組織反応陽性荷電鉄コロンドのプロテイン銀 と 塩化金による現像

岡山医誌
(1997)
109,
151∼156
組 織 反 応 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ ン ドのプ ロ テ イ ン銀 と
塩 化 金 に よ る現 像
岡 山大学 医学 部解 剖 学第 二講座(主 任:村 上宅 郎教 授)
村上
宅 郎,蘇
衛 東,洪
大塚
珞 珈,朴
大勳
愛二
健照 会 セ オ病 院(院 長:瀬 尾憲 治博 士)
瀬
尾
憲
(平成9年8月11日
Key words:
Cationic
iron
colloid,
protein
silver,
gold
physical
chloride,
治
受理)
development,
Bodian's
Prussian
silver
言
た.後
陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ドで 染 色 した 試 料 は,一 般
reaction,
impregnation
混 合 水 溶 液 で10分
緒
blue
間 還 元 し,蒸
留 水 で充分 洗 っ
染 色 は 省 略 し た.
鉄 コ ロ イ ド処 理 し た 切 片 の 一 部 は,プ
ロテ イ
に フ ェ ロ シ ア ン化 カ リ ウ ム と塩 酸 で処 理 し,組
ン 銀 や 塩 化 金 に よ る 現 像 を お こ な わ ず,従
織 と反 応 した 鉄 コ ロ イ ドをPrussian
方 法 でPrussian
blue反
応
と して 検 出 して い る1).し か し,鉄 コ ロ イ ド と組
織 との 反 応 が 弱 い 場 合 に はPrussian
blue反
redで
応
blue反
来 の
応 を 行 いnuclear
fast
後 染 色 し た1,2).
以上 の切 片 はすべ てバ ルサ ム で透徹 して光 顕
も弱 く,染 色 結 果 の 判 定 に 苦 しむ こ と が あ る2).
観 察 し た.
本稿 は これ を補 うた め の プ ロ テ イ ン 銀 と塩 化 金
結
に よ る現 像 法 を紹 介 す る.
果
脳 には神 経細 胞 を囲 む陰性 荷電 硫酸 化 プ ロテ
材 料
と 方 法
オ グ リ カ ン(perineuronal
0.1Mカ
ド液(pH
コ ジ ル酸 緩 衝4%パ
7.2)で
ラ ホル ム ア ル デ ヒ
灌 流 固 定 し たICRマ
glycans)が
ウ スの
脳 のパ ラ フ ィ ン 包 埋 標 本3)か ら10∼15μmの
厚さ
あ り陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ドに よ く反 応
い て 述 べ る.
大 脳 皮 質 と小 脳 核 の プ ロ テ オ グ リ カ ン の 鉄 コ
トとカ コ ジ ル 酸 と共 に 煮 沸 す る こ とに よ っ て 調
1.5)で
proteo
す る3∼5).以 下 こ の プ ロ テ オ グ リ カ ン の 所 見 に つ
の切 片 を作 製 し,塩 化 鉄 を ヒ ドラ ジ ン ヒ ドラ ー
製 した 微 細 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ド(pH
sulfated
ロ イ ド反 応 は 従 来 のPrussian
処
に 観 察 で き た(Fig.
理 した2).
blue反
1A).プ
応 で明 瞭
ロ テ イ ン銀 と塩 化
金 処 理 に よ る現 像 で こ れ ら の プ ロ テ オ グ リカ ン
この切 片 を1%プ
ロテ イン銀(Albumosesilber,
Merck)水
溶 液 に3∼4時
で1∼2分
間 洗 っ た.次
に,同
切 片 を1%塩
金 水 溶 液 に20∼30分 浸 し,蒸 留 水 で10∼15分
っ た後 に1%ハ
は 一 層 明 瞭 に 観 察 で き,そ
間浸 した後 に蒸留 水
イ ドロ キ ノ ン ・5%ホ
の 網 目構 造 も明 ら か
に 観 察 で き た(Fig.1B).
化
小 脳 皮 質(小
洗
ea)の
ルマ リン
脳 糸 球)と
海 馬(Fasciola
鉄 コ ロ イ ド反 応 はPrussian
は 非 常 に 微 弱 で あ っ た が(Figs.
151
ciner
blue反
2A,
2A
応で
Inset),
152 村上
宅 郎:他4名
Fig. 1B
Fig. 1A
Fig.
1A
and
Inset.
(pH
1.5),
stained
Sections
from
treated
with
with
nuclear
detectable
with
the
rat
potassium
fast
Prussian
cerebral
cortex,
ferrocyanide
red.
Some
blue
neurons
reaction
after
which
and
HCl
possess
the
were
stained
for
Prussian
marked
cationic
with
blue
perineuronal
iron
colloid
cationic
sulfated
staining
iron
reaction
and
colloid
counter
proteoglycans
(arrowheads). •~250,
Inset: •~800.
Fig.
1B
and
Inset.
(pH
1.5),
Sections
and
sulfated
from
treated
with
proteoglycans
(arrowheads). •~250,
the
rat
protein
are
clearly
cerebral
silver
and
and
cortex,
which
gold
chloride
sharply
were
for
stained
physical
demonstrable
by
with
cationic
iron
colloid
development.
Perineuronal
the
development
physical
Inset: •~800.
プ ロ テ イ ン銀 と塩 化 金 に よ る現 像 で 明 瞭 か つ 高
考
い コ ン トラ ス トで観 察 す る こ と が で き た(Figs .
2B,
2B Inset).
大 脳 皮 質,小
察
本 研 究 は 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ドで染 色 し た 標 本
脳 皮 質,海
馬 台 で プ ロ テ イ ン銀
をプ ロテ イ ン銀 と塩 化 金 で 現 像 す る と,従 来 の
と塩 化 金 に よ る現 像 で神 経 線 維 と くに 細 い 線 維
Prussian
が 明 瞭 に 可 視 化 さ れ た(Figs. 1B, 2B, 2B Inset).
組 織 と結 合 し た 鉄 コ ロ イ ドを 明 瞭 に 可 視 化 で き
Prussian
る こ と を示 し た.こ
blue反
応 で は,こ の よ う な神 経 線 維 の
blue反
応 よ り一 層 強 い コン トラス トで
の現像 法 はす で に知 られて
明 瞭 な観 察 は で きな か っ た(Figs. 1A, 1A Inset,
お り,山
2B,
で あ る ジ ア ミ ン とチ オ カ ル ボ ヒ ドラ ジ ドで 処 理
2B
Inset).
神 経 膠 細 胞,血
鉄 コ ロ イ ド(pH
管 内 皮 や 他 の 細 胞 は 陽性 荷 電
1.5)と
こ れ に つ づ くPrussian
田 とそ の 共 同 研 究 者 は,陽
性 荷電 物質
し た 脾 臓 の 標 本 をプ ロ テ イ ン 銀 と塩 化 金 で 現 像
し て,血
管 内皮表 面 の陰 性荷 電 基に 結合 した ジ
blue処 理 あ る い は プ ロテ イ ン銀 と塩 化 金 現 像 処
ア ミ ン とチ オ カ ル ボ ヒ ドラ ジ ドを現 像 可 視 化 し
理 に 反 応 し な か っ た.
て い る6).
本 研 究 の 鉄 コ ロ イ ド処 理 を 省 略 した 予 備 的 実
験 で は,プ
ロ テ イ ン 銀 と塩 化 金 に よ る処 理 の み
組 織 反 応 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ ン ドの プ ロ テ イ ン 銀 と塩 化 金 に よ る現 像 Fig. 2B
Fig. 2A
Fig.
2A
and
Inset.
stained
Sections
with
Prussian
lycans
Fig.
2B
are
Inset:•~450.
and
Inset.
and
thin
Sections
cationic
sulfated
reaction
so
800,
with
from
cationic
blue
that
from
iron
protein
で はperineuronal
chloride.
silver.
Purkinje
sulfated
rat
cerebellar
colloid
and
counter-stained
they
show
the
coterx
(pH
1.5),
a slight
rat
(pH
are
Arrow
P
the
iron
colloid
proteoglycans
gold
153
with
nuclear
Prussian
blue
cerebellar
1.5)
and
cortex
treated
clearly
demonstrated
indecates
some
cell. •~800,
(A)
treated
(B)
with
hippocampal
fasciola
potassium
ferrocyanide
fast
and
the
fibers
red.
reaction
silver
physical
cinereum
and
Perineuronal
sulfated
(arrowheads).
hippocampal
protein
by
nerve
and
with
P Purkinje
fasciola
and
gold
development
concomitantly
cinereum
chloride.
stained
(Inset),
HCl
for
proteog
cell. •~
, stained
Perineuronal
with
or
protein
developed
silver
with
Inset: •~450
proteoglycansは
維8)は 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ド処 理 後 にPrussian
も ち ろ ん の こ と小 脳 皮 質 海 馬 の プ ロ テ オ グ リカ
blue反 応 を示 す.も
ン様 網 目構 造 は 決 し て染 色 され な か っ た(未 発
ロ テ イ ン銀 と塩 化 金 に よ る現 像 処 理 に 強 く反 応
表 所 見).従
した(未
っ て,本 研 究 で 示 し た 陽 性 荷 電 鉄 コ
ロ イ ドで処 理 し た 後 の プ ロ テ イ ン 銀 と塩 化 金 に
対 す る 陽 性 反 応 は 同 鉄 コ ロ イ ドの 組 織 と の 反 応
(結合)を
反 映 して い る こ とは 明 らか で あ る.
Prussian blue反
応 で は通 常 観 察 で きな い神 経 終
ち ろ ん,こ れ らの 線 維 も プ
発 表 所 見).
しか し,一 方 で 本 研 究 で 用 い た 現 像 法 は神 経
とくに その 終 末 を特 異 的 に染 め る とされ るBodian
氏 渡 銀 法 と原 理 的 に 同 じで あ り9,10),本研 究 で 現
像 され た 神 経 終 末 はBodianの
渡 銀効 果 を反 映
末 線 維 が プ ロ テ イ ン 銀 と塩 化 金 に よ る現 像 法 で
して い る可 能 性 が あ る.事 実,本
明 瞭 に 可 視 化 さ れ た こ と も,同 現 像 法 が 有 用 で
イ ド処 理 を 省 略 し た 予 備 的 実 験 で は,プ
あ る こ と を示 して い る と思 わ れ る.坐
骨神 経 を
ン 銀 と塩 化 金 に よ る 現 像 処 理 の み で 神 経 終 末 が
構成 す る神 経 線 維7)や脊 髄 の 白 質 と髄 質 の神 経 線
軽 度 で あ る が 染 色 さ れ た(未 発 表 所 見).従 っ て,
研究 の鉄 コロ
ロ テイ
154 村上
鉄 コ ロ イ ド処 理-プ
宅 郎:他4名
ロ テ イ ン 銀 ・塩 化 金 現 像 に
ま り,本 研 究 に お け る現 像 で は,プ
ロ テ イ ン銀
対 す る神 経 線 維 終 末 の 強 い 反 応 は プ ロ テ イ ン銀
が 組 織 と反 応 した 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ドに 結 合 し,
の 現 像 効 果 に 同 銀 の神 経 親 和 性(媒
染 効 果)が
次 に 銀 を イ オ ン化 イ
頃向 に従 っ て 金 に 置 換 して 色
重 な っ た.もの と思 わ れ る.な お,プ
ロ テ イ ン銀
調 を整 え て い る こ と に な る.
と塩 化 金 に よ る 現 像 処 理 で は,細
胞 核 と核 小 体
結
語
も媒 染 さ れ る の で,特 に 後 染 色 を 必 要 と し な い.
わ れ わ れ の 先 の 研 究 で は,陰
ドで 処 理 し た小 腸 のPaneth細
塩 化 第 二 鉄 を ヒ ドラ ジ ン ヒ ドラー ト と カ コ ジ
性 荷電 鉄 コ ロイ
胞 の 果 粒 はPrus
ル 酸 と共 に 煮 沸 して 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ イ ドを 調 製
sian blue反 応 に 陽 性 で あ っ た11).一 方,本 研 究
し た(Murakami
の 予 備 実 験 で は,陰
性 荷 電 鉄 コ ロ イ ドで 処 理 し
で マ ウ ス の 脳 切 片 を染 色 し,そ
た小 腸 のPaneth細
胞 の果粒 は プ ロテ イン銀 と
ン 化 カ リウ ム と塩 酸 でPrussian
塩 化 金 に よ る 現 像 に 反 応 し な か っ た.ま
予 備 実 験 で,陰
た,同
性 荷 電 鉄 コ ロ イ ド処 理 を 省 い て
et al, 1986).こ
の コロイ ド
の後 フ ェ ロシア
blue反
応,あ
る い は プ ロ テ イ ン 銀 と塩 化 金 で 物 理 的 現 像 処 理
を 行 っ た.そ
の 結 果,現
像 法 の 方 が よ り強 く明
直 接 プ ロ テ イ ン銀 と塩 化 金 処 理 を行 った とこ ろ,
瞭 な コ ン トラ ス トを産 む と い う利 点 が あ る こ と
Paneth細
が わ か っ た.こ
胞 の 果 粒 は 見事 に 染 色 さ れ た(未 発 表
の現像 法 で神 経周 囲硫 酸化 プ ロ
所 見).こ れ らの 所 見 は プ ロ テ イ ン 銀 は 陰 性 荷 電
テ オ グ リカ ン や 神 経 終 末 線 維 が 光 顕 下 に 明 瞭 に
物 質 で あ る こ と を 示 して い る と考 え られ る.つ
可 視 化 さ れ た.
文
1) Seno S,
Akita
physiochemical
Histochemistry
T,
献
Ono T and Tsuji T: Fine-granular
characteristics and histochemical
(1985) 82, 307-312.
cationic
iron colloid.
use for the detection
Its preparation,
of ionized anionic groups.
2) Murakami T, Taguchi T, Ohtsuka A, Sano K, Kaneshige T, Owen RL and Jones AL: A modified
method of fine-granular
cationic iron colloid preparation:
Its use in light and electron microscopic
detection of anionic sites in the rat kidney glomerulus and certain other tissues.
Arch Histol Jpn
(1986) 49, 13-23.
3) Murakami
T,
Taguchi T,
Ohtsuka
A and Kikuta A: Neurons with strongly negative-charged
surface-coats in adult rat brain as detected by staining with cationic iron colloid. Arch Histol Cytol
(1993) 56, 13-21.
4) Murakami T, Ohtsuka A and Taguchi T: Neurons with intensely negatively charged extracellular
matrix in the visual cortex.
Arch Histol Cytol (1994) 57, 509-522.
5) Murakami T, Ohtsuka A, Taguchi T and Piao DX:
Perineuronal
neurons in the brain and spinal cord: A histochemical
and adult mice.
sulfated proteoglycans
and electron microscopic
and dark
study of newborn
Arch Histol Cytol (1995) 58, 557-565.
6) Ueda H, Fujimori O and Abe M: Histochemical
elium lining the splenic blood vessels in the rat.
analysis of acidic glycoconjugates
in the endoth
Arch Histol Cytol (1996) 59, 389-397.
7) Toda K, Nishida K, Inoue H, Ohtsuka A and Murakami
T: Strongly anionic sites in peripheral
axons of the rat sciatic nerve: Light and electron microscopic detection using cationic iron colloid.
Arch Histol Cytol (1995) 58, 485-492 .
8) Murakami T, Ohtsuka A and Ono K: Neurons with perineuronal sulfated proteoglycans in the
mouse brain and spinal cord: Their distribution
and Golgi's silver nitrate.
and their reactions to lectin Vicia villosa agglutinin
Arch Histol Cytol (1996) 59, 219-231.
組 織 反 応 陽 性 荷 電 鉄 コ ロ ン ドの プ ロ テ イ ン銀 と塩 化 金 に よ る現 像 155
9) Bodian D: A new method for staining nerve fibers and nerve endings in mounted paraffin sections.
Anat Rec (1936) 65, 89-97.
10) Bodian D: The staining of paraffin section of nervous tissues with activated
fixatives.
protargol.
The role of
Anat Rec (1937) 66, 153-162.
11) Ohtsuka A and Murakami
T: Fine anionic iron colloid and its use in light and electron microscopic
detection of cationic sites in the rat kidney.
Arch Histol Jpn (1986) 49, 543-552.
156 村上
Physical
development
of tissue-reacted
protein
Takuro
宅 郎:他4名
silver
cationic
iron colloid
with
and gold chloride
MURAKAMI1), Wei Dong Su1), Luo Jia HONG1),
Da Xun PIAO1), Aiji OHTSUKA1)and Kenji SEO2)
1)Section of Human Morphology,
Department of Anatomy,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan
(Director:
Prof. T. Murakami)
2) Kensho-Kai Seo Hospital,
Fukuyama, Japan
(President:
Dr. K. Seo)
Rat brain sections were treated with fine granular
cationic iron colloid, which was prepared
by boiling ferric chloride with hydrazine hydrate and cacodylic acid (Murakami et al., 1986).
The sections were then treated with ferrocyanide
and HCl for Prussian blue reaction or with
protein silver and gold chloride for physical development. Physical development had an
advantage over Prussian blue reaction in that it produces clear and highly contrasted images
under a light microscope. Thus, the perineuronal sulfated proteoglycans
of the nerve cells were clearly demonstrated
by physical development.
and the fine processes