N-Methyl-2-anilinonaphthalene-6-sulfonyl 基の結合した Gramicidin S

Title
Author(s)
Citation
Issue Date
N-Methyl-2-anilinonaphthalene-6-sulfonyl基の結合した
Gramicidin Sの調製
小野寺, 昌彦; 田中, 恭介; 高沢, 俊英; 塩川, 洋之
北海道大学免疫科学研究所紀要 = Bulletin of the Institute of
Immunological Science, Hokkaido University, 38: 56-58
1978-03
DOI
Doc URL
http://hdl.handle.net/2115/26510
Right
Type
bulletin
Additional
Information
File
Information
38_P56-58.pdf
Instructions for use
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
N
M
e
t
h
y
l
2
・
ani
1
in
o
n
a
p
h
t
h
a
l
e
n
e
6・s
u
l
f
o
n
y
l基の
結合した G
r
a
m
i
c
i
d
i
nSの 調 製
小野寺昌彦
田中恭介
白沢俊英
塩川洋之
(北海道大学免疫科学研究所生化学部門)
(昭和 5
2年 1
2月 2日受付)
ハプテンに対する抗体を得るためには，通常血清アル
c
h
l
o
r
i
d
e は Sachdv等制の方法で合成した。 Grami-
ブミンやへそシアニンのような分子量の大きな蛋白質
c
i
d
i
nS は Sigma社 製 GramicidinJの塩酸滋を用い
(
c
a
r
r
i
e
r
)に，多数のハプテンを結合させて調製した抗原
た
。 SephadexLH-20は Pharmacia社製，カラムクロ
を動物に注射する必要がある。このようにして得られた
i
e
s
e
l
g
e
l
マトグラフィー用シリカゲルは Merck社製 K
抗ハプテン抗体て、は，
0.05~0.2
多くの場合不均一な分子の集団
m m(
7
0
3
2
5meshASTM)を用いた。薄層ク
(結合定数や等電点分画法によるパターンについて)とな
C-Alufolieren
ロマトグラフィーには Merck 社 製 D
3
)。 しかし;最近ジニトロフェニル基やアデニン環を
る1
k
i
e
s
e
l
g
e
l6
0を用いた。
Gramicidin S (
5種類のアミノ酸が 1
0個環状に結合し
GramicidinS と MANS-GramicidinS 複 合 体 の
これらの化合物を 6NHCl で
たペプチド)のオルニチン残基の 2個のアミノ基に結合
構成アミノ酸の検出は，
ramicidinS 複合物を抗原として用
させたハプテン G
1
1
00C，2
3時間加水分解した後 HClをエパポレーターで
いると，著しく抗ハプテン抗体の不均一性が減少するこ
除いて，薄層クロマトグラフィーを行ない，ニンヒドリ
ミエ
ramicidinS と (MANS)2
ン反応によって行なった。 G
ローマ蛋白質で、行なわれたような，クローンの比較や化
GramicidinS のアミノ酸分析は， 1
1
00Cで 6NHClに
学構造の研究が 7，
8
)，誘発された抗ハプテン抗体でも可
よ る 加 水 分 解 物 を 目 立 ア ミ ノ 酸 分 析 器 (ModelKLA-
能となると期待されている。
3B)を用いて行なった。 加水分解時間は
とが示された 4-6)。 この不均一性の減少によって，
我々は，
a
r
ウシ血清アルブミンやへモシアニンを c
r
i
e
r として用いて，ケイ光色素 N・m
e
t
h
y
l
2
a
n
i
l
i
n
o
n
a
-
Gramicidin
4時間， (MANS)γGramicidinSの場合
Sについては 2
4，7
2，9
6時間であった。
は2
pht
h
a
l
e
n
e
6
s
u
l
fony1基 (MANS基)に対する抗体(抗
結果と考察
MANS抗体)をウサギに産生させる方法を示した9，
1
0
)。
また， MANS基のケイ光は，抗 MANS抗体に結合す
(
1
) MANS2-GramicidinS の合成
ると数百倍に増加することと，結合 MANS基のケイ光
0.5msのアセトンに 4
3
.
5mgの MANSc
h
l
o
r
i
d
eを
極 大 波 長 が 抗 MANS 抗体結合部位の構造を反映して
溶解する。このアセトン溶液に 5
0m MBorax(pH9
.
3
)
1
2
)。これらのことから， MANS
変化することを述べた 11，
溶 液 0.5ms加える。さらに 50mgの G
ramicidinS の
基は，抗体量の変化，
溶解した lmsアセトン溶液を加え，反応を開始し一昼夜
クローンの比較，結合部位構造の
5C恒温槽中で放置する。
室温または 2
0
研究に適したノ、プテンで・あると結論された。
この報告では，
MANS基の 2個結合した， Grami
司
を用いて溶媒を除き乾燥させる。
エパポレーター
lmsのエタノールで、
cidinSの調製法を述べる οMANSc
h
l
o
r
i
d
eと Gramト
溶解し(完全には溶けなし、)，この全量をエタノールで平
c
i
d
i
nS とをアルカリ性アセトン水溶液中で、反応させ，
3
5cmx1c
m
c
i
)
衡化しである SephadexLH-20カラム (
SephadexLH-20 カラムクロマトグラフィー， 続いて
に供し，エタノールで、溶出し最初に溶出するケイ光画分
シリカゲルカラムグロマトグラフィーを行なし、，容易に
を集めた。
(MANS)
z-GS を得ることが出来た。
液 b
utanol
/a
c
e
t
i
ca
c
i
d=
2
0
/
1
)で大まかに 3つの成分に
この物質の同定は
アミノ酸分析により行なった。
この画分は，薄層クロマトグラフィー(展開
)
。すなわち，最先端まで
分離することが示された(図 1
泳動した大きなケイ光スポット， Rf0.5~0.6 のスポット
実験方法及び試薬
MANSate は Cory等 の 方 法 で 合 成 し 1
3
)， MANS
および原点にとどまるスポットの 3個である。 Rf0
.
5の
スポットはケイ光を発し，かつニンヒドリン反応陽性で
5
7
あったので， MANS基の 1個結合した G
ramicidinS
ィーで単一のケイ光スポットを示した(図 2
)
0 (実験の初
と思われる。また原点のスポットもニンヒドリン反応陽
t
h
y
l
a
c
e
t
a
t
eを用いていたが，
期には，溶出液として e
ramicidinS と考えられる。最先
性であり未反応の G
この場合ごく小さなスポットが主スポットに遅れて泳動
端まで泳動したスポットはニンヒドリン反応陰性で、あり
するのが見られたので，
(MANS)2-Gramicidin S と思われるので，
液でシリカケ守ルクロマトグラフィーを繰りかえすことに
この画分を
さらに精製するために，次にシリカゲルカラムクロマト
グラフィーを行なった。
e
t
h
y
l
a
c
e
t
a
t
e
/
b
e
n
z
e
n
e
;1
/
1溶
より，この小さな成分を除く必要があった)。
(
2
) 得られた主成分のアミノ酸分析
(
1
)の薄層クロマトグラフィーで均ーな物質と Gram
i
c
i
d
i
n S とを各々 6NHCl，1
1
00
Cで2
3時間加水分
解した後， HClをエパポレーターで除いた後，薄層クロ
マトグラフィーを行な¥"，ニンヒドリン反応によって検
ramicidinS の構成アミノ酸の Orn，Leu，
出した。 G
Phe，Val， Pro も対照として同時に泳動した。展開液
u
t
a
n
o
l 酢酸水 (
3
:1
:1
)を用いた。 Leu と
として b
Pheは同位置に泳動し，続いて Val，Pro，Orn の順に
ramicidinS の分解物では，これら
遅れて泳動した。 G
4個のスポットすべてが見られたが， (
1
)で得られた最終
精製物では
4個のスポットの内特に Orn のスポット
が著しく弱くなり，新たに， Leu+Pheのスポットより
医1-1 MANS-GramicidinSの薄層
クロマトグラム
も先に泳動した，ニンヒドリン反応陽性で、かつヶい光を
発するスポットが出現した。加えて，
ニンヒドリン反
応陰性で，弱いながらケイ光を発するスポットがさらに
3個出現した。これらの結果は，最終精製物は Ornが
MANS化された GramicidinS であることを強く示唆
している。
表-1 GramicidinS および MANS-Gramicidin
S の構成アミノ酸のモル比
化合物
l
2
出r
仇
包
加水分解時問( μ
捕 時問
MA
l
'
附
N
釧
4
叩
胤
S叫
1
24時間
1
72時間
1
9
6時間
(モル比) (モル比 )
I
(モノレ比 )
i
(モノレ比)
図-2 G
ramicidinS および MANS-GramicidinS
複合体の加水分解物の薄層クロマトグラム
ア
Orn
0
.
8
6 10
.
1
3
Pro
0
.
9
3 11
.0
2 10
.
9
7 10
.
9
9
ノ
Val
0
.
9
4 I0
.
8
2 I0
.
9
2 I0
.
9
8
酸 I Leu
I 0
.
9
8 I1
.0
4 I0
.
9
8 I0
.
9
8
1
.0
1
.0
1
.0
1
.0
Phe
SephadexLH-20 カラムクロマトグラフィーで溶出
I
0
.
3
9
I
0油
した最初の画分を集め，シリカゲ、ルを少量加え，濃縮し，
シリカゲルに溶出物を出来るだけ均一に吸着させる。こ
の溶出物を吸着したシリカゲルをあらかじめ e
t
h
y
l
a
c
e
-
表
-u
こG
ramicidinSおよび MANS-GramicidinS
複合物の構成アミノ酸のモル比を示した (
Pheを 1とし
t
a
t
e
/
b
e
n
z
e
n
e
;1
/
1溶液で平衡化したシリカゲルカラム
0 GramicidinS においても MANS-GramicidinS
た)
(
3
5cmx1
.5cm</1)の上に重層した後(約 2cm)，平衡化
複合体においても Orn以外のアミノ酸のモル比は 1に
に用いたものと同じ溶液で溶出する。最初に溶出する画
ramicidinS では
近い値を示している。 Orn の値が G
分を集め， 45~500C で溶媒を除き乾燥させる。 10.5 mg
0
.
8とやや低いのは，
の白色粉末が得られた。このものは薄層クロマトグラフ
るために， 2
4時間の加水分解時聞が短かったことによる
このペプチドが環状ペプチドであ
5
8
ものであろう。 MANS-GramicidinS は Orn の{直が
低く
2
4時間の加水分解ではわずかに 0
.
1
3であり，分
6時間にしても 0.
49という値しか示
解時聞を延長して 9
さなかった。これは MANS基と Ornの結合がペプチ
ド結合に比べて非常に強く， 9
8時間後においても約半数
の Ornが MANS と結合したままであると思われる。
SephadexLH-20 およびシリカゲルクロマトグラフ
ィーによって精製された MANS-GramicidinS複合物
は
， (
1
)b
u
t
a
n
o
l
a
c
e
t
i
ca
c
i
d系の薄層クロマトグラフィ
ーにおいて，ケイ光は発するが，ニンヒドリン反応陰性
であるスポットを与えること， (
2
) さらに加水分解によ
りGramicidinSの構成アミノ酸である Phe，Leu，Val，
Pro，Ornを与えることから， MANS基が Gramicidin
こ結合した (MANS)2-GramicidinS
S の 2個の Orn I
であると考えられる。ただし， Ornの回収率は 9
6時間
の加水分解によっても約 50%であり，この点加水分解の
条件を検討する必要がある。
結
論
N
m
e
t
h
y
l
2
a
n
i
l
i
n
o
n
a
p
h
t
h
a
l
e
n
6・s
u
l
f
o
n
y
l(MANS)
c
h
l
o
r
i
d
e と GramicidinS を反応させた後， Sephadex
LH-20 およびシリカゲルクロマトグラフィーにより，
(MANSh-GramicidinS複合体を調製した。この複合物
は，薄層クロマトグラム上でケイ光発光とニンヒドリン
)
z
発色および加水分解物のアミノ酸分析により (MANS
Gramicidin S であることを確認した。
文
献
1
) Eisen，H. N. and S
i
s
k
i
n
d，G
. W.・ B
i
o
c
h
e
mistry
，3
，9
9
6，1
9
6
4
.
2
) Kreth，H. W. and Williamson，A.R.: Euro‘
peanJ
.lmmuno
，
.
l3
，1
4
1，1
9
7
3
.
3
) Margoi
1e
s，M.N.，Cannon，L
.E
.I
I
I，Strosberg，
A. D
. and Haber，E
.
: P
r
o
. Natl
. Acad. S
c
i
.，
USA，7
2，2
1
8
0，1
9
7
5
4
) Montgomery
，P
.C
.，Rockey，J
. H. and W
illiamson，A. R.: P
r
o
. Natl
.A
cad. S
c
i
.USA，
6
9，2
2
8，1
9
7
2
.
.C
.，Rockey，J
.H.，Kahn
，R.L
5
) Montgomery，P
. A.: J
. lmmuno
，
.
l 1
1
5，9
0
4，
and Skandera，C
1
9
7
5
.
6
) Cameron，D
.J
. and E
rlanger，B
.F
.
: lmmunochem.，1
3，2
6
3，1
9
7
6
.
.F
.，Konigsberg，W.H.，Rosenstein，
7
) Richards，F
，J
. M.: Science，187，130，
R
. W. and Varga
1
9
7
5
.
，
妊S
.，Varga，M.，Rao，D.N.
8
)P
o
t
t
e
r，M.，Rudiko
.B
.
: Cold Spring Harbar
and Mushinski，E
.B
io
，
.
l4
1，6
6
1，1
9
7
6
.
Symp. Quat
9
) Onodera，M.，Shiokawa，H. and Takagi，T.:
J
. Biochem.，7
9，1
9
5，1
9
7
6
.
1
0
) 小野寺昌彦・ 蛋白質・核酸・酵素別冊， p.189，共
立出版，東京， 1
9
7
4
.
1
1
) Onodera，M.and Shiokawa，H.: J
. Biochem.，
8
1，8
9
1，1
97
7
.
1
2
) 小野寺昌彦・塩川洋之. 化学の領域別冊， p.79，
9
7
6
.
南江堂，東京， 1
.，Becker，R
.R
.
， Rosenbluth
，R. and
1
3
) Cory，R.P
lsenberg，1
.
: J
.Am.Chem.S
c
i
.，9
0，1
6
4
3，1
9
6
8
.
.P
.，Brownstein，A D
.and Fruton，
1
4
) Sachdeu，G
J
.
:J
.B
iol
. Chem.，2
4
8，6
2
9
2，1
9
7
3
1
5
)S
t
a
h
l，
E
.(
E
d
i
t
o
r
)
:T
h
i
n
l
a
y
e
rChromatography，
p8
8
9，Springer-Verlag，B
e
r
l
i
n，1
9
6
9
.
目
目
Preparation and Puri五
cation of Bis-N
・methyl-2
・
anilinonaphthalene-6-sulfonyl-Gramicidin S
Masahiko ONODERA，Kyδsuke TANAKA，Toshihide TAKASAWA
and Hiroyuki SHIOKAWA
n
i
l
i
n
o
n
a
p
h
t
h
a
l
e
n
e
6・s
u
l
f
o
n
y
l
G
r
a
m
i
c
i
d
i
n S was prepared and p
u
r
i五e
d by c
h
r
o
Bis-N-methyl-2・a
matographyonSephadexLH-20ands
i
l
i
c
agel
. Aminoa
c
i
da
n
a
l
y
s
e
sandt
h
i
nl
a
y
e
rchromatography
1nonaphthaleneふ sulfonyl group are bound t
o one molecule o
f
i
n
d
i
c
a
t
et
h
a
t two N
m
e
t
h
y
l
2
a
n
ii
GramicidinS
.