクローナル抗体)
ニワトリ (ポリクローナル抗体)
ラット (ポリクローナル抗体)
⼀次抗体の宿主
 アプリケーション
⼆次抗体の製品情報に書かれている使⽤
可能なアプリケーションを参考にして、⽬的
の⽤途に応じて選びます。
⼆次抗体
マウス
(モノクローナル抗体)
Goat Anti-Mouse IgG FITC conjugate (製品番号F0257).
C. Rieder, Wadsworth Center, Division of Molecular
Medicine, Lab of Cell Regulation, Albany, NY.
⼀次抗体の
アイソタイプ
IgG1
IgG2a
IgG2b
IgG3
IgA
IgM
ウサギIgGに対する抗体
ニワトリIgYに対する抗体
ラットIgGに対する抗体
⼆次抗体
マウスIgGに対する抗体
マウスIgA (α鎖) に対する抗体
マウスIgM (μ鎖) に対する抗体
Anti-Rabbit IgG-FITC (製品番号F0382).
From Lynn Burgess, Natural Sciences Department,
Dickinson State University, Dickinson, ND.
抗体の実験にきっと役⽴つ基礎知識
最適な⼆次抗体を選ぶヒント
1. ⼀次抗体は何の動物種で作られているか？
⼆次抗体は⼀次抗体に対して結合するものなので、⼀次抗体の免疫動物(ホスト)によって⼆次抗体を選ぶ必要があります。もしマウス
で作成された⼀次抗体を使⽤している場合は、マウスのイムノグロブリンに対する抗体が⼆次抗体となります。
2. ⼀次抗体のクラス・サブクラスは何か？
⼀次抗体がモノクローナル抗体の場合に重要なポイントになります。⼀次抗体がポリクローナル抗体の場合、抗体のイムノグロブリンのクラ
スは⼀般的にIgGのため、⼆次抗体はIgGに対する抗体でおおむね問題ありません。⼀次抗体がモノクローナル抗体の場合、抗体のイム
ノグロブリンがIgGではないこともあります。そのためモノクローナル抗体がどのイムノグロブリンであるか確認し、そのイムノグロブリンクラスに対
する抗体を⼆次抗体として使⽤する必要があります。例えばモノクローナル抗体のイムノグロブリンがマウスIgMの場合、マウスIgMに対す
る抗体を⽤います。またマウスのモノクローナル抗体でイムノグロブリンのサブクラスが不明な場合、多くのマウスイムノグロブリンサブクラスを認
識するマウスIgG F(ab)に対する抗体を⼆次抗体として⽤いることもできます。
ヒトやマウスのIgGは多くのクラスやサブクラスがあり⼆次抗体の選択は複雑になります。ただしIgG, IgM, IgA, IgDおよびIgEはいずれ
もκまたはλ軽鎖を持ち、つまりこれらのIgGは軽鎖(κ, λ)が共通しています。⼀⽅、重鎖はクラスによって特異的に異なります。
⼆次抗体の製品名に書かれている情報と反応性は次のようになります。
Anti-Fc specific , heavy-chain specific: 重鎖にのみ反応、つまりクラス特異的
Anti-Fab specific , whole molecule specific: 重鎖と軽鎖に反応。軽鎖の反応性によってすべてのクラスに反応性を⽰す
Light chain (kappa, lambda) specific: すべてのクラスに反応
3. アフィニティ精製された⼆次抗体やIgGフラクション(イムノグロブリン精製)の⼆次抗体のどちらが良いか？
アフィニティ精製された抗体とIgGフラクション抗体のどちらにも利点があり、⽬的に応じて使い分けられています。⾮特異的な反応を少なく
したい場合はアフィニティ精製が好まれ、⼀⽅少量の抗原を検出する場合はIgGフラクションの⽅が優れていることがあります。
4. どの標識を選べば良いか？
標識は⾏うアプリケーションによって選ぶ必要があります。イムノブロット、ウェスタンブロットやELISAでペルオキシダーゼはアルカリホスファター
ゼより経済的で安定的な酵素で、化学発光法にもよく⽤いられています。アルカリホスファターゼは発⾊法のときペルオキシダーゼより感度
が良いという特徴があります。
細胞や組織の染⾊ではアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ、あるいは蛍光⾊素の標識が⽤いられます。⼀般的な蛍光⾊素として
FITC, phycoerythrin, CF, Atto, Quantum Redがあります。これらはフローサイトメトリーでも使⽤されています。
またビオチン/アビジンによる2ステップのシステムは検出の増幅に⽤いられることがあります。ビオチンはアビジンに⾮可逆的に強く結合します。
この性質を利⽤して、まずビオチン標識した⼆次抗体を⽤い、次にアビジン(またはExtrAvidin、ストレプトアビジン)が結合した酵素また
は蛍光⾊素を与えます。ビオチン標識した⼆次抗体に複数結合することによってシグナルが増幅されて感度が⾼くなります。
5. 吸収済みの⼆次抗体は必要か？
吸収済みの抗体(pre-adsorbed antibody)とは固定した⾎清タンパク質やIgGで処理した抗体で、細胞や組織で⾮特異的なバック
グランドを抑えることが期待できます。
6. F(ab)やF(abʻ)2フラグメント抗体は必要か？
Fc受容体を持つ組織や細胞で⾏う場合、⾮特異的な結合を抑えるためF(ab)やF(abʻ)2フラグメントにした抗体が使われることがありま
す。サンプルとしてリンパ節、脾臓、末梢⾎から得たものはFc受容体(マクロファージ、 Bリンパ球、ナチュラルキラー細胞)を持ち、抗体のFc
領域に結合することで⾼いバックグランドが⽣じます。
⼆次抗体の製品名の⾒⽅
製品名の例
Anti-Rabbit IgG (whole molecule), F(ab′)2 fragment–FITC antibody produced in goat
抗原
処理
標識
宿主
抗体の実験にきっと役⽴つ基礎知識
お勧めの⼆次抗体
⼀次抗体の宿主がウサギの場合
抗原
ウサギIgG
免疫動物
製品の特性
標識
ヤギ
すべてのウサギ免疫グ アルカリオキシダーゼ
ロブリンと交差。
ビオチン
FITC
PE
ペルオキシダーゼ
⾦コロイド
未標識
ウサギIgG
ヤギ
すべてのウサギ免疫グ アルカリオキシダーゼ
ロブリンと交差。
ビオチン
ヒトIgGで吸収済み。
FITC
ペルオキシダーゼ
TRITC
未標識
ウサギIgG
ヤギ
すべてのウサギ免疫グ アルカリオキシダーゼ
ロブリンと交差。
F(ab')2フラグメント。
製品番号
製品名
A3687 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase
antibody produced in goat
B7389 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Biotin antibody produced
in goat
F0382 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–FITC antibody produced
in goat
P9537 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)­R-Phycoerythrin
antibody produced in goat
A6154 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Peroxidase antibody
produced in goat
G7402 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Gold antibody produced
in goat
R2004 Anti-Rabbit IgG (whole molecule) antibody produced in
goat
A9919 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase
antibody produced in goat
B8895 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Biotin antibody produced
in goat
F9887 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–FITC antibody produced
in goat
A0545 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Peroxidase antibody
produced in goat
T6778 Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–TRITC antibody
produced in goat
R4880 Anti-Rabbit IgG (whole molecule) antibody produced in
goat
A3937 Anti-Rabbit IgG (whole molecule), F(ab′)2
fragment­Alkaline Phosphatase antibody produced in goat
適⽤
ELISA, IHC, WB
ELISA
IF
IF
ELISA
WB
免疫電気泳動
ELISA, IHC, WB
ELISA, IHC, WB
IF
ELISA, IHC, WB
IF
免疫電気泳動
ELISA, IHC, WB
FITC
F1262 Anti-Rabbit IgG (whole molecule), F(ab′)2 fragment–FITC
antibody produced in goat
IF
PE
P8172 Anti-Rabbit IgG (whole molecule), F(ab′)2 fragment­RPhycoerythrin antibody produced in goat
IF
ペルオキシダーゼ
A6667 Anti-Rabbit IgG (whole molecule), F(ab')2 fragmentPeroxidase antibody produced in goat
ELISA
未標識
R9130 Anti-Rabbit IgG (whole molecule), F(ab')2 fragment
antibody produced in goat
免疫電気泳動
標識
アルカリオキシダーゼ
製品番号
製品名
A9171 Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Alkaline
Phosphatase antibody produced in rabbit
適⽤
ELISA, IHC, WB
⼀次抗体の宿主がニワトリの場合
抗原
ニワトリIgY
免疫動物
製品の特性
ウサギ
すべてのニワトリIgYと
交差。
FITC
F8888
ペルオキシダーゼ
A9046
未標識
C2288
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-FITC antibody
produced in rabbit
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase
antibody produced in rabbit
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody
produced in rabbit
IF
ELISA, IHC, WB
ELISA
⼀次抗体の宿主がヒツジの場合
抗原
ヒツジIgG
免疫動物
製品の特性
標識
ロバ
すべてのヒツジ免疫グロ アルカリオキシダーゼ
ブリンと交差。
FITC
製品番号
A5187
F7634
ペルオキシダーゼ
A3415
未標識
S2763
製品名
Anti-Sheep IgG (whole molecule)-Alkaline Phosphatase
antibody produced in donkey
Anti-Sheep IgG (whole molecule)-FITC antibody
produced in donkey
Anti-Sheep IgG (whole molecule)-Peroxidase antibody
produced in donkey
Anti-Sheep IgG (whole molecule) antibody produced in
donkey
適⽤
ELISA, WB
IF
ELISA
抗体の実験にきっと役⽴つ基礎知識
⼀次抗体の宿主がマウスの場合
抗原
マウスIgG
マウスIgG
マウスIgG
マウスIgG
免疫動物
製品の特性
標識
ヤギ
マウスIgG, IgA, IgMと アルカリオキシダーゼ
交差。
ビオチン
ウサギ
ヤギ
ヤギ
マウスIgG
ヤギ
マウスIgG
ヒツジ
F0257
PE
P9287
ペルオキシダーゼ
A4416
⾦コロイド
G7652
未標識
M8642
ヤギ
ペルオキシダーゼ
A9044
未標識
M7023
マウスIgA (α鎖) ヤギ
マウスIgM (μ鎖) ヤギ
A3688
B6649
F2012
PE
P9670
produced in goat
Anti-Mouse IgG (whole
goat
Anti-Mouse IgG (whole
goat
Anti-Mouse IgG (whole
produced in goat
Anti-Mouse IgG (whole
in goat
Anti-Mouse IgG (whole
goat
Anti-Mouse IgG (whole
molecule)-Biotin antibody produced in
ELISA
molecule)-FITC antibody produced in
IF
molecule)-R-Phycoerythrin antibody
IF
molecule)-Peroxidase antibody produced ELISA
molecule)-Gold antibody produced in
molecule) antibody produced in goat
免疫電気泳動,
ELISA
Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Alkaline Phosphatase antibody ELISA, IHC, WB
produced in rabbit
Anti-Mouse IgG (whole
rabbit
Anti-Mouse IgG (whole
rabbit
Anti-Mouse IgG (whole
in rabbit
Anti-Mouse IgG (whole
Anti-Mouse IgG (whole
produced in goat
Anti-Mouse IgG (whole
goat
Anti-Mouse IgG (whole
goat
Anti-Mouse IgG (whole
produced in goat
Anti-Mouse IgG (whole
molecule)-Biotin antibody produced in
ELISA
molecule)-FITC antibody produced in
IF
molecule)-Peroxidase antibody produced ELISA, IHC, WB
molecule) antibody produced in rabbit
ELISA
molecule)-Alkaline Phosphatase antibody ELISA, IHC, WB
molecule)-Biotin antibody produced in
ELISA
molecule)-FITC antibody produced in
IF
molecule)-R-Phycoerythrin antibody
IF
molecule) antibody produced in goat
⼆重免疫拡散法
未標識
M8645
アルカリオキシダーゼ
A9316
ペルオキシダーゼ
A8924
アガロース
A6531
Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Agarose antibody produced in IP (免疫沈降), ⼆
goat
重免疫拡散法
アルカリオキシダーゼ
A3563
Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab')2 fragment-Alkaline
Phosphatase antibody produced in sheep
Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab')2 fragment-Cy3 antibody
produced in sheep
Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab')2 fragment-FITC
antibody produced in sheep
Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab')2 fragment-RPhycoerythrin antibody produced in sheep
Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Peroxidase antibody produced
in sheep
Anti-Mouse IgG (Fab specific)-Alkaline Phosphatase antibody
produced in goat
Anti-Mouse IgG (Fab specific)-FITC antibody produced in goat
C2181
F2883
PE
P8547
ペルオキシダーゼ
A6782
すべてのマウス免疫グロブ アルカリオキシダーゼ
リンと交差。ヒトIgGで吸
FITC
収済み。
ペルオキシダーゼ
マウスIgG (γ鎖) ヤギ
B8520
F9137
Cy3
ヒト⾎清タンパク質で吸収
FITC
済み。
マウスIgG Fab
A2418
FITC
マウスIgG, IgA, IgMと アルカリオキシダーゼ
交差。
ビオチン
ヒト⾎清タンパク質で吸収
FITC
済み。
F(ab')2フラグメント。
B7264
FITC
マウスIgG, IgA, IgMと アルカリオキシダーゼ
交差。
ビオチン
マウスIgG, IgA, IgMと
交差。
ラット⾎清タンパク質で吸
収済み。
マウスIgG, IgA, IgM,
ミエローマタンパク質と交
差。
マウスIgG, IgA, IgMと
交差。
製品番号
製品名
適⽤
A3562 Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Alkaline Phosphatase antibody ELISA, IHC, WB
マウスIgG (γ鎖) に特異 アルカリオキシダーゼ
的に反応。
ビオチン
A1293
F5262
A9917
A3438
B7022
FITC
F8264
ペルオキシダーゼ
A3673
未標識
M1397
マウスIgAに特異的に反 アルカリオキシダーゼ
応。
FITC
A4937
F9384
ペルオキシダーゼ
A4789
未標識
M8769
マウスIgMに特異的に反 アルカリオキシダーゼ
応。
ビオチン
A9688
B9265
FITC
F9259
ペルオキシダーゼ
A8786
未標識
M8644
Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Alkaline Phosphatase antibody ELISA, IHC, WB
produced in goat
Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Peroxidase antibody produced ELISA
in goat
ELISA, IHC, WB
IF
IF
IF
ELISA
ELISA, IHC, WB
IF
Anti-Mouse IgG (Fab specific)-Peroxidase antibody produced in ELISA, IHC, WB
goat
Anti-Mouse IgG (gamma-chain specific)-Alkaline Phosphatase
ELISA, IHC, WB
antibody produced in goat
Anti-Mouse IgG (gamma-chain specific)-Biotin antibody produced ELISA
in goat
Anti-Mouse IgG (gamma-chain specific)-FITC antibody produced IF
in goat
Anti-Mouse IgG (gamma-chain specific)-Peroxidase antibody
ELISA
produced in goat
Anti-Mouse IgG (gamma-chain specific) antibody produced in
ELISA
goat
Anti-Mouse IgA (alpha-chain specific)-Alkaline Phosphatase
ELISA, WB
antibody produced in goat
Anti-Mouse IgA (alpha-chain specific)-FITC antibody produced in IF
goat
Anti-Mouse IgA (alpha-chain specific)-Peroxidase antibody
ELISA
produced in goat
Anti-Mouse IgA (alpha-chain specific) antibody produced in goat ⼆重免疫拡散法
Anti-Mouse IgM (mu-chain
antibody produced in goat
Anti-Mouse IgM (mu-chain
goat
Anti-Mouse IgM (mu-chain
goat
Anti-Mouse IgM (mu-chain
produced in goat
Anti-Mouse IgM (mu-chain
specific)-Alkaline Phosphatase
ELISA, IHC, WB
specific)-Biotin antibody produced in ELISA
specific)-FITC antibody produced in
IF
specific)-Peroxidase antibody
ELISA
specific) antibody produced in goat
⼆重免疫拡散法
抗体の実験にきっと役⽴つ基礎知識
⼀次抗体の宿主がヤギの場合
抗原
ヤギIgG
免疫動物
ウサギ
製品の特性
標識
すべてのヤギ免疫グロブリン アルカリオキシダーゼ
と交差。
FITC
製品番号
A4187
F7367
ペルオキシダーゼ
A5420
TRITC
T7028
未標識
G4018
製品名
Anti-Goat IgG (whole molecule)-Alkaline
Phosphatase antibody produced in rabbit
Anti-Goat IgG (whole molecule)-FITC antibody
produced in rabbit
Anti-Goat IgG (whole molecule)-Peroxidase
antibody produced in rabbit
Anti-Goat IgG (whole molecule)-TRITC antibody
produced in rabbit
Anti-Goat IgG (whole molecule) antibody produced
in rabbit
適⽤
ELISA, IHC, WB
IF
ELISA, IHC, WB
IF
ELISA
⼀次抗体の宿主がラットの場合
抗原
ラットIgG
ラットIgG
免疫動物
製品の特性
標識
ヤギ
すべてのラット免疫グロブリ アルカリオキシダーゼ
ンと交差。
ビオチン
ウサギ
ラットIgG2a
マウス
ラットIgM
マウス
B7139
ペルオキシダーゼ
A9037
未標識
R5130
すべてのラット免疫グロブリ アルカリオキシダーゼ
ンと交差。
FITC
ヒトIgGで吸収済み。
ペルオキシダーゼ
ラットIgG2aと交差。
モルモット免疫グロブリンと
弱く交差。
ラットIgMと交差。
モルモット免疫グロブリンと
弱く交差。
製品番号
A8438
A6066
F1763
A5795
TRITC
T4280
未標識
R3756
未標識
R0761
未標識
R0886
製品名
適⽤
Anti-Rat IgG (whole molecule)-Alkaline Phosphatase ELISA, IHC, WB
antibody produced in goat
Anti-Rat IgG (whole molecule)-Biotin antibody
ELISA
produced in goat
Anti-Rat IgG (whole molecule)-Peroxidase antibody ELISA
produced in goat
Anti-Rat IgG (whole molecule) antibody produced in 免疫電気泳動
goat
Anti-Rat IgG (whole molecule)-Alkaline Phosphatase ELISA, IHC, WB
antibody produced in rabbit
Anti-Rat IgG (whole molecule)-FITC antibody
IF
produced in rabbit
Anti-Rat IgG (whole molecule)-Peroxidase antibody ELISA, IHC, WB
produced in rabbit
Anti-Rat IgG (whole molecule)-TRITC antibody
IF
produced in rabbit
Anti-Rat IgG (whole molecule) antibody produced in 免疫電気泳動
rabbit
Monoclonal Anti-Rat IgG2a antibody produced in
ELISA
mouse
Monoclonal Anti-Rat IgM antibody produced in
mouse
ELISA
2015年5⽉