雌性発生ギンブナにおける精子核導入による四倍体の作出

Title
雌性発生ギンブナにおける精子核導入による四倍体の作
出
Author(s)
間田, 康史; 宮川, 真紀子; 林, 大雅; 海野, 徹也; 荒井, 克俊
Citation
Issue Date
水産増殖, 49(1): 103-112
2001
DOI
Doc URL
http://hdl.handle.net/2115/35199
Right
著作権は日本水産増殖学会に帰属する
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Additional
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arai-57.pdf
Instructions for use
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
SUISANZOSHOKU 4
9
(
1)
，1
03-112 (
2
0
0
1)
雌性発生ギンブナにおける精子核導入による四倍体の作出
間田康 史 ・宮川 真紀子 - 林 大 雅
海野徹也・荒井克俊
(
2
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1年 1月 5日受理)
ProductionofTetraploidsbyIntroductionofSpermN uc
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体と四倍体が存在し ，それらはすべてが雌で雌性発生
とが予想され，この点は鱗移植6，
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1
) アイソザイム分
により繁殖することが知られている 1.
5
)。雌のみを生産
析 12，
1
，
め RAPD-PCR分析 12)および DNAフインガープリ
すること，親の優良形質をそのまま子に伝えること，
ント法 13.16)により確認されてきた。一方，三倍体に比べ
および遺伝的に均一な集団を作ることはいずれも育種
ると四倍体の生殖についての知見は断片的であり，四
上重要で、あるが，ギンプナはこれら三点を自然、に行っ
倍体ギンプナの卵をキンブナ精子で媒精 した場合， そ
ている 6)。従って，ギンブナの特殊な生殖様式を理解す
の子孫がすべて 四倍体雌 となることから ，これも雌性
ることは育種技術開発の基礎的知見となる。
発生により繁殖するが 17叫，卵成熟，精子排除の機構
三倍体ギンプナでは，卵成熟の過程において第一減
の詳細は不明のままであり，生じる四倍体子孫がク ロ
数分裂は行われず，第二分裂中期に至り排卵されるの
ーンか否かは遺伝学的手法により確認されてい ない。
で，体細胞の染色体数と遺伝的構成がそのまま卵に引
四倍体ギンプナの生殖機構に関する知見が乏しい理由
8
)。そして，この様な卵に精子
き継がれることになる 7，
は，これらの分布が日本の中央部より北の地域のみに
が侵入しでも精子核と雌性核の融合は起きず，雌性核
限られ，
のみで発生を開始する 9)。従って ，三倍体ギンプナの子
か出現しないことから州，研究に必要な実験材料を十
しかも三倍体と比べると極めて低い頻度で し
広島大学生物生産学部 (
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岡田・宮川・林 ・海野 ・荒井
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分確保できない点にある。
査し，性比を明らかにするとともに，混合飼育した三
三倍体ギンプナの受精卵を受精後 1
5分 に 低 温 処 理
倍体と成長を比較した。
5分間)すると，その子孫に精子核由来の雄親
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材料と方法
ゲノムを含む四倍体個体が生じることが報告されてお
り20) 最 近 ， 同 様 の 現 象 は 受 精 後 5分 後 の 高 温 処 理
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雌親魚、として用いたギンプナ C
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た21)。本来であれば三倍体ギンブナの卵に侵入した精
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6年 4月に広島県下黒瀬川中
子は核膜崩壊が抑制され9) 雄性前核形成ができないは
9
9
4年に黒瀬川産ギン
流において採取した。 #5152は1
ずであるが，温度処理により何らかの機構で核膜崩壊
プナより採卵，受精，僻化させた後，広島大学生物生
0
の抑制が阻害され，そのため精子核が前核化し，雌性
産学部実験池において飼育，育成した群に由来する。
前核との融合が成されたと見ることができる。すなわ
#7041は 1
9
9
4年に黒瀬川中流において採取後，飼育し
ち，受精卵の操作により四倍体を比較的高率で作出し
た個体である。これらの雌親魚は後述の DNAフィンガ
うる。この様な四倍体は卵成熟ならびに雌性発生機構
ープリ ン ト法あるいは RAPDPCR法により同ーのクロ
解明のための研究材料として有用なばかりか，導入す
ー ン (クローン 1
)15)に属することを確認した 。受精卵
司
る雄性ゲノムの由来，すなわち雄親とする魚種を変え
9
9
6
の細胞学的観察に用いた交配群の雌親魚 #6121は 1
ることにより，種々の異質四倍体を作りうるので新た
年黒瀬川中流で採取し，学内実験池で養成した個体で
な染色体操作技術としても期待できる。
ある。性比および成長調査のための実験群(後述)作
そこで，本研究では，まず三倍体ギンプナの卵をキ
ンギ ョの精子で受精後，様々な条件で低温，高温およ
び圧力処理を施し，効率よく四倍体を作出しうる条件
を見出そうとした。次に
これらの操作により生じた
2
8
2は 1
9
9
7年黒瀬川に
成に用いた雌親魚 #5281お よ び5
おいて採取後，学内実験池で飼育した個体である 。
雄親魚、としては学内実験池で飼育中のキンギョ
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附 3
個 体 ( #1~3) およびコイの'fJrinus
は RAPD-PCR分析をおこない，精子核導入を遺伝学的
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o1個 体 ( #1
)， 黒 瀬 川 で 採 取 し た 二 倍 体 フ ナ
(#1，ゲ ンゴロウプナC. c
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i以外の種，未同定) 1
に確認した。そして，好適条件で受精卵を処理した場
個体を用いた。
四倍体等について DNAフインガープリ ン ト分析あるい
合，いかなる過程で精子核の取り込みが生じるか，そ
0
-15IUの HCG
人 工 受 精 雌 に つ い て 体 重 19当たり 1
の詳細を細胞学的に観察した。また，好適条件の処理
(ゴナトロピン③，帝国臓器)を腹腔内に注射し，水温
により生じた四倍体ギンプナの生殖腺を組織学的に調
を2
0Cに保った。約 1
5時間後，排卵を確認してポリ塩
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O
，
雌性発生ギンプナへの精子核導入
105
化ピニリデンフィルム(商品名サランラップ，旭化成)
雄 #2により受精した。これら受精卵の一部を下記の処
を敷いたシャーレ上に卵を搾出した。雄親魚、(キンギ
T
a
b
l
e1 および~ 2)。
理に供し，未処理卵を対象群とした (
ヨ，コイ，二倍体フナ)より採取した精液を淡水硬骨
四倍体の性比や成長調査のため 1997年 5~7 月に雌
魚 用 リ ン ゲ ル 液 (NaCl7
.
5g， CaCI
.
4g， KCl
2， 0
親魚 #5281および #5282より採卵し，各々の雌由来の
H
.
7
.
8
) で 100
倍に希釈し，媒
0
.
2g/1000ml蒸留水， p
卵を三分し，それぞれ，キンギョ雄 #3，コイ #1，二
精に用いた。卵に希釈精液を加え，薬匙で撹#後20C
倍体フナ #1の精子で受精し，その後直ちに，高温処理
の淡水をいれたホウロウ引きのパット(縦250X横 300X
に供した。 1997年 6月に，雌 #6121より得た卵をキン
深さ 30mm) 中の磨りガラス板に付着させ人工受精を完
ギョ (#3) 精子により受精し，高温処理の細胞学的検
了した。 1995年春，雌親魚、#50
，
1 505， 506，および
討に用いた。
0
508の卵をキンギョ雄 #1により受精し， 1996年 4月 に #
低 温 処 理 受 精 卵 を 20Cの一定水温で培養し，受精
5152，7031，7032，7033，および7041の卵をキンギヨ
5，8，1
5分)が経過後，低温水 (
0，1，
後所定の時間 (
0
Table2
.S
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a
r
t
i
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4
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0
問団・宮川・林・海野・荒井
1
0
6
1
0C) に磨りガラスごと受精卵を浸し低温処理を行っ
さらに 5分間の伸長反応を行った。 PCR産物は 1
0%ポリ
1
5，45，5
5分間)が経過した後，水温
た。一定時間 (
アクリルアミドゲルで分離し，エチジウムブロマイドで
2
0Cのホウロウ引きパットに移した。
検出した。
0
0
0Cの一定水温で培養し，受精
高温処理受精卵を2
0
受精卵の細胞学的観察
親魚 #6121の成熟卵をキン
3~95分)が経過後，断熱容器に用意
後所定の時間 (
#
3
)の精子で受精後 5分(培養水温20C
) に4
0C，
ギ
、
ヨ (
した湯に磨りガラスごと付着した受精卵を一定時間浸
1分間の高温処理を施した卵を処理直後よりほぼ 5分間
0Cで 1
5分間，
潰し，高温処理を行った。処理条件は 3
隔で経時的にプアン液で固定した。動物極側の匹盤部
4
0Cで6
0
秒間，あるいは 4
1Cで5
0
秒間とし，処理終了
分を剃刀ではぎ取り，常法により脱水・透徹後，パラ
0
0
0
後，受精卵を水温2
0Cのパットに移した。
0
圧 力 処 理 受 精 後 4，5 ，あるいは30分に 700~800kg/
2で6
cm
0
秒間圧力処理を施した。すなわち，所定の時聞が
0
0
フインに包埋し，厚さ 8~10μm の切片に H-E 染色を
施し観察した。
四倍体の性比と成長
親 魚 #5
281および5282より
経過後に受精卵の付着した磨りガラス (30X200X1mm)
)，ある
各々得た成熟卵をキンギョ (#3)， コ イ ( #1
をフレンチプレス(大岳製作所)のシリンダ一内に収
) の精子で受精後 5分(培養水温2
0C)
いはフナ(#1
0Cのパットに収
容し，加圧した。処理終了後は水温2
に4
0C， 1分間の高温処理を施した 。無処理群を対照
容した。
とした。これらの実験群を 8~12 月齢まで飼育し，体
0
鮮化後 3日目からアルテミア幼生を
仔稚魚の飼育
与え，体長 25mm程度になるまで，ホウロウ引きパッ
0
0
長，体重を測定後，前述の方法により倍数性判定を行
った。魚体をプアン液で固定し，常法により脱水，透
ト中で飼育した。その後，室外に用意したコンテナ
徹後パラフインに包埋し，厚さ 8~10μm の切片として，
2
0X横 380X深さ 180mm) に移し，成長に応じて
(
縦6
H-E染色の後，観察 に供した。得られた結果を倍数性
アl
レテミア，
ごとに整理し，成長と性比を四倍体と三倍体の間で比
ミジンコ，テトラフイン，アユ用人工飼
1月以降は水温を約 2
0Cに保った室内
料で飼育した。 1
0
較した。
の601ガラス製水槽で人工飼料を与え飼育した。
結 果
倍数性の判定 供試魚、の尾部静脈より採取した血液一
滴をクエン酸ーDMSO緩衝液22)あるいは E
a
g
l
e
sMEM培
低温‘高温および圧力処理と四倍体出現率
四倍体
N
i
s
s
u
i
) 1ml中にとり，穏やかに混和後，遠心
養液 (
作出の至適条件を調査する目的で，受精卵を低温，高
分離 (
9
0g，5分間)した。採血不能の場合は偲等の組
T
a
b
l
e1
)，処理群の
温，および圧力で処理した結果 (
織をとり，
2
2
CMF-PBS
あるいは
)
EaglesMEM液中で細
醇化率は対照群の 42.6~50.7% に対し，
#501由来の群
切後，これらのいずれかを 1ml加え遠心分離した。上
を除き， 0~25.7% と低下した。また，受精後 5 分から
ZhangandArae2)の処方による染色液
の低温処理群および圧力処理群の仔魚、は鮮化した場合
澄みを除き，
1mlを加え，冷暗所で3
0分以上染色し，分析前に 40μm
でも，正常個体は著しく少なかった 。 約 3~6 月齢の
メッシュを用い細胞の破片などを除去し，三倍体ギンプ
生存個体について DNA量フローサイトメトリーによる
C
o
u
l
t
e
rEPICS
ナを基準として，フローサイトメーター (
T
a
b
l
e1
)，三倍体 (
F
i
g
.
倍数性の判定を行ったところ (
Iあるいは BectonD
i
c
k
i
n
s
o
nFACSC
a
l
i
b
u
r
)に
P
r
o
f
i
l
eI
O
4分
， lC， 1
5
1
a
) の他に，一つの低温処理群(受精後1
より細胞核の相対 DNA量を測定して個体ごとの倍数性
分間)で 12.5% ，また四つの高温処理群(受精後20~40
を判定した。
分
， 40~41 o
C，5
0
秒間)で 1
1
.
1~50%の四倍体 (Fig. 1
b
)
DNAフィンガープリント分析既報 1
4
)に従い親魚の
が出現した。これら高温処理群中 2群には四倍体と三
血液および子孫の筋肉より DNAを抽出した。 DNAフ
倍体の細胞を合わせ持つ四倍体
f
Iで
インガープリントは抽出した DNAを制限酵素 Hin
1c) が3.6~5.1%生じた。これら以外の温度処理群と圧
.
8
%アガロースゲル電気泳動により分離した
消化後， 0
力処理群には四倍体の出現がないか，生存個体がいな
後，ナイロン膜に転写し，
S
p
r
u
e
l
le
ta
l
.23)の方法に従
い，アルカリフオスフアターゼで標識した NICE™
3
3
.
624)
(
C
e
l
l
m
a
r
kD
i
a
g
n
o
s
t
i
c，UK) をプロープとし，
かった 。
F
i
g
.
三倍体モザイク (
しかし，親魚 #505 の対照群に1.9~6.8%の率で
四倍体が見られた。
高温処理開始時期と四倍体出現率
高温処理条件を
4
0C，6
0
秒間と一定にして，受精後 5~95分の聞の様々
化学発光により検出した。
0
RAPD-PCR分 析 抽 出 し た DNAを鋳型として，ラ
な時期に処理を施し，最も効率的に四倍体が作出でき
ンダムプライマ-A69 (和光純薬工業;5'-TGGTACG-
T
a
b
l
e2
)。対照群の鮮化率は親魚
る条件を検討ーした (
GTATA3
'
) を用いた。 PCR反応は 9
3Cで 1分間プレヒ
間で3 1.7~58.5% と変動し，親魚による差が大きかった 。
3Cで 1分間変性， 3
4Cで 1分間アニー
ートした後， 9
しかし，いずれの親魚の子孫においても処理群の僻化
2Cで 2分間の伸長反応を 4
0サイクル実施し，
リング， 7
率は対照群よりも低下した 。!iIIf化率と処理開始時期の
0
司
0
0
0
雌性発生ギンプナへの精子核導入
F
i
g
.2
)，昨化率は受精後 5， 1
5，35，
関係を調べると (
1
0
7
したが， #7
0
3
1，7
0
3
2，および7041の処理群子孫には，
5
5分処理群で周期的に低くなり (
0~2 6.3% ) ，受精後
三倍体の他，四倍体，高四倍体あるいは四倍体一三倍
2
5， 45分で高くなった。受精後65~95分の間では鮮化
体モザイクが出現し，その率は受精後 5分処理群で最
率の周期性は不明瞭で、あったが， 8
5分で低くなる傾 向
も高く
があった (
F
i
g
.2)。この様な周期性は鮮化後 1
8日にお
た (7.7~33 .3%) 。受精後25分処理群では #7032 の子孫
T
a
b
l
e2)
。
ける生残率では不明瞭であった (
のみにおいて 3
8
.
5
%の四倍体が見られた。以降，受精後
(66.7~100%) ，次いで受精後 15分処理群であっ
解化後 6~8 月齢の倍数性判定結果を Table 2に示
3
5，4
5，5
5， 6
5分処理群においては四倍体等の出現頻
す。親魚 #5152， #7033の子孫には 三倍体のみが出現
5分では再び四倍
度は低下する傾向があった。受精後 7
体出現率が上昇したが， #7032由来子孫では60%(
3
/5)，
a
2
0
0
#7031の子孫では 9
.
5
%(
2
/
21)，その他では 0%と親魚、に
1
6
0
よる差が大きかった 。受精後8
5分においても 6
.
3
% (#
1
2
0
/
1
6
) から 3
7
.
5
% (#7032，3
/
8
) の四倍体等が
7
0
3
1， 1
8
0
見られた。受精後95
分処理開始群では， 5
.
3
%(
#7
0
3
1，
4
0
1
/
1
9) の四倍体が見られた。#5152， #7
0
3
1， #7033
O
O
2
0
0
4
0
0
6
0
0
8
0
0
1
0
0
0
および #7041の対照群では三倍体のみが出現したが，
むE
山
田
沼 wZU ﹄U Q由
芯 UMO ﹄A
2Z
#7032の対照群では 1
3
.
3% (
2
/
1
5
) の四倍体の出現が見
られた。
a
噌 ム唱
AUAUnu
nunbqL
OYU
b
DNAマーカーによる精子核導入の確認
好適処理条
EA
件の検討に用いた 4個 体 の 親 魚 ( #501， 505， 506，
8
0
5
0
8
) より得た DNA標本を既知クローンの試料と同ー
4
0
のゲルにおき DNAフインガープリント分析を行ったと
O
O
2
0
0
4
0
0
6
0
0
8
0
0
1
0
0
0
- 12KB
2
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C
1
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一7KB
1
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ハ
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，
(渓)ZUM
吋出
i
唱
ハU
O
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K
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C
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5 2
5 3
5 4
5 5
5 6
5 7
5 8
5 9
5
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ころ，これらはすべて同 ーのクローン(クローン 1
)15)
照群でも同様であった。
に属することが判明した。そこで，これら親魚、の受精
受精後35~45分:観察した卵で雌性前核が見られた
卵に由来する対照群，低温・高温処理群の三倍体，四
(
F
i
g
.
5
d
)。精子核には以下の三つのタイプが見られた。
倍体，および三倍体 四倍体モザイク個体を精子の供給
A
:全く膨潤しない， B
:やや膨潤， C
:膨潤して雄性前
源としたキンギョ(#1)の試来十とともに，同一ゲルにて
核を形成。 タイプ A とBの精子核は，雌性前核に接近
DNAフィンガープリント分析を行った一例を Fig.3に
F
i
g
.5
e
)，雌性前核が第一分裂中期に進んだ
しており (
n
=
8
) はす
示す。その結果，(1)分析に供した三倍体 (
時，精子核は膨潤せずに中期像の周辺あるいは中に位
2
)
べて既知クローン Iと同ーのパターンを示すこと， (
置した。一方，雌性前核と雄性前核(タイプ C精子核)
四倍体 (
n
=
5
) と四倍体一三倍体モザイク (
n
=1)は三
との接合と見られる像も認められた (
F
i
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f
)
。
倍体に比べ DNA断片数が多いこと，
他，精子核が前核化するが，雌性前核と接合せず，分
(
3
)増加した断片は
すべて雄キンギョ由来であることが明らかになった。
この
F
i
g
.
5
g
)。
裂中期像の中に位置する場合も稀に見られた (
7032に由
好適処理開始時期の検討に用いた雌親魚 #
受精後55分 ~65分:第一卵割は完全に終了し，生じ
DNA試料をとり，雌雄両親
た各割球のなかには新しい娘核が形成されていた。こ
来する三倍体，四倍体より
魚、の標本とともに RAPD-PCR分析を行ったところ，分
れらのうち，第二卵割中期像を示すものも見られた
析した三倍体個体と雌親魚(クローンI)はすべて同ー
(
F
i
g
.5
h
)。娘核あるいは分裂中期像の赤道板近くに，
の泳動像を示したのに対し，四倍体は雄キンギョ由来
全く膨潤していないタイプ Aや，やや膨潤したタイプ B
F
i
g
.
4
)。
の DNA断片を保有していた (
の精子核が見られる場合があった (
F
i
g
.
5i
)。
精子核導入過程の細胞学的観察
三倍体ギンプナの
受精後7
0
分:第二卵割の中期像あるいは間期を示す
卵をキンギヨの精子で受精後 5分に高温処理を施した。
ものがあった。割球内で雄性前核が娘核と接合してい
、
その後，経時的に固定した卵を観察したところ，以下
る像，あるいは娘核付近に位置する 像が認められた
の結果が得られた。
受精後 8分:第二減数分裂がほぼ終了し，第二極体
(
F
i
g
.
5j
)
。
四倍体の性比と成長 2個体の雌親魚、(#528
，
15
2
8
2)
F
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.5
a
)。侵入した精子頭部の
が放出されつつあった (
の卵を 3種類の雄(コイ，キンギョ，二倍体フナ)の精
F
i
g
.
5
b)
。
周囲には精子星状体の形成が見られた (
1
2
.
5
子で受精した 6交配区の対照群において高い率 (
5分:第二極体放出後，卵内に残った染色体
受精後 1
~37.5%) で四倍体が見られ，不注意による混合が生じ
は卵の中央に向かつて移動するとともに，染色体胞を
た可能性があった 。従 って，精子の供与種の相違によ
F
i
g
.
5
c
)。精子核も卵の中央に向かい，卵核
形成した (
る，四倍体誘起率の差異を検討することはできなかっ
付近に位置していた。
たが，いずれの 交配においても四倍体が得られた。そ
受精後25分:卵核は次第に膨潤し，胞状化とともに
こで，三倍体と四倍体両者について 11~14 月齢時に十
核の染色性が低下し雌性前核となった。雌性前核の両
分な個体が生存していた 3交配区温度処理群の三倍体
側に星状体が見られた。精子核は雌性前核の近くに位
と四倍体の聞で体長および体重を比較したが，有意差
置するが，膨潤は起きていなかった。以上の過程は対
T
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)。
は認めら1-しなかった (
，
雌性発生ギンプナへの精子核導入
ギンプナ雌 (#5281)x
キンギョ雄の受精卵の高温処
7
個体について組織学的観察を行
理より生じた四倍体 1
0
個体は周辺仁期の卵母
い，性判別を試みたところ， 1
F
i
g
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a
)，雌と判定されたが，
細胞を含む卵巣を有し (
F
i
g
.
6
b
)。同じ
残り 7個体の生殖腺は未分化であった (
雌からコイあるいは 二倍体フナの精子の受精により生
1
0
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) はすべて四倍体と同様
じた雌性発生三倍体子孫 (
F
i
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)，雌であった。
の卵巣を示し (
考 察
本研究において検討した圧力処理条件において四倍
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体誘起に成功したものはなかった。Tak
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の条件に従って低温処理を加えた受精卵からは四倍体
分における処理が各々第一卵割，第二卵割に至る細胞
が 出 現 し た が ， そ の 出 現 率 (12.
5%) は 彼 ら の 報 告
学的過程に作用したことが考えられる。これらの時期
(50%) よりも低かった。受精後 5分 か ら の 高 温 処 理
における処理は匹発生に著しく有害な作用を与え，解
(
4
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C
， 1分間)により同様の現象が生じることは董ら 21)
化率が著しく低下したものと考えられる。
により確認されており，処理群では僻化率は著しく低
DNAマーカーを用いた検討から，出現する四倍体等
下し，生残個体は全て四倍体であったと報告されてい
は対照群に見られた個体も含め，すべて精子核の取り
る。ほぽ同じ条件で高温処理を行った本研究において
込みにより生じることが明らかになった。さらに処理し
も鮮化率の著しい低下と高い四倍体出現率が観察され
た受精卵の発生過程を観察したところ，精子核が膨潤
たのは董らの報告 21)と一致する点であったが，四倍体
し前核化する像と雌性，雄性両前核が接合する像が見
の他に四倍体一三倍体モザイクと高四倍性個体が出現
られたことから，高温処理により本来三倍体ギンプナ
したのは新しい知見である。
本研究において受精後 5~95分の範囲で好適な処理
開始時期を検討した結果，受精後 5分からの高温処理
の卵細胞質中では前核化しないはずの精子9
)が膨潤し雄
性前核化し，雌性前核と接合することにより四倍性の
個体が生じると推論された。
により最も効率的に四倍体等を誘起しうることが判明
また，第二卵割以降の二細胞期あるいは四細胞期に，
したが，受精後 15~95分の範囲においても四倍体等の
割球内で遅れて膨潤した雄性前核が娘核と融合する像
出現が認められた。 これらの範囲内で僻化率を見ると，
が観察されたことから，四倍体一三倍体モザイクはこ
5， 35， 55， 85分の処理開始群において周
受精後 5， 1
のような過程を経て形成されたものと考えられる。今
期的に低下していた 。 ギンプナにおいて受精後 5~15
回，細胞学的観察は受精後 5分に処理を施した卵につ
分は第二極体放出の時期に相当する 2)と考えられる。ま
いてのみ行ったが，受精後 25~85分の卵割の後期に処
た
， 20~220C の水温下で、はギンプナは受精後47分に第
理を行った卵からも四倍体あるいは四倍体一三倍体モ
一分裂を完了して， 52分に完全な二細胞期となり， 57
ザイクが生じた。このことは精子核が遅れて膨潤して
分より第二卵割の前期となること 2)から，受精後25，55
前核の形態をとり，割球の娘核と融合し，一種の遅延
雌性発生ギンブナへの精子核導入
受精を起こす場合があることを強く示唆する。
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.28)，まコイ精子の関与により雌性発生的に
し
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ない場合も生じる。 Nakakukie
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o三
繁殖しているギベリオブナ C
に，精子核の膨潤と雄性前核化が観察される卵を産す
倍体成魚養殖集団のなかに，ごく少数の四倍体を認め，
る三倍体ギンブナが存在することを報告し，このよう
これらの成長が著しく良好であることを認めた。このこ
な交配群に四倍体が見られることを報告している。そ
とは，異種精子の取り込みによる異質四倍体化による
して，大沢ら 26)はアイソザイム分析からこれらのギンプ
成長改善の可能性を示唆し，今後の四倍体フナの成長
ナについて父系遺伝子の伝達を証明した。同様に中西
を追跡する必要がある。
7
個体中，雌と明確に判定出来た個体は 1
0
個体で
，
プナ 1
19
)。これらの報告は自然条件下において
より立証した 18.
残り 7個体は一様に未分化な生殖腺を示した。未分化
も，自発的に精子の取り込みが起き，四倍体が生じる
生殖腺を示す個体を，正常な精巣の発達を起こせなか
系統があることを示唆する。しかし，西日本で四倍体
0
:7となり，雌雄
った雄と考えると，雌 :雄の性比は 1
の出現が未だ報告されていない旬。特に本研究の材料を
2
X
0
5
)。
同数の性比 (
1:1)と有意差はない (
検定，P>0.
得た黒瀬川水系のギンフ ナでは過去の交配実験も含め，
したがって，高温処理による精子核取り込みにより出
四倍体が全く見られていない 141h 今後，三倍体ギンプ
来た四倍体の雄は未分化未発達の精巣を有し ，不妊の
ナの受精において，自発的な精子核取り込みが生じる
可能性があるが，雌は正常に卵形成を行う公算が高い。
のか否か，そして，生じるとすればどのくらいの率かに
この様にして生じた四倍体雌の生殖様式は目下不明で
ついて詳細に検討する必要がある。
あるが，ギベリオプナにおいてコイ精子の取り込みによ
松村・梶島 27)はギンプナ卵ホモジェネートで精子核
クロマチンの拡散を観察したが，三倍体ギンプナ卵内
同様，雌性発生により生殖するのかもしれない。この問
種の精子核に働いてクロマチン拡散機能を回害する未
題は自然の四倍体ギンプナの起源，発生機構とも関連し
知の物質が存在するためと推定した。本研究では受精
て興味深いことから，今後さらに検討する必要がある。
温度処理によりクロマチン拡散機能を阻害する未知の
雌性発生に より 繁殖している三倍体ギンプナの卵を
おいて興味深い点は，圧力処理では四倍体が認められ
キンギョ精子で受精後，様々な条件で低温あるいは高
なかったことである。これは，クロマチン拡散機能を阻
温処理を施すことにより，四倍体あるいは四倍体 一三
害する未知の物質が，温度に不安定であるタンパク質
0C，6
0
秒間の高温処理
倍体モザイクが作出できた。 4
やペプチドである可能性を示唆するものである。
では受精後 5分に処理を開始した群で四倍体の出現率
後，第二極体放出あるいは第一卵割の時期に高温処理
0
が高かった (67~100%)o
DNAフインガープリ ント分
析と RAPD-PCR分析から，四倍体は父親キンギョ由来
等の刺激を加えることにより，染色体数が倍化した六
の DNA断片を示すことから，精子核ゲノムが取り込ま
倍体が出現することが理論上考えられる。しかし，本
4
0C，6
0
秒
れて作出されることが判明した。高温処理 (
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研究においては四倍体以上の倍数体は出現せず， T
間，受精後 5分)を施した受精卵の細胞学的観察から，
2
0
)，董ら 2
andOjima
1
)も六倍体の出現はみていない。本
三倍体では本来膨潤しないはずの精子核が雄性前核と
研究の細胞学的観察では，高温処理を施した受精卵中
なり，三倍体雌性前核あるいは二細胞期の割球の核と
0
に極体放出の阻止像が全く認められなかったことから，
融合することにより四倍体核が形成されることが判っ
ギンブナでは何らかの理由により極体放出あるいは卵割
2月
た。同 一水槽で、三倍体と四倍体を飼育した場合， 1
の阻止が困難なことが考えられる。染色体操作により
齢魚、では成長に差は見られなかった。これらの三倍体
生じた六倍体の生存能力が著しく低く，フローサイト
7
個体中 1
0
個体が雌で，
は全雌であったが，四倍体では 1
メトリ ーによる倍数性判定時まで生き残らない可能性
残りの 7個体は性的に未分化であった。
も考えられるが，現在までの初期旺の染色体観察の結
果(岡田，未発表)では，三倍体と四倍体のみが出現
し，六倍体は認められていなし、。
，
‘
本研究では，雌性発生三倍体ギンプナとコイあるい
v・
T
-
=
要 約
物質の機能が喪失したためと思わる。また，本研究に
ところで，三倍体ギンプナの場合，雌性発生の開始
，
り生じた四倍体は雌性発生を行うことが報告されてい
ることから 29) 自然界に存在する四倍体ギンブナ 17.19)
で近縁種の精子核が凝縮したままとどまるのは，近縁
後の温度処理により四倍体子孫が出現したが，これは，
司
b
本研究において高温処理により得られた四倍体ギン
倍体になる系統で 18) 父系遺伝子の伝達を組織移植に
e
:
予
くとも 1
2月齢では成長に差が認められなかった。しか
精子核の取り込みによる四倍体の出現は処理を施さ
は諏訪湖産ギンプナの中に近縁種の精子を受け入れ四
J
1
1
1
はフナ精子の受精により生じた四倍体の問ではすくな
謝 辞
本研究の 一部は 文部省科学研究費補助金，基盤研究
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)，課題番号0
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4によった。フローサイトメータ
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問団・宮川・林・海野・荒井
112
ては広島大学生物生産学部免疫生物学研究室の協力を，
そして， BectonDickinson社 製 FACSC
uliburの 使 用
にあたっては広島大学遺伝子実験施設の協力を得た。
記して関係各位に深く感謝する。本研究の飼育，倍数
性判定，各種測定等においては中川平介教授はじめ，
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広島大学生物生産学部水産増殖研究室の院生学生諸兄
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の助力を得た。記して厚く感謝する。
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7)小林 弘・中野和枝・中村守純 (
1
8
7
7
):キンプナ雄との
交配により生じた 4倍体ギンプナの仔魚、と，その染色体
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1
3
7
.
について. 日水誌， 4
1
8
) 中西照幸 (
1
9
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2
):クローンギンプナを用いた免疫学・遺
伝学研究.細胞工学， I
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) 董仕・大原健一・谷口順彦 (
1
9
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7
):高水温処理による
ギンプナ卵へのコイ精子の導入と DNAマーカーによる確
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) 大沢康典・筒井清・町田秀夫・梶島孝雄 (
1
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):3倍
文 献
1)小林 弘・川島康代 ・竹内直政 (
1
9
7
0
):フナ属魚類の染
色体の比較研究，特にギンプナに現れた倍数性について.
4，1
5
3
1
6
3.
魚類学雑誌， 1
2) 小 林 弘 (
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2
2
.
細胞学的研究.動物学雑誌， 8
3)小林 弘・越智尚子 (
1
9
7
2
):キンプナとドジョウの精子
の媒精により生じた 3倍体ギンプナの仔魚、の染色体につ
1，6
7
71
.
いて動物学雑誌， 8
4) 小 野 里 坦 ・ 鳥 淳 雅 ・ 草 間 政 幸 ( 19
8
3
):北海道に於け
0，1
84
-1
9
0
.
る倍数体フナの分布.魚類学雑誌， 3
5)小林 弘 (
1
9
8
4
):倍数性ギンプナの日本および日本周辺
地域の分布とその起源について.海洋科学， 1
7
(
2
)，7
5
-
8
1
.
6)小野里坦(19
8
3
):クロー ンプナの話.淡水魚， 9，3
3
4
1
.
7)小林弘 (
1
9
7
6
):3倍体ギンプナの卵形成における成熟分
2，2
34
-2
4
0
.
裂の細胞学的観察.魚類学雑誌， 2
8) Y
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) 董仕・谷口順彦 (
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):RAPD-PCRおよびアイソザイ
ムパターンによるギンブナ一腹子のクローン性の証明.
2，8
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8
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6
.
日水誌， 6
1
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) 董 仕 ・ 谷 口 順 彦 ・ 辻 荘 一 ( 19
9
6):DNAフインガー
プリントとアイソザイムパターンによるギンプナクローン
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の識別 .日水誌， 6
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のクローン性の検討.信州大学理学部紀要， 1
2
7
) 松村清隆・梶島孝雄(19
8
4
):ギンプナ卵ホモジュネート
による精子核クロマチンの拡散.信州大学理学部紀要，
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