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ISSN 1346 −2334
Trace Nutrients Research
微量栄養素研究
Vol. 28
2011
Japan Trace Nutrients Research Society
日本微量栄養素学会
編集委員
委員長
吉
田
宗
弘（関西大学）
委員
荒
川
泰
昭（労働安全衛生総合研究所）
同
江
崎
信
芳（京都大学）
同
河
村
幸
雄（近畿大学）
同
鈴
木
鐵
也（クィーンズランド大学）
同
中
川
平
介（広島大学）
同
松
井
同
矢
野
秀
雄（家畜改良センター）
同
吉
野
昌
孝（愛知医科大学）
同
渡
邊
敏
明（兵庫県立大学）
徹（京都大学）
（50音順）
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日本微量栄養素研究第 28 集
目次
第 29 回日本微量栄養素学会学術集会の開催のお知らせ
原著
日本酒原料米中の D- および L-アミノ酸含有量の地域差と局在性 ...................................................................................................................
1
郷上佳孝，保井美保，岡田かおり，老川典夫
The eﬀect of light quality on harvested sweet corn by low intensity LED light
irradiation at low temperature during short storage ..................................................................................................................................................................... 10
Hirokazu Ohta, Mari Ohta and Tetsuya Suzuki
ウマに対するメナキノン-7 補給が血漿中メナキノン-7 濃度に及ぼす影響 ............................................................................................ 16
寺地智弘，井上喜信，蘆原永敏，
小林光紀，安藤邦英，松井徹
ビオチン欠乏マウスにおけるロイシン大量摂取による有機酸代謝への影響 .......................................................................................... 21
安藤沙織，松井朝義，榎原周平，
湯浅正洋，福井徹，渡邊敏明
病院および介護施設の食事からの微量ミネラル摂取量の計算値と実測値との比較 ......................................................................... 27
吉田宗弘，児島未希奈，三由亜耶，森田明美
ヒドロキシケトン化合物による活性酸素生成 ................................................................................................................................................................ 32
村上恵子，細川好孝，吉野昌孝
Direct visualization of capsaicin and vanillylamine in
fruit with laser ﬂuorometric imaging ................................... 35
Hideo Suzuki, Mari Ohta, Tatsuo Watanabe and Tetsuya Suzuki
カキ抽出エキスパウダーの安全性および機能性に関する報告 .......................................................................................................................... 40
西堀頼史，鈴木陽子，岸浪昌礼，藤澤紘，
永岡茂樹，山崎則之，松井博之，松田芳和
日本人成人女性ビーガンの脂肪酸摂取量 ........................................................................................................................................................................... 45
細見亮太，湯川法子，大儀倫子，吉田宗弘，福永健治
アロマセラピー精油の不死化視床下部神経細胞に対する作用 .......................................................................................................................... 49
大城なつき，小山裕也，中村亜紀子，大河原晋，川原正博
Dietary nitrate loads on cows in dairy farms near Lake Dian, Kunming City, Yunnan Province, China. .................................. 54
Hiroki Anzai, Kazato Oishi, KunZhi Li, Chagan Irbis,
Hiroyuki Hiraooka, Tatsuya Inamura and Hajime Kumagai
Function of FADH2-dependent 2-haloacrylate hydratase
sp. WS .................................................................................................................................... 58
from a 2-chloroacrylate-utilizing bacterium,
Anoop Vasudevan, Michiyo Fujita, Atsushi Kurata,
Jun Kawamoto, Nobuyoshi Esaki, and Tatsuo Kurihara
日本酒中の D- アミノ酸の定量と生成機構の解析 ........................................................................................................................................................ 65
岡田かおり，郷上佳孝，老川典夫
緑色野菜中ビオチン含量の季節変動について ................................................................................................................................................................ 70
曽根英行，神山伸，守木葵
Accumulation of manganese and zinc in growing Hijiki (
) plants. .............................................................................. 74
Masayuki Katayama, Yohko Sugawa-Katayama,
Motohiro Kasama and Etsu Kishida
市販離乳食からのヨウ素とクロムの摂取量の推定 ..................................................................................................................................................... 79
吉田宗弘，野崎詩乃，乾由衣子
成年女子の“貧血のない鉄欠乏症”における亜鉛値の一考察 .......................................................................................................................... 84
澤田孝子，許斐亜紀，横井克彦
レビュー
消化管における必須微量金属の吸収
―トランスポーターによる制御機構― ................................................................................................................................................................................ 89
橋本彩子，辻徳治，逸村直也，神戸大朋
学会記事
事務局からのお知らせ ...................................................................................................................................................................................................................... 資1
日本微量栄養素学会歴代会頭 ...................................................................................................................................................................................................... 資1
日本微量栄養素学会定款 ........................................................................................................................................................................................................... 資2
「Trace Nutrients Research 微量栄養素研究」原稿投稿規程 ............................................................................................................................. 資5
日本微量栄養素学会役員名簿 ...................................................................................................................................................................................................... 資6
日本微量栄養素学会会員名簿 ...................................................................................................................................................................................................... 資6
Trace Nutrients Research 28 : 1−9（2011）
原著
日本酒原料米中の D- および L-アミノ酸含有量の地域差と局在性
郷上佳孝，保井美保，岡田かおり，老川典夫
＊
（関西大学化学生命工学部生命・生物工学科）
Regional difference and localization of D- and L-amino acids contents
in brown rice for sake brewing
Yoshitaka GOGAMI, Miho YASUI, Kaori OKADA and Tadao OIKAWA
Department of Life Science and Technology, Faculty of Chemistry, Material Bioengineering,
Kansai University, Suita Osaka 564-8680, Japan
Summary
D-Amino
acids are widely detected in various organisms and foods and expected to have physiological functions for
human. We measured all of the D- and L-amino acids in 48 kinds of brown rice for sake brewing using HPLC. We
found that the almost all brown rice contained the D-amino acid forms of Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, His, Ser, Val.
Asp and Glu. D-Ala was detected only in brown rice produced in Hyogo, Hiroshima, Kochi, and Fukui Prefecture. The
D-Ser
concentration was relatively high in brown rice produced in Yamagata, and Tokushima Prefecture. D-Val was
detected in brown rice produced in Hokkaido and Iwate Prefecture but not in Kochi and Kagawa Prefecture. D-Asp
was detected only in brown rice but not in the 70 %, 60 %, and 50 % polished rice. These results suggested that D-Asp
existed around the center of the brown rice, and other D-amino acids existed near the surface of the brown rice. Accordingly, D-amino acid contents of brown rice for sake brewing are diﬀerent signiﬁcantly depend on the production
area and the polishing ratio.
D-アミノ酸は自然界での存在や役割が不明のアミノ酸
酒原料米中の D-アミノ酸含有量を高速液体クロマトグラ
と考えられてきたが，近年分析技術の発達に伴いヒト等の
フィーで定量し，その地域差と局在性を解明することを目
哺乳動物の体内に遊離型 D-アミノ酸が存在することが明
的とする。
らかにされ，その由来や生理的機能が注目されている。
実験方法
D-セリンは哺乳類の脳内に存在し，神経伝達に関与する
N-Methyl-D-aspartate（NMDA）受容体のグリシン結合部
位のコアゴニストとして機能することが明らかとなってい
1．実験材料
1）
る。また D-アラニンはラットの膵臓に存在し，血糖値
2）
玄米 46 種類および 70％精米品 46 種類，60％精米品 4
の制御に関与すると推定されている。さらに D-アスパ
種類，50％精米品 4 種類の計 100 種類の試料は独立行政法
ラギン酸は，脳内のメラトニンの分泌抑制等に関与してい
人酒類総合研究所（広島）及び酒米研究会から提供された。
3）
ると報告されている。
これらの試料の産地と品種名を Table 1 にまとめた。
またわれわれは D-アミノ酸がさまざまな食品中にも存
在することを明らかにした
4，5）
。たとえば，野菜ではトマ
2．日本酒原料米の遊離 D- 及び L-アミノ酸の抽出
ト，たけのこ，キュウリ，かぼちゃやねぎなどに，また果
様々な品種および産地の玄米または白米（精米歩合
物ではりんご，バナナ，キウイ，梨や柿などにさまざまな
70 %，60 %，50 %）10 g を上皿天秤で量りとり，ミルで 5
D-アミノ酸が含まれている。その他に，オレンジジュー
分間粉砕した後，その米粉を 250 µm のふるいにかけた。
6）
ス
7）
やミルク，ビール
9）
ココア，米
10）
8）
8）
やワイン，チョコレート
9）
や
チューブに入れ，20 mM クエン酸-リン酸緩衝液（pH 8.0）
などにもその存在が報告されている。
先にわれわれは，日本酒中にさまざまな D-アミノ酸が
含まれていることを明らかにした
11）
ふるいを通過した米粉 0.5 g を 15 ml 容のファルコン
。本研究では，日本
を 4.5 ml 加えて上下に激しく混合した後，25 ℃で 15 分間
超音波処理した（超音波処理は合計 2 回行った）。超音波
所在地：大阪府吹田市山手町3-3-35（〒564-8680）
＊
― 1 ―
処理後，13,000 rpm（15,000 x g），15 分間遠心分離し，そ
結果および考察
の上清を分析サンプルとした。
1．日本酒原料米の玄米中の D- および L-アミノ酸含有量
3．サンプルの除タンパク質
アミノ酸分析の結果，46 品種の日本酒原料米の玄米中
上記 2 で得られた上清にトリクロロ酢酸を添加し夾雑タ
に含まれている D-アミノ酸の種類と各 D-アミノ酸を含ん
ンパク質を変性後，水酸化ナトリウムを加えて中和し遠心
，
でいる玄米の品種の割合は，D-アスパラギン酸（100%）
分離後の上清のアミノ酸含有量を高速液体クロマトグラ
（26.1%），D-スレオニン
（0%）
，D-グルタミン
D-アラニン
フィー（HPLC）で測定し定量した。
酸（87.0%），D-バリン（67.4%），D-フェニルアラニン
（2.2%）
，D-イソロイシン（0%）
，D-チロシン（0%）
，D-ロ
４．サンプル中のアミノ酸のキラル誘導化
イシン
（0%），D-セリン
（87.0%）
，D-メチオニン
（0%），D-
OPA/NAC 法
（28.0%）
，D-アルギ
トリプトファン
（0%），D-ヒスチジン
試料溶液 60 µl に 1％四ホウ酸ナトリウム溶液 40 µl を
ニン（40.0%）
，D-アスパラギン
（27%）
，D-グルタミン
（9%）
，
加えた後，1％ N-アセチル-L-システイン（NAC），1.6 ％
（0%）
，D-リシン（0%）であった。一方，46
D-プロリン
o-フタルアルデヒド（OPA）溶液をそれぞれ 20 µl ずつ加
類の玄米中にはすべての L-アミノ酸が含まれていた。46
え試料中のアミノ酸をキラル誘導化した。その反応液
品種の日本酒原料米の玄米中に含まれている L-アミノ酸
11）
10 µl を HPLC で分析した。
種
の種類と各 L-アミノ酸を含んでいる玄米の品種の割合は，
（100%）
，L-スレオニン
（91.3%）
，L-アラ
L-アスパラギン酸
FLEC/ADAM 法
ニン（100%），L-メチオニン
（97.8%）
，L-セリン
（95.7%）
，
試料溶液 10 µl に 500 mM ホウ酸ナトリウム（pH 9.0）
（97.8%）
，L-フェニルアラニン（100%）
，L-イソロ
L-バリン
10 µl を加えた後，1 mM（
（+）- 1 -（9-フルオレニル）エチ
イシン
（100%），L-ロイシン
（100%），L-チロシン
（97.8%），
ルクロロホルメート（FLEC）溶液 20 µl を添加し 40 ℃で
（43.5%）
，L-ヒスチジン（98%）
，L-アル
L-トリプトファン
インキュベートした。30 分後，40 mM ADAM（1-アミノ
ギニン（100 %）
，L-アスパラギン（100 %）
，L-プロリン
アダマンタン）25 µl を加え過剰の FLEC を除去した。15
（100%）
，L-リシン
（99%）であった。さらに，DL-システイ
分後，50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）35 µl を添
ン，グリシンの含有割合は，それぞれ 0%，78.3%であっ
加し誘導化反応を停止した。その反応液 5 µl を HPLC で
た。
12）
分析した。
Table 1 Growing place and species of brown rice for analysis
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㻮㼄㼝㼈㼑㼄㼕㼘㼎㼒
㻮㼄㼝㼈㼑㼄㼕㼘㼎㼒
㻲㼒㼖㼈㼗㼒
㻲㼒㼖㼈㼗㼒
㻩㼘㼖㼄㼑㼒㼐㼄㼌
㻮㼒㼖㼋㼌㼋㼌㼎㼄㼕㼌
㻩㼘㼖㼄㼎㼒㼊㼄㼑㼈
㻼㼘㼐㼈㼎㼄㼑㼄㼈
㻪㼒㼋㼜㼄㼎㼘㼐㼄㼑㼊㼒㼎㼘
䟼㻸㼑㼇㼈㼕㻃㼗㼈㼖㼗㻃㼆㼘㼏㼗㼌㼙㼄㼗㼌㼒㼑
― 2 ―
2．日本酒原料米の玄米中の D- および L-アミノ酸濃度と
ることが明らかとなった。
一方，日本酒原料米の玄米中の L-アミノ酸と日本酒原
産地との関係
得られたアミノ酸分析の結果にもとづき日本酒原料米の
料米の産地との関係を検討した結果，L-アスパラギン酸，
玄米中の D-アミノ酸濃度と日本酒原料米の産地との関係
L-グルタミン酸，L-アラニン，L-ロイシン，L-イソロイシ
を検討した結果，D-アスパラギン酸はすべての産地の玄米
ン，L-フェニルアラニンはすべての産地の玄米に含まれて
に含まれていることが明らかとなった（Fig. 1）
。特に福島
（No. 22-No. 24）
，千葉県産
おり，L-アラニンは兵庫県産
県産の五百万石
（No. 13）や夢の香
（No. 14）に高濃度で含ま
（No. 44，45）に多く含まれ，L-セリンは高知県産
（No. 36，
れていた。また北海道産の玄米
（No. 1-No. 7）にはいずれも
37）にあまり含まれていないことが明らかとなった（Fig.
D-アスパラギン酸がほぼ同濃度含まれていた。D-アラニ
3-Fig. 16）
。
ンは福井県産（五百万石
（No. 16）
，おくほまれ
（No. 17）
）
，
兵庫県産（試験栽培中につき品種非公開（No. 21）
，兵庫北
3．日本酒原料米の玄米中の D- および L-アミノ酸の局在性
錦
（No. 22）
，五百万石
（No. 23）
，杜氏の夢
（No. 24）
）
，広島
日本酒原料米の玄米中の D-アミノ酸の局在性を明らか
県産（コヒシカリ
（No. 28）
，東広島産（山田錦
（No. 32）
，
にするために，山田錦（東広島産（No. 32）
），日本晴（東
日本晴
（No. 33）
）
，高知県産（風鳴子
（No. 38）
）
，新潟県産
広島産
（No. 33）
）
，コシヒカリ（広島県産
（No. 28）
）
，五百万
（五百万石（No. 46）の 11 種類の玄米に含まれていた
石（新潟県産
（No. 46）
）の精米歩合 70，60，50％の玄米中
（Fig. 2）
。D-セリンは特に山形県産（出羽の里
（No. 11）
）
，
の D-アミノ酸含量を定量した結果，D-アスパラギン酸は
徳島県産（山田錦
（No. 35）
）の玄米に多く含まれている傾
すべての玄米および精米歩合が 70％，60％，50％の玄米
向が見られた（Fig. 3）
。D-バリンは北海道産（彗星
中に含まれていることが明らかとなった
（Fig. 10）
。また，
（No. 3）
，試験栽培中につき品種非公開（No. 5）
，福井県産
D-セリン，D-アルギニン，D-ヒスチジン，D-バリンはい
（五百万石
（No. 18）
，おくほまれ
（No. 17）
，越の雫
（No. 19）
）
，
くつかの精米歩合が 70％の玄米中に含まれていたが，そ
東広島産（山田錦
（No. 32）
）の玄米に多く含まれていたが，
の他の D-アミノ酸は玄米以外には含まれていなかった。
高知県産
（No. 36-No. 39）や香川県産
（No. 40，No. 41）の玄米
これらの結果から，D-アスパラギン酸は米の内部に，そ
には全く含まれていなかった（Fig. 4）
。D-グルタミン酸は
の他の D-アミノ酸は米の表面付近に局在していることが
ほとんどの玄米中に含まれていたが，特に福井県産
明らかとなった。
（五百万石
（No. 18）
）
，兵庫県産（兵庫北錦
（No. 22）
）に多
一方，含有 L-アミノ酸と日本酒原料米の精米歩合との
く含まれていた（Fig. 5）
。D-ヒスチジンは北海道産の彗星
関係を検討した結果，L-アスパラギン酸，L-グルタミン
（No. 1）に多く含まれており，広島県産の玄米
（No. 26-
酸，L-スレオニン，L-バリン，L-アラニン，L-ロイシン，
No. 31）にも広く含まれていた。D-アルギニンは北海道産
L-イソロイシン，L-フェニルアラニンは玄米及び精米歩
（吟風
（No. 1）
，大地の風
（No. 2）
，彗星
（No. 3）
，試験栽培中
合が 70％，60％，50％の日本酒原料米中に含まれている
につき品種非公開（No. 5）
，福井県産（五百万石
（No. 18）
，
ことが明らかとなった。また L-セリンは玄米と精米歩合
越の雫
（No. 19）
）
，広島県産（八反錦 1 号
（No. 26）
，千本錦
が 70％の日本酒原料米にしか含まれていないことが明ら
（No. 27）
，こしひかり
（No. 28）
）
，徳島県産（日本晴
（No. 34）
，
かとなった。また精米歩合が 70％のすべての日本酒原料
山田錦
（No. 35）
）
，高知県産（吟の夢
（No. 37）
，風鳴子
（No. 38,
米中の D-アミノ酸及び L-アミノ酸の濃度の平均値は，そ
39）
）
，香川県産（オオセト
（No. 40, 41）
）の玄米に多く含ま
れぞれ玄米の約 10％，13%であった。以上の結果から，
れていた（Fig. 6）
。D-アスパラギンは北海道産（吟風
D-アミノ酸及び L-アミノ酸は，いずれも米の外側，すな
（No. 1）
，大地の風
（No. 2）
，試験栽培中につき非公開品種
わち表層部に多く含まれていることが明らかとなった。
（No. 4）
，福井県産（五百万石
（No. 16）
，越の雫
（No. 19）
）
，
まとめ
兵庫県産（試験栽培中につき品種非公開（No. 21）
，兵庫北
錦
（No. 22）
，五百万石
（No. 23）
）の玄米に多く含まれてい
た（Fig. 7）
。D-グルタミンは北海道産（試験栽培中につき
日本酒原料米の玄米中には D-アラニン，D-アルギニン，
品種非公開（No. 5）
，
（彗星
（No. 7）
，岩手県産（ひとめぼ
D-アスパラギン，D-アスパラギン酸，D-グルタミン酸，
れ
（No. 8）
）
，福島県産（五百万石
（No. 13）
）
，東広島産（山
D-グルタミン，D-ヒスチジン，D-セリン，D-バリンが含
田錦
（No. 32）
）の玄米に多く含まれていた（Fig. 8）
。それ
まれていることが明らかとなった。D-アスパラギン酸は，
ぞれの D-アミノ酸の分析した玄米中での平均濃度は D-ア
すべての産地の日本酒原料米中に検出され，D-アラニン
スパラギン酸（0.21 µM）
，D-アラニン
（0.06 µM）
，D-セリ
は，兵庫県産，東広島産，広島県産，高知県産，福井県産
ン
（0.33 µM）
，D-バリン（0.09 µM）
，D- グルタミン酸
に検出され，D-セリンは，山形県産，徳島県産に多く含
（0.07 µM）
，D-ヒスチジン（0.16 µM）
，D-アルギニン
まれ，D-バリンは，北海道産，岩手県産，福島県産，福
（0.79 µM）
，D-アスパラギン（0.24 µM）
，D-グルタミン
井県産，東広島産，徳島県産に多く含まれ，D-グルタミ
（0.02 µM）であった。これらの結果から日本酒原料米の玄
ン酸は，ほとんどすべての産地の日本酒原料米中に検出さ
米中の D-アミノ酸濃度は玄米の産地によって大きく異な
れ，特に，北海道産，岩手県産の日本酒原料米中に多く含
― 3 ―
まれていることが明らかとなった。さらに，精米歩合が
度は，日本酒原料米の産地や精米歩合によって大きく異な
50，60，70%の日本酒原料米の玄米中には，D-アスパラギ
ることが明らかとなった。一般に日本酒原料米には精米歩
ン酸のみが含まれており，D-アスパラギン酸は米の中心
合が 70％以下の玄米が用いられることを考慮すると，日
部分に存在していることが明らかとなった。一方，D-ア
本酒中の D-グルタミン酸，D-セリン，D-バリン，D-アラ
ラニン，D-セリン，D-バリン，D-グルタミン酸，D-ヒス
ニンは，日本酒原料米にほとんど由来していないが，日本
チジン，D-グルタミン，D-アスパラギン，D-アルギニン
酒中の D-アスパラギン酸の一部は日本酒原料米に由来す
は，米の表層部に含まれていることが明らかとなった。以
ることが明らかとなった。
上の結果から，日本酒原料米中の D-アミノ酸の種類や濃
Fig. 1 Comparison of D- and L-Asp concentration in brown rice
Fig. 2 Comparison of D- and L-Ala concentration in brown rice
Fig. 3 Comparison of D- and L-Ser concentration in brown rice
― 4 ―
Fig. 4 Comparison of D- and L-Val concentration in brown rice
Fig. 5 Comparison of D- and L-Glu concentration in brown rice
Fig. 6 Comparison of D- and L-His concentration in brown rice
Fig. 7 Comparison of D- and L-Arg concentration in brown rice
― 5 ―
Fig. 8 Comparison of D- and L-Asn concentration in brown rice
Fig. 9 Comparison of D- and L-Gln concentration in brown rice
Fig. 10 Comparison of L-Leu concentration in brown rice
Fig. 11 Comparison of L-Ile concentration in brown rice
― 6 ―
Fig. 12 Comparison of L-Phe concentration in brown rice
Fig. 13 Comparison of L-Met concentration in brown rice
Fig. 14 Comparison of L-Lys concentration in brown rice
Fig. 15 Comparison of L-Thr concentration in brown rice
― 7 ―
Fig. 16 Comparison of L-Tyr concentration in brown rice
Fig. 16 Relationship between polished ratio and D-amino acid concentration
a）No. 27 b）No. 31 c）No. 32 d）No. 45
― 8 ―
謝辞
6）Brückner H, Lüpke M (1991) Determination of amino
acid enantiomers in orange juices by chiral phase
capillary gas chromatography Chromatographia 31:
日本酒原料米を提供頂いた独立行政法人酒類総合研究所
123-128.
の橋詰克己様（現：秋田県立大学），伊豆英恵様および酒
7）老川典夫（2009）食品中の D-アミノ酸 ―おいしさと
米研究会の皆様に御礼申し上げます。
なお，本研究は生物系特定産業技術研究支援センターの
の関連と食品産業への応用―．バイオインダストリー
イノベーション創出基礎的研究推進事業により実施したも
Vol.27 No.1 : 44-48
のである。
8）老川典夫，山田高史，杉原裕貴，宮田智子，吉田宗弘，
左右田健次（2003）食品中の D-アミノ酸：定量的解析
参考文献
と微量栄養素としての可能性．微量栄養素研究 20：
121-124
1）De Miranda J, Panizzutti R, Foltyn VN, Wolosker H
9）Pätzold R, Brückner H (2006) Gas chromatographic de-
(2002) Cofactors of serine racemase that physiologi-
termination and mechanism of formation of D-amino
cally stimulate the synthesis of the N-methyl-D-as-
acids occurring in fermented and roasted cocoa
partate (NMDA) receptor coagonist D-serine. Proc
beans, cocoa powder, chocolate and cocoa shell. Ami-
Natl Acad Sci USA 99: 14542-14547.
no Acids 31: 63-72.
2）Morikawa A, Hamase K, Ohgusu T, Etoh S, Tanaka H,
10）Gogami Y, Ito K, Kamitani Y, Matsushima Y, Oikawa
Koshiishi I, Shoyama Y, Zaitsu K (2007) Immunohisto-
T (2009) Occurrence of D-serine in rice and charac-
chemical localization of D-alanine to beta-cells in rat
terization of rice serine racemase. Phytochemistry
70(3) : 380-387.
pancreas. Biochem Biophys Res Commun 355: 872-876.
3）Takigawa Y, Homma H, Lee JA, Fukushima T, Santa
11）Aswad DW (1984) Determination of D- and L-aspar-
T, Iwatsubo T, Imai K(1998) D-Aspartate uptake into
tate in amino acid mixtures by high-performance liq-
cultured rat pinealocytes and the concomitant eﬀect
uid chromatography after derivatization with a chiral
on L-aspartate levels and melatonin secretion.Bio-
adduct of o-phthaldialdehyde Anal Biochem 137(2):
405-409.
chem Biophys Res Commun 248: 641-647.
4）郷上佳孝，伊藤克佳，老川典夫（2006）野菜および果
12）Einarsson S, Josefsson B, Möller P, Sanchez D (1987)
物中の D-アミノ酸の定量と植物における D-アミノ酸
Separation of amino acid enantiomers and chiral
の生合成機構．微量栄養素研究 23 : 1-4
amines using precolumn derivatization with (+)-1-(9-ﬂu-
5）老川典夫（2008）高等植物及び食品中の D-アミノ酸とそ
の代謝関連酵素．生化学第 80 巻第 4 号：pp. 300-307
― 9 ―
orenyl) ethyl chloroformate and reversed-phase liquid
chromatography Anal Chem 59(8): 1191-1195.
Trace Nutrients Research 28 : 10−15（2011）
原著
The effect of light quality on harvested sweet corn by low intensity
LED light irradiation at low temperature during short storage
1）
2）
2）
, 3）
Hirokazu OHTA , Mari OHTA and Tetsuya SUZUKI
1）
Lambda Seed Co. Ltd.＊
2）
The Graduate School for the Creation of New Photonics Industries * *
3）
The University of Queensland, Faculty of Health Sciences, National Research Centre for Environmental Toxicology * * *
Summary
Sweet corn with husk (Zea mays L. var. saccharata f. Peter corn) was stored at 5 °
C for 4 d under a photosynthetic
- 2 -1
photon ﬂux density (PPFD) of 1 µmol m s
using red and blue LEDs. During storage, the sugar content (Brix) was
measured consecutively for 4 d, and the amino acid content was analyzed after 4 d storage. Corn stored under blue
LED light at 5 °
C had higher sugar content than corn stored in a dark, cool condition. Similarly, the content of umami
was increased by storage under the blue LED-cool condition, a result likely due to increases in aspartic acid and the
major amino acid, glutamic acid. The red LED-cool condition was not as good as the blue LED-cool condition for preserving corn, but was much better than dark, room temperature storage. In contrast, the palatability of sweet corn
kept at room temperature in the dark quickly declined. Blue LED-cool preservation appears to be a useful technique
for storing sweet corn with husk.
Introduction
the required light intensity to maintain the quality of
11）
green plants during long-term storage .
Harvested sweet corn quality deteriorates extremely
To date, the eﬀectiveness of low intensity light irradia-
fast in comparison with other vegetables due to a rapid
tion on dehusked fruits is unknown. Since details about
decrease in sugar content from respiration and conver-
the mechanisms of amino-acid biosynthesis have been
1）
sion to starch . To prevent the deterioration of harvest-
elucidated by biochemistry, molecular biology and genet-
ed vegetables, low temperatures are eﬀective for sup-
ics , we now know how to control the dynamics of ami-
2）
pressing respiration . The respiration rate of sweet corn
12）
no-acid synthases by photonic conditions.
is higher than other vegetables, and the Q10 value,
In this study, we discovered fundamental knowledge
which is an index of the respiration dependency on tem-
about the effect of low light irradiation on harvested,
2）
perature, is higher, too . Cooling harvested sweet corn is
sweet corn with husk during low temperature storage.
very eﬀective in preventing quality deterioration. As a
Because of the convenience of devices such as LEDs
result, it is possible to preserve sweet corn for two
and refrigerator, our result may enjoy widespread prac-
3）
tical use in the near future.
weeks at 0 °
C and 95 % humidity .
The eﬀectiveness of low intensity light irradiation dur-
Materials and Methods
ing the preservation of seedlings or harvested plant tis4）
-8）
sues has been reported previously
. By using red LED
and supplying mineral nutrients in the form of a nutri-
1. Plant Materials
Sweet corn (Zea mays L. var. saccharata) was picked
ent gel, harvested green leaves were kept fresh at low
9）
temperature for 27 days . High quality harvested green
from ﬁelds at Ashoro-shi in Hokkai-do or Mori-machi in
leaves or grafted plug seedlings were maintained under
Shizuoka Prefecture. We used sweet corn ear two days
optimized conditions of light irradiation in addition to
after harvest for this study. Corn was kept at 10 °
C dur-
10）
CA (Controlled Atmosphere) storage . A mixture of red
ing transport from Hokkai-do to Shizuoka Prefecture or
and blue light irradiation at low temperature decreased
stored in a refrigerator. Upon receipt, corn with husk
Address：1820, Kurematsu-cho, Nishi-ku, Hamamatsu-shi, Shizuoka-Pref., 431-1202, Japan
Address：1955-1,Kurematsu-cho, Nishi-ku, Hamamatsu-shi, Shizuoka-Pref., 431-1202, Japan
＊＊＊ Address：39 Kessels Road, Coopers Plains, Queensland, 4108 Australia
＊
＊＊
― 10 ―
was placed into the light-irradiation boxes, and the tem-
ter (Pocket Refractometer Model-PAL-1, Atago Co. Ltd,
perature was maintained at 5 °
C.
Tokyo, Japan).
2. Light sources and storage conditions
5. Analysis of amino acids
Red LEDs (LXHL-LD3C, Lumileds Lighting LLC., San
Since there was a signiﬁcant diﬀerence in umami in
Jose, CA, USA) and blue LEDs (LXHL-LB3C, ditto) were
the sensory evaluation, we analyzed quantitatively the
used as light sources. Both LEDs had low, directional
amino acid content of stored corn kernels.
light diﬀusion patterns. Using The LEDs and light boxes
To identify which amino acid was changed by LED ir-
were conﬁgured to work as pseudo Integrating Spheres.
radiation during low temperature storage, we ordered
The LEDs were placed on top of the box, and the entire
the analysis of 18 free amino acids by the Japan Food
sweet corn ear surface was irradiated by LED light be-
Research Laboratories (Japan). Free amino acid analysis
cause light was reﬂected isotropically by the light box wall.
was carried out using an Amino Acid Analyzer (JLC-500/
Light power at the bottom of the box was adjusted to
V, JEOL, Tokyo, Japan; Column, LCR-6, JEOL).
-2 -1
1 µmol m s in photosynthetic photon ﬂux density (PPFD).
Secondly, we focused on glutamic acid and aspartic
PPFD was measured using a Photon flux meter (LI-
acid, using a highly selective ﬂuorimetric determination
190SA Quantum Sensor, LI-COR, Inc., Lincoln, NE, USA).
of acidic amino acids by high performance liquid chro-
We conﬁrmed that the PPFD on the surface of sweet
matography (HPLC) after intramolecular eximer-forming
-2 -1
14）
corn ears in such a box was approximately 1 µmol m s .
derivatization with a pyrene-labeling reagent . HPLC
An ear of sweet corn was wrapped with PVC ﬁlm and
(LC-20AD, Shimadzu, Kyoto, Japan), with a ﬂuorescence
placed in a box standing up. The box was covered with
detector (RF-10AXL, Shimadzu), Column (ODS80Ts, Toso,
aluminum foil to prevent irradiation from adjacent boxes,
Tokyo, Japan) was used for the amino acid analysis.
and the boxes were set in the refrigerator at 5 ± 1 °
C.
Results
LED irradiation at low temperature was maintained for
4 days after which time sweet corn was dehusked and
1. Sensory evaluation
frozen at - 40 °
C.
Scores of the sensory evaluation parameters that indi3. Sensory Evaluation
cated signiﬁcant diﬀerence are shown in Fig. 1. Subjec-
Frozen corn ears were defrosted at room temperature
tive visual appearance revealed that Red irradiation and
for 2 hours. Defrosted corn ears were heated in a micro-
cool temperature (RC) and Blue irradiation and cool tem-
wave oven for 5 minutes, the ear was cut into 20 pieces
perature (BC) was better than Dark (no irradiation) and
and evaluated for taste. Subjective measurement of sen-
cool temperature (DC), and also the visual appearance of
sory quality (sweetness, umami, visual appearance of
corn stored under the RC condition was significantly
kernels) was obtained by submitting samples to a
better than for corn stored under BC condition. RC and
12-member taste panel using an 11-point scale (from + 5
BC were sweeter than DC, and RC and BC were equal-
to - 5). We determined a score of sensory quality for an
ly sweet. The umami evaluation of corn stored under
objective corn in comparison with the corn stored under
the Dark and Cool condition (control). When a panelist
judged that a sample quality was better than control,
the score of sensory quality stood at positive. Signiﬁcant
diﬀerences in the parameters were determined using the
13）
sensory quality evaluation method for rice . The following abbreviations were used for the storage conditions:
Red and Cool (RC), Blue and Cool (BC), and the control
condition Dark and Cool (DC).
4. Brix measurement
Placement of the corn ears into the boxes signaled the
Fig. 1: Comparison of Sensory Evaluation Sore for sweet corn
kernels preserved under diﬀerent conditions and its 95%
conﬁdence interval (95% CI)
start (0 hr) of the experiment for Brix measurement. Almost daily, 3 g of corn kernels were harvested to measure the Brix of squeezed corn juice with a refractome― 11 ―
DC : Dark & Cool, RC : Red light & cool, BC : Blue light & Cool
Diﬀerent letters a, b indicate signiﬁcances (P < 0.05). An error
bar indicates the range of 95% CI. If an error bar crosses to 0,
there is no signiﬁcance with DC.
the BC condition was signiﬁcantly better than for corn
stored corn was about 110 % higher than that of DC-
stored under the DC condition, but umami levels of RC
stored corn. The aspartic acid content of BC-stored corn
stored corn did not differ from those of DC and BC
was almost equal to the alanine content, which was the
stored corn.
second most abundant amino acid in sweet corn.
2. Brix daily change
Table 1 Ingredient contents of free amino acid for sweet corn under diﬀerent preservation
Fig. 2 shows the daily change in kernel sugar content
(Brix). When corn was stored under the DC condition, Brix
decreased with time. Brix deterioration at 3 d and 4 d was
significant (Kruskal-Wallis test, P < 0.05). In RC or BC
conditions, Brix deterioration was not signiﬁcant until 4 d.
The Brix measurement of corn stored 3 d and 4 d in RC
and BC conditions differs significantly from the Brix
measurement of of corn stored under the DC condition
for 3 - 4 d. Brix did not change during 4 d storage under
the RC and BC conditions.
conditions
Free Amino Acid
Glutamic acid
Alanine
Proline
Serine
Aspartic acid
Lysine
Tyrosine
Threonine
Leucine
Valine
Glycine
Arginine
Phenylalanine
Histidine
Isoleucine
Cysteine
Tryptophan
Methionine
Total
[mg/100 g]
DC
99
61
44
33
27
22
11
9
6
6
6
6
4
4
3
1
0
0
342
RC
78
57
37
37
41
21
11
10
7
6
6
5
5
4
4
2
1
0
332
BC
96
55
42
41
56
22
9
10
6
7
6
6
6
5
4
1
0
0
372
(n = 3) DC: Dark & Cool, RC: Red light & cool,
BC: Blue light & Cool
Fig. 3 shows the changes in glutamic acid and aspartic acid contents in corn subjected to light irradiation
conditions. The glutamic acid content of corn stored unFig. 2: Daily changes of Brix Index for sweet corn preserved under diﬀerent conditions. Vertical bars represent standard
errors of the means (n = 4) of each day.
der the DC and BC conditions was signiﬁcantly higher
than corn stored under the RC condition (Tukey test,
Means with a mark are signiﬁcantly diﬀerent at the 5 % level.
P < 0.05). The aspartic acid content of RC- and BC-stored
DC : Dark & Cool, RC : Red light & cool, BC : Blue light & Cool
corn was significantly higher than that of DC-stored
Also, we conﬁrmed that the moisture content ( % ) of
sweet corn did not change during whole period of storage and there was no dependency on the light irradiation condition.
3. Analysis of Amino Acids
The total amino acid content was high in BC-stored
corn; glutamic acid, alanine, proline, serine, lysine, and
aspartic acid were the major amino acids present in the
samples with glutamic acid being the most abundant
(Table 1 ). The glutamic acid content of DC- and BCstored corn was higher than that of RC-stored corn. The
glutamic acid content of RC-stored corn was 19 % less
than that of DC-stored corn. The aspartic acid content
changed remarkably depending on the light irradiation
condition. The aspartic acid of RC-stored corn was about
Fig. 3: Comparison of contents of glutamic acid, aspartic acid and
total of those acids in sweet corn kept under the diﬀerent
preservation conditions. The value represents the average
of 3 measurements. Means with a mark are signiﬁcantly
diﬀerent at the 5% level.
50 % higher than that of DC-stored corn, and that of BC― 12 ―
DC : Dark & Cool, RC : Red light & cool, BC : Blue light & Cool
corn. In addition the totals of glutamic acid content and
creasing the asp content than the DC condition.
aspartic acid content for each condition are indicated in
The taste of vegetables is changed by the glutamic and
Fig. 3. Total content of BC-stored corn was signiﬁcantly
aspartic acid content . But in this case, the valance of
higher than that of DC- and RC-stored corn.
sour taste was changed by the composition of glu and
16）
asp. Then, we have a question, how does umami taste
Discussion
change when the content of glu and asp is changed?
Some studies for receptor of umami taste suggested
1. Effect of low light irradiation and low tempera-
that the psychophysical detection threshold values for
ture storage
glu or asp were estimated around 1 to 4 mM
Subjective sensory evaluation revealed that Red light
(10 - 40 mg/100 g converted by author). In Fig. 3, all of the
(RC) or Blue light (BC) irradiated cool conditions were ef-
asp and glu contents were more than psychophysical
fective for keeping sweet corn kernels looking fresh in
detection threshold value, except the asp content of DC-
appearance. The appearance of corn stored under the RC
stored corn which was nearly detection threshold. In ad-
condition diﬀered signiﬁcantly from other conditions (BC,
dition, the receptors for umami of human or rat re-
DC). Here, the appearance of sweet corn means visual
sponded proportionally to the contents of glu (MSG: Mono
freshness (color, glaze, etc). Therefore, we think that the
Sodium Glutamate) and asp
RC storage method is eﬀective for keeping freshly sweet
criminate between the tastes of glu (MSG) and asp
corn in visually appealing.
we have recognized that the contribution of glu and asp
17）18）
18）19）
, and it was diﬃcult to dis19）20）
. So
Similarly, sensory evaluation revealed that the RC and
to the umami taste is almost equal. So, shown in Fig. 3,
BC conditions were eﬀective in maintaining kernel sweet-
we evaluated the total content of glu and asp as parame-
ness. The daily change in sugar content deteriorated in
ters for the umami taste. The total content of BC-stored
the dark condition (DC), and RC and BC conditions re-
corn was signiﬁcantly more than those of DC- and RC-
duced the deterioration of sweetness with time. There
stored corn. This result is consistent with the result of
were no statistically signiﬁcant diﬀerences in the sweet-
the sensory evaluation (Fig. 1)
ness sensory scores or in the Brix values for RC- and
BC-stored corn.
The composition and content of glu and asp were
changed by the light irradiation condition. Corn stored
We hypothesize that the Brix value did not decline
due to a mixed eﬀect coming from 1 ) the inhibition of
in the BC condition had the best taste and glu and asp
contents within the conditions examined in this study.
sweet corn respiration caused by a nearly zero rate of
CO2 exchange when the light irradiation intensity is
2. The dependency of amino acid content on light
nearly equal to the light compensation point , and 2 ) a
quality
reduction in starch synthase enzyme activity at low
We confirmed that the amino acid composition of
15）
sweet corn was changed by light irradiation during cool
temperature.
On the other hand, the sensory evaluation revealed that
storage (Fig. 3). In comparison with dark storage (DC),
BC-stored corn signiﬁcantly diﬀered from DC-stored corn
the asp content increased but the glu content did not
in umami. As a result from the analysis of amino acids
change in BC-stored corn whereas, the asp content
(Fig. 3), the glutamic acid (glu) content of BC-stored corn
increased and the glu content decreased in corn stored
was almost equal to DC-stored corn; however, the aspar-
under the RC condition. The precise mechanism for
tic acid (asp) content of BC-stored corn was signiﬁcantly
these differences in amino acid metabolism in corn
higher than DC-stored corn. So, the eﬀect of the BC con-
kernels depending on light wavelength is unknown at
dition on the glu content is equal to what happens under
present. In higher plants, the assimilation of ammonia is
the DC condition, but the BC condition was more eﬀec-
dynamically controlled by the external environment
tive in increasing the asp content than the DC condition.
likely by light irradiation or by the internal environment
Also, the glu content of corn stored under the RC condi-
likely by the sucrose content in plastids.
12)
tion was significantly less than for corn stored under
Suzuki et.al. (2001) reported that the amino acid con-
the DC and BC conditions; however, the asp content of
tent of maize seedlings changed depending on the light
RC-stored corn was significantly higher than for corn
treatment during storage . Seven-d-old dark grown
stored under the DC condition. So, the RC condition was
maize seedlings were subjected to intermittent 5 min
less eﬀective than the DC condition in regulating the glu
Red light (6 Wm ) treatment at 4 h intervals (R), continu-
content, but the RC condition was more eﬀective in in-
ous white light (300 µmol m s ) (WL) or no light
21）
-2
― 13 ―
-2
-1
References
irradiation(D) for 72 hours. At the beginning, the total
-1
amino acid content was 759 nmol mg
{gln : glu : asn : asp
= 16 : 29 : 323 : 31 (nmol mg ) }. WL decreased the total
1）Olsen DK, Giles JE, Jordan RA(1990), Post-harvest
-1
{gln : glu : asn : asp
carbohydrate changes and sensory quality of three
= 2 : 12 : 22 : 4}, whereas the total amino acid content re-
sweet corn cultivars. Scientia Horticulturae 44 :
mained constant in the R condition at 855 nmol mg {gln :
179-189.
amino acid by 80 % ; 145 nmol mg
-1
-1
glu : asn : asp = 2 : 13 : 448 : 32}, and the D treatment sub-
2）Salunkhe DK, Desai BB (1984), Vegetables: General
stantially increased the total amino acid content by 150 %
considerations. In: Postharvest biotechnology of veg-
{gln : glu : asn : asp = 8 : 17 : 600 : 27}.
etables, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, Vol. 2 :
to 1087 nmol mg
-1
35-53.
The asn content was also changed by the light treatment, and these actions were coupled with the activity
3）Spalding DH, Davis PL, Reeder WF(1978) Quality of
of ferredoxin-dependent glutamate synthase (Fd-GOGAT).
Sweet Corn stored in controlled atmospheres or under low pressure. J. Am. Soc. Hortic. Sci., 103 : 592.
The results reported by Suzuki et al. (2001) strongly
indicate that plant amino acid in plant contents must
4）Paton F, Schwabe BB(1987) Storage of cutting of
change depending on the light quality during storage.
pelargonium × hortorum bailey. J. Hortic. Sci., 62 :
We hypothesize that the light quality during storage
79-87.
highly relates to the activity of nitrogen assimilation en-
5）Heins R, Lange N, Wallace TF, Jr. Carlson (1994) W,
zymes as glutamate synthase (GS), ferredoxin-dependent
Plug Storage, Greenhouse Grower, Willoughby, 19.
glutamate synthase (Fd-GOGAT), aspirate aminotransfer-
6）Kubota C, Kozai T(1994) Low-temperature storage
ase (Asp-AT), asparagine synthetase (AS) ; however,
for quality preservation and growth suppression of
there are some diﬀerences between our results and the
broccoli plantlets cultured in vitro. Hort. Science 29 :
Suzuki et al. (2001) report. In our study, Red irradiation
1191-1194.
(RC) decreased the glu and increased the asp contents
7）Kozai T, Kubota C, Sakami K, Fujiwara K, Kitaya
in comparison with the dark (DC) control ; that is, the
Y(1996) Growth suppression and quality preserva-
change in the content of these two amino acids was dif-
tion of eggplant plug seedlings by low temperature
ferent. We do not know whether these diﬀerences de-
storage under dim light (Japanese text with English
pend on environmental conditions such as light quality,
abstract and captions). Environ. Control in Biol. 34 :
135-139.
light intensity, temperature or the sample s developmen-
8）Fujiwara K (2004) Low Light Irradiation-CA Storage
tal state such as seedlings versus corn kernels.
of Green Plants (Japanese text with English abstract
Blue light is more eﬀective than red light in the photo-
and captions). Environ. Control in Biol. 42 : 353-356.
synthesis reaction. For example, photosynthetic performance of blue light irradiated birch plantlets in vitro was
9）Fujiwara K, Takaku K, Iimoto M(1999) Availabilities
twice the eﬀect of Red light because increasing both the
of red light-emmiting diodes as light source for low
chlorophyll content and translocation rate of carbohy-
light irradiation and mineral nutrient supply using
22）
nutrient gel during low temperature storage of
drates from chloroplasts is dependent on light quality .
Also, the content of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase
postharvest chervil (Anthriscus cerefolium L.) (Japanese
/oxygenase (Rubisco) of blue light grown pea seedlings
text with English abstract and captions). Environ.
23）
Control in Biol. 37 : 137-14.
was higher than seedlings grown in red light . In addition to these reports, the dependency of the photosynthe-
10）Fujiwara K., Isobe S, Iimoto M(1999) Eﬀects of con-
sis reaction and nitrogen assimilation on light quality af-
trolled atmosphere and low light irradiation using
fects our results indicating inhibition of Brix deterioration
red light emmiting diodes during low temperature
and diﬀerences in amino acid; however, at this time we
storage on the visual quality grafted tomato plug
do not know whether translocation could occur from the
seedlings (Japanese text with English abstract and
captions). Environ. Control in Biol. 37 : 185-190.
husk irradiated by low intensity light at low temperature
into the corn kernels. This possibility merits further re-
11）Fujiwara K, Sawada T, Kimura T, Kurata K (2005)
Application of an automatic control system of pho-
search.
tosynthetic photon ﬂux density for LED-low light
irradiation storage of green plants. Hort Technology, 15 : 781-786.
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Trace Nutrients Research 28 : 16−20（2011）
原著
ウマに対するメナキノン-7 補給が血漿中メナキノン-7 濃度に及ぼす影響
1）
2, 3）
2）
寺地智弘，井上喜信，蘆原永敏，
4）
4）
1）
小林光紀，安藤邦英，松井徹＊
1）
＊＊
2）
（京都大学大学院農学研究科応用生物科学専攻，日本中央競馬会，
＊＊＊
3）
現鳥取県庁
＊＊＊＊
4）
，軽種馬育成調教センター
）
Plasma vitamin K concentration in horse supplemented with menaquinone-7
1）
2, 3）
2）
Tomohiro TERACHI , Yoshinobu INOUE , Nagatoshi ASHIHARA ,
4）
4）
1）
Mitunori KOBAYASHI , Kunihide ANDO and Tohru MATSUI
1）
Division of Applied Biosciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University,
2）
3）
Japan Racing Association
Present address, Prefectural Government of Tottori
4）
Bloodhorse Training Center
Summary
It is generally considered that phylloquinone in forage along with menaquinones synthesized by intestinal microbes
meet the requirement of horses. We investigated the concentrations of fecal and plasma menaquinone-7 (MK-7 ) and
the eﬀect of MK-7 supplementation on plasma vitamin K concentration in adult horses.
Fecal and plasma samples were collected from twenty Thoroughbred horses aged 9.0 ± 2.9 yr before MK-7 supplementation, and MK-7 concentrations in feces and plasma were determined. Subsequently the horses were allocated to 4
groups (n = 5) and each group was given MK-7 at 20 µmol/d, 40 µmol/d, 60 µmol/d, or no MK-7 supplement for 7 d.
Plasma samples were collected before feeding, and 2, 4, and 8 h after feeding on d 7, and plasma concentrations of menaquinone-7 were determined (Experiment 2). Although fecal MK-7 concentration can be measured in all horses without
supplying vitamin K, plasma MK-7 concentration was extremely low and was under the measurement limit in some
horses. Additionally, the relationship between plasma concentration and fecal excretion of MK-7 was not observed. We
suggest that MK-7 produced by intestinal bacteria is not important for horses. Plasma MK-7 concentration was higher
in the 40 µmol/d group (P < 0.001) and the 60 µmol/d group (P < 0.001) than in the control group through the experiment. Further, plasma MK-7 concentration was not changed after feeding in the 40 µmol/d group; plasma MK-7 concentration was stably high in this group. These results suggest that MK-7 is a good source of vitamin K for bone health
in horses because the supplementation of MK-7 increases its plasma concentration greatly and continuously.
ビタミン K は，その構造からビタミン K1（フィロキノ
作用がはるかに強いことが報告されている
2, 3）
。また，
ン，PK）
，ビタミン K2（メナキノン，MK）
，ビタミン K3
MK-4 はオーファンレセプターである核内転写因子の
（メナジオン，MD）に分類される。PK は植物が，多種の
SXR を活性化し，骨形成を促進すること，MK-4 がプロテ
MK 類は微生物が生産するビタミン K である。また，吸
インキナーゼ A の活性を介して骨芽細胞に作用すること
収された PK は動物体内で MD を介して MK-4 に変換さ
も報告されている
1）
れることが報告されている。
4, 5）
。MK-4 同様に MK-7 もまた，
MC3T3-E1 骨芽細胞において，骨形成を促進することや，
ビタミン K の機能として，血液凝固機能，骨代謝調節
骨形成マーカーの発現を調節していること，BMP2 の産
機能が知られているが，近年の培養細胞を用いた研究によ
生を促進することにより，遺伝子発現を調節することが報
り，MK 類の一つである MK-4 は PK および MD よりも
告されており
ヒト骨芽細胞の分化促進作用や，マウス破骨細胞分化抑制
活性型ビタミン K であることを示唆している。
所在地：京都府京都市左京区北白川追分町（〒606-8502）
所在地：北海道浦河郡浦河町西舎535-13（〒057-0171）
＊＊＊所在地：鳥取県鳥取市東町1-220（〒680-8570）
＊＊＊＊所在地：北海道浦河郡浦河町西舎535-13（〒057-0171）
＊
＊＊
― 16 ―
6 - 8）
，これらの報告は，MK 類は骨における
Table 1. Composition of experimental diet
(as-fed basis)
ウマでは，生草や良質な乾草に含まれる PK および腸管
内の微生物によって合成される MK 類でビタミン K 要求
Ingredient, g/kg
Timothy hay
Oat grain
a）
Commercial ration
Alfalfa hay cube
Wheat bran
Sodium chloride
Calcium carbonate
Concentration
DE, Mcal/kg
CP, %
Phylloquinone, µmol/kg
9）
量は満たされているとされている。この根拠としては，
正常なウマではビタミン K 欠乏に起因する出血が見いだ
10）
されていないことが挙げられている。しかし，ヒトにお
いて正常な骨代謝の維持には正常な血液凝固よりも多くの
11）
ビタミン K が必要であることが報告されており，ウマ
においてもビタミン K 不足によって，骨代謝が変化する
10）
危険性も示唆されている。
ビタミン K は胆汁酸とリパーゼなどの膵酵素の存在下
12）
で小腸から吸収され，リンパ系に移行する。そのため，
13）
しない動物ではその利用は限られているとされている。
14）
2. 29
10. 50
1. 92
b）
b）
c）
a) Power Up Horse II (Keiba Shiryo, Tokyo, Japan; DE,
2.6 Mcal/kg; CP, 14.0 %).
b) Calculated value.
c) Analytical Value.
大腸で合成される MK 類の吸収は一般に少なく，食糞を
実際に Groenen-van Dooren ら
546. 9
227. 9
109. 4
91. 2
22. 8
0. 9
0. 9
は，ラットにおいて，
PK，MK-4 あるいは MK-9 を経口投与した場合と大腸に
直接投与した場合の吸収性の違いを検討し，大腸内投与で
飼料（Table 1）を 11 kg/d の割合で，それぞれ朝
（8：00）と
は，経口投与した場合の 0.2 から 2 ％しか吸収されないこ
夕方（17：00）の二度に分けて同量ずつ給与した。チモシー
とを報告している。
乾草とヘイキューブの PK 濃度はそれぞれ 1.00 mg/kgDM，
我々は，成馬の血漿中 MK-4 濃度が低いこと，PK，
3.08 mg/kgDM であった。したがって供試馬は，1 日あた
MK-4 あるいは MD を成馬に補給すると，MD の補給に
り 9.54 mg（21.2 µmol）の PK を飼料より摂取していた。
よってのみ血漿中 MK-4 濃度が上昇することを明らかと
一方，飼料中 MK-7 は検出されなかった。１週間の予備
15）
した。これらの結果から，ウマでは，他動物種と比べ，
期の後に，朝の給餌直前（8：00）に各ウマから血液と糞を
PK から MD への変換効率が低く，飼料摂取により PK は
採取した。採血は頚静脈穿刺により行い，採取した血液は
要求量を満たしていても，骨における活性型ビタミン K
遠心分離（2,500×g，30 分間，4 ℃）によりヘパリン血漿
と考えられる MK-4 の血漿中濃度は低いことが示唆された。
として，窒素ガス封入後分析まで−20℃で保存した。飼料
Schurgers ら
16）
は，ヒトでは PK と比べ MK-7 の血漿中
濃度上昇は長時間維持されることを示し，吸収された
は粉砕した後，分析まで室温で保存した。糞は，凍結乾燥
した後，分析まで−20℃で保存した。
MK-7 は肝臓に取り込まれた後，PK および MK-4 とは異
17）
なり，肝臓から放出されやすいことを推察している。こ
2）分析
うした血漿中の滞留時間の長さから，ヒトにおいては，ビ
血漿中 MK-7 濃度，飼料中 PK 濃度および MK-7 濃度の
タミン K サプリメントとして，MK-7 が注目されている。分析は我々の先行研究
18）
15）
と同様の方法により測定した。
は，馬糞から Bacillus cereus を検出してい
糞中 MK-7 濃度は飼料と同様の方法で測定した。一日あ
るが，Bacillus cereus を含む多くの Bacillus 属は MK-7 を
たりの糞排泄量は酸不溶性灰分を指標として算出した。す
また，Rae ら
19）
なわち，飼料および糞中酸不溶性灰分を Thoney ら
合成することが報告されている。
20）
の
本試験では，糞中に排泄される MK-7 量と血漿中 MK-7
方法により測定し，摂取した酸不溶性灰分量と糞中酸不溶
濃度の比較を行うとともに，ウマに対する MK-7 補給の効
性灰濃度から 1 日当たり排糞量を算出した。糞中 MK-7 濃
果を検討した。
度に 1 日当たり排糞量を乗じることによって，1 日当たり
の糞中 MK-7 排泄量を得た。
実験方法
本試験での血漿中 MK-7 の測定下限は 0.05 nmol/l で
あった。
本試験は日本中央競馬会競走馬総合研究所動物実験倫理
2．第二試験 MK-7 補給が血漿中 MK-7 濃度に及ぼす影響
委員会の承認の下で行った。
1）供試動物と供試飼料
第一試験終了後に，第一試験で供試したウマを，第一試
1．第一試験糞中 MK-7 排泄量と血漿中濃度の関係
1）供試動物と供試飼料
験と同様に飼養した。20 頭のウマを，性ならびに平均年
サラブレッド種馬 20 頭（去勢牡馬（セン馬）14 頭，牝
齢と体重が揃うように，4 区（n = 5）に割り当て，各区に，
馬 6 頭，年齢 9.0 ± 2.9 歳齢，体重 486.0 ± 28.1 kg）を供試
0 µmol/d（対照区）
，20 µmol/d，40 µmol/d，60 µmol/d の
した。これらを午後（12：00 ∼ 15：00）に 3 時間，生草の生
MK-7（J-オイルミルズ，東京）を１週間連続補給した。
えていないサンシャインパドックで放牧し，それ以外
MK-7 はフスマと混合し，窒素ガス封入後，−20℃で保存
（15：00 ∼ 12：00）は個別の厩舎で飼育した。供試馬には，
し，給与前に同量のフスマと置き換え混合した。
― 17 ―
Plasma MK-7 concentration (nmol/l )
2）試料採取と分析
補給期最終日の，朝の給餌直前（8：00）
，給餌 2，4，8 時
間後に採血を行った。採取した血液は遠心分離（2,500×g，
30 分間，4 ℃）によりヘパリン血漿として，窒素ガス封入
後分析まで−20 ℃で保存した。
血漿中 MK-7 濃度の分析は第一試験と同様の方法によ
り測定した。
3．統計処理
第一試験では，血漿中 MK-7 濃度と糞中 MK-7 濃度，
また血漿中 MK-7 濃度と糞中 MK-7 排泄量について一次
回帰分析を行った。
第二試験の統計処理は SAS（SAS Institute Inc., Cary,
0.3
0.2
0.1
0
NC）を用い行った。MK-7 補給が血漿中 MK-7 濃度に及
ぼす影響を MIXED PROC を用い，各ウマを試験単位と
し，同一個体の異なる採血時間の効果を繰り返し測定値と
0
0.2
0.4
0.8
0.6
Fecal MK-7 concentration (μmol/kg)
Fig 1 Relationship between plasma and fecal concentrations of
menaquinone-7(MK-7) in horses without supplying vitamin K.
する下の統計モデルにより検定した。
Plasma MK-7 concentration (nmol/l )
Yijk = µ + Treat i + Time j +（Treat×Time）ij
+ Animal k( i ) + e ijk
µ：全平均，Treat i：処理の母数効果
（i = 4）
，Time j：時
間の母数効果
（j = 4）
，
（Treat × Time）
ij：処理×時間の母数
効果，Animal k( i )：処理に含まれるウマの変量効果（k = 5）
，
e ijk ：残差
同一処理における給餌後変化は CONTRAST option を
用い，一次回帰と二次回帰とで検討した。各処理における
１日間最少二乗平均（LSM）の差は LSMEANS option を
用い，Tukey の多重比較法により検定した。処理と採血
時間の交互作用が有意であった場合，同一採血時間におけ
る処理区間の LSM の差も，Tukey の多重比較法により検
討した。p < 0.05 を統計的に有意な差とした。なお，測定
下限以下であった場合は測定下限の半分の値として計算し
た。
0.3
0.2
0.1
0
0
3
1
2
5
4
Fecal MK-7 excretion (μmol/d)
(μ mol/d)
Fig 2 Relationship between plasma concentration and fecal excretion of menaquinone-7 (MK-7) in horses without supplying vitamin K.
結果
供試したウマは，いずれも試験期間を通じて，臨床的に
時間後をピークに，二次曲線的に変化した（P = 0.005）
は異常所見は認められなかった。
（Table 2）
。一方，それ以外の区では血漿中 MK-7 濃度に
有意な給餌後の経時変化はなかった。
1．第一試験
MK-7 を補給されていないウマでは，平均 1.8 µmol/d
対照区の血漿中 MK-7 濃度は著しく低い濃度であり，給
（0.8−4.6 µmol/d）の MK-7 が糞中に排泄されていると推
餌直前，給餌 2，4，8 時間後の血漿中 MK-7 濃度は，5 頭
定された。血漿中 MK-7 濃度は 0.084±0.014 nmol/l
（平均
中それぞれ 1，4，3，2 頭で測定下限を下回った。対照区以
±標準誤差）であり，供試した 20 頭の内 9 頭が測定下限
外の区の血漿中 MK-7 濃度は，すべての個体ならびに採血
以下であった。糞中 MK-7 濃度ならびに MK-7 排泄量は
時刻で測定可能であり，40 µmol/d 補給区および 60 µmol/d
個体間の差が大きく，血漿中 MK-7 濃度と糞中 MK-7 濃度，
補給区の血漿中 MK-7 濃度は，対照区と比べすべての採血
また血漿中 MK-7 濃度と糞中 MK-7 排泄量にはいずれも
時刻で有意に高かった（P < 0.05）
。また，各処理における
有意な関係は認められなかった（Fig 1, 2）
。
１日間 LSM において，20 µmol/d 補給区は対照区と比較し，
MK-7 濃度が高い傾向にあった（P = 0.07）
。40 µmol/d 補
給区および 60 µmol/d 補給区では，すべての採血時刻の
2．第二試験
血漿中 MK-7 濃度は，60 µmol/d 補給区において給餌 4
LSM において，20 µmol/d 補給区と比べても，有意に高
― 18 ―
Table 2. Plasma menaquinone-7 concentration（nmol/L）after feeding in horses given the diet supplemented with diﬀerent amounts
1
of menaquinone-7
Dose
Control
20
40
60
Time after feeding, h
2
0
2
a
0.099
4
（1）
a
0.921
b
4.181
b
3.487
a
0.048
（4）
a
2.269
b
6.641
b
6.675
P-value
LSM of
4
8
a
treatment
a
0.057
（3）
a
5.016
b
7.194
b
12.796
0.084
（2）
a
2.463
b
5.891
b
7.812
0.072
2.666
5.977
7.693
3
SEM
Linear
Quadratic
a
0.011
0.995
0.995
a
0.284
0.757
1.105
0.235
0.357
0.003
0.271
0.358
0.005
b
b
a, b
LSM within a column without a common superscript diﬀer（P < 0.05）
.
Eﬀects of treatment, P < 0.001; time, P = 0.002; treatment and sampling time interaction, P < 0.001（n = 5）
2
Dose of menaquinone-7（µmol/d）
.
3
LSM = least squares mean
4
Parenthetic number showed sample number under measurement limit.
1
かった（P < 0.05）
。一方，40 µmol/d 補給区と 60 µmol/d
の利用は限られている可能性がある。MK-7 以外の長鎖
補給区との間に有意な血漿中 MK-7 濃度の差は認められな
MK 類もウマの大腸で合成されると考えられるが，Ichihashi
かった。
ら
21）
は側鎖が長いほど MK 類は吸収されにくいとしてい
る。したがって，大腸で合成される MK-7 より長鎖の MK
考察
類はさらに利用性が低い可能性がある。
ウマにおけるビタミン K 要求量は，飼料中 PK と消化
本試験では，MK-7 を摂取していないすべてのウマの糞
管内で合成される MK 類で十分満たされていると考えら
で MK-7 が認められた。この結果は，ウマの大腸内で
れてきた。本試験の結果から，ウマの消化管内で合成さ
MK-7 が合成されていることを示しており，糞中の MK-7
れる MK 類の栄養学的意義については更に検討する必要
排泄量は，0.8 - 4.6 µmol/d であるので，少なくともこの値
があることが明らかである。
9）
以上の MK-7 が消化管内で合成されていたと考えられる。
第二試験でも，対照区のウマの血漿中 MK-7 濃度は低く，
18）
実際，馬糞からは Bacillus cereus が検出されており，B.
測定限界以下の個体も多かった。60 µmol/d の MK-7 を補
cereus を含む多くの Bacillus 属は MK-7 を合成することが
給した区では，給餌 4 時間後をピークに血漿中 MK-7 濃度
19）
報告されている。糞中 MK-7 濃度ならびに MK-7 排泄
は二次曲線的に変化した（Table 2）
。また，60 µmol/d 補給
量は個体間の差が大きいことから，ウマの消化管内におけ
区における血漿中 MK-7 濃度のピークは，12.8 nmol/l で
る MK-7 生産量には大きな個体差があることが示唆された。
あった。一方，先行研究において，60 µmol/d の PK を補
さらに，血漿中 MK-7 が検出されたウマがいたことから，
給した区の血漿中 PK 濃度は，本試験同様，給餌 4 時間を
消化管内で合成された MK-7 はウマに利用されていること
ピークに変化し，血漿中 PK 濃度のピークは 4.8 nmol/l で
が明らかになった。一方，血漿中 MK-7 濃度と糞中 MK-7
あった。また，MK-7 補給と PK 補給に関して，各処理
排泄量には明瞭な関係は認められなかったことから，消化
における１日間 LSM を比較すると，本試験の 40 µmol/d，
管内で合成された MK-7 の吸収性に大きな個体差があるこ
60 µmol/d の MK-7 補給区における血漿中 MK-7 濃度はそ
とが示唆された。さらに，血漿中 MK-7 濃度が検出されな
れぞれ 6.0 nmol/l，7.7 nmol/l であり，先行試験における
い場合も認められ，ウマの消化管内で合成されている
60 µmol/d の PK 補給区の血漿中 PK 濃度の 3.3 nmol/l を
MK-7 は，血漿中 MK-7 濃度の上昇には不十分な場合があ
大きく上回っていた。これらの結果から，ウマでは，経口
る可能性が示唆された。また，後述するようにウマでは経
摂取された MK-7 は PK よりも吸収されやすいことが示唆
口的に補給された MK-7 は PK よりも高い効率で吸収され
された。一方，給餌前の PK 補給区における血漿中 PK 濃
ると考えられる。先行研究において，ビタミン K を補給
度は 2.1 nmol/l だったのに対して，本試験の 40 µmol/d 補
されていないウマの血漿中 PK 濃度と MK-4 濃度は，それ
給区では給餌前の MK-7 濃度は 4.2 nmol/l と高く，給餌後
ぞれ，0.87 nmol/l，0.125 nmol/l であり，本試験の MK-7
の MK-7 濃度の有意な経時的変化は認められなかった。す
濃度の 0.084 nmol/l を大きく上回っていた。したがって，
なわち，ウマでは PK 補給と比べ MK-7 摂取後の血漿中
ウマの消化管内で合成される MK-7 の栄養学的意義は，大
MK-7 濃度は高濃度を維持していた。この結果は，ヒトに
きくない可能性がある。Groenen-van Dooren ら
14）
は，ウ
15）
16）
おける Schurgers らの報告と一致する。さらに Schurgers
17）
マと同様に大腸で多量の MK 類を合成できるラットにおい
ら
て，MK 類は大腸から吸収されにくいことを示唆している。
された MK-7 が肝臓に取り込まれた後，PK とは異なり，
ビタミン K は胆汁酸とリパーゼなどの膵酵素の存在下で
肝臓から放出されやすいことに起因していることを示唆し
12）
小腸から吸収され，リンパ系に移行するため，大腸で合
13）
は，MK-7 の長い半減期は吸収性の差ではなく，吸収
ている。ウマにおいても，摂取された MK-7 は，肝臓に蓄
成される MK 類の吸収は一般に少ないとされている。ウ
積された後に再び血漿中に放出されやすいことで，長い血
マでも，消化管内で合成された MK-7 の吸収は少なく，そ
漿中滞留時間につながっていると考えられる。
― 19 ―
min K Status of Growing Horses. Journal of Equine
Veterinary Science 20 : 726-729.
結論として，ウマの消化管内で合成される MK-7 の栄
養学的意義は小さい可能性が示された。一方，経口補給さ
中濃度が長時間維持されることが示されたため，ウマにお
11）Booth SL, Suttie JW. (1998) Dietary intake and adequacy of vitamin K. Journal of Nutrition 128 : 785-788.
いてもヒト同様に，MK-7 はより良いビタミン K サプリ
12）Shearer MJ, McBurney A, Barkhan P (1974) Studies
れた MK-7 は PK よりも吸収されやすく，補給後に血漿
on the absorption and metabolism of phylloquinone
(vitamin K1) in man. Vitamins and Hormones 32 :
メントとして利用可能である可能性が示唆された。
謝辞
513-542.
13）McDowell LR (1989) Introduction and Historical
Considerations. In: McDowell LR (ed.), Vitamin in
本研究は，日本中央競馬会の資金補助によって行われた。
Animal Nutrition, Harcourt Brace Jovanovich, New
York : pp. 1-9.
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Fukunaga T, Suzuki N, Saijoh K, Fushimi S, Sunami
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21）Ichihashi T, Takagishi Y, Uchida K, Yamada H,
8）Katsuyama H, Saijoh K, Otsuki T, Tomita M, Fukunaga
Ichihashi T, Takagishi Y, Uchida K (1992) Colonic
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10）Siciliano PDW, Lawrence LK (2000) Changes in Vita― 20 ―
Trace Nutrients Research 28 : 21−26（2011）
原著
ビオチン欠乏マウスにおけるロイシン大量摂取による有機酸代謝への影響
1）
安藤沙織，松井朝義 1），榎原周平 2），
湯浅正洋 1），福井徹 3），渡邊敏明 1）
1）
＊
2）
＊＊
＊＊＊
3）
（兵庫県立大学環境人間学部食環境解析学教室，兵庫県立大学環境人間学部栄養生理学教室，病体生理研究所
）
Effect on organic acid metabolism with high intake of leucine
and biotin deficiency in mice
1）
1）
2）
1）
3）
1）
Saori ANDO , Tomoyoshi MATSUI , Shuhei EBARA , Masahiro YUASA , Toru FUKUI and Toshiaki WATANABE
1）
Department of Dietary Environmental Analysis, School of Human Science and Environment, University of Hyogo
2）
Department of Nutritional Physiology, School of Human Science and Environment, University of Hyogo
3）
Byotai-seiri Laboratory
Summary
Biotin belongs to the one of the water-soluble vitamin B groups, and it is a cofactor of carboxylase, such as acetyl-CoA
carboxylase (ACC), pyruvate carboxylase (PC), propionyl-CoA carboxylase (PCC) and 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase
(MCC). 3-Hydroxyisovaleric acid (3-HIA) which is a metabolite of leucine catabolism is a kind of organic acid in urine.
The leucine degradation pathway often works to create acetyl-CoA and acetoacetate. When biotin is deﬁcient, an alternative metabolic pathway produces 3-HIA. In this study, when the activity of 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase decreased, 3-HIA excretion increased in the urine. The urinary excretion of 3-HIA was determined by HPLC. Feeding an
additional two-fold increase of leucine had no eﬀect on urinary 3-HIA but urinary biotin was increased due to the leucine. In addition, leucine had eﬀects on relative weight and biotin levels in some tissues. From these ﬁndings, although
3-HIA is a sensitive indicator of biotin deﬁciency, we have to pay attention when evaluating biotin deﬁciency.
ビオチンは水溶性ビタミンの一種であり，ビタミン B
PC は糖新生，ACC は脂肪酸合成，PCC および MCC は
群に分類される。ビオチンの欠乏症状として，皮膚炎，脱
アミノ酸異化代謝に関わっている。ビオチン欠乏状態にな
毛，神経障害などが挙げられ，妊娠動物においては胎児の
るとカルボキシラーゼ活性が低下し，MCC 活性の低下に
1）
形態形成への影響も報告されている。ビオチンは様々な
2）
おいては，分岐鎖アミノ酸（BCAA）のロイシンの異化代
食品に分布し，レバーや卵黄などに多く含まれている。
謝が阻害される。通常，ロイシンの異化代謝が起こると，
生卵白中に含まれるアビジンと非常に強固に結合し，吸収
アセチル CoA やケトン体であるアセト酢酸を産生する
が阻害され，ビオチン欠乏が起こることが知られているが，
が，ビオチン欠乏状態では有機酸の一種である 3- ヒドロ
キシイソ吉草酸（3-HIA）の尿中排泄量が増加する。この
一般にビオチン欠乏は通常の食生活では起こらない。しか
し，近年の報告では，妊婦
3, 4）
，抗てんかん剤を服用して
5）
いる患者，一般調製粉乳や治療用特殊ミルクを与えられ
6, 7）
10)
ことから，ビオチン欠乏の指標として 3-HIA の有用性が
示唆されている。
11）
において，ビオチン欠乏が起こるとされて
Mock らのこれまでの報告によると，ヒトにおける境
おり，臨床症状が見られない境界型ビオチン欠乏の存在も
界型ビオチン欠乏状態では，オレンジジュースに平均一日
認められている。
摂取量の 2 倍のロイシンを添加し，飲用後の随時尿を採取
したところ，尿中 3-HIA 排泄量が有意に増加した。また，
ている乳児
ビオチンは，ピルビン酸カルボキシラーゼ（PC）
，アセ
チル CoA カルボキシラーゼ（ACC），プロピオニル CoA
カルボキシラーゼ（PCC）
，3-メチルクロトニル CoA カル
8, 9）
ボキシラーゼ（MCC）の補酵素として機能している
。
著者らもビオチン欠乏マウスに一般飼料である CE-2 に含
まれる約 7 倍量のロイシンを飼料中に添加したところ，尿
12）
中 3-HIA 排泄量が有意に増加することを見出した。一
所在地：兵庫県姫路市新在家本町1-1-12（〒670-0092）
所在地：兵庫県姫路市新在家本町1-1-12（〒670-0092）
＊＊＊所在地：東京都板橋区熊野町47-11（〒173-0025）
＊
＊＊
― 21 ―
3-Hydroxyisovaleric acid (3-HIA)
Leucine
Isovaleric acid
2-ketoisocaproate
mitochondria
Isovaleryl-CoA
3-Hydroxyisovaleryl-CoA
3-Methylcrotonyl-CoA
3-Methylcrotonylglycine
MCC
3-Methylglutaconyl-CoA
3-Hydroxyisovaleryl-carniƟne
3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA
Acetyl-CoA
Fig. 1
Acetoacetate
Catabolism of leucine.
The leucine degradation pathway often works to create acetyl-CoA and acetoacetate. However,
when 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase (MCC) activity has decreased during biotin deﬁciency,
an alternative metabolic pathway produces 3-methylcrotonylglycine, 3-hydroxyisovaleryl-carnitine and 3-hydroxyisovaleric acid (3-HIA). 3-HIA is also made by isovaleryl-CoA.
方，ビオチン欠乏時とは異なる 3-HIA 排泄経路が存在す
Table 1
13）
ることが知られている（Fig. 1）
。つまり，ロイシンの摂
取が増加すると，3 HIA 排泄量が増加することから，ビオ
㻬㼑㼊㼕㼈㼇㼌㼈㼑㼗
㼆㼒㼕㼑㼖㼗㼄㼕㼆㼋
㼈㼊㼊㻃㼚㼋㼌㼗㼈䟺㼇㼕㼌㼈㼇䟻
䃇㻐㼆㼒㼕㼑㼖㼗㼄㼕㼆㼋
㼖㼘㼆㼕㼒㼖㼈
㼖㼒㼜㼅㼈㼄㼑㻃㼒㼌㼏
㼆㼈㼏㼏㼘㼏㼒㼖㼈
㼐㼌㼑㼈㼕㼄㼏㻃㼐㼌㼛䟺㻤㻬㻱㻐㻜㻖㻪㻐㻰㻻䟻
㼙㼌㼗㼄㼐㼌㼑㻃㼐㼌㼛䟺㻤㻬㻱㻐㻜㻖㻐㻹㻻䟻
㻯㻐㼆㼜㼖㼗㼌㼑㼈
㼆㼋㼒㼏㼌㼑㼈㻃㼅㼌㼗㼄㼕㼗㼕㼄㼗㼈
㼗㼈㼕㼗㻐㼅㼘㼗㼜㼏㼋㼜㼇㼕㼒㼔㼘㼌㼑㼒㼑㼈
チン欠乏時にロイシン負荷を行うことで，より早期の段階
でビオチン欠乏を見出すことが出来ると期待される。そこ
で，本研究では，尿中 3-HIA 量のビオチン欠乏指標とし
ての有用性と，ビオチン欠乏状態におけるロイシン大量摂
取が尿中 3-HIA 量に及ぼす影響について検討した。
実験方法
1．実験動物
Jcl:ICR 系 3 週齢雄マウス（日本クレア㈱，東京）を実
験動物として用いた。マウスは室温 22 ± 1 ℃，12 時間の
Composition of the biotin-deﬁcient diet.
㻋㼊㻒㼎㼊㻃㼇㼌㼈㼗㻌
㻖㻜㻚㻑㻗㻛㻙
㻕㻓㻓㻑㻓㻓㻓
㻔㻖㻕㻑㻓㻓㻓
㻔㻓㻓㻑㻓㻓㻓
㻚㻓㻑㻓㻓㻓
㻘㻓㻑㻓㻓㻓
㻖㻘㻑㻓㻓㻓
㻔㻓㻑㻓㻓㻓
㻖㻑㻓㻓㻓
㻕㻑㻘㻓㻓
㻓㻑㻓㻔㻗
Diets of the C and CL groups were made by adding biotin (1.71 mg/kg diet)
to a biotin-deﬁcient diet.
Diets of the DL and CL groups were made by adding leucine (20.7 g/kg
diet) to a biotin-deﬁcient diet.
Mineral and Vitamin mixed (absent of biotin) compositions were based
on AIN-93G.
明暗サイクル（明サイクル：9 : 00-21 : 00）の条件で飼育し
チン欠乏群（D 群）に分け，8 週間飼育した。飼料は AIN-
2．分析方法
尿中 3-HIA 量は有機酸分析システム専用の高速液体ク
93G 組成ビオチン欠乏飼料（オリエンタル酵母㈱，東京）
ロマトグラフィ（㈱島津製作所，京都）を用いて測定した。
た。1 週間予備飼育した後，コントロール群（C 群）
，ビオ
14）
を用いた（Table 1）
。C 群にはビオチン（田辺三菱製薬
分析条件として，カラムには Shim-pack SPR-H（㈱島津
㈱，大阪）を添加した（1.71 mg/kg 飼料）
。8 週目以降，
一般飼料 CE-2 に含まれる 2 倍相当量のロイシン（プロテ
製作所，京都）を使用し，移動相は 4 mM -トルエンスル
インケミカル㈱，東京）を添加し，C 群および D 群の一部
び 80 µM EDTA･2Na を含む 16 mM Bis-Tris 水溶液を使
に与えた（20.7 g/kg 飼料）
。ロイシン添加群をそれぞれ
用した。流速は 0.8 ml/ 分（移動相および反応液）
，カラム
CL 群，DL 群とし，計 4 群（n = 8 - 10）に分け，さらに 4
温度は 40 ℃，検出器は CDD-10Avp（㈱島津製作所，京都）
週間飼育した。糞食を防ぐため，ステンレス網の中敷きの
で測定した。尿中ビオチン量は
あるプラスチックケージで飼育し，水は蒸留水を自由摂取
させた。週 1 回代謝ケージにて絶食状態で採尿した。計 12
ATCC 8014 を用いた微生物学的定量法（比濁法）により
測定した。尿中ビオチン量および尿中 3-HIA 量は，尿中
週間飼育後，ジエチルエーテル麻酔下で開腹し，後大静脈
クレアチニン量で補正した。なお，尿中クレアチニン量は
より採血し屠殺した。なお，本研究は兵庫県立大学環境人
Jaﬀe 法を用いて測定した。
ホン酸水溶液，反応液は 4 mM -トルエンスルホン酸およ
間学部倫理委員会の承認（021，2010）を得て実施した。
― 22 ―
増加，ロイシン添加による有意な減少が見られた。肝臓で
3．統計解析
は，D 群が最も有意な増加を示し，精巣では CL 群が有意
統計解析には，Microsoft Oﬃce Excel 2007（マイクロソ
な減少を示した。
尿中 3-HIA 量は，9 週目以降，D 群で有意に増加したが，
フト㈱，東京）
，統計ソフトウェア SPSS Statistics 17.0 for
Windows（SPSS ㈱，東京）を用いて検定を行った。デー
タは平均値±標準誤差（mean±SEM）で表し，有意水準
p < 0.05 のとき統計学的に有意であるとした。
実験結果
本実験では，マウスの体重に関しては，3 週目までは全
ての群において，ほぼ同様の成長曲線を示したが，5 週目
以降，D 群において有意な減少を示した（Fig. 2）。飼育 7
週目から，D 群のマウスに脱毛が見られた（Fig. 3）。飼
料摂取量は，飼育 1，2，4 週目では C 群が有意に多く飼
料を摂取し，ロイシン添加を開始した 9 週目以降，ビオチ
ン欠乏による有意な飼料摂取量の増加が見られた（Fig. 4）
。
Fig. 3 The representative biotin deﬁcient mice.
組織の相対重量においては，腎臓，大脳，膵臓，肺にお
Hair loss was observed in the biotin deﬁcient group.
（A：control group, B：biotin deﬁcient group）
いて，ビオチン欠乏による有意な増加が認められた
（Table 2）
。心臓においては，ビオチン欠乏による有意な
45
*
Body weight g
40
*
*
*
*
*
*
9.0
*
8.0
35
30
D
25
20
DL
15
C
10
CL
5
Dietary intake g/day
50
7.0
6.0
*
*
*
*
*
*
*
5.0
D
4.0
DL
3.0
C
2.0
CL
1.0
0
0.0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
Experimental period Weeks
4
5
6
7
8
9
10 11 12
Experimental period Weeks
Fig. 2 Changes of body weight in biotin deﬁciency and leucine
addition mice.
Fig. 4 Changes of dietary intake in biotin deﬁciency and leucine addition mice.
Values are mean ± SEM.
*t-test (0-8wk)：5-8wk. p < 0.05.
Post hoc test after two-way ANOVA repeated measures (9-12wk)：
There was no interaction between biotin and leucine. Biotin deﬁciency groups (D and DL) showed statistically signiﬁcant diﬀerences in comparison with control groups (C and CL). p < 0.05.
*Values in biotin deficiency groups (D and DL) and Control
groups (C and CL) are significantly different (p < 0.05) at the
same point. Every point has shown a signiﬁcant diﬀerence. (D
and DL vs. C and CL：9-12wk.)
Values are mean±SEM.
*t-test (0-8wk)：1-2, 4wk. p < 0.05.
Post hoc test after two-way ANOVA repeated measures (9-12wk)：
There was no interaction between biotin and leucine. Biotin deﬁciency groups (D and DL) showed statistically signiﬁcant diﬀerences in comparison with control groups (C and CL). p < 0.05.
Values in biotin deﬁciency groups (D and DL) and Control groups
(C and CL) are signiﬁcantly diﬀerent (p < 0.05) at the same point.
Every point has shown a signiﬁcant diﬀerence. * (D and DL vs. C
and CL：9-12wk.)
Table 2 Relative weight in biotin deﬁciency and leucine addition mice.
Relative weight （/g%）
Liver
Kidney
Heart
Soleus
Testis
Brain
Pancreas
Spleen
Lung
Dietary groups
Two-way ANOVA
D
DL
C
CL
Biotin
Leucine
Interaction
4.54 ± 0.14a
2.35 ± 0.12
0.58 ± 0.01
1.12 ± 0.03
0.80 ± 0.03a
0.99 ± 0.07
0.58 ± 0.08
0.29 ± 0.04
0.54 ± 0.01
4.08 ± 0.15b
2.01 ± 0.07
0.52 ± 0.03
1.18 ± 0.09
0.80 ± 0.02a
0.89 ± 0.02
0.62 ± 0.05
0.26 ± 0.05
0.51 ± 0.01
3.42 ± 0.06c
1.68 ± 0.10
0.44 ± 0.02
1.09 ± 0.03
0.75 ± 0.03a
0.77 ± 0.02
0.53 ± 0.01
0.21 ± 0.02
0.46 ± 0.02
3.61 ± 0.06c
1.70 ± 0.05
0.43 ± 0.01
1.13 ± 0.04
0.62 ± 0.03b
0.77 ± 0.02
0.52 ± 0.02
0.20 ± 0.01
0.44 ± 0.01
*
*
*
n.s.
*
*
*
n.s.
*
n.s.
n.s.
*
n.s.
*
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
*
n.s.
n.s.
n.s.
*
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
Values are mean ± SEM.
Each sample was analyzed by two-way ANOVA. *p < 0.05. In the liver and testis, there were interactions between biotin and leucine. Hence, each group was
ab, a−c
p < 0.05.
analyzed by multiple comparisons.
― 23 ―
*
450
1600
1400
1200
D
1000
800
DL
600
C
400
CL
*
*
*
200
*
*
*
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Urinary bioƟn mmol/mol creaƟnine
Urinary 3-HIA mmol/mol creaƟnine
1800
400
*
*
350
300
250
D
*
200
*
150
100
DL
*
*
*
*
*
4
5
6
7
8
*
*
50
*
C
*
CL
0
0
10 11 12
1
2
Experimental period Weeks
3
9
10 11 12
Experimental period Weeks
Fig. 5 Urinary 3-HIA in biotin deﬁciency and leucine addition mice.
Fig. 6 Urinary biotin in biotin deﬁciency and leucine addition mice.
Values are mean±SEM.
*t-test (0-8wk)：1, 4, 6wk. p < 0.05.
Post hoc test after two-way ANOVA repeated measures (9-12wk)：
There was an interaction between biotin and leucine. Hence,
each group was analyzed by repeated measures of ANOVA and
multiple comparisons. The D group showed statistically signiﬁcant differences in comparison with the DL group and control
groups (C and CL). p < 0.05.
Each groups values are signiﬁcantly diﬀerent at the same point.
(p < 0.05)
*(D vs. DL：9wk, D vs. C：9, 11-12wk, D vs. CL：9-12wk)
Values are mean±SEM.
*t-test (0-8wk)：0-8wk. p < 0.05.
Post hoc test after two-way ANOVA repeated measures (9-12wk)：
There was an interaction between biotin and leucine. Hence, each
group was analyzed by repeated measures of ANOVA and multiple comparisons. The D group showed statistically signiﬁcant
diﬀerences in comparison with the DL group and control groups
(C and CL). p < 0.05.
Each groups values are signiﬁcantly diﬀerent at the same point.
(p < 0.05)
*(D vs. DL：9-12wk、D vs. C：9-12wk、D vs. CL：9-12wk)
ロイシン添加による影響は見られなかった（Fig. 5）
。尿
有意な増加は，体重の有意な低下や，尿中ビオチン量で見
中ビオチン量は，ビオチン欠乏により有意に減少した
られたビオチン欠乏による有意な減少と，必ずしも一致し
（Fig. 6）
。しかし，ロイシン添加が行われた 9 週目におい
て，D 群の尿中ビオチン量は低値を維持したが，DL 群の
なかった。
尿中 3-HIA 排泄量は，体重増加が比較的著しい飼育 3
尿中ビオチン量の増加が認められた。10 週目以降は，DL
週目まで，ビオチン欠乏の有無によらず，高い傾向を示し
群の尿中ビオチン量は C 群および CL 群と同程度まで増加
た。これは，体重増加が比較的安定する飼育 4 週目以降に
した。
組織中のビオチン量では，精巣において，ビオチン欠乏
比べ，尿中クレアチニン量が少なく，クレアチニン補正さ
れた尿中 3-HIA 排泄量が高値となるためである。尿中ク
による有意なビオチン量の減少，ロイシン添加による有意
レアチニンは，ロイシン代謝と相関する因子ではなく，尿
なビオチン量の増加が見られた（Table 3）
。肝臓，膵臓で
の希釈性を現す指標であり，筋肉量に比例する
は，ビオチン欠乏による有意なビオチン量の減少，ロイシ
ン摂取により DL 群で特異的なビオチン量の増加が確認さ
アチニン補正を行った尿中 3-HIA 量を用いることは，成
体期の尿中 3-HIA 量と比べ，尿濃縮能の未熟な幼若期に
れた。
おいて高値を示す原因となる。横断的に検討する場合は，
15-16）
。クレ
クレアチニン補正が有用であるものの，縦断的に検討する
考察
場合，尿濃縮能や筋肉量により影響を受ける。今後，他の
バイオマーカーとの比較や，ロイシン異化代謝における他
本研究では，ビオチン欠乏飼料により飼育 5 週目で，D
の中間代謝産物との比較について，検討する必要がある。
群においてビオチン欠乏を示し，体重の有意な低下，脱毛
を生じた。しかし，ビオチン欠乏による尿中 3-HIA 量の
また，C 群と D 群の間で，有意な体重の差を認めない
時期であるにも関わらず，第 1 週において尿中 3-HIA 排
Table 3 Biotin concentration of tissues in biotin deﬁciency and leucine addition mice.
㻥㼌㼒㼗㼌㼑
㻯㼌㼙㼈㼕㻃㻋㼷㼊㻒㼊㻌
㻮㼌㼇㼑㼈㼜㻃㻋㼷㼊㻒㼊㻌
㻫㼈㼄㼕㼗㻃㻋㼷㼊㻒㼊㻌
㻶㼒㼏㼈㼘㼖㻃㻋㼷㼊㻒㼊㻌
㻷㼈㼖㼗㼌㼖㻃㻋㼷㼊㻒㼊㻌
㻥㼕㼄㼌㼑㻃㻋㼷㼊㻒㼊㻌
㻳㼄㼑㼆㼕㼈㼄㼖㻃㻋㼷㼊㻒㼊㻌
㻶㼈㼕㼘㼐㻃㻋㼷㼊㻒㼐㻯㻌
㻧㼌㼈㼗㼄㼕㼜㻃㼊㼕㼒㼘㼓㼖
㻧
㻓㻑㻕㻗㼳㻓㻑㻓㻕㼄
㻓㻑㻗㻓㼳㻓㻑㻓㻙㼄
㻓㻑㻖㻗㼳㻓㻑㻓㻙㼄
㻓㻑㻓㻘㼳㻓㻑㻓㻔
㻓㻑㻔㻗㼳㻓㻑㻓㻔
㻓㻑㻕㻗㼳㻓㻑㻓㻕
㻓㻑㻖㻚㼳㻓㻑㻓㻘㼄
㻓㻑㻓㻘㼳㻓㻑㻓㻓
㻧㻯
㻓㻑㻗㻗㼳㻓㻑㻓㻗㼅
㻓㻑㻛㻓㼳㻓㻑㻓㻚㼄
㻓㻑㻗㻙㼳㻓㻑㻔㻓㼄㼅
㻓㻑㻓㻙㼳㻓㻑㻓㻔
㻓㻑㻕㻘㼳㻓㻑㻓㻕
㻓㻑㻖㻔㼳㻓㻑㻓㻗
㻓㻑㻜㻖㼳㻓㻑㻓㻛㼅
㻓㻑㻓㻘㼳㻓㻑㻓㻓
㻦
㻓㻑㻚㻘㼳㻓㻑㻓㻘㼆
㻔㻑㻖㻕㼳㻓㻑㻔㻖㼅
㻓㻑㻙㻖㼳㻓㻑㻓㻗㼄㼅
㻓㻑㻓㻙㼳㻓㻑㻓㻓
㻓㻑㻕㻗㼳㻓㻑㻓㻖
㻓㻑㻖㻕㼳㻓㻑㻓㻔
㻔㻑㻔㻚㼳㻓㻑㻔㻓㼅
㻓㻑㻓㻙㼳㻓㻑㻓㻔
㻦㻯
㻥㼌㼒㼗㼌㼑
㻓㻑㻙㻓㼳㻓㻑㻓㻕㼇
㻔㻑㻕㻓㼳㻓㻑㻓㻛㼅
㻓㻑㻚㻗㼳㻓㻑㻔㻓㼅
㻓㻑㻓㻙㼳㻓㻑㻓㻓
㻓㻑㻖㻓㼳㻓㻑㻓㻕
㻓㻑㻕㻛㼳㻓㻑㻓㻕
㻔㻑㻔㻔㼳㻓㻑㻓㻙㼅
㻓㻑㻓㻘㼳㻓㻑㻓㻔
㻍
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㼑㻑㼖㻑
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㼑㻑㼖㻑
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㼑㻑㼖㻑
㻷㼚㼒㻐㼚㼄㼜㻃㻤㻱㻲㻹㻤
㻯㼈㼘㼆㼌㼑㼈
㻬㼑㼗㼈㼕㼄㼆㼗㼌㼒㼑
㻍
㼑㻑㼖㻑
㼑㻑㼖㻑
㼑㻑㼖㻑
㻍
㼑㻑㼖㻑
㻍
㼑㻑㼖㻑
㻍
㻍
㻍
㼑㻑㼖㻑
㼑㻑㼖㻑
㻍
㻍
㼑㻑㼖㻑
Values are mean ± SEM.
Each sample was analyzed by two-way ANOVA. *p < 0.05. In the liver, kidney, heart, brain and pancreas, there were interactions between biotin and
leucine. Hence, each group was analyzed by multiple comparisons.
a d, a, b
p < 0.05.
― 24 ―
泄量は，C 群のほうが高値となっている。このことは，体
重増加の著しい時期において，何かしらの要因により，尿
中 3-HIA 排泄量が，ビオチン欠乏のみのバイオマーカー
としては，信頼性に欠ける可能性を示唆している。ロイシ
ンは飼料摂取より得られ，これは同化により体構成タンパ
3-HIA 量の減少との間で関連があるものと推測される。
尿中 3-HIA 排泄量は，異化亢進時において，境界型ビ
オチン欠乏のみを示すバイオマーカーである。しかし，同
化亢進時においては，ロイシンの過剰摂取を示す可能性も
示唆され，尿中 3-HIA 量が，ビオチン欠乏の単独のバイ
亢進時には，体筋肉の崩壊によりロイシンは導入され，ア
オマーカーとして評価するには問題があると思われる。以
上のことから，尿中 3-HIA 量はビオチン欠乏の指標とし
セチル CoA やアセト酢酸まで分解され，エネルギー源と
て有用ではあるが，より有用な指標として利用するために
クなどを合成するのに用いられる。一方，飢餓などの異化
10）
して利用される。この過程において，ビオチン欠乏によ
は，今後さらに検討を重ねる必要がある。
り，ビオチン依存性酵素である MCC の活性の低下が生じ
ると，3-HIA が産生され，尿中に排泄される。一般的にア
参考文献
ミノ酸やタンパク質は，同化に必要な摂取量を越えた場合，
余剰分をアミノ酸の形で体に貯蔵することは出来ない。同
1）Toshiaki Watanabe（1983）Teratogenic eﬀects of biotin
化必要量を越えたタンパク質やアミノ酸であるロイシンを
過剰に摂取すると，同化時であってもエネルギー源として
deﬁciency in mice. J. Nutr. 113：574-581.
2）日本ビタミン学会（2010）ビタミン総合事典，株式会
利用され得る。第 1 週目から第 2 週目において，C 群は D
社朝倉書店，東京：pp. 355-390.
群よりも，飼料を有意に多く摂取している。このことが，
3）Donald M. Mock, Diane D. Stadler, Shawna L. Stratton,
幼若期の体重増加に著しく，同化作用の活発な時期に，一
Nell I. Mock（1997）Biotin status assessed longitudi-
過性にビオチン欠乏群より過剰にタンパク摂取を来たし，
尿中 3-HIA 量の値が高値を示した可能性がある。
nally in pregnant women. J. Nutr. 127：710-716.
4） Donald M. Mock, J. Gerald Quirk, Nell I. Mock（2002）
本研究では，DL 群の尿中 3-HIA 量が最も高値を示すと
予測していたが，Mock ら
11）
Marginal biotin deﬁciency during normal pregnancy.
12）
Am. J. Clin. Nutr. 75：295-299.
および著者らによる先行
研究とは異なり，尿中 3 HIA 量はロイシン添加後，概ね
5）Klaus-Henning Krause, Jean-Pierre Bonjour, Peter
D 群，DL 群，C 群，CL 群の順で低くなった。その原因
Berlit, Walter Kochen（1985）Biotin status of epileptics.
として考えられるのが，以下の 2 点である。
まず，2 倍量のロイシン添加では，尿中 3-HIA 量への影
6）渡邊敏明，福井徹（1996）わが国の調製粉乳に含まれ
響が確認出来なかった。Mock らの研究では，ヒトにおい
ているビオチン量の分析．日本栄養・食糧学会誌 49：
て平均一日摂取量の 2 倍量のロイシンをオレンジジュース
に添加し，飲み干した後の採尿により，尿中 3-HIA 量を
7）福井徹，石盛嘉浩，榎原周平，木村幸子，渡邊敏明
Ann. N. Y. Acad. Sci. 447：297-313.
343-347.
11）
測定した。その結果，尿中 3-HIA 量の増加が見られて
（2006）母乳および人工栄養乳児におけるビオチンの
体内動態の検討．微量栄養素研究 23：5-12.
いる。この理由として，体内のロイシン量が急激に増加す
ることにより，境界型のビオチン欠乏において活性の低下
した MCC をオーバーフローし，3-HIA 排泄量が増加した
8）Janos Zempleni，Robert B. Rucker，Donald B. McCormick，
と指摘されている。著者らの研究においても，ビオチン欠
乏マウスに一般飼料 CE-2 に含まれるロイシンの約 7 倍量
CRC Press Taylor & Francis Group，Florida：pp.361-383.
9） Charles R. Scriver, Arthur L. Beaudet, William S. Sly,
12）
の飼料添加で，尿中 3-HIA 量が増加した。これらのこ
David Valle（1995）The metabolic and molecular bases
とから，マウスにおいて，体重増加がある程度恒常化した
of inherited disease. -7th ed., McGraw-Hill Inc., New
時期には，食餌中に 2 倍量のロイシンが添加されても，尿
中 3-HIA 量に影響を及ぼす十分量の過剰摂取とは言えな
York：vol. 2. pp. 3151-3177.
John W. Suttie（2007）Handbook of Vitamins -4th ed.，
10） Charles R. Scriver，Arthur L. Beaudet，William S.
Sly，David Valle（1995）The metabolic and molecu-
いのかもしれない。
lar bases of inherited disease. -7th ed.，McGraw-Hill
次に，尿中，組織中において，C 群および CL 群では，
Inc., New York：vol. 1. pp. 1387-1422.
ビオチン量に大きな差が見られなかったが，D 群および
DL 群では，DL 群で特異的なビオチン量の増加が確認出
11）Donald M Mock, Cindy L. Henrich, Nadine Carnell, Nell
来た。これらのことから，ビオチンが充足している状況で
I Mock（2002）Indicators of marginal biotin deﬁciency
は，2 倍量のロイシン添加は，ビオチン量には影響を与え
and repletion in humans：validation of 3-hydroxyiso-
ないことが示唆された。一方，ビオチン欠乏状態において
valeric acid excretion and a leucine challenge. Am. J.
Clin. Nutr. 76：1061-1068.
は，ロイシン添加がビオチンの体内動態に影響を及ぼして
いることも示唆された。ビオチン欠乏状態でのロイシン摂
12）香西彩加（2009）
，マウスにおける微量栄養素のビオ
取が，腸内細菌叢のビオチン産生に関与しているのかもし
チン吸収への影響，兵庫県立大学環境人間学部学位論
れない。DL 群のビオチン量の増加は，本研究の尿中
文
― 25 ―
13）清水章，中西豊文（1992）尿有機酸定量分析による病
態診断 . 臨床病理 40：743-750.
14）Philip G. Reeves, Forrest H. Nielsen, George C. Fahey,
JR（1993）AIN-93 purified diets for laboratory rodents：ﬁnal report of the American Institute of Nutrition
ad hoc writing committee on the reformulation of the
AIN-76A rodent diet. J. Nutr. 123：1939-1951.
15）上代淑人（2007）イラストレイテッドハーパー・生化
学原書 27 版，丸善株式会社，東京：pp. 294-302.
16）Thomas Remer, Annette Neubert, Christiane MaserGluth（2002）Anthropometry-based reference values
for 24-h urinary creatinine excretion during growth
and their use in endocrine and nutritional research.
Am. J. Clin. Nutr. 75：561-569.
― 26 ―
Trace Nutrients Research 28 : 27−31（2011）
原著
病院および介護施設の食事からの微量ミネラル摂取量の
計算値と実測値との比較
1）
1）
1）
吉田宗弘 *，児島未希奈，三由亜耶，森田明美
1）
2）
2）
（関西大学化学生命工学部食品工学研究室，国立健康・栄養研究所）
Comparison of Calculated Values with Analyzed Values in Intake of
Microminerals from Diets in Hospital and Nursing Home
1）
1）
1）
2）
Munehiro YOSHIDA , Mikina KOJIMA , Aya MIYOSHI and Akemi MORITA
1）
Laboratory of Food and Nutritional Sciences, Faculty of Chemistry, Materials and Bioengineering, Kansai University
2）
National Institute of Health and Nutrition
Summary
Intake of microminerals (iron (Fe), zinc (Zn), copper (Cu), manganese (Mn), iodine, selenium (Se), chromium (Cr) and molybdenum (Mo)) from diets in hospitals and nursing home was determined by atomic absorption spectrometry or inductively coupled plasma mass spectrometry, and compared with those estimated by a calculation using the Standard Tables
of Food Composition in Japan, 5th edition (Fe, Zn, Cu and Mn) or 2010 (iodine, Se, Cr and Mo). In the intake of Fe, Zn, Cu
and Mn, correlation coeﬃcients between the analyzed values and calculated values ranged from 0.6 to 0.9 and Y-intercepts of the regression equations were near zero; however, slopes of the equation ranged from 0.50 to 0.69. In the daily
intake of Se and Mo, the estimated values using the Standard Tables, 2010 were almost equal to the analyzed values. On
the other hand, the calculated iodine intake in some diets was markedly lower than the analyzed values. In addition, the
calculated Cr intake was less than one−quarter of the analyzed values. These results indicate that considerable loss of
Fe, Zn, Cu and Mn occurs in cooking and the estimated Se and Mo intake calculated using the Standard Tables of Food
Composition in Japan, 2010 is reliable.
日常の食事からのエネルギーと栄養素の摂取量を知るこ
本研究では，病院および介護施設で提供されている献立か
とは，個人や集団の食生活を評価する上で重要である。食
らの鉄，亜鉛，銅，マンガンの摂取量について，五訂食品
事からの栄養素摂取量を推定する場合，献立に用いられて
成分表にもとづく計算値と化学分析にもとづく実測値との
いる個々の食材の量と食品成分表に記載されている各食材
差異を検討した。一方，2010 年秋に公表された「日本食
中の栄養素含有量にもとづく計算値を用いるのが一般的で
品標準成分表 2010」においては，収載食品の 3 分の 1 に
ある。また，給食施設などにおいて，管理栄養士が献立を
相当する約 500 食品に対して，ヨウ素，セレン，クロム，
設計する場合も，食品成分表からエネルギーと栄養素の摂
モリブデンの含有量が示された。そこで，これら 4 元素
取量を計算している。
の摂取量についても，計算値と化学分析にもとづく実測値
このようにして算定されたエネルギーと栄養素摂取量が
5）
との差異を検討した。
真の摂取量を反映しているかの検討はしばしば行われてお
実験方法
り，少なくともタンパク質のような主要栄養素では計算値
と化学分析にもとづく実測値との間に高い一致性が認めら
1）
れている。しかし，一部のビタミンやミネラルについて
は，献立によって一致しない事例も認められている
1．食事試料
2, 3）
。
大阪府下の 2 つの病院（A および B）において，通常食
また水溶性ビタミンやミネラルでは調理中の損失も無視で
として提供されていた食事を，それぞれ 3 日間（病院食
4）
きないといわれる。このような成分表と実測値との間の
A1 ∼ 3，B1 ∼ 3），朝，昼，夕食別に収集した（合計で，
一致性が低い場合には，食事摂取基準における推奨量を満
2 × 3 × 3 ＝ 18 試料）。収集時期は病院 A が 2010 年 7 月，
足させる献立を設計する場合に一定の配慮が必要となる。
病院 B が 2010 年 11 月である。また神奈川県下の介護施
所在地：吹田市山手町3 3 35（〒564 8680）
＊
― 27 ―
設において，通常食 1 日分と介護食 1 日分を，朝，昼，夕
らかな場合は，構成食品の平均値を使用，③その食品が属
食別に収集した。収集時期は 2010 年 1 月である。介護食
する食品群ごとの平均値で代用，のいずれかの方式で数値
については別に昼食 1 回分を 2009 年 11 月にも収集した
をあて，摂取量の算定を行った。結果として，①は 138 食
（合計で，1 × 2 × 3 ＋ 1 ＝ 7 試料）
。これらのうち，介護食
品中の 17 ％，②は 7 ％，③は 27 ％だった。
とは，咀嚼または嚥下が困難な要介護者に対するもので，
結果
加水もしくはとろみづけを行い，ミキサーなどによって均
一後，裏ごしなどによって堅い固形物を除去した半流動食
である。各食事は，朝，昼，夕食別に凍結乾燥した後，細
Fig. 1 に，朝，昼，夕食別の 25 試料に関して，鉄，亜
粉化し，分析用試料とした。朝，昼，夕食に分けたため，
鉛，銅，マンガンの摂取量の計算値を独立変数（X），分
食事試料は総計で 25 種類となった。
析値を従属変数（Y）とした回帰分析の結果をまとめた。
なお，鉄に関しては，計算値（7.1 mg）と実測値（0.65 mg）
2．微量ミネラルの分析
との乖離が著しい 1 試料を除外して関連を検討した。4 種
1）鉄，亜鉛，銅，マンガン，セレン，モリブデンの定
の微量ミネラル摂取量の計算値と実測値との相関は強く
量：粉末試料１g をケルダールフラスコに入れ，硝酸 10 mL
（r ＝ 0.6 ∼ 0.9），その回帰式は，Y 切片の 95 ％信頼区間
と沸騰石を加えて約 30 分加熱後，過塩素酸 2 mL を加え，
（鉄，−0.53 ∼ 1.12；亜鉛，−0.16 ∼ 0.79；銅，−0.08 ∼ 0.03；
過塩素酸の白煙が生じるまで加熱して完全に灰化した。そ
マンガン，−0.01 ∼ 0.25）がゼロを含み，傾き（回帰係数）
して灰化液に標準ロジウムとテルルを終濃度 20 ng/mL と
が 0.5 ∼ 0.7 の範囲だった。
なるように加え，純水で 10 mL にメスアップしたものを
Table 1 は，病院と介護施設の食事 8 日分について，ヨ
測定用試料とした。この試料中の鉄，亜鉛，銅，マンガン
ウ素，セレン，クロム，モリブデンの 1 日摂取量の計算値
をフレーム式原子吸光光度計，セレンとモリブデンを誘導
と分析値を一覧にしたものである。なお，ヨウ素とクロム
結合プラズマ質量分析器（ICPMS），を用いて定量した。
に関しては，介護施設の食事が分析できなかったため，病
ICPMS の測定において，セレンに対してはテルル，モリ
院食 6 日分のみの比較である。対応のある t 検定では，ク
ブデンに対してはロジウムを内部標準とした。
ロムのみ計算値と実測値に有意な差があり，他の 3 元素は
2）ヨウ素の定量：粉末試料 200 mg に 20 ng/mL のテ
有意差なしだった。
ルルを含む 0.5 ％テトラメチルアンモニウムヒドロキシド
ヨウ素摂取量において，分析値／計算値の比は 0.85 ∼
溶液 40 mL を加え，室温で一夜放置した。さらに，60 ℃
5.85 だった。すなわち，計算値は 6 日中 2 日が 100 µg/d
で 4 時間加熱後，遠心および濾過を行い，抽出液を得た。
未満，残り 4 日が 250 ∼ 420 µg/d だったのに対して，分
抽出液中のヨウ素を，テルルを内部標準として，ICPMS
析値は 6 日すべてが 290 ∼ 420 µg/d であり，3 分の 1 に
を用いて定量した。
おいて計算値と分析値との乖離が認められた。一方，クロ
3）クロムの定量：粉末試料 500 mg を磁製るつぼに入
ムの摂取量においては，計算値と分析値の相関は大きかっ
れ，550 ℃で 16 時間加熱した。灰化後の残渣を 20 ng/mL
たが，分析値／計算値の比は 4.64 ∼ 6.85 であり，いずれ
のロジウムを含む 0.1 M 硝酸に溶解し，含有されるクロム
の日も分析値が計算値を大きく上回っていた。
を，ロジウムを内部標準として，ICPMS を用いて定量し
た。
これに対して，セレンとモリブデンの摂取量では，分析
値／計算値の比がそれぞれ 0.78 ∼ 1.84 と 0.98 ∼ 1.80 であ
り，計算値と分析値がおおむね一致する傾向にあった。そ
3．成分表からの微量ミネラル摂取量の算定
こでこの 2 元素については，朝，昼，夕食別に分けた 24
1）鉄，亜鉛，銅，マンガンの摂取量の算定：鉄，亜鉛，試料（別途収集した介護施設の介護食昼食は，献立につい
銅，マンガン摂取量の成分表からの計算値は各施設におい
ての詳細な情報が得られず，摂取量の計算値がもとめられ
て五訂食品成分表にもとづき算定された数値を使用した。
なかったので検討から除外した）を対象として，計算値と
2）
「日本食品標準成分表 2010」を用いたヨウ素，セレ
分析値との関連を検討し，Fig. 2 に示した。相関係数は，
ン，クロム，モリブデン摂取量の算定：「日本食品標準成
セレンが 0.67，モリブデンが 0.78 であり，比較的大き
分表 2010」においてヨウ素，セレン，クロム，モリブデ
かった。回帰式を求めたところ，セレンにおいては Y 切
ン含有量の記載があるのは全体の約 3 分の 1 である。実際，
片が比較的大きく（95 ％信頼区間 11.4 ∼ 32.0）
，傾きは
今回の収集献立で使用されていた 138 食品中で，成分表に
0.74 となった。これに対してモリブデンの回帰式では，Y
これら 4 元素の含有量記載があったのは 49 ％だった。記
切片の 95％信頼区間（ 43.7 ∼ 30.7）がゼロを含み，傾き
載のない食品に関しては，①近縁のもので代用（ロース肉
は 1.39 だった。
→牛肉の平均値，ロールパン→パンの平均値，魚種の細か
な違いを同属のもので代用（例，サワラ→同じアジ科のサ
バで代用）など），②ミックスベジタブルなどのように加
工食品において，複数の食品を組み合わせていることが明
― 28 ―
(r = 0.61, p < 0.01)
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
Estimated iron intake (mg/meal)
0.8
(c)
Y = 0.692 X - 0.03
0.6
(r = 0.87, p < 0.001)
0.4
0.2
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
Estimated copper intake (mg/meal)
5
Analyzed selenium intake (μg/menu)
4
6
(b)
Y = 0.638 X + 0.31
.
p < 0.001)
(r = 0.86,
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
Estimated zinc intake (mg/meal)
2.5
(d)
Y = 0.607 X + 0.12
2.0
(r = 0.90, p < 0.001)
1.5
1.0
0.5
0
0
0.5 1.0
1.5 2.0
2.5
Estimated manganese intake (mg/meal)
Analyzed molybdenum intake (μg/menu)
Y = 0.499 X + 0.29
Analyzed zinc intake (mg/menu)
(a)
Analyzed manganese intake (mg/menu)
Analyzed iron intake (mg/menu)
Analyzed cpper intake (mg/menu)
5
Fig. 1 Relation between estimated and analyzed values in intakes of iron (a), zinc (b),
copper (c) and manganese (d)
80
(a)
60
40
20
Y = 0.738 X + 15.2
(r = 0.67, p < 0.001)
0
0
20
40
60
80
Estimated selenium intake (μg/meal)
200
(b)
150
100
50
Y = 1.39 X - 6.5
(r = 0.78, p < 0.001)
0
150
200
0
50
100
Estimated molybdenum intake (μg/meal)
Fig. 2 Relation between estimated and analyzed values in intakes of selenium (a)
and molybdenum (b)
Table 1 Comparison of estimated values with analyzed values in intakes of iodine, selenium, chromium and molybdenum from diets
in hospital and nursing home
Diets
Hospital
Usual diet A1
Usual diet A2
Usual diet A3
Usual diet B1
Usual diet B2
Usual diet B3
Nursing home
Usual diet
Soft semi-liquid diet
Mean
Paired t-test
Correlation coeﬃcient
Iodine (µg/d)
Estimated Analyzed
Selenium (µg/d)
Estimated Analyzed
Chromium (µg/d)
Estimated Analyzed
Molybdenum (µg/d)
Estimated Analyzed
347
80
52
246
345
419
411
340
304
332
292
415
108
146
73
120
82
86
101
114
90
125
151
146
7
5
5
9
13
14
48
22
25
28
67
65
242
269
253
223
218
267
302
289
247
177
333
480
−
−
248
−
−
349
58
17
86
59
24
101
−
−
9
−
−
43
157
65
212
230
106
271
NS
0.56 (NS)
p = 0.005
0.88 (p = 0.017)
NS
0.67 (NS)
考察
NS
0.71 (p = 0.049)
た。すべての食品に関して成分表記載の数値が実際のもの
よりも小さいということは考えにくい。したがって，高い
鉄において，計算値と分析値との間で著しい乖離を示し
相関係数と 0.5 ∼ 0.7 の傾きは，これらの微量ミネラルで
たのは，水戻しされた状態で販売されているヒジキを用い
は調理中の損失が 30 ∼ 50％であることを示している。調
た献立だった。このようなヒジキでは，水戻し操作の過程
理によるミネラルの損失はミネラルの種類に関わらず
において大部分の鉄が流出していると思われる。
25％程度といわれているが，今回の結果はこれよりも明
4）
鉄，亜鉛，銅，マンガン摂取量において，五訂成分表に
らかに大きい。今回の病院食では煮物のように損失が大き
もとづく計算値と実測値との間の関連を検討したところ，
い調理法のものが多かったことが関係しているのかもしれ
相関係数は比較的大きく，回帰式の Y 切片はいずれもゼ
ない。なお介護食では，通常の調理に裏ごしなどの操作が
ロを含み，その傾き（回帰係数）は 0.5 ∼ 0.7 の範囲だっ
加わっており，栄養素の損失はさらに大きくなる可能性が
― 29 ―
されていることを意味している。以上より，現状では，成
高いが，今回は確認できなかった。
2010 年秋に公表された「日本食品標準成分表 2010」に
おいては，ヨウ素，セレン，クロム，モリブデンの含有量
分表からのクロム摂取量の算定は困難であり，かつその意
義も小さいといわざるを得ない。
ヨウ素，クロムとは異なり，セレンとモリブデンでは，
が初めて示されたが，含有量記載の対象となった食品は全
5）
体の約 3 分の 1 に過ぎなかった。このため，これら 4 元
計算値と分析値がおおむね一致しており，
「日本食品標準
素の摂取量計算においては，使用食品の約半分に関して数
成分表 2010」を用いた計算による摂取量把握は可能と判
値のあてはめ作業を行う必要があった。収載されていない
断できる。これは，セレンが魚介類や小麦製品，モリブデ
食品に関して，その食品が含まれる食品群の平均値を使用
ンが穀類と豆類といった主要食品が供給源であり
することは，あてはめのルールとして単純で好ましいとい
れらの食品は食事記録において定量的把握が容易であるた
える。しかし，現実には，全体の約 4 分の 1 近くが，パン
めと思われる。セレンに関しては，両者の回帰式が原点か
の種類や肉の部位，魚種の細かな違いなど，明らかに近縁
らやや離れ，傾きが 0.74 となった。しかし，献立の数値
の食品が利用可能なケース，または調理済み食品などで食
自体は近似しているケースが多かった。したがって，傾き
材が特定できるケースであったため，食品群の平均値使用
の数値から，ただちにセレンに関して 25％程度の調理損
のケースは全体の 27 ％にとどまった。あてはめ作業は恣
失があると結論することはできない。検討例が増加すれば，
意的に陥る危険性もあるので，今後，4 元素含有量を記載
回帰式が原点に近づき，傾きも大きくなる可能性も考えら
した食品数の増加が期待される。
れる。一方，モリブデンでは，回帰式が原点付近を通過す
11, 12）
，こ
「日本食品標準成分表 2010」を利用したヨウ素，セレ
るものの，傾きが 1.4 となっており，分析値が計算値より
ン，クロム，モリブデン摂取量の計算値と実測値との関連
もやや高い値となる傾向にあった。しかし，これも検討例
を検討したところ，ヨウ素では両者の乖離が著しいケース
を増加することにより，1 に近い傾きとなる可能性も考え
が認められた。ただし，ヨウ素摂取量の把握では，まず低
られる。今後より多くの献立について検討し，計算値と実
ヨウ素の献立と摂取量が数 mg にも達する高ヨウ素の献立
測値との正確な関連を明らかにする必要があるだろう。
の区別が期待されるが，今回の献立はいずれも 1 日 500 µg
までの低ヨウ素の献立であったため，今回の結果からは成
本研究は，平成 23 年度厚生労働科学研究費補助金（循
分表を用いた計算値によってこの区別を行えるかという判
環器疾患等生活習慣病対策総合研究事業：日本人の食事摂
断はできない。ヨウ素濃度の高い食品は水産物，とくに海
取基準の改定と活用に関する総合的研究）により行われた
藻類であり，なかでも昆布製品のヨウ素摂取への寄与は著
ものである。
6）
しいことが知られている。しかし，昆布製品，とくに
参考文献
「だし」として使用される場合，これを定量的に把握する
ことは難しい。すなわち一般論としては，ヨウ素摂取量を
計算によって把握する場合，布施らが提案しているように
1）菅原和夫，熊江隆，町田和彦，島岡章，大下喜子，
7）
特別な調査票を使用するか，あるいは食事記録をとるさ
鈴木継美（1983）秤量法，“買上げ計算法”，“思い
いに昆布製品の使用量をできるかぎり詳細に記載すること
出し法”によるタンパク質，およびナトリウム摂取量
と実測値との比較．栄食誌 36：15 20.
を心がけることが必要であろう。
クロムでは計算値と分析値との相関係数は高かったが，
2）Fraser GE, Shavlik DJ (2004) Correlations between
分析値は計算値の数倍となった。分析値が高くなった理由
としては，調理加工段階でのクロムの汚染，および分析段
estimated and true dietary intakes. Ann Epidemiol
14 : 287 295.
階でのクロムの汚染が考えられる。今回の分析ではステン
3）富永直美，今井美子，保元美保子，池田康子，猪口尚
レス製の実験器具を 100％回避することができていないの
子，後藤智美，横田美菜子，文燦錫，渡辺孝男，池
で，分析中の汚染は否定できない。ただし，今回の実測に
田正之，新保愼一郎（1994）食事中からの鉄摂取量に
よるクロム摂取量の数値は，国内外における陰膳収集献立
ついて ― 計算値と実測値の比較 ― ．京都女子大学食
のクロム分析値とほぼ等しい
8 10）
物学会誌 49：35 43.
。したがって，分析での
汚染よりも調理加工の段階でのクロム汚染が寄与している
4）木村美恵子，糸川嘉則（1990）食事中ミネラルの調理
損耗の実態と基礎実験．栄食誌 43：31 42.
可能性が高い。かりに調理加工における汚染の寄与が大き
いとすれば，実測値の意義が大きく，成分表からの計算値
5）文部科学省科学技術・学術審議会資源調査分科会
は実態を反映していないことになる。この点を解明するに
（2010）日本食品標準成分表 2010．全国官報販売協同
組合，東京．
は，厳格に汚染をコントロールした分析を前提として，調
理加工に伴うクロム含有量の変化を追跡する必要がある。
6）Nagataki S (2008) The average of dietary iodine in-
ただし，成分表においても高クロム濃度の食品は，各食品
群に散見され，一定の傾向が認められない。このことは調
take due to the ingestion of seaweed is 1.2 mg/day
in Japan. Thyroid 18 : 667 668.
理前の食品においても，高クロムが汚染によって引き起こ
7）布施養善，山口曉，山口稔，岡安香織，植松裕子，
― 30 ―
analysis and calculations using the duplicate portion
technique. Nahrung 48 : 47 52.
大橋俊則，紫芝良昌，入江實（2011）食物からのヨ
ウ素摂取量を推定するための食物摂取頻度調査票作成
11）吉田宗弘（2007）日本人はセレン摂取を増やすべきか．
の試み．日臨栄会誌 32：147 158.
臨床栄養 111：598 599.
8）池辺克彦，田中之雄，田中凉一（1988）陰膳方式によ
る 15 金属元素の一日摂取量について．食衛誌 29：52
12）吉田宗弘（2007）日本人におけるモリブデン栄養の現
状．臨床栄養 111：286 287.
57.
9）Van Cauwenbergh R, Hendrix P, Robberecht H,
13）Hattori H, Ashida A, Itô C, Yoshida M (2004) Deter-
Deelstra HA (2003) Daily dietary chromium intake
mination of molybdenum in foods and human milk,
in Belgium, using duplicate portion sampling. Z Lebensm Unters Forsch 203 : 203 206.
and an estimate of average molybdenum intake in
the Japanese population. J Nutr Sci Vitaminol 50 :
10）Marzec Z (2004) Alimentary chromium, nickel, and
selenium intake of adults in Poland estimated by
― 31 ―
404 409.
Trace Nutrients Research 28 : 32−34（2011）
原著
ヒドロキシケトン化合物による活性酸素生成
村上恵子，細川好孝，吉野昌孝
＊
（愛知医大・医・生化）
Generation of reactive oxygen species by hydroxyketone compounds
Keiko MURAKAMI, Yoshitaka HOSOKAWA and Masataka YOSHINO
Department of Biochemistry, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi 480-1195, Japan
Summary
Deferiprone (3-hydroxy-1,2-dimethyl-4-pyridone), a hydroxyketone compound with pyridine ring, is a water soluble,
orally active iron chelator used for the therapy of Friedreich s ataxia and β-thalassemia. Toxic eﬀect of deferiprone was
analyzed in relation to the generation of reactive oxygen species. 1. Deferiprone/iron complex inactivated aconitase,
the most sensitive enzyme to oxidative stress. The inactivation was dependent on sodium azide, an inhibitor of catalase, indicating that deferiprone/iron complex can generate hydrogen peroxide as a principal product. Deferiprone
was more eﬀective on aconitase than maltol or kojic acid, hydroxyketone compounds with pyrane ring. 2. Deferiprone,
2+
maltol and kojic acid stimulated the atuooxidation of Fe
suggesting that these compounds promote the activation of
dioxygen molecule by reduced iron. When chelating agents are used for iron storage disease, attention should be paid
to the transition metal-complex mediated generation of reactive oxygen species.
複素環であるピラン環，及びピリジン環をもつヒドロキ
シケトン化合物は強力な鉄キレート能をもつ。そのうちピ
鉄の除去によるものではなく，マルトールと同様の活性酸
素生成によることを明らかにした。
ラン環のマルトール鉄複合体が活性酸素を生成し，アポ
トーシスを誘導することを以前に報告した
1, 2）
材料と方法
。ピラン化
合物と類似した性質をもつピリジン環のヒドロキシケトン
であるデフェリプロン（3-ヒドロキシ-1, 2-ジメチル - 4 -ピリ
試薬，実験材料
ドン）はその鉄キレート作用が地中海貧血，フリードライ
パン酵母，NADP 依存性イソクエン酸脱水素酵素−オ
ヒ失調症などの治療に応用されているが，その副作用とし
リエンタル酵母。デフェリプロン−和光純薬。マルトール，
て補助因子に鉄をもつアコニターゼを失活させることが報
コウジ酸−カーク。NADP −ロシュ。
3）
告されている。一方，デフェリプロンを投与されたヒト
透過性パン酵母の調製
では血中の EPR シグナルが増強し，フリーラジカルを生
4）
市販のパン酵母 1 g を 0.5 M ソルビトールを含む 0.2 M
じていると考えられることもフェントン反応によりヒド
5）
ロキシルラジカルを生じることも報告された。我々は今
リン酸緩衝液（pH 7.4）4 ml に懸濁し，2.5 ml のトルエン
回デフェリプロンの作用を検討し，アコニターゼの失活は
を加えた。43 ℃で 2.5 分間加温後，遠心分離によって上清
を除き，0.5 M ソルビトールを含む 50 mM トリス・塩酸
CH3
緩衝液（pH 7.1）4 ml に懸濁した（以後この懸濁液を酵母
CH3
200 mg/ml とする）
。これによって酵母は透過性を増しア
コニターゼ活性を細胞そのまま（in situ）で測定できるよ
5）
うになる｡
アコニターゼの失活
Deferiprone
Maltol
Kojic acid
上記の透過性パン酵母懸濁液 50 μl を 50 μM FeSO4，各
Fig. 1 Hydroxyketone compounds with pyridine or pyrane ring
濃度のヒドロキシケトン化合物，1 mM アジ化ナトリウム
所在地：愛知県長久手市岩作雁又 1 番地 1 （〒480-1195）
＊
― 32 ―
（カタラーゼを阻害）あるいは 1 mM KCN（Cu/ZnSOD，
リウムまたは 2 価鉄を加えてもアコニターゼの活性には
シトクロムオキシダーゼを阻害）を含む 40 mM トリス・
まったく影響がなく，鉄とアジ化ナトリウムの両方を加え
塩酸緩衝液（pH 7.1）0.95 ml に加えて酵母の濃度を
た時にのみアコニターゼは失活したことからデフェリプロ
10 mg/ml とし 37 ℃にて 10 分間加温後，800 × g にて 5 分
ン鉄複合体が過酸化水素を生成してアコニターゼを失活さ
間遠心し，沈殿した酵母を 40 μl の 0.5 M ソルビトールを
せたと結論できる。デフェリプロンによる失活はシアンの
含む 50 mM トリス・塩酸緩衝液（pH 7.1）に懸濁した。
添加による影響を受けなかった（data not shown）。比較
これをアコニターゼ活性の測定に用いた。
のため 2.5 mM マルトールとコウジ酸の失活効果も示す。
これらの化合物は 2 mM 以上の高濃度を加え，かつ 1 mM
アコニターゼ活性の測定
シアン化カリウムの存在下でのみ効果があった。マルトー
上記の酵母懸濁液 5 μl を 5 mM クエン酸，0.25 mM NADP，
ルとコウジ酸はほとんど同程度の失活効果を示した。以前
4 mM MgCl2，10 mU/ml NADP-イソクエン酸脱水素酵素
1 mM 以下の低濃度マルトールによる活性酸素生成とアコ
を含む 0.1 M トリス・塩酸緩衝液（pH 7.8）1 ml に加えて
ニターゼの失活を報告したが
Aconitase (μmol/min/g)
混合し，分光光度計を用いて 340 nm の吸光度増加を 2 分
間測定しこの時の酵母濃度を 1 mg/ml として反応速度を
算出した。
二価鉄イオンの自動酸化
0.1 mM の FeSO4 と各濃度のヒドロキシケトン化合物を
含む 10 mM トリス・塩酸緩衝液（pH 7.0）2 ml 中で 37℃
に加温し，この溶液 0.2 ml を各時間毎にマイクロプレー
1, 2）
，コウジ酸も 2 mM 以上
6
NS vs none
4
p<0.01 vs 0.1mM
2
p<0.01 vs 0.2mM
ト上で 1 mM バソフェナンスロリンジスルフォン酸 0.1 ml
と反応させて，540 nm の吸光度をマイクロプレートリー
6）
ダーにて測定した。
0
0
0.2
結果
0.4
deferiprone (mM)
パン酵母アコニターゼに対するデフェリプロンの効果を
Fig. 2 に示す。デフェリプロン単独でもそこへアジ化ナト
Fig. 3 Eﬀect of various concentrations of deferiprone on the
activity of aconitase in baker s yeast. Experimental conditions were similar to those described in Fig. 2
Aconitase activity (μmol/min/g)
0
3
6
None*
1
NS vs None
0.5 mM Deferiprone(A)
NS vs A
A/0.5 mM NaN3
A/50 μM FeSO4(B)
NS vs A
P < 0.001 vs B
A/NaN3/FeSO4(C)
P < 0.01 vs C
2.5 mM Maltol/KCN(D)*
P < 0.05 vs D
2.5 mM Kojic acid/KCN*
Fig. 2 Eﬀect of deferiprone, malltol and kojic aicd on the activity of aconitase in baker s yeast. Yeast cells were permeabilized
3)
according to the method reported previously . Permeabilized yeast cells (10 mg/ml) were mixed with compounds
indicated in 40 mM Tris-HCl (pH 7.1). After incubation at 37 ℃ for 10 min, cells were collected by centrifugation at
800×g for 5 min and suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.1) containing 0.5 M sorbitol at the concentration of 200 mg/ml.
Aconitase activity was determined by the coupling with NADP-isocitrate dehydrogenase, and the reaction mixture
contained 5 mM citrate, 0.25 mM NADP, 4 mM MgCl2, 10 mU/ml of NADP-isocitrate dehydrogenase and 1 mg/ml of
yeast. The increase in the absorbance at 340 nm was recorded. *, 50 μM FeSO4 and 0.5 mM NaN3 added.
― 33 ―
れば，組織に対して活性酸素による酸化障害を来たす可能
性を考慮する必要があると思われる。
Fe2+(mM)
0.1
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0
0
20
Time (min)
19 : 253-257
40
2）Murakami K, Ishida K, Watakabe K, Tsubouchi R,
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Fig. 4 Eﬀect of deferiprone, maltol and kojic aicd on the auto2+
oxidation of Fe . FeSO 4 of 0.1 mM was incubated in
10 mM Tris-HCl (pH 7.0) at 37℃. Aliquot of 0.2 ml was
mixed with 0.1 ml of 1 mM bathophenanthroline disulfonate at the indicated time and the absorbance at 540 nm
was recorded by microplate reader. ◆, no addition ; ○,
0.1 mM deferiprone; □, 0.2 mM maltol; ▲, 0.2 mM kojic
acid; added.
apoptosis in HL60 cells: Participation of reactive oxygen species (2006) Toxicology Lett. 161 : 102-107
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ed pro-oxidant activity of deferiprone in β-thalasemia.
なった。
Free radical res. 43 : 485-491
デフェリプロンによるアコニターゼ失活の濃度依存性を
5）Devanur LD, Neubert H, Hider RC (2008) The fenton
activity of iron(III) in the presence of deferiprone. J
示す（Fig. 3）
。失活には 0.2 mM 以上の濃度が必要である。
Pharm Sci. 97:1454-67
ヒドロキシケトン化合物は二価鉄イオンの自動酸化を促
進した（Fig. 4）
。ピラン環，ピリジン環を有するヒドロ
6）Murakami K, Nagura H, Yoshino M (1980) Permeabili-
キシケトン化合物が鉄イオンを結合して酸素との反応を促
zation of yeast cells: Application to study on the regu-
進することが推測された。
lation of AMP deaminase activity in situ. Anal Biochem 105 : 407-413
考察
7）Yoshino M, Murakami K (1998) Interaction of iron
with polyphenolic compounds: Application to antioxi-
以上の結果からヒドロキシケトン化合物と鉄の複合体は
酸素との反応性を増すことにより活性酸素を生成してアコ
ニターゼを失活させることが示された。これらの化合物の
細胞毒性は鉄との反応によって生じる活性酸素によるもの
と推測される。同じヒドロキシケトン化合物であってもピ
リジン環のデフェリプロンはピラン環のマルトールより強
力な活性酸素生成能を示すことが明らかになった。
ピリジン環を持つヒドロキシケトン化合物であるデフェ
リプロンは強力な鉄のキレーターとして鉄の吸収を阻害す
る働きを持ち，従来フリードライヒ失調症や地中海貧血の
治療薬に用いられている。その副作用として活性中心に鉄
を持つアコニターゼの鉄を結合・除去することによって本
酵素を失活させ好気代謝を抑制する可能性が報告されたが，
今回の結果からデフェリプロンのアコニターゼに対する作
用は鉄との複合体形成による活性酸素生成に基づくものと
推測された。これらの疾患は遺伝性であり，症状の進行を
阻止できても治癒は期待できない。従って治療薬剤は長期
に渡って使用することになり，その場合多少でも吸収され
― 34 ―
dant characterization. Anal Biochem 257 : 40-44
Trace Nutrients Research 28 : 35−39（2011）
原著
Direct visualization of capsaicin and vanillylamine in
Capsicum fruit with laser fluorometric imaging
1）
1）
2）
1）
, 3）
,†
Hideo SUZUKI , Mari OHTA , Tatsuo WATANABE and Tetsuya SUZUKI
Laboratory of Bio-Photonics, Graduate School for Creation of New Photonics Industries＊,
2）
School of Food and Nutritional Sciences, University of Shizuoka＊＊ ,
3）
National Research Centre, Faculty of Health Sciences, University of Queensland ＊＊＊
1）
Summary
Capsaicin, the pungent secondary metabolite found in fruit of the genus Capsicum, and vanillylamine, a metabolic
precursor to capsaicin, are used in the food science, pharmaceutical, medical, and forensic industries; however, a rapid
method to evaluate fruit for the presence of these two compounds is lacking. The present research describes the in
situ visualization of capsaicin and its precursor in Capsicum fruit by laser-induced ﬂuorescence imaging and spectrometry.
When excited by ultraviolet lasers at 266 nm, capsaicin and vanillylamine have peak ﬂuorescence emissions at 310 nm.
The ﬂuorescence spectra of precursors of capsaicin and analogs, i.e., trans-caﬀeic acid, trans-ferulic acid, trans-para-coumaric acid, vanillyl alcohol, vanillin, vanillic acid, had diﬀerent peaks than those of capsaicin and vanillylamine. The localization of capsaicin and its immediate precursor, vanillylamine, was imaged with an ultraviolet-sensitive camera after
excitation with a laser at 266 nm. Fluorescence images detected at 310 nm showed the localization of capsaicinoid and/
or vanillylamine on the surface of placenta and septa of Capsicum fruits. No ﬂuorescence speciﬁc to capsaicin and vanillylamine was observed in seeds or pericarp. Both bell pepper and sweet pepper also showed 310 nm ﬂuorescence on the
placental surface, suggesting the accumulation of vanillylamine in the placenta. Laser-induced imaging shows considerable promise as a suitable technique for rapidly screening Capsicum fruit for their capsaicin and vanillylamine contents.
Introduction
has revealed extremely important roles in human neuro5）
biology . Capsaicinoids raise the heart rate, perspiration,
Spices are essential for adding color, ﬂavor and variety
and stimulate the release of endorphins.
The thermo-
to our daily meals. In particular, red hot peppers (C. ann-
genic eﬀect of capsaicinoids in assisting the prevention of
uum, C. frutescence, C. chinense, C. pubescens and C. baccatum)
a particular metabolic syndrome is well known ; namely,
have greatly contributed to our diet along with black
a study reported in 2008
pepper
1, 2）
. Red hot pepper is rich in vitamin C, provita3）
6）
7）
that capsaicin alters energy
utilization produced from ATP. Anticancer and apoptotic
8, 9）
min A, and B vitamins . The pungent principle of red
eﬀects of capsaicin have been reported
hot pepper, capsaicin (8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide)
co-carcinogenic activity of capsaicin has been reported,
and its analogs, i.e., dihydrocapsaicin (N- (4-Hydroxy-
as well . In spite of such a negative report, the impor-
3-methoxybenzyl)-8-methylnonanamide), nordihydrocapsa-
tance of hot red pepper as a spice has not been dimin-
icin (N- (4-Hydroxy-3-methoxybenzyl) -7-methyloctanamide),
ished.
; however, the
10）
homocapsaicin ((3E)-N-(4-Hydroxy-3-methoxybenzyl)-9-
A constant supply of high quality Capsicum fruits is nec-
methyldec-7-enamide) and homodihydrocapsaicin (N-
essary for the food science industry and the pharmaceuti-
(4-Hydroxy-3-methoxybenzyl)-9-methyldecanamide), are
cal, medical, and forensic industries .
not essential micronutrients; however, the pungent com-
have been made to breed new and improved Capsicum
pound plays an essential role in enhancing appetite, and
species with higher Scoville heat units, an organoleptic
4）
stimulating the secretion of gastric juices . Recent research on capsaicinoids, i.e. capsaicin and its analogs,
5）
11）
Continual efforts
measure of capsacinoid content often determined by a
taste panel. Sensory evaluation is time consuming and
Address：Kurematsu, West-Ward, Hamamatsu, Shizuoka, Japan
Address：Yada, Suruga-Ward, Shizuoka, Shizuoka, Japan
＊＊＊ Address：39 Kessels Road., Coopers Plains, Brisbane, Queensland, Australia
† To whom all correspondence should be mailed. E-mail: [email protected]
＊
＊＊
― 35 ―
often depends on the sensitivity of individual tasters. For
study is based on the observation that excitation of cap-
qualitative analysis of capsaicinoids, thin-layer chromatog-
saicinoids with ultraviolet light at 277 nm gives a ﬂuores-
raphy (TLC) has been the most popular method
12, 13）
;
18, 19）
cence emission in the UV-B region at 330 nm
. We as-
however, TLC requires extraction, concentration, and
sumed that the ﬂuorescence emission of capsaicinoids in
then a lengthy chromatographic process including sam-
the UV-B region must be derived from 8-methyl-6-
ple application, development in the glass chamber, dry-
vanillyl moieties. Therefore, capsaicin and probably the
ing, and ﬁnally visualization with an appropriate color re-
immediate precursor vanillylamine either should yield
agent such as 2,6-dichlorochinonechloroimide
13, 14）
. For
the same spectral peak. In our system, we introduced a
more precise quantitative analysis of capsaicin and ana-
digital UV camera in place of a HPLC detector to pres-
logues, gas chromatography-mass spectrometry, high per-
ent the location of capsaicinoid as images on a display.
formance liquid chromatography, and high-performance
The imaging system used in this study is composed of a
liquid chromatography-mass spectrometry have been
laser light source for UV light irradiation, a UV ﬂuores-
15-17）
used
cence detection camera, and a UV spectrophotometer as
.
Direct observation of the localized distribution of cap-
shown in Fig. 1.
saicin and vanillylamine in Capsicum fruit without preliminary treatment will save time and money. By taking ad-
Individual hardware used in the experiment is as de-
vantage of modern imaging technology with an ultraviolet
scribed below:
laser and a digital UV camera system, we directly and
Laser light source: OPO (optical parametric oscillator)
qualitatively visualized the location of capsaicin and its
(Hamamatsu Photonics, Japan) for fluorescence spectro-
immediate precursor, vanillylamine, in Capsicum fruit.
photometric analysis. Nd: YAG laser (Hamamatsu Photonics, Japan) for ﬂuorescence imaging.
Materials and Methods
Emission ﬂuorescence detector (UV-camera): UV-CCD
camera (Hamamatsu Photonics, Japan)
1. Principles of the imaging system
UV spectrophotometer: Multi-channel spectrometer
The basic principle of the imaging system used in this
(Hamamatsu Photonics, Japan)
Fig. 1. Schematic outline of the UV laser ﬂuorescence imaging system
th
The imaging system is composed of four parts: i.e., (A) laser light source section using a Nd: YAG laser (1064 nm, 7 ns, 30 Hz), 4 harmonic frequency radio wave generator, (B) specimen stage, (C) multichannel spectrometer, and (D) ﬂuorescence imaging camera using
a CCD camera equipped with CCD control gain contrast.
― 36 ―
2. Materials provided for the analysis
Prior to taking in situ images of capsaicinoids in Capsicum fruits, UV ﬂuorescence spectra of authentic samples
of compounds involved in capsaicinoid synthesis and related compounds taken.
Authentic samples were as follows: capsaicin and
vanillylamine-HCl salt (reagent grade) were purchased
®
from Sigma-Aldrich ; guaranteed reagent grade precursors of capsaicinoid, L-phenylalanine, L-tyrosine, trans-ferulic acid, trans-caffeic acid, p-coumaric acid, and vanillin,
vanillic alcohol, and vanillic acid were purchased from
®
Nacalai Tesque Co. , Kyoto, Japan. Capsaicin was used
as an ethanol solution, and other authentic standards
were used as aqueous solutions.
Red hot pepper (Capsicum annuum var. annuum cv. Yat-
Fig. 2. UV ﬂuorescence spectra of capsaicin and related compounds
UV ﬂuorescence spectra of capsaicin and its precursors.
The excitation wavelength was 266 nm. Spectra for authentic samples of (1) trans-p-coumaric acid, (2) ferulic acid, (3) vanillylamine, (4)
vanillin and (5) capsaicin were taken.
subusa) was purchased from a commercial market in
Hamamatsu in September 2010. Fresh bell pepper (Capsicum annuum var. annuum cv. Paprika) and fresh sweet pepper (Capsicum annuum var. annuum) were purchased from
ﬂuorescence maximum at 310 nm. Capsaicin s immediate
a commercial market in Hamamatsu in October 2010.
precursor, vanillylamine, also showed a ﬂuorescence max-
Red hot pepper fruits (cv. Yatsubusa) were collected im-
imum at the same wavelength. Fluorescence maxima of
mediately before each experiment, and cut into longitudi-
the three other precursors were at distinctively diﬀerent
nal or cross sections with a sharp scalpel. For both the
wavelength regions. Phenylalanine and trans-caﬀeic acid
bell pepper and sweet pepper, fruits were cut open im-
both showed different fluorescence maxima (data not
mediately before ﬂuorometric analysis.
shown). As we predicted, the fluorescence maxima of
capsaicinoids should be attributed to the 8-methyl-N-
3. Fluoro-spectrophotometric analysis of capsaicin,
vanillyl moieties, because the ﬂuorescence maximum of
its precursors and related vanillyl-compounds
vanillylamine (8-methyl-N-vanillylamine) completely coin-
Firstly, ﬂuorescence spectra for capsaicin, its precur-
cided at 310 nm. On the other hand, those of vanillin, va-
sors and related vanillyl-compounds were taken. Each
nillic acid, and vanillyl alcohol did not coincide in spite of
sample (10 20 micro-liters) was placed on the sample
similar structures, a result that also strongly indicates
stage, and entirely irradiated by the UV-C (270 nm) beam
the amine moiety is responsible for the fluorescence
spot. The ﬂuorescence spectrum of the sample was mea-
maximum at 310 nm.
sured immediately after the sample was placed on the
2. Imaging of capsaicin and/or vanillylamine in Capsicum
stage.
fruits
4. Imaging of capsaicin and vanillylamine in Capsi-
Fig. 3 and Fig. 4 show ﬂuorescence images of hot red
cum fruit with a UV-camera
pepper, Capsicum annuum var. annuum cv. Yatsubusa and bell
Secondly, after recording the fluorescence spectra of
pepper (Capsicum annuum cv. Paprica), respectively. The
capsaicin, its precursors and vanillyl-compounds, red hot
bright white zone observed with red hot pepper corre-
pepper fruits were cut longitudinally or in cross section
sponds to the placenta and septum tissue, whereas no
and placed on the sample stage. The fruits were exposed
bright ﬂuorescence was observed for pericarp tissues or
to UV-C (266 nm) light and the ﬂuorescence images were
seeds. Since capsaicin is known to localize in placental
recorded within a few minutes by the UV camera.
tissues
20-22）
, our results were in coincidence with our pre-
vious reports. HPLC analysis of capsaicin and vanillylamine in the Capsicum fruits conﬁrmed the localization of
Results and Discussion
capsaicin and its precursor vanillylamine was localized in
1. Fluorometric spectra of capsaicin and four of its ma-
the septa and placenta (data not shown).
jor precursors are shown in Fig. 2. Capsaicin showed a
― 37 ―
Although preliminary our data show that capsaicin
Acknowledgements
The authors are grateful to the Systems Division of
Hamamatsu Photonics for assisting with spectrophotometric devices and UV-camera.
Authors are also grateful to Dr. Masumi WatanabeTakebe, the Central Research Laboratory of Hamamatsu
Photonics for her technical assistance.
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Upper left: longitudinal sections of Capsicum fruit.
Upper right: UV ﬂuorescence image of the longitudinal section
shown in .
Lower left: cross section of Capsicum fruit.
Lower right: UV fluorescence image of the cross section
shown in .
Note the faint white ﬂuorescence corresponding to the placenta.
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Fig. 4. UV ﬂuorescence images of green bell pepper (Sample 501)
and red bell pepper (Sample 502)
Upper left; green bell pepper cross section.
Upper right; red bell pepper cross-section.
Lower left; UV ﬂuorescence image of the sample used for the upper left photograph (Sample 501).
Lower right; UV ﬂuorescence image of the sample used for the upper right photograph (Sample 502).
Journal of Biological Chemistry 283 (31) : 21418‒21426.
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rectly visualized in Capsicum fruit; however, the data
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present in this paper are qualitative. We are now inves-
by reactive oxygen species. Cancer Res. 64 : 1071 1078.
tigating ways to obtain semi-quantitative data. Hopefully,
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Trace Nutrients Research 28 : 40−44（2011）
原著
カキ抽出エキスパウダーの安全性および機能性に関する報告
1）
西堀頼史，鈴木陽子 1），岸浪昌礼 1），藤澤紘 1），
2）
2）
永岡茂樹 1），山崎則之 1），松井博之，松田芳和
＊
1）
2）
（株式会社新薬開発研究所，日本クリニック株式会社中央研究所
＊＊
）
Study of Safety and Functionality in Oyster Extract Powder
1）
1）
1）
1）
Yorifumi NISHIHORI , Yoko SUZUKI , Masahiro KISHINAMI , Hiro FUJISAWA ,
1）
1）
2）
2）
Shigeki NAGAOKA , Noriyuki YAMAZAKI , Hiroyuki MATSUI and Yoshikazu MATSUDA
1）
New Drug Development Research Center, Inc.
2）
Central Research Institute, Japan Clinic Co., Ltd.
Summary
Oyster is an old worldwide food containing abundant nutritional elements including many kinds of minerals such as
zinc, nucleic acid, glycogen, and amino acids. It is reported that Oyster Extract Powder exhibits several physiological
activities including anti-platelet aggregation eﬀect in human and experimental animals. Recently, possible interaction between medical drugs and health foods has attracted the public attention, and in some health foods, occurrence of drug
interaction is reported by concomitant ingestion with medical drugs. This time, we investigated the safety and possible
drug interaction of Oyster Extract Powder in rabbits and rats.
Safety assessment by a 90 days repeated oral dose toxicity study in rats revealed no signiﬁcant toxic eﬀects of Oyster Extract Powder. Possible drug interaction was investigated with anti-platelet aggregation drugs including aspirin
and ticlopidine, and anti-blood coagulation drug, warfarin, and no interaction was observed with any drugs. From these
results, it was conﬁrmed that Oyster Extract Powder is a safety health food showing no possible drug interaction with
anti-platelet aggregation and anti-blood coagulation drugs.
In addition, glutathione level in hippocampus was analyzed since it was reported that Oyster Extract Powder increased glutathione levels. Then, signiﬁcant increase in total glutathione level in hippocampus was noticed by administration of Oyster Extract Powder.
カキは，種々の生体への有効性，機能性が報告されてい
いて検討を行った。安全性試験としては，ラットを用いて
る。カキを原材料としたカキ抽出エキスパウダー（日本ク
90 日間反復投与により検討を行った。医薬品との相互作
リニック株式会社）は，5 -AMP，cAMP，イノシンなど
用については，血小板凝集抑制薬であるアスピリン及びチ
の核酸関連物質及びミネラルを含有し，ラットを用いた検
クロピジン，血液凝固抑制薬であるワルファリンを用いて
1）
2）
討，ヒトを用いた検討で，いずれも血小板凝集抑制作
検討を行った。
また，前骨髄性白血病細胞 HL60 を用いた in vitro での
用を有することが報告されている。
近年，医薬品と健康食品の併用による相互作用が注目さ
検討により，カキ抽出エキスの添加により濃度依存的に細
れており，一部の健康食品では，医薬品との併用による相
胞内グルタチオン含量が増加すること，ヒトを用いた検討
互作用の発現が報告されている。グレープフルーツジュー
において，カキ抽出エキス摂取により，血中グルタチオン
ス，セントジョーンズワート，イチョウ葉エキスなどの健
が増加することが報告されている
康食品と医薬品との併用により，医薬品の効果が増強ある
ら，今回，ラットにカキ抽出エキスパウダーを投与した際
3）
いは減弱されることはよく知られている。
4 - 6）
。このようなことか
の，海馬グルタチオン含量について検討を行った。
以上のことより，今回，カキ抽出エキスパウダーについ
て，安全性ならびに医薬品との相互作用について動物を用
所在地：北海道恵庭市戸磯452-1（〒061-1405）
所在地：京都市右京区太秦開日町10-1（〒616-8555）
＊
＊＊
― 40 ―
実験方法
3．海馬のグルタチオン含量の検討
前述の 2.2 血液凝固抑制薬との相互作用の試験の，採血
1．カキ抽出エキスパウダーのラットにおける 90 日間反復
後の動物を用いて実施した。採血後に速やかに冷却下で海
馬を摘出し重量を測定した。グルタチオン量は，Total
経口投与毒性試験
カキ抽出エキスパウダー含有食品の安全性評価の一環と
して，カキ抽出エキスパウダーを 90 日間反復経口投与し
Glutathione Quantiﬁcation Kit（㈱同仁化学研究所）を用
いて測定した。
たときの毒性についてラットを用いて検討した。
実験結果
投与開始時 5 週齢の Crl:CD(SD)（SPF）ラット雌雄を
用いた。雌雄各 6 匹で媒体（注射用水），カキ抽出エキス
パウダーを 1000 及び 2000 mg/kg/day の投与量で，90 日
1．カキ抽出エキスパウダーのラットにおける 90 日間反復
間反復経口投与した。安全性の評価は一般状態観察，体重
経口投与毒性試験
推移，摂餌量，尿及び血液検査，臓器重量，病理解剖学的
いずれの群においても死亡例は認められなかった。
及び病理組織学的検査を指標に行った。
一般状態観察，体重推移，摂餌量及び臓器重量では，カ
キ抽出エキスパウダー投与による影響を示唆する変化は認
2．医薬品との相互作用の検討
められなかった。
2.1 血小板凝集抑制薬との相互作用
尿，血液検査，病理解剖学的及び組織学的検査について
カキ抽出エキスパウダーと血小板凝集抑制薬のアスピリ
ンあるいはチクロピジンとの相互作用について，ウサギを
は，カキ抽出エキスパウダー投与による影響を示唆する変
化は認められなかった。
用いて確認を行った。
10 ∼ 13 週齢の Kbs:JW（Healthy）雄性ウサギを用いた。 2．医薬品との相互作用の検討
ウサギに媒体（注射用水）あるいはカキ抽出エキスパウ
2.1 血小板凝集抑制薬との相互作用
ダーを，1 日 1 回 7 日間経口投与を行った。投与 7 日目の
アスピリンとの併用試験では，コラーゲン及びアラキド
カキ抽出エキスパウダーの投与 30 分後に，血小板凝集抑
ン酸による凝集は，いずれもアスピリン投与前値を 100 %
制薬（アスピリンあるいはチクロピジン）を経口投与した。
とした時の凝集率の変化は，投与後 30 分及び 3 時間に A
血小板凝集抑制薬の投与前及び投与後 30 分並びに 3 時間
群と比較してアスピリン単独投与の B 群は有意な低値を示
後に採血を行い血小板凝集率の測定を行った。得られた凝
した。B 群と比較してカキ抽出エキスパウダーを併用した
集率及び投与前値を 100 %とした時の変化で評価を行った。 C 及び D 群では，統計学的な差は認められなかった（Fig. 1）
。
凝集惹起物質として，アスピリン投与の場合は，コラーゲ
チクロピジンとの併用試験では，ADP 及びトロンビン
ン及びアラキドン酸，チクロピジン投与の場合は，ADP
による凝集は，いずれもチクロピジン投与前値を 100 %と
及びトロンビンを用いた。群構成は，対照群，血小板凝集
した時の変化において，投与後 30 分及び 3 時間に A 群と
抑制薬単独投与群，血小板凝集抑制薬及びカキ抽出エキ
比較してアスピリン単独投与の B 群は有意な低値を示し
スパウダー併用群として，カキ抽出エキスパウダーは 2 用
た。B 群と比較してカキ抽出エキスパウダーを併用した C
量設定した。投与量は，アスピリンは 50 mg/kg，チクロ
及び D 群では，統計学的な差は認められなかった（Fig. 2）
。
ピジンは 100 mg/kg，カキ抽出エキスパウダーは 200 及
び 500 mg/kg とした。
2.2 血液凝固抑制薬との相互作用
2.2 血液凝固抑制薬との相互作用
び活性化部分トロンボプラスチン時間共に，A 群と比較
ワルファリンとの併用試験では，プロトロンビン時間及
カキ抽出エキスパウダーと血液凝固抑制薬のワルファリ
してワルファリンの B 群は有意な延長を示した。B 群と
ンとの相互作用について，ラットを用いて確認を行った。
6 週齢の Crl : CD(SD)（SPF）雄性ラットを用いた。ラッ
比較してカキ抽出エキスパウダーを併用した C 及び D 群
では，統計学的な差は認められなかった（Fig. 3）
。
トに媒体（注射用水）あるいはカキ抽出エキスパウダーを，
1 日 1 回 7 日間経口投与を行った。投与 6 日目のカキ抽出
3．海馬のグルタチオン含量の検討
エキスパウダーの投与 30 分後に，血液凝固抑制薬（ワル
海馬の総グルタチオン量の測定において，カキ抽出エキ
ファリン）を経口投与した。ワルファリンの投与 24 時間
スパウダーを投与していない A 及び B 群と比較して，カ
後に採血を行い，プロトロンビン時間及び活性化部分トロ
キ抽出エキスパウダーを投与した C 及び D 群は，有意な
ンボプラスチン時間を測定した。群構成は，対照群，血液
増加が認められた（Fig. 4）
。
凝固抑制薬単独投与群，血液凝固抑制薬及びカキ抽出エ
キスパウダー併用群として，カキ抽出エキスパウダーは 2
用量設定した。投与量は，ワルファリンは 1 mg/kg，カキ
抽出エキスパウダーは 200 及び 500 mg/kg とした。
― 41 ―
120
Fig.1-A
100
100
80
**
60
40
‫ې‬
‫۔‬
‫ڷ‬
‫ڦ‬
20
**
A㸯Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡 Aspirin 0 mg/kg
B㸯 Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡 Aspirin 50 mg/kg
C㸯 Oyster Extract Powder 200 mg/kg㸡 Aspirin 50 mg/kg
D㸯Oyster Extract Powder 500 mg/kg㸡 Aspirin 50 mg/kg
Ratio of change (%)
Ratio of change (%)
Fig.1-B
120
80
60
40
A㸯Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡 Aspirin 0 mg/kg
B㸯 Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡 Aspirin 50 mg/kg
C㸯 Oyster Extract Powder 200 mg/kg㸡 Aspirin 50 mg/kg
D㸯Oyster Extract Powder 500 mg/kg㸡 Aspirin 50 mg/kg
‫ې‬
‫۔‬
‫ڷ‬
‫ڦ‬
20
**
**
0
0
0
0.5
1.5
1
2
2.5
3
0
0.5
Time after administration 㸝hr㸞
1.5
1
2
2.5
3
Time after administration 㸝hr㸞
Fig. 1 Eﬀects of Oyster Extract Powder and Aspirin on the platelet aggregation in rabbits.
Fig.1-A) Collagen 16 µg/mL aggregation time course
Fig.1-B) Arachidonic acid 75 µg/mL aggregation time course
Data are expressed as mean ± S.E. of 6 rabbits. ** p < 0.01 A vs B by student t-test
Fig.2-A
Fig.2-B
120
100
Ratio of change (%)
Ratio of change (%)
120
80
*
60
100
*
80
60
40
40
**
‫ې‬
‫۔‬
‫ڷ‬
‫ڦ‬
20
A㸯Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡 Ticlopidine 0 mg/kg
B㸯 Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡 Ticlopidine 100 mg/kg
C㸯 Oyster Extract Powder 200 mg/kg㸡 Ticlopidine 100 mg/kg
D㸯Oyster Extract Powder 500 mg/kg㸡 Ticlopidine 100 mg/kg
0
0
0
0.5
1.5
1
2
2.5
‫ې‬
‫۔‬
‫ڷ‬
‫ڦ‬
20
3
0
A㸯Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡 Ticlopidine 0 mg/kg
B㸯 Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡 Ticlopidine 100 mg/kg
C㸯 Oyster Extract Powder 200 mg/kg㸡 Ticlopidine 100 mg/kg
D㸯Oyster Extract Powder 500 mg/kg㸡 Ticlopidine 100 mg/kg
0.5
Time after administration 㸝hr㸞
1.5
1
2
2.5
Time after administration 㸝hr㸞
Fig. 2 Eﬀect of Oyster Extract Powder and Ticlopidine on the platelet aggregation in rabbits.
Fig.2-A) ADP 16 µmol/L aggregation time course
Fig.2-B) Thrombin 0.5 U/mL aggregation time course
Data are expressed as mean ± S.E. of 6 rabbits. * p < 0.05, ** p < 0.01 A vs B by student t-test
35
50
Fig.3-A
45
30
**
**
25
40
35
Time (sec)
Time (sec)
Fig.3-B
30
25
20
15
20
10
15
10
5
5
0
0
A㸯
B㸯
C㸯
D㸯
Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡
Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡
Oyster Extract Powder 200 mg/kg㸡
Oyster Extract Powder 500 mg/kg㸡
Warfarin 0 mg/kg
Warfarin 1 mg/kg
Warfarin 1 mg/kg
Warfarin 1 mg/kg
A㸯
B㸯
C㸯
D㸯
Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡
Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡
Oyster Extract Powder 200 mg/kg㸡
Oyster Extract Powder 500 mg/kg㸡
Warfarin 0 mg/kg
Warfarin 1 mg/kg
Warfarin 1 mg/kg
Warfarin 1 mg/kg
Fig. 3 Eﬀects of Oyster Extract Powder and Warfarin on blood coagulation in rats.
Fig.3-A) Prothrombin time
Fig.3-B) Activated partial thromboplastin time
Data are expressed as mean ± S.E. of 10 rats. ** p < 0.01 A vs B by student t-test
― 42 ―
3
4.00
**㸡##
Glutathione (μmol / g tissue)
3.50
**㸡##
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
A㸯
B㸯
C㸯
D㸯
Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡
Oyster Extract Powder 0 mg/kg㸡
Oyster Extract Powder 200 mg/kg㸡
Oyster Extract Powder 500 mg/kg㸡
Warfarin 0 mg/kg
Warfarin 1 mg/kg
Warfarin 1 mg/kg
Warfarin 1 mg/kg
Fig. 4 Eﬀects of Oyster Extract Powder and Warfarin on hippocampal glutathione in rats.
Data are expressed as mean ± S.E. of 10 rats.
##
p < 0.01 vs B by Dunnett multiple comparison test.
** p < 0.01 vs A by student t-test
考察
ADP 受容体 P2Y12 と共役する抑制性 G 蛋白質 Gi の機能
を阻害し，cAMP を増加させ，さらに，血小板内の遊離
今回試験に供したカキエキス（カキ抽出エキスパウダー，
2+
Ca 濃度を抑えることにより，各種血小板凝集因子によ
日本クリニック㈱）は，独自の製法でカキのエキスを抽出
る凝集反応を抑制することが知られている。今回，ウサギ
し，製品化されたものである。本製品の特徴は，瀬戸内，
を用いて，血小板凝集抑制作用を指標に相互作用の有無に
主に広島で収穫された生牡蠣を使用し，日本クリニック㈱
ついての確認を行った。凝集惹起剤としては，アスピリン
独自の製法である，湯煎抽出法により，最も有効性の高い
については，コラーゲン及びアラキドン酸，チクロピジン
エキスを使用した製品である。
については，ADP 及びトロンビンを使用した。ヒト血液
以上より，今回，カキ抽出エキスパウダーの安全性，医
薬品との相互作用及び機能性についての検討を行った。
を用いた血小板凝集抑制作用の検討に汎用されるアドレナ
リンについては，ウサギ血小板ではアドレナリンによる血
9）
ラットを用いた 90 日間反復投与による安全性の評価で
小板凝集は惹起されないことから，アドレナリンは使用
は，カキ抽出エキスパウダー投与による影響を示唆する変
しなかった。以上により検討を行った結果，カキ抽出エキ
化は認められなかった。今回の検討より，無毒性量は，雌
スパウダーの併用は，アスピリンあるいはチクロピジンの
雄共に 2000 mg/kg/day（ヒトの推奨量の 120 倍）を超え
血小板凝集抑制作用に影響を与えず，相互作用は示さない
るものと推察された。また，カキエキスの安全性に関する
ことが確認された。なお，今回用いたカキ抽出エキスパウ
報告では，細菌を用いた復帰突然変異試験においても陰性
ダーの投与量は，ヒト推奨量の 12 及び 30 倍であり，相互
7）
の結果が得られており，マウスを用いた催奇形性試験に
作用を評価するに十分な投与量であると考えられる。
ワルファリンは，血栓塞栓症の治療・予防に処方されて
おいても催奇形性は認められないという報告がなされてい
8）
いる抗凝固薬であり，血液凝固に働くビタミン K に拮抗
る。
次に，医薬品との相互作用についての検討を行った。カ
1）
キエキスは，ラットを用いた検討，ヒトを用いた検討
2）
することで血液凝固を抑制する。また，血漿タンパク質と
の結合率も高く，相互作用がしばしば問題とされる薬であ
で，いずれも血小板凝集抑制作用を有することが報告され
る。今回は，プロトロンビン時間及び活性化部分トロンボ
ている。したがって，血小板凝集抑制薬あるいは血液凝固
プラスチン時間を指標に，ワルファリンとの相互作用につ
抑制薬との併用により，相互作用の発現が懸念される。こ
いての検討を行った。その結果，カキ抽出エキスパウダー
れらのことより，今回，血小板凝集抑制薬としては，アス
の併用は，ワルファリンの血液凝固抑制作用に影響を与え
ピリン及びチクロピジン，血液凝固抑制薬としてはワル
ず，相互作用は示さないことが確認された。
以上の結果をまとめると，カキ抽出エキスパウダーは，
ファリンを用いて相互作用の有無についての確認を行った。
アスピリンは，アラキドン酸カスケードに関与するシク
ラットを用いた 90 日反復毒性試験において，投与による
ロオキシゲナーゼを抑制することにより血小板凝集抑制作
影響を示唆する変化は認められなかった。一方，変異原性
用を示すことが知られている。チクロピジンは，血小板の
及び催奇形性に関しては，いずれも陰性であることが報告
― 43 ―
されており，安全な食品であることが再確認された。更に，
カキ抽出エキスパウダーは，血小板凝集抑制作用を有する
物 2：265．
3）内田信也，山田静雄（2007）食品・サプリメントと医
ことが報告されているが，この作用は，血小板凝集抑制薬
及び血液凝固抑制薬との間に相互作用を示さないことが確
薬品との相互作用．ぶんせき 9：454．
4）H Tapiero, KD Tew (1996) Increased glutathion ex-
アルツハイマー病（AD）は進行性の神経変性疾患であ
pression in cells induced by Crassostera gigas extract
(JCOE). Biomed & Pharmacother 50 : 149．
り，海馬でのアミロイドβ（Aβ）やタウの凝集・蓄積に
5）L Gate, M Schltz, E Walsh, S Dhalluin, G Nguyenba,
起因する神経変性が病態に関与すると考えられている。
H Tapiero, KD Tew (1998) Impact of dietary supple-
AD の発症は酸化ストレスの増強と関連し，ビタミン E
ment of Crassostera gigas extract (JCOE) on glutathi-
などの抗酸化物質の摂取が AD の発生率を低下させると
いう疫学的研究報告がある。更に，培養神経細胞を用い
one levels and S-transferase activity in rat tissues.
In vivo 12 : 299．
た研究で，過酸化水素の暴露により，細胞内の還元型グル
6）H Tapiero, KD Tew, S Dhalluin, G Nguyenba, V
タチオン（GSH）が低下し，引き続いて細胞死が観察さ
Soupramanien, J Kouyate (1998) The antioxidant ef-
認された。
10）
11）
fects of Crassostera gigas extract (JCOE) in human
volunteers. In vivo12 : 305．
れることが報告されている。また，カキエキスは，スー
パーオキシド・ヒドロキシラジカルについて，濃度依存的
な消去作用を示し，過酸化水素による細胞障害に対しても，
12）
7）日本クリニック㈱，未発表
濃度依存的な抑制作用を示すことが報告されている。こ
8）Toshiaki Watanabe, Yoshikazu Matsuda, Takao Ohta
れらのことより，今回，カキ抽出エキスパウダーを 1 週間
and Yukio Shibata (1998) Eﬀects of Oyster Extract on
投与したラットの海馬中のグルタチオン含量の測定を行っ
た。その結果，カキ抽出エキスパウダーの投与により，海
Teratogenicity and Embryonic Development in ZincDeﬁcient Mice Trace Nutrients Research 15 : 73-8．
馬中の総グルタチオン量で有意な増加が認められた。この
9）周藤俊樹（2003）実験動物の血小板凝集能の測定法．
日本血栓止血学会誌 14（3），265 - 269.
結果は，カキ抽出エキスパウダーが，老化及び認知症の予
10）今泉和則，原英彰，伊藤芳久，田熊一敞，布村明彦
防に有用である可能性が高いことを示唆している。
（2007）神経細胞死と神経変性疾患の最先端研究．日
文献
本薬理学雑誌 130，144 - 482.
11）福島哲郎（2010）新規神経栄養因子様低分子化合物
T-817MA の薬効薬理．日本薬理学雑誌 136，11 - 14．
1）杉野徳和，太田隆男，大久保雅啓，奥村重雄，坪内凉
子，服部雅康，柴田幸雄（1986）かき成分の血小板凝
12）T Yoshikawa, Y Naito, K Masui, T Fujii, Y Boku, S
集能におよぼす影響．微量栄養素研究 3：61 - 68.
Nakagawa, N Yoshida, M Kondo (1997) Free radical-
2）大田隆男，柴田幸雄（1988）カキ抽出エキスの血小板
scavenging activity of Crassostera gigas extract (JCOE)
凝集に与える影響−核酸成分を中心として．糖尿病動
― 44 ―
Biomed & Pharmacother, 51, 328．
Trace Nutrients Research 28 : 45−48（2011）
原著
日本人成人女性ビーガンの脂肪酸摂取量
1）
2）
細見亮太，湯川法子，大儀倫子 2），吉田宗弘 2），福永健治 2）
＊
1）
＊＊
2）
（鳥取短期大学生活学科食物栄養専攻，関西大学化学生命工学部食品工学研究室）
Intake of Fatty Acids in Japanese Woman Vegans
1）
2）
2）
2）
2）
Ryota HOSOMI , Noriko YUKAWA , Noriko OGI , Munehiro YOSHIDA and Kenji FUKUNAGA
1）
Department of Food and Nutrition, Division of Human Living Sciences, Tottori College,
2）
Laboratory of Food and Nutritional sciences, Faculty of Chemistry, Materials and Bioengineering, Kansai University,
Summary
To estimate the daily intake of total lipids, saturated fatty acids, n-6 fatty acids and n-3 fatty acids in Japanese woman
vegans, 33 duplicate portion samples of daily diets were collected from 11 Japanese female vegans and their fatty acid
compositions were determined by gas chromatography after methylation with sodium methoxide. Intake of total lipid
and each fatty acid in vegan diets was as follows (mean ± SD) : total lipid ( % energy), 20.5 ± 7.9 ; saturated fatty acids
( % energy), 2.6 ± 1.0 ; n-6 fatty acids ( % energy), 4.4 ± 1.8 ; n-3 fatty acids (g/d), 1.2 ± 0.8. Compared with the tentative dietary goal for preventing lifestyle-related diseases in female aged 30 to 49 years in the Dietary References Intakes for Japanese 2010, n-6 fatty acid intake is appropriate; however the intake of saturated fatty acids and n-3 fatty
acids in vegan diets is quite low.
菜食主義者（ベジタリアン）とは，畜産業に対する倫理
アメリカでは全人口の約 3％がベジタリアン，さらに約
4）
観や穢れなどを理由にして，動物性食品を避け，穀類，豆
1％がビーガンと見積もられている。このため欧米では，
類，種実類，野菜，果物などの植物性食品を中心とした食
菜食主義の実践に伴う栄養学的諸問題の発生に対処する必
事を摂取する人をさす。ベジタリアンは，動物性食品を厳
要性から，ベジタリアンを対象とした様々な研究が行われ
格に避けるビーガン，乳製品の摂取に寛容なラクトベジタ
ている。しかし，日本では，ベジタリアンを対象とした調
リアン，卵製品の摂取に寛容なオボベジタリアン，さらに
査研究はきわめて少なく
は魚介類の摂取にまで寛容なペスコベジタリアンなどに分
した研究は見当たらない。欧米諸国と日本の食生活には違
類される。最近では，このような菜食主義が，疾病予防や
いがあることから，日本のベジタリアンの栄養素摂取は欧
健康増進のための食事スタイルのひとつとして認識されて
米諸国とは異なる可能性が高く，とくにビーガンでは，欧
いる。なかでも乳・卵製品に対して寛容なラクトオボベジ
米以上に飽和脂肪酸，高度不飽和脂肪酸などの特定の脂肪
タリアンの食事は，栄養的に十分であり，高血圧，動脈硬
酸の不足が危惧される。本研究では，日本に在住する女性
化，虚血性心疾患，糖尿病，各種ガンなどの予防と治療に
ビーガンの献立を収集して各種脂肪酸の摂取量を実測し，
1）
効果的であると報告されている。また，もっとも厳格な
5, 6）
，なかでもビーガンを対象と
脂肪酸摂取の評価を試みた。
ビーガンの食事を食事療法に応用することで，血中コレス
実験方法
テロール，血圧，体脂肪率を低下させ，脳血管疾患，肥満，
2）
糖尿病を予防・改善する効果が得られている。しかし，
動物性食品を摂取しないビーガンの食事は，食物繊維，マ
1．試料の収集
グネシウム，ビタミン C などの一部の微量栄養素の摂取
関東地方に存在する菜食者用食材販売店の協力を得て，
が比較的高くなるものの，エネルギー，飽和脂肪酸，コレ
調査の趣旨を明示した上で，調査対象者を募集した。結果
ステロール，高度不飽和脂肪酸，カルシウム，亜鉛，ビタ
として 11 名（30 ∼ 49 歳）の健康な女性ビーガンから協力
ミン D と B12 など，いくつかの栄養素の摂取不足が指摘さ
の申し出があった。これらの対象者から 3 日分の全献立，
3）
れている。
合計 33 献立を提供してもらった。収集した献立は，1 日
所在地：鳥取県倉吉市福庭854（〒682-8555）
所在地：大阪府吹田市山手町3-3-35（〒564-8680）
＊
＊＊
― 45 ―
結果と考察
分ごとにすべてを凍結乾燥後，ミル（GM200, Retsch 社
製）で均一・細粉化し，測定用試料とした。
本研究対象者の食事内容の特徴として，朝食にはパンに
2．一般成分の分析
果実，もしくは玄米飯にみそ汁・サラダの組み合わせなど
たんぱく質はケルダール窒素法，脂質は酸分解法，灰分
が多かった。昼食・夕食ではご飯やパスタといった炭水化
は 550 ℃燃焼法，水分は 105 ℃恒量法で測定した。たんぱ
物にサラダ，野菜の和え物や煮物，さらには豆乳クリーム
く質，水分，灰分，脂質以外の成分は炭水化物とみなした。
シチューといった通常食の動物性食品部分を植物性食品に
エネルギー量の計算においてはアトウォーター指数を用い
置き換えて調理したものもみられた。対象者のたんぱく質，
た。
脂質，炭水化物の摂取量は順に 56.0 ± 12.0，43.1 ± 18.7，
311 ± 66 g/d であった。平成 20 年度の国民健康・栄養調
9）
3．脂肪酸組成の分析
査成績における 30 ∼ 49 歳女性の摂取量と比較すると，
7）
試料 1 g から Bligh & Dyer 法に準じ，総脂質を抽出し
脂質が低値，炭水化物が高値を示した。
た。抽出した総脂質を約 15∼20 mg 採取し，内部標準とし
Table 1 に主要な脂肪酸の摂取量をまとめた。植物性油
てヘプタデカン酸（17 : 0）を添加した。そして，ナトリウ
脂に多く含まれるオレイン酸（18 : 1 n-9）やリノール酸
8）
ムメトキシド法により脂肪酸をメチルエステル化後，ガス
（18 : 2 n-6）の摂取量が多く，パルミチン酸（16 : 0）やス
クロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した。分析条件
テアリン酸（18 : 0）などの飽和脂肪酸の摂取量はきわめ
は以下のとおりである。装置，GC-14B（島津製作所）
；カ
て少なかった。これは植物性油脂の脂肪酸組成を反映した
ラム，Omegawax 250（30 m x 0.25 mm ID，df 0.25 µm，
ものといえる。飽和脂肪酸は，ほとんどがパルミチン酸
Supelco）
；カラム温度，120℃から 240℃（2℃/min）へ昇
（16 : 0）とステアリン酸（18 : 0）であったが，ミリスチン
温；キャリアガス，ヘリウム；流量，1.5 ml/min；検出器，
酸（14 : 0）やアラキジン酸（20 : 0）などの摂取もみられ
水素炎イオン化検出器；注入口と検出器温度，250 ℃。ク
た。n-6 系脂肪酸は，すべての献立でリノール酸が供給源
ロマトグラムにおける脂肪酸の同定は 37-Component
となっており，アラキドン酸（20 : 4 n-6）は含まれていな
FAME Mix（Supelco）
，定量は内部標準とのピーク面積
かった。n-3 系脂肪酸としては，植物性油脂に比較的多く
比を用いて行った。
含まれるα-リノレン酸（18 : 3 n-3）の摂取がほとんどで
あったが，海苔や海藻を含む献立（10 食）では，少量
Table 1. Intakes of several fatty acids（g/d）in Japanese vegan
diets（n = 33）
Fatty acids
14 :
16 :
16 :
18 :
18 :
18 :
18 :
18 :
20 :
22 :
24 :
0
0
1
0
1
1
2
3
0
0
0
n-9
n-9
n-7
n-6
n-3
Mean
SD
Minimum
0.12
3.85
0.11
1.21
15.9
0.72
9.11
1.18
0.19
0.13
0.07
0.15
1.86
0.13
0.63
9.75
0.62
3.89
0.80
0.11
0.12
0.05
0.01
1.10
0.01
0.16
2.41
0.06
1.68
0.05
0.04
0.02
0.02
Median Maximum
0.04
3.43
0.05
1.11
13.2
0.59
8.45
1.12
0.16
0.08
0.05
（5.4 mg ∼ 72.5 mg/d）のエイコサペンタエン酸（20 : 5 n-3，
EPA）の摂取がみられた。しかし，ドコサヘキサエン酸
（22 : 6 n-3，DHA）はどの献立からもほとんど検出できな
かった。
0.58
10.1
0.61
3.17
41.1
3.32
16.5
2.92
0.47
0.48
0.25
Table 2 にエネルギー，脂肪エネルギー比，飽和脂肪酸，
n-6 系および n-3 系脂肪酸の摂取量をまとめ，日本人の食
事摂取基準に示された数値
10）
と比較して示した。エネル
ギー摂取量は 1877 ± 280 kcal/d（平均±標準偏差）であ
り，平成 20 年度の国民健康・栄養調査成績における 30 ∼
9）
49 歳女性のエネルギー摂取量 1682 ± 469 kcal/d よりも
高値だった。また脂肪エネルギー比は，平均値が摂取基準
の目標量の下限に近い 20.5 ％であり，同調査における 30
Table 2. Intakes of energy, total lipids, saturated fatty acids, n-6 fatty acids and n-3 fatty acids in Japanese vegan diets（n = 33）
Mean
SD
Minimum 25 percentile
Median
75 percentile Maximum
AI*
DG**
Energy (kcal/d)
1877
280
1299
1606
1879
1959
2498
−
−
Total lipid (g/d)
43.1
18.7
10.4
27.1
39.7
Total lipid (% energy)
20.5
7.9
6.1
14.6
19.0
51.5
92.1
−
−
26.1
34.0
−
20−25
Saturated fatty acids (g/d)
5.6
2.5
1.4
4.0
Saturated fatty acids (% energy)
2.6
1.0
0.8
1.9
5.0
6.3
12.4
−
−
2.5
3.1
4.6
−
4.5−7.0
n-6 fatty acids (g/d)
9.1
3.9
1.7
n-6 fatty acids (% energy)
4.4
1.8
1.0
6.2
8.5
12.0
16.5
9
−
2.9
4.4
5.1
8.0
−
< 10
n-3 fatty acids (g/d)
1.2
0.8
0.1
0.4
1.1
1.5
2.9
−
> 1.8
9）
* Adequate intake for female aged 30 to 49 years in the Dietary References Intakes for Japanese, 2010
9）
** Tentative dietary goal for preventing life-style related diseases for female aged 30 to 49 years in the Dietary References Intakes for Japanese, 2010
― 46 ―
9）
∼ 49 歳女性の平均値（27.2 ％）よりもやや低かった。こ
はα-リノレン酸からの EPA や DHA 合成が抑制される可
のように脂肪エネルギー比はやや低いものの，エネルギー
能性が考えられる。したがって，可能ならば，ビーガンで
摂取量は一般女性をやや上回ることから，今回の対象者の
も n-3 系脂肪酸の一部は EPA や DHA として摂取するこ
エネルギー摂取量と脂肪エネルギー比に大きな問題はない
とが望ましい。亜麻仁油やしそ油は，α-リノレン酸を多
と考えられる。アメリカ在住ビーガンの脂肪エネルギー比
く含むため，調理に使用すれば n-3 系脂肪酸摂取量を増や
11）
12）
であ
すことが可能であるが，これに加えて，EPA を比較的多
ると報告されている。本研究の数値はこれらよりも明らか
く含む海苔などの海藻類を積極的に摂取することも必要だ
に低い。このことは，欧米と日本とでは，菜食主義者にお
ろう。
は 28 ∼ 33％，イギリスの女性ビーガンは 36.2 ％
以上，ビーガンの献立は，玄米，小麦製品，大豆製品が
いても，一般と同様に脂肪摂取量に大きな違いのあること
中心であるため，飽和脂肪酸と n-3 系脂肪酸の摂取が摂取
を意味している。
日本の食事摂取基準では，飽和脂肪酸に関して，摂取量
が少ない日本人の集団では脳血管疾患の増加が認められる
という報告を考慮し
13, 14）
，目標量の範囲（エネルギー比
10）
基準の目標量を満たさない可能性が高いため，これを防止
するには意識的な食材選択が必要であると述べた。しかし，
ビーガンの食事は一般人に比較して食物繊維，葉酸，抗酸
4.5 ∼ 7.0 ％）を定めている。今回のビーガンの献立にお
化物，フィトケミカルなどの含有量が高く，生活習慣病予
ける飽和脂肪酸摂取量は，ほとんどがこの目標量の下限よ
防という点では優れているという報告がある。食事摂取
りも低値だった（Table 2）
。また平成 17 年および 18 年度
基準の目標量は，生活習慣病予防の観点から定められてい
国民健康・栄養調査成績における 30 ∼ 49 歳女性の平均値
ることを考えると，これを一般人と相当異なる構成である
10）
（13.8 g/d）より低値を示した。Appleby らは，イギリス
3）
ビーガンの食事にそのまま適用することは意味がないかも
の女性ビーガンとベジタリアンの飽和脂肪酸摂取量は一般
しれない。ベジタリアン，とくにビーガンの食事について，
よりも少なく，それぞれ 7.4 ％と 14.3 ％であるが，総死亡
多くの食事成分を考慮した上で，各疾患との関連を検討す
12）
率の増加は認められないと報告している。これはビーガ
ることが期待される。
ンであっても，飽和脂肪酸摂取量が日本人と比べて高いた
参考文献
めに脳血管疾患が増加しないためだと考えられる。本研究
で対象とした日本人女性ビーガンは，ほとんどの飽和脂肪
酸摂取量が目標量の下限に達していないことから，脳血管
1）Craig WJ, Mangels AR (2009) American Dietetic As-
疾患の発生リスクが高くなる懸念がある。これを解消する
sociation. Position of the American Dietetic Associa-
には，飽和脂肪酸の多い植物性油脂を含む食品，たとえば
tion: vegetarian diets. J Am Diet Assoc 109 :
チョコレート類やヤシ油などの積極的な利用が有効と思わ
れる。
1266-1282.
2）Dewell A, Weidner G, Sumner MD, Chi CS, Ornish
n-6 系脂肪酸摂取量は，平均が 9.1 g/d であり，平成 17
D (2008) A very-low-fat vegan diet increases intake
年および 18 年度国民健康・栄養調査成績における 30 ∼
of protective dietary factors and decreases intake of
10）
pathogenic dietary factors. J Am Diet Assoc 108 :
49 歳女性の平均値（8.7 g/d），および食事摂取基準の目
10）
347-356.
安量（9 g/d）にほぼ一致していた。またエネルギー比
でみた場合も，最大値を与えた献立が 8.0 ％であり，摂取
3）Davey GK, Spencer EA, Appleby PN, Allen NE,
10）
Knox KH, Key TJ (2003) EPIC-Oxford: lifestyle char-
基準の目標量（10 ％未満）を満たしていた。
これに対して，n-3 系脂肪酸の摂取量は，平均が 1.2 g/d
acteristics and nutrient intakes in a cohort of 33 883
であり，平成 17 年および 18 年度国民健康・栄養調査成績
meat-eaters and 31 546 non meat-eaters in the UK.
10）
Public Health Nutr 6 : 259-269.
における 30 ∼ 49 歳女性の平均値（1.8 g/d）に比較して
低かった。また，75 パーセンタイル値（1.5 g/d）からわ
かるように，摂取基準の目標量である 1.8 g/d 以上
10）
4）Stahler C (2009) How many vegetarians are there?
Veg J 28 : 12-13.
を満
たす献立はきわめて少なかった。n-3 系脂肪酸の摂取が目
5）仲本桂子，渡邊早苗，工藤秀機，田中明（2008）日
標量よりも多かった献立をみると，大豆製品やアーモンド
本人中高年菜食者の栄養状態の特徴．Vegetarian Re-
など，植物性食品の中でもα-リノレン酸を多く含むもの
search 9：7-16.
を摂取していた。このように，ビーガンの食事では魚介類
6）小切間美保，小畠ゆかり，樋口寿，井奥加奈，伏木
を摂取しないため，n-3 系脂肪酸の多くはα-リノレン酸と
沙織，奥田豊子（2008）菜食者における抗酸化能に関
して摂取することになる。α-リノレン酸は体内で EPA
連する因子の検討 ̶ 亜鉛・セレンについて．微量栄養
や DHA に変換されるが，その変換効率はかなり低いとの
15）
素研究 25：108-113，2008.
報告がある。また，α-リノレン酸から EPA や DHA の
7）Bligh E, Dyer WJ (1959) A rapid method of total
合成に関わるΔ6 不飽和化酵素がリノール酸からのアラキ
lipid extraction and purification. Can J Biochem
ドン酸合成にも働くため，リノール酸摂取量が多い場合に
Physiol 37 : 911-917.
― 47 ―
GG, Kagan A (1984) Epidemiologic studies of coro-
8）日本油化学会［編］（2003）基準油脂分析試験法，暫
nary heart disease and stroke in Japanese men liv-
11-2003，ナトリウムメトキシド法．
ing in Japan, Hawaii and California: incidence of
9）厚生労働省（2011）平成 20 年国民健康・栄養調査報
stroke in Japan and Hawaii. Stroke 15 : 15-23.
告，http://www.mhlw.go.jp/bunya/kenkou/eiyou/
h20-houkoku. html: pp. 309-329，2011 年 8 月 4 日ア
14）Iso H, Sato S, Kitamura A, Naito Y, Shimamoto T,
Komachi Y (2003) Fat and protein intakes and risk
クセス．
of intraparenchymal hemorrhage among middle-
10）厚生労働省（2009）日本人の食事摂取基準［2010 年
aged Japanese. Am J Epidemiol 157 : 32-39.
版］，第一出版，東京：pp. 77-108.
11）Mark M, Virginia M (1996) The Dietitian s Guide to
15）Burdge GC, Finnegan YE, Minihane ME, Williams
Vegetarian Diets : issues and applications, Aspen Pub,
CM, Wootton SA (2003) Eﬀect of altered dietary n‒3
Gaithersburg : pp. 405-416.
fatty acid intake upon plasma lipid fatty acid com-
12）Appleby PN, Thorogood M, Mann JI, Key TJ (1999)
13
position, conversion of [ C] alpha-linolenic acid to
The Oxford Vegetarian Study: an overview. Am J
longer-chain fatty acids and partitioning towards beta-
Clin Nutr 70 : 525S-531S.
oxidation in older men. Br J Nutr 90 : 311-321.
13）Takeya Y, Popper JS, Shimizu Y, Kato H, Rhoads
― 48 ―
Trace Nutrients Research 28 : 49−53（2011）
原著
アロマセラピー精油の不死化視床下部神経細胞に対する作用
大城なつき
1）
＊
1）
2）
1）
1）
，小山裕也，中村亜紀子，大河原晋，川原正博
1）
＊
2）
＊
（九州保健福祉大学薬学部分析学講座，九州保健福祉大学 QOL 研究機構薬学研究所）
Effects of essential oils on the degeneration of immortalized
hypothalamic neurons induced by hydrogen peroxide
1）
1, 2）
1）
1）
Natsuki OHSHIRO , Akiko NAKAMURA
Hironari KOYAMA Susumu OHKAWARA and Masahiro KAWAHARA
1）
Dept. Analytical Chemistry, Kyushu University of Health and Welfare,
2）
Quality of Life Research Institute in Kyushu University of Health and Welfare,
1714-1 Yoshino-cho, Nobeoka-shi, Miyazaki 882-8508, Japan
1）
Summary
Aromatherapy and the plant-based essential oils are widely used for the complementary and alternative therapies
of symptoms including anxiety and depression. Furthermore, it was reportedly eﬀective for the care of patients of Alzheimer s disease. To investigate the pharmacological eﬀects of essential oils, we have developed an in vitro assays
system using GT1-7 cells (immortalized hypothalamic neurons). Among tested 21 essential oils, we found that the neuronal death induced by hydrogen peroxide was attenuated by lemon, black pepper, geranium, juniper berry, majoram,
eucalyptus, lavender, vanilla, and clarysage. We also examined the radical scavenger activity using DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) and the SOD (super oxide dismutase)-like activity. Our developed in vitro assay system could be
useful for the neuropharmacological study of essential oils.
アロマセラピーは，植物や果実から抽出した芳香成分で
性軸索輸送によって物質輸送が行われることが古くから知
ある精油（essential oil）を用いて心身の健康増進を行う
られている。Kanayama らは，マルチトレーサー法を用
療法であり，近年ではストレス解消など心身の不快な状態
いて金属イオンの脳内移行における投与経路の違いについ
1）
+
+
を改善する為に一般にも広く使用されている。さらに，
て詳細に検討した結果，鼻腔に投与された Rb ，Tl など
最近では，うつ病やアルツハイマー病など様々な疾患に対
の金属イオンは，投与 6 時間後には嗅球に移行し，さらに
2）
3）
する治療効果が注目されている。アロマセラピーに用い
視床下部や海馬にまでも移行することを報告している。
られる精油の作用については，主に，ヒトに対する臨床試
従って，脂溶性の芳香成分は，嗅覚系を経由して中枢に移
験や生理心理学的な研究による報告が多いが，患者の心身
行し，神経細胞に直接作用し得る。また，芳香浴やマッ
の状態や嗜好などの個人差が大きく，また，精油の濃度や
サージなどによって皮膚から吸収され血管内に侵入した精
投与方法等によっても様々に変化しうるために不明な点が
油成分が末梢神経系や中枢神経系に直接影響する可能性も
多い。また，精油が，抗菌作用，女性ホルモン作用，抗不
考えられる。
安作用，自律神経系調節作用などを持つことも報告されて
そこで我々は，実験条件のコントロールが容易な培養神
いるが，動物実験では精油の投与方法等に関して実験的な
経細胞系を用いて，精油成分の作用について検討した。
困難が多い。
GT1-7 細胞（不死化視床下部神経細胞）は，マウス視床下
アロマセラピーによって，芳香成分が鼻腔を経由して嗅
部神経細胞の腫瘍化によって得られた細胞株であり，増殖
上皮に侵入し，嗅細胞の匂い受容体と結合することによっ
能を持つために取り扱いが容易である一方で，神経細胞と
て嗅覚神経系を刺激する。匂いの情報は，嗅球から，大脳
しての性質を保持しており，特に GnRH（gonadotropin-re-
辺縁系，視床下部などに伝えられ，様々な中枢効果を現し，
leasing hormone）分泌能を持つことから神経内分泌系の
心身に影響するのではないかと考えられている。しかしな
モデル系として広く使用されている。GT1-7 細胞は，血
がら，嗅覚系は，外界の情報のみならず物質の脳内への侵
清除去によって神経突起伸展を生じ，神経伝達物質受容体，
入経路でもあり得る。嗅上皮から嗅球に至る経路では逆行
女性ホルモン（E2 : β-estradiol）受容体（ER α，ERβ）など
4）
所在地：宮崎県延岡市吉野町1714-1（〒882-8508）
＊
― 49 ―
材料及び方法
多くの受容体や MAP2（microtubule associated protein 2）
，
neuroﬁlament などの神経特異的蛋白を発現することが報
告されている。さらに，演者らは，E 2 によって GT1-7 細
1 ．試薬
胞の突起伸展や細胞増殖が生じることや E 2 のアンタゴニ
精油は㈱ GAIA/NP 社より購入し，原液を 99.5% etha-
ストである tamoxifen（TMX）によって顕著な細胞死が生
nol によって希釈して実験に用いた。Table 1 に使用した
じることから，GT1-7 細胞が内分泌攪乱作用を持つ化学物
精油の種類と，主な構成成分を示す。クロロゲン酸，
5）
質の研究の良いモデル系となりうることを報告しており，
DPPH は Sigma-Aldrich より購入した。
アルツハイマー病や脳血管性認知症の実験モデル系として
も使用している
6, 7）
。このような GT1-7 細胞の有用な性質
2 ．細胞培養
GT1-7 細胞は University of California at San Francisco，
から，我々は，GT1-7 細胞が，精油が神経内分泌系に及ぼ
す影響を検討する良い
モデル系になりうるのでは
6）
Dr. R. Weiner より恵与され，既報に従い培養を行った。
ないかと考え，検討を行った。その結果，これまでに ge-
培養液として FBS（fetal bovine serum）添加 Dulbecco s
ranium, lavender, grapefruit, mandarin などの精油が
modiﬁed Minimum Essential Medium（DMEM）を用い，
GT1-7 細胞の細胞生存維持・増殖に影響することを見いだ
7 % CO2 存在下で培養し，細胞が conﬂuent になった後，
している。また，このような効果は，神経細胞のモデル系
trypsin-EDTA 処理を行った。細胞は，無血清 DMEM に
として汎用されている PC-12 細胞では観察されず，E 2 受
分散させた後，96 well プレートに 4 × 10 cells/well の濃
容体を介していることが示唆され，さらに，geranium 精
度で播き，7 % CO2 存在下で培養し，培養 1 日後，試薬投
油が E 2 のアンタゴニスト様作用を持つ可能性を示唆する
与を行った。
4
8）
結果を得ている。
本研究では，精油の抗酸化能について検討するために，
3 ．過酸化水素による細胞死保護活性
21 種類の精油について過酸化水素（H2O2）によって生じる
GT1-7 細胞を 24 時間培養した後，well に精油（10 ∼
GT1-7 細胞の細胞死に及ぼす影響を検討した。さらに，安
100 ppm）を投与し，直後に H2O2，25 µM を投与した。投
定なラジカルを生成する DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhy-
与 24 時間後にミトコンドリア内の酵素活性を指標とする
drazyl）を用いて，精油自体のラジカル消去能についても
WST-1 法によって生存細胞数の測定を行った
（Cell counting
比較し，さらに SOD（super oxide dismutase）様活性に
kit，同仁化学）。Control として，1.0 % ethanol を投与し，
ついても比較検討した。
細胞生存率に影響ないことを確認した後，生存率を比較検
討した。
Table 1 Characteristics of essential oils
Name
Scientific name
Blackpepper (BP)
Cinnamon (CI)
Clary Sage (CS)
Eucalyptus (EU)
Frankincense (FR)
Major component
β-pinene, sabinene
cinnamaldehyde, eugenol
myrcene, limonene
1,8-cineole
α-pinene, di-pentene, cadinene
citronerol, geraniol, limonene,
β-caryophyllene
limonene, myrcene, α-pinene
α-pinene, cadinol, cadinene
α-pinene, α-thujene, sabinene
linanool, linalyl acetate
limonene, α-pinene, β-pinene
γ-terpinene, α-pinene, β-pinene
terpinen-4-ol, γ-terpinen, α-terpinenol
linanool, limonene, trans-ocimene
patchoulene, pogostol
menthol, menthone
camphene, α-pinene, β-pinene
linanool, α-terpineneol
terpinen-4-ol, γ-terpinene
vaniline, hydroxybenzaldehide, eugenol
germacrene D,
β-caryophyllene, methylbenzoate, linalol
Geranium (GE)
Grapefruit (GR)
Hinoki (HI)
Juniper Berry (JB)
Lavender (LA)
Lemon (LE)
Mandarin Green (MG)
Marjoram (MJ)
Neroli (NE)
Patchouli (PA)
Peppermint (PE)
Rosemary (RM)
Rosewood (RW)
Tea Tree (TT)
Vanilla (VA)
Ylang Ylang (YY)
― 50 ―
(a) without H2O2
120
Viability (%)
100
80
**
60
40
20
0
cont BL
CI
CL EU FR GE GR HI JB
LA LE MG MA NE PA PM RM RW TT
VA YY
(b) with H2O2
120
Viability (%)
100
80
60
*
*
**
**
**
**
*
40
*
**
20
**
**
** **
0
cont BL
CI
CL EU FR GE GR HI JB
LA LE MG MA NE PA PM RM RW TT
VA YY
Fig. 1 Viability of GT1-7 cells after exposure to various essential oils
GT1-7 cells were preadministered with 100 ppm of various essential oils without (a) or with (b) the cosxistence of 25 µM H2O2.
After 24 h, the viability was analyzed using WST-1 method. Data are presented as mean ± S.E.M. (n = 6). * p < 0.05,
** p < 0.001.
BL: black pepper, CI: cinnamon, CL: clary sage, EU: eucalyptus, FR: frankincense, GE: geranium, GR: grapefruit, HI: hinoki,
JB: juniper berry, LA: lavender, LE: lemon, MG: mandarin green, MA: marjoram, NE: neroli, PA: patchouli, PE: peppermint,
RM: rosemary, RW: rosewood, TT: tea tree, VA: vanilla, YY: ylang ylang.
結果
4 ．形態観察
GT1-7 細胞をポリエチレンイミンコートしたカバーガラ
4
ス上に 4 × 10 cells/well の濃度で播き，上記条件にて培養
1 ．過酸化水素による細胞死に及ぼす影響
を行った後，生細胞を染色する carboxy ﬂuorescein およ
H2O2 は，ヒドロキシラジカルを生成し，細胞毒性を持
び死細胞の DNA を染色する propidium iodide を投与した
つことが知られている。この培養条件下で，H2O2 は濃度
後，蛍光顕微鏡（Olympus IX71）を用いて形態観察を
依存的な GT1-7 細胞の細胞死を引き起こし，25 µM H2O2
行った。
存在下 24 時間後の細胞生存率は 41.0 ± 1.8 % であった
（mean ± S.E.M., n = 6）
。しかしながら，表 1 に示す 21 種
5 ．フリーラジカル消去能
類の精油（100 ppm）を前投与した後，H2O2 を投与した結
DPPH ラジカルの消去能に関しては，DPPH 溶液
果，Fig. 1（b）に示すように，lemon，black pepper，gera-
（100 ppm）に対して，精油 100 ppm を加え，10 分間攪拌
nium，juniper berry，majoram，eucalyptus，lavender，
した後，吸光度（520 nm）を測定した。コントロールとし
vanilla，clarysage など 9 種類の精油に，有意な細胞死保
て，クロロゲン酸（25 ppm）による活性を 100 %として，
護効果が観察された。特に効果が顕著であった lemon 精
ラジカル消去能を比較した。
油の場合には，細胞生存率は 70.0 ± 0.7%に回復した。また，
また，ホルマザン塩を用いる WST-1 法（SOD assay kit， Fig. 2 に示すように，H2O2 投与によって，carboxy ﬂuores同仁化学）によって 450 nm での吸光度を測定することに
cein で染色される生細胞数は減少し，神経突起の縮退や，
よって精油の SOD 活性を比較した。SOD（MP Biomedi-
propidium iodide で染色される死細胞の DNA が多数観察
cals）1 unit における活性を 100 %として，各精油の SOD
されるが，lemon 精油を前投与した細胞では，細胞死が抑
活性を表した。
制されていることが形態的にも観察された。
一方，cinnamon 精油のみを投与した場合には有意な細
6 ．統計処理
胞生存率の低下が観察された。これはおそらくは含まれる
得られた結果は，解析ソフトウエア Kareida Graph
（ver
何らかの精油成分に細胞障害活性があるためと考えられる。
4.0J，Synergy Softwear）を用いて，Student s t-検定を行っ
また，patcheli，vanilla などいくつかの精油では生存率の
た。
上昇傾向が観察された。既に，grapefruit，mandarin な
― 51 ―
Fig. 2 Morphological changes of GT1-7 cells
GT1-7 cells were double-stained by carboxy ﬂuorescein (CF: (a) (c)) and propidium iodide (PI: (d) (f)) after the
exposure to 25 µM H2O2 with or without lemon oil (100 ppm). Bar represents 25 µm.
2 ．フリーラジカル消去能
どの精油を投与してより長期間の培養を行った場合には，
H2O2 による細胞死に対する精油の保護効果をさらに検
無血清培養条件下での神経細胞死に対する保護効果を持ち，
8）
顕著な細胞生存率の上昇を引き起こすことを報告している。
討するために，精油自体のラジカル消去能について検討し
しかしながら，frankinsense，grapefruit，hinoki，neroli，た。まず，DPPH ラジカルの消去能を調べた結果，cinnapatcheli などの精油を前投与した場合には，精油のみでは
mon，vanilla などの精油に顕著なラジカル消去活性が観
細胞死を引き起こさないにもかかわらず，H2O2 による細
察された。次に，SOD 活性を調べた結果，cinnamon，
胞死を増強する結果が得られた。
lavender，peppermint などの精油に活性が観察された。
Radical-Scavenging Activity (%)
120
(a)
100
80
60
40
20
0
Cont BL
(CA)
CI
CL EU
FR GE GR HI
JB
LA
LE MG MA NE PA PM RM
RW TT
VA YY
Fig. 3(a) Radical scavenging activity of various essential oils
The solution of 100 ppm DPPH and various essential oils (each 100 ppm) were mixed and their absorbancy at 520 nm was
analyzed. Data are presented as mean ± S.E.M. (n = 4).
Cont (CA): chlorogenic acid (25 ppm), BL: black pepper, CI: cinnamon, CL: clary sage, EU: eucalyptus, FR: frankincense, GE:
geranium, GR: grapefruit, HI: hinoki, JB: juniper berry, LA: lavender, LE: lemon, MG: mandarin green, MA: marjoram, NE:
neroli, PA: patchouli, PE: peppermint, RM: rosemary, RW: rosewood, TT: tea tree, VA: vanilla, YY: ylang ylang (each 100 ppm).
120
(b)
SOD activity (%)
100
80
60
40
20
0
Cont BL
(SOD)
CI
CL EU
FR GE GR HI
JB
LA
LE MG MA
NE PA PM RM
RW TT
VA YY
Fig. 3(b) SOD activity of various essential oils
The solution of WST-1 and various essential oils (each 100 ppm) were mixed and their absorbancy at 450 nm was analyzed. Data are presented as mean ± S.E.M. (n = 4).
Cont (SOD): SOD (1 unit), BL: black pepper, CI: cinnamon, CL: clary sage, EU: eucalyptus, FR: frankincense, GE: geranium, GR: grapefruit, HI: hinoki, JB: juniper berry, LA: lavender, LE: lemon, MG: mandarin green, MA: marjoram, NE: neroli,
PA: patchouli, PE: peppermint, RM: rosemary, RW: rosewood, TT: tea tree, VA: vanilla, YY: ylang ylang (each 100 ppm).
― 52 ―
Alzheimer s disease. Psychogeriatrics. 9 : 173-9.
考察
3）Kanayama Y, Enomoto S, Irie T and Amano R (2005)
Axonal transport of rubidium and thallium in the
21 種類の精油について，H2O2 による細胞死を指標にし
olfactory nerve of mice. Nucl Med Biol 32 : 505-512.
て保護活性を検討した結果，lemon などの精油に細胞保護
活性が観察された。しかしながら，これらの精油の保護活
4）Mellon PL, Windle JJ, Goldsmith PC, et al. (1990)
性と，DPPH ラジカル消去能や SOD 様活性は相関してお
Immortalization of hypothalamic GnRH neurons by
らず，lemon 精油はほとんど抗酸化活性を示さない。
genetically targeted tumorigenesis. Neuron 5 : 1-10.
H2O2 による細胞死のメカニズムとしては，Fe ラジカル生
5）Kawahara M and Kuroda Y (2002) Eﬀects of endo-
成，ミトコンドリア異常などが示唆されているが，今回明
crine-disrupting chemicals on the proliferation and
らかになった lemon 精油などの保護効果のメカニズムに
the toxicity of immortalized hypothalamic neurons.
ついては，これらとは関係しない可能性もあり，現在検討
Environmental Sciences 9 : 319-328.
6）Kawahara M, Arispe N, Kuroda Y, Rojas E (2000)
中である。
アッセイ
Alzheimer s β-amyloid, human islet amylin and prion
系は，取り扱いが簡便であり，様々な神経系，神経内分泌
protein fragment evoke intracellular free-calcium el-
系の機能変化を観察することが可能である。既に報告した
evations by a common mechanism in a hypothalam-
ように，女性ホルモン系関連作用については神経系の研究
ic GnRH neuronal cell-line. J Biol Chem, 275 : 14077-
本研究で開発した GT1-7 細胞を用いる
14083.
に広く使用されている PC12 細胞と異なる応答を示すこと
も明らかになっており，アロマセラピー精油の薬理作用研
7）Kawahara M, Konoha K, Nagata T, Sadakane Y (2007)
Protective substances against zinc-induced neuronal
究に応用していきたいと考えている。
death after ischemia: carnosine a target for drug of
参考文献
vascular type of dementia, Recent Patents on CNS
Drug Discovery 2 : 145-149.
1）Cooke B, Ernst E. (2000) Aromatherapy: a systemat-
8）中村亜紀子，永田哲也，川原正博（2007）アロマセラ
ic review. Br J Gen Pract. 50 : 493-6.
ピー用精油による不死化視床下部神経細胞 (GT1-7 細
2）Jimbo D, Kimura Y, Taniguchi M, Inoue M, Urakami
K. (2009) Eﬀect of aromatherapy on patients with
― 53 ―
胞 ) の生存維持及び細胞死に及ぼす影響 , 日本味と匂
い学会誌（Jpn. J. Taste Smell Res.）14：535-538.
Trace Nutrients Research 28 : 54−57（2011）
Original Article
Dietary nitrate loads on cows in dairy farms near Lake Dian,
Kunming City, Yunnan Province, China.
1）
1）
2）
2）
1）
Hiroki ANZAI , Kazato OISHI , KunZhi LI , Chagan IRBIS , Hiroyuki HIRAOOKA ,
1）
1）
Tatsuya INAMURA and Hajime KUMAGAI
1）
Graduate School of Agriculture, Kyoto University ＊
2）
Biotechnology Research Center, Kunming University of Science and Technology ＊＊
Summary
In a cropland area near Lake Dian, large amount of the crop wastes, i.e. vegetable and ﬂower residues, were fed to
cows in dairy farms. Since several vegetables and ﬂowers tend to accumulate nitrate, animals kept such situations were
suspected to ingest large amount of nitrate. The objective of this study was to quantify the dietary nitrate loads on
dairy cows in the area. Questionnaire surveys on feedstuﬀs fed to cows were conducted in the dairy farms from October
2009 to September 2010. Nitrate contents in the feedstuﬀs and methemoglobin concentrations in the blood of cows were
measured. The feeding amounts of crop wastes from vegetables and ﬂowers were 28.4 kg to 50.0 kg per head per day on
a fresh weight basis. The contents of nitrate nitrogen in the residues of rape blossoms, parsley, stem lettuce and carnations were 0.19 % DM to 0.37 % DM, which were potentially toxic levels for ruminants. Those in the residues of celery and
broccoli were 1.36 % DM and 0.59 % DM respectively, which were toxic levels. However, the nitrate nitrogen contents in
the total diets (sum of feed ingredients) were 0.15 % DM to 0.19 % DM, which were below the allowable limit. The ratios
of methemoglobin to the total hemoglobin in the blood were less than 10 % , indicating that the dairy cows did not fall into
acute nitrate poisoning.
Introduction
In this area, large amounts of chemical fertilizer and animal manure are applied to the cropland. Since several veg-
There have been numerous reports of deaths in rumi3
1）
etable and ﬂower species have a tendency to uptake and
5）
nant animals due to nitrate toxicity . Nitrates (NO ) in-
deposit nitrates from the soil , it is believed that some har-
gested by ruminant animals are generally reduced to am-
vests might have high levels of nitrate. The crop residues
-
monias through nitrites (NO2 ) and hydroxylamines in the
2）
and the market irregulars from the vegetables and ﬂowers
rumen . However, when dietary nitrate levels are espe-
are supplied to cows in dairy farms in the area, and there-
cially high, nitrites are directly transferred from the ru-
fore, the dairy cows were suspected of having ingested ex-
men to the blood. The nitrites in the blood convert ferrous
cessive quantities of nitrates and of being aﬀected by ni-
2+
3+
ions (Fe ) of hemoglobin to ferric ions (Fe ), and methe3）
trate poisoning. The objective of this study was to quantify
moglobin is produced . Due to the inability of methemo-
the dietary nitrate loads on the dairy cows by surveying
globin to carry oxygen, animals begin to present symp-
the amounts of feed ingredients, analyzing nitrate contents
toms of oxygen deficiency and cyanosis as the ratio of
in the feedstuﬀs and determining methemoglobin levels in
methemoglobin to total hemoglobin rises; at very high ra-
the blood of cows.
4）
tios, they will die . This is the process of nitrate poisoning
Materials and Methods
in ruminants.
Kunming city, the capital of Yunnan province, China, has
a population of 6 million people. In the southeastern shore
Site description
areas of Lake Dian, located 40 kilometers from the center
The investigation was conducted in the cropland area
of Kunming city, vegetable and ﬂower production has ex-
near the southeastern shore of Lake Dian (24.7 °
N, 102.7 °
E,
panded to meet the increasing demand in the urban area.
1892 m above sea level), Kunming city, Yunnan province,
＊
＊＊
Address：Sakyo-ku, Kyoto 606-8502, Japan
Address：Kunming, Yunan, 650024, China
― 54 ―
by interview from October 2009 to September 2010 (Farm
City center of
Kunming
N
N
A and B : March, May and September 2010, Farm C : October 2009, Farm D : March 2010, Farm E : March and June
2010). Each feedstuﬀ was sampled and subsequently dried
at 70°
C for 48 hours to measure the dry matter percentage.
Blood samples of lactating cows from 2 farms (Farm A and
B) were also sampled using heparinized vacuum tubes.
Chemical analysis
The feed samples were ground using a Wiley mill, added to distilled water, shaken at 45°
C at 1 hour, and filtered. Nitrate nitrogen contents in the samples were ana6）
lyzed by the Cataldo method . Dietary nitrate nitrogen
Lake Dian
amount per head per day was estimated by multiplying
the nitrate nitrogen content in each feedstuﬀ by its amount
Study site
fed and summing the products. At the calculation, all vegetable wastes were assumed to be broccoli wastes because the supplied vegetable residues diﬀered from day to
day, but broccoli wastes were available throughout the
year.
Whole blood samples were hemolyzed by distilled water
and added to M/10 phosphoric acid buﬀer, and the super-
55km
km
natant was separated by centrifugation at 3, 000 rpm for 10
Fig. 1 Location of the study site.
minutes. Ratios of methemoglobin to the total hemoglobin
in the blood samples were determined by a colorimetric
China (Fig. 1). Because of the high altitude, this area has
method using a visible-ultraviolet spectrophotometer with
been classiﬁed as temperate monsoon climate despite the
5 % sodium cyanide solution and 20 % potassium ferri-cya-
low latitude, and the annual mean temperature and pre-
nide solution based on the cyan-methemoglobin method .
7）
cipitation are 15.0 °
C and 1,017 mm, respectively. The area
Results and discussion
consists of 27 administrative villages located 40 km from
the city center of Kunming. The total population and the
number of households in the area are 53, 677 and 17, 714,
respectively.
The amounts of each feedstuﬀ and the proportions of vegetable and ﬂower wastes in the whole feed at 5 dairy farms
Table 1 shows the agricultural characteristics of the
are shown in Table 2. Fermented corn residue, maize pow-
study area, obtained from the investigation. Cultivation of
der, rice bran, noodle powder, yellow bean cake, concen-
vegetables and flowers is very popular in the area, and
trate mixture and wheat bran were fed to dairy cows as
most of these crops are cultured in greenhouses. The area
concentrates. Broad bean stems, rice straw and maize
covered by greenhouses is about 85 % of the total cultivat-
stems and leaf silage were fed as roughages. Vegetable
ed area.
and ﬂower wastes, residues on cropland and market irregulars available at the moment, such as broccoli, celery,
Table 1 Agricultual characteristics of study area
Land area (ha)
parsley, stem lettuce, purple cabbage, rape blossoms and
No. of animals (head)
Grain
Vegetable
Flower
Other
167
1, 664
895
73
Total
2, 799
Dairy cattle
Pig
Chicken
Duck
carnations, were also fed to dairy cows. The fed amounts
4, 034
36, 564
293, 155
58, 219
of these wastes were 28. 4 kg to 50. 0 kg per head per day
in fresh weight, and their proportions out of the whole feed
were 25 % to 31 % on a dry weight basis. Most of the
dairy farmers in the area did not have their own cultivated lands for feed crops; thus, the vegetable and flower
Field survey and sample collection
wastes obtained from nearby sources were useful in terms
The amount of each feedstuﬀ fed to cows at each of 5
of price and availability compared with feed purchased far
dairy farms (Farm A to E) in the area was investigated
from their farms. As a result, most of the dairy farms in
― 55 ―
Table 2 Amounts of feedstuﬀs and proportions of vegetable and ﬂower wastes at 5 investigated farms
Farm A
1）
2）
DM
FW
Feeding amount (kg/day/head)
Concentrates
Fermented corn residue
Maize powder
Rice bran
Noodle powder
Yellow bean cake
Concentrate mixture
Wheat bran
Roughages
Broad bean stems
Rice straw
Maize stems and leaf silage
10.0
4.5
1.0
0.5
5.0
2.3
4.0
0.9
0.4
0.5
1.0
1.1
8.4
Farm B
1）
2）
FW
DM
8.0
8.0
2.0
0.8
1.1
1.9
2.0
3.0
Farm C
1）
2）
FW
DM
1.8
7.1
1.8
5.0
5.0
1.1
4.5
3.0
2.7
1.7
2.9
Farm D
1）
2）
FW
DM
5.0
4.5
1.5
1.4
1.5
1.4
Farm E
1）
2）
FW
DM
5.0
4.5
2.0
1.8
3.3
Vegetable and ﬂower wastes
43.0
5.0
50.0
5.8
30.0
3.5
28.4
3.3
28.7
Total
74.5
16.9
73.0
21.1
43.0
11.8
36.4
10.5
35.7
9.6
57.7
29.5
68.5
27.5
69.8
29.4
78.0
31.4
80.4
34.5
Proportion of vegetable and ﬂower wastes in total feed (%)
1）
Fresh weight,
2）
Dry matter weight
8）
the area have used these wastes as feed. To our knowl-
standard (0.15 % DM to 0.4 % DM) and therefore should be
edge, there have been no previous reports about situa-
restricted in feeding amount, The nitrate nitrogen con-
tions in which fresh vegetables and/or ﬂowers comprised
tents in celery and broccoli were 1.36 % DM and 0.59 % DM,
such a large part of dairy cows diets.
respectively. These residues should not be fed to rumi8）
The nitrate nitrogen content in each feed is shown in
nants to prevent acute toxicosis ( > 0.4 % DM) . The nitrate
Table 3. The nitrate nitrogen contents in concentrates and
nitrogen contents in the total diets in the 5 farms were
roughages were less than 0.05 % DM, which were within
0.15 % DM to 0.19 % DM, which were below the allowable
the range of the safety standard of nitrate nitrogen con-
limit given by MAFF (< 0.2 % DM) . It is known that ru-
tents in feedstuﬀs for ruminants (< 0.1 % DM)
8）
9）
(Table 4).
minants often fall into nitrate poisoning when they ingest
The nitrate nitrogen contents in parsley, stem lettuce, rape
soiling crops containing high levels of nitrates in a short
blossoms and carnations were 0.19 % DM to 0. 37 % DM.
period . Therefore, it was suggested that occurrence of
These residues were at potentially toxic levels by the
acute toxicosis for the dairy cows may depend on the
10）
feeding management, ingredients and intervals.
Table 3 Nitrate nitrogen contents in feedstuﬀs (% DM)
Items
Concentrates
Fermented corn residue
Maize powder
Oilseed cake
Roughages
Broad bean stems
Rice straw
Maize stems and leaf silage
Vegetable wastes
Celery
Broccoli
Rape blossom
Parsley
Stem lettuce
Purple cabbage
Tomato
Flower wastes
Carnation
n
Mean
4
3
1
0.002
0.003
0.002
SD
1）
0.0023
0.0035
―
2
2
1
0.000
2）
N.D.
0.050
0.0001
0.0000
3
5
1
2
1
1
1
1.357
0.592
0.368
0.248
0.190
0.138
2）
N.D.
0.3615
0.2238
0.0880
3
0.260
0.1005
―
The ratios of methemoglobin to the total hemoglobin
were less than 10 % (Table 5). In humans, the normal level
of methemoglobin is 1 to 2 % of the total hemoglobin;
symptoms of cyanosis will appear at 10 % , consciousness
11）
is lost at 50 % , and death occurs at 70 % . This also holds
12）
true in dairy cows . Therefore, in the present study, the
dairy cows were assumed not to have fallen into acute nitrate poisoning.
―
Table 5 Ratios of methemogrobin to the total
hemoglobin in blood of cows (%)
―
―
―
1）
Sampling date
n
Methemoglobin proportion
Jun-2010
Sep-2010
5
3
2.2 (1.6−3.2)
5.0 (3.0−8.0)
1）
1）
Mean (min.−max.).
Standard deviation.
Not detected.
2）
Table 4 Safety standard of nitrate nitrogen content (% DM) in feedstuﬀs for ruminants
Nitrate nitrogen content
Eﬀect on ruminants
< 0.10
0.10 to
0.15 to
0.20 to
0.35 to
> 0.40
Safe.
Moderately safe. Limit use for pregnant animals to 50 % of total ration.
Potentially toxic. Limit feed to 50 % of total ration.
Potentially toxic. Limit feed to 35 % of total ration. Do not feed to pregnant animals.
Potentially toxic. Limit feed to 25 % of total ration. Do not feed to pregnant animals.
Toxic. Do not feed to prevent death and acute toxicosis.
0.15
0.20
0.35
0.40
8）
Quated from Bradley et al. (1940)
― 56 ―
Although the methemoglobin levels in the blood did not
5）Pietro S (2006) Nitrate in vegetables: toxicity, content,
intake and EC regulation, J Sci Food Agric 86 : 10-17.
imply acute nitrate poisoning, some vegetable wastes had
toxic levels of nitrates, and the nitrate contents in the
6）Cataldo DA, Haroon M, Schrader LE, Younds VL
whole diets were close to the allowable limit. The high
(1975) Rapid colorimetric determination of nitrate in
methemogrobin levels in September, 2.3 times as high as
plant tissue by nitration of salicylic acid. Soil Sci Plant
that in June, might have reﬂected high nitrate contents in
Anal 6(1) : 71-80.
the diets at the moment. Even if it does not cause acute
7）Hashimoto T (1958) Scrutiny of Evelyn and Malloy
poisoning, frequent intake of relatively high levels of ni-
method of methemoglobin determination. National
Sanitation 27 : 385-387. (In Japanese)
trate may cause chronic nitrate poisoning and thereby affect reproduction, lactation and growth: namely, increased
8）Bradley WB, Eppson HF, Beath OA. (1940) Livestock
rates of abortion and fetal abnormality, decrease of milk
poisoning by oat hay and other plants containing ni-
13）
trate. Wyo Agric Exp Sta Bull : 241.
yield and body weight gain . Therefore, the dairy farmers in the area should pay attention to the potential for ni-
9）Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries
trate poisoning in their dairy cows and give special con-
(MAFF) (1988) Report on soil diagnostic criteria for
sideration to the variety and proportions of vegetable and
feed crop ﬁelds in Kanto and Tokai regions, Grassland
ﬂower wastes in their diets.
experiment station. 20-25. (In Japanese)
10）Miyazaki A, Kawashima R, Uesaka S (1974) Eﬀect of
References
repeated administration of nitrate on methemoglobin
formation in sheep. Jpn. J. Zootech. Sci. 45 : 233- 238.
(In Japanese)
1）Nielsen DB, James LF (1992) Economic impact of poisonous plants on livestock production, J Range Man-
11）Steven CMD (1982) Collective review Methemoglobinemia. Ann Emerg Med 11(4) : 214-221.
age 45 : 3-8.
2）Barnett AJG, RL Reid (1961) Reactions in the Rumen,
12）Li CW, Garcia-Rivera J, Burris RH (1961) Metabolism
of nitrate by cattle. Biochem J 81(2) : 237-242.
Edward Arnold, London : pp. 198-203.
3）Smith HA, TC Jones (1957) Veterinary Pathology, Lea
13）Yoshida N (1994) Safety of roughages. in Guidebook of
& Febigar, Philadelphia : pp. 575-576.
Roughage Quality Evaluation, ed. by Society for quali-
4）Hungerford TG (1970) Diseases of Livestock, Angus
ty evaluation of self-sufficient feed, Japanese Grassland Society, Tokyo : pp. 95-103. (In Japanese)
and Robertson, Sydney : pp. 929-930.
― 57 ―
Trace Nutrients Research 28 : 58−64（2011）
Original Article
Function of FADH2-dependent 2-haloacrylate hydratase from
a 2-chloroacrylate-utilizing bacterium, Burkholderia sp. WS
1）
1）
1, 2）
Anoop VASUDEVAN , Michiyo FUJITA , Atsushi KURATA ,
1）
1）
1）
Jun KAWAMOTO , Nobuyoshi ESAKI and Tatsuo KURIHARA
1）
Institute for Chemical Research, Kyoto University ＊ ,
2）
Graduate School of Applied Biological Chemistry, Kinki University ＊＊
Summary
Enzymes that catalyze the degradation of organohalogen compounds are useful in environmental technology
and chemical industry. Burkholderia sp. WS is a Gram-negative bacterium that can utilize an aliphatic unsaturated
organohalogen compound, 2-chloroacrylate (2-CAA), as its sole carbon source. The production of 2 proteins, CAA43 and
CAA67_WS, is induced when the bacterium is grown in 2-CAA medium. CAA43 catalyzes the conversion of 2-CAA
into (S)-2-chloropropionate, whereas the function of CAA67_WS remains unknown. Recently, a homolog of CAA67_WS
from Pseudomonas sp. YL (CAA67_YL), subsequently named 2-haloacrylate hydratase, was shown to catalyze the
FADH2-dependent hydration of 2-CAA to produce pyruvate. Our results suggest that CAA67_WS has a similar activity.
Gene-disruption studies of CAA43 and CAA67_WS indicated that CAA67_WS is physiologically more important in
the assimilation of 2-CAA in Burkholderia sp. WS. The enzyme CAA67_WS was puriﬁed from Burkholderia sp. WS and
characterized. The UV-visible spectrum of the protein indicated the presence of bound ﬂavin. CAA67_WS released
chloride ions from 2-CAA in the presence of FAD and reducing agents such as NAD(P)H. CAA67_WS is similar to
CAA67_YL in these respects. However, while the reduced form of ﬂavin mononucleotide (FMN) served as a cofactor for
CAA67_WS, it did not for CAA67_YL. CAA67_YL is a bifunctional enzyme that catalyzes the hydration of 2-CAA and
the reduction of FAD by using NADH; CAA67_WS did not catalyze the reduction of FAD. Thus, comparative studies
of these 2 proteins can provide valuable information on the structure-function relationship of these proteins.
Abbreviations: 2-CAA, 2-chloroacrylic acid
(S)-2-CPA, (S)-2-chloropropionic acid
ESI-MS, electrospray ionization mass spectrometry
Introduction
another being conversion of these compounds to other organohalogen compounds that can be easily metabolized.
Halogenated organic compounds are one of the largest
The enzymes that catalyze the removal of halogen at-
groups of environmental pollutants because of their wide-
oms from organohalogen compounds are called dehaloge-
spread use in the past as herbicides, fungicides, solvents,
nases. Some of the dehalogenases characterized so far can
1）
plasticizers, and intermediates for chemical synthesis .
act on unsaturated aliphatic organohalogen compounds
Apart from the organohalogen compounds produced in-
such as cis/trans-3-chloroacrylic acid and 2-chloromaleylace-
dustrially, many are produced biologically or by natural
tate
2）
6- 8）
. Previously, 3 bacterial strains were isolated from
abiogenic processes such as volcanic eruption . Many or-
garden soil in Uji, Kyoto, Japan; these strains can assimi-
ganohalogen compounds are hazardous to the environ-
late 2-chloroacrylic acid (2-CAA) as a sole carbon source.
ment due to their toxicity, bioconcentration, and long life-
These strains were identiﬁed as Pseudomonas sp. YL, Burk-
spans. Many microorganisms and enzymes capable of
holderia sp. WS (formerly Pseudomonas sp. WS), and Burk-
3- 5）
. Re-
holderia sp. WL (formerly Pseudomonas sp. WL)9）. 2-CAA is
moval of the halogen atom from these organohalogen com-
a bacterial metabolite of 2-chloroallyl alcohol, which is an
pounds is a major way of detoxifying these compounds,
intermediate or byproduct in industrial herbicide synthe-
degrading these compounds have been reported
＊
＊＊
Address：Uji, Kyoto 611-0011, Japan
Address：3327-204 Nakamachi, Nara 631-8505, Japan
― 58 ―
10）
sis . Rats excrete 2-CAA when treated orally with herbi11）
for tetracycline-resistance (tet) from the plasmid pBR322
was ampliﬁed using sense primer (5′
-CACATCATGGT
cides containing a haloallyl substituent .
Two inducibly produced proteins, CAA43 and
TCCTTGGGCGTGACAGCTTATCATCGATA-3′
) and an-
CAA67_WS, were expressed when Burkholderia sp. WS
tisense primer (5′
-GGTAGCGCCGAGGTGGCGTTCTTG
12）
was grown in 2-CAA medium . The protein CAA43 was
GAGTGGTGAATCCGTT-3′
) for inserting into caa43, and
found to be 2-haloacrylate reductase. It catalyzes the re-
the sense primer (5′
-TCATTGACGACGGGGGCCGAATG
duction of 2-CAA to (S)-2-chloropropionic acid ((S)-2-CPA),
ACAGCTTATCATCGATA-3′
) and antisense primer (5′
-G
using NADPH as a co-substrate (Fig. 1). The function of
ATGCTTCACCAGGACGTTTCTTGGAGTGGTGAA
the other protein, CAA67_WS, could not be determined
TCCGTT-3′
) for inserting into caa67_ws. These were then
earlier due to the diﬃculty in construction of an eﬀective
used in the construction of plasmids for disruption of
recombinant expression system. It was found that Pseudo-
caa43 and caa67_ws. The tet gene was placed in between
monas sp. YL produces a homolog of CAA67_WS (sequence
the 5′
- and 3′
-halves of these genes by overlap extension
identity, 84.6 %) when it grows on 2-CAA. This enzyme
PCR. The resultant fragments were digested with restric-
was recently characterized and found to be 2-haloacrylate
tion enzymes PstI and XbaI for inserting into pK18mob-
hydratase, which catalyzes the hydration of 2-CAA to pro-
sacB plasmid. These plasmids were introduced into com-
13）
duce pyruvate . The present study analyzes the function
petent Burkholderia sp. WS cells, either by electroporation
of CAA67_WS in Burkholderia sp. WS and its physiological
or by conjugation with Escherichia coli S17-1. The mutants
importance in metabolism of 2-CAA.
Δcaa43 and Δcaa67_ws were veriﬁed by Southern blot hybridization.
Materials and Methods
Culture conditions
Materials
The wild-type Burkholderia sp. WS, Δcaa43, and Δcaa67_
2-CAA was purchased from Lancaster Synthesis Ltd.
ws were grown aerobically at 28°
C in a medium contain-
(Lancashire, UK). All other reagents were of analytical
ing 0.2 % (NH4)2SO4, 0.05 % Bacto yeast extract (Difco), 0.1 %
grade and were purchased from Nacalai Tesque (Kyoto,
K2HPO4, 0.1 % NaH2PO4, 0.01 % MgSO4 7H2O (pH 7.1), and
Japan) and Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan).
various carbon sources. Either 0.2 % 2-CAA, lactate, (S)-2-
Restriction enzymes and kits for genetic manipulation
CPA, or both 2-CAA and (S)-2-CPA together were added
were purchased from Takara Bio (Otsu, Japan), Toyobo
to the medium as a carbon source.
(Osaka, Japan), and Qiagen Ltd. (West Sussex, UK).
Purification of native CAA67_WS
Generation of gene-disrupted mutants
The cells of Burkholderia sp. WS were harvested at the
The gene fragments corresponding to 5′
- and 3′
-halves
late logarithmic phase, washed twice with 50 mM potassi-
of caa67_ws and caa43 (GenBank accession number:
um phosphate buﬀer (pH 7.1) containing 1 mM dithiothrei-
AB196962) were amplified from the genomic DNA of
tol, resuspended in the same buﬀer, and disrupted by
Burkholderia sp. WS using the following primers: (1) sense
passing through a French press 3 times at 1000 psi. Cell
primer (5′
-AACTGCAGATGGTAATGGCAGCGGTA
debris was removed by centrifugation. The cell-free ex-
ATTCATAAGAAG-3′
) and antisense primer (5′
-TATC
tract thus obtained was subjected to ammonium sulfate
GATGATAAGCTGTCACGGCCCAAGGAACCATGAT
precipitation at 40 % saturation. The precipitated proteins
GTG-3′
) and sense primer (5′
-AACGGATTCACCACTC
were removed by centrifugation, and the supernatant was
CAAGAACGCCACCTCGGCGCTACC-3′
) and antisense
diluted to 30 % ammonium sulfate saturation. This super-
primer (5′
-GCTCTAGACTACGCTTGCGGAAGCAAAA
natant that contained 2-haloacrylate hydratase activity
CAATCGAGCC-3′
) for the 5′
- and 3′
-halves of the caa43
was then applied to a Toyopearl Butyl 650 M column pre-
gene, respectively; and (2) sense primer (5′
-AACTGCA
equilibrated with 50 mM potassium phosphate buﬀer (pH
GATGTCGGATGTTCTTGTAACAGACGTGTTG-3′
) and
7.1) containing 1 mM dithiothreitol and 30 % ammonium
antisense primer (5′
-TTATCGATGATAAGCTGTCATTC
sulfate. The unbound proteins were removed by washing
GGCCCCCGTCGTCAATG-3′
) and sense primer (5′
-AACG
with the same buﬀer. CAA67_WS was then eluted using a
GATTCACCACTCCAAGAAACGTCCTGGTGAAG
linear gradient of 30 - 0 % ammonium sulfate. The active
CATC-3′
) and antisense primer (5′
-GCTCTAGATTAG
fractions were collected, concentrated, and dialyzed
AGGGGAACGTCTTTGAAATGCAACGC-3′
) for the 5′
-
against 5 mM potassium phosphate buﬀer (pH 7.1) contain-
and 3′
-halves of the caa67_ws gene, respectively. The gene
ing 1 mM dithiothreitol. This was then applied to a Toyo-
― 59 ―
pearl DEAE 650 M column pre-equilibrated with 5 mM
Explorer 10S system (GE Healthcare UK Ltd., Bucking-
potassium phosphate buﬀer (pH 7.1) containing 1 mM di-
hamshire, United Kingdom) equipped with a HiLoad 16/60
thiothreitol. After washing the column to remove unbound
Superdex 200 pg column (GE Healthcare UK Ltd.). Molecu-
proteins, CAA67_WS was eluted with a linear gradient of
lar mass marker proteins (Oriental Yeast Co. Ltd., Tokyo,
5-60 mM potassium phosphate buﬀer (pH 7.1) containing
Japan) consisting of glutamate dehydrogenase (290 kDa),
1 mM dithiothreitol. The active fractions were pooled and
lactate dehydrogenase (142 kDa), enolase (67 kDa), myoki-
concentrated using a Millipore Amicon 30-kDa membrane
nase (32 kDa), and cytochrome c (12.4 kDa) were used as
ﬁlter. These fractions were then subjected to gel ﬁltration
standards.
using a HiLoad 16/60 Superdex 200 pg column and 50 mM
Results and Discussion
sodium phosphate buﬀer (pH 7.1) containing 150 mM sodium sulfate. The active fractions were pooled, concentrated
to 5.3 mg/ml, and stored at -80°
C until use.
This study describes the biochemical characteristics
and physiological importance of 2-haloacrylate hydratase
Enzyme assay
expressed in Burkholderia sp. WS grown in 2-CAA medi12）
The enzymatic activity of CAA67_WS was determined
um. As reported previously , CAA67_WS and CAA43
under anaerobic conditions by measuring the amount of
are able to be inducibly produced when Burkholderia sp.
chloride ions released from 2-CAA, according to the meth-
WS is grown in 2-CAA medium. The protein CAA43 was
18）
od described by Iwasaki et al . The reaction mixture
subsequently characterized as 2-haloacrylate reductase,
(100 µl) contained 60 mM Tris sulfate buffer (pH 9.0),
which catalyzes the conversion of 2-CAA into (S)-2-CPA in
3.5 mM 2-CAA neutralized with an equimolar amount of
an NADPH-dependent manner (Fig. 1).
NaOH, 0.1 mM FAD or FMN, and 10 mM NAD(P)H. The
reaction was carried out at 30°
C and terminated by the
addition of 11.1 µl of 1.5 M sulfuric acid.
Analysis of 2-CAA degradation product by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
Fig. 1 Proposed pathway for the degradation of 2-CAA by 2-haloacrylate reductase (CAA43) in Burkholderia sp. WS.
A 500-µl reaction mixture containing 60 mM ammonium
acetate buﬀer (pH 7.1), 5 mM 2-CAA, 20 mM NAD(P)H,
Based on the amino acid sequences of CAA67_WS and
0.1 mM FAD or FMN, and 10 % (v/v) cell-free extract was
CAA43, degenerate primers were designed, and a part of
incubated at 28°
C for 24 h. The reaction was terminated
the gene cluster containing these 2 proteins was ampliﬁed
by the addition of 1 ml acetonitrile. The reaction mixture
by inverse PCR. The genes coding for CAA67_WS and
was centrifuged, ﬁltered, and diluted with acetonitrile/
CAA43 were found to be located next to each other on
10 mM ammonium acetate ( 1 : 1 ). After dilution, the mix-
12）
the genome of Burkholderia sp. WS (GenBank accession
ture was analyzed by ESI-MS using an API3000 LC/MS/
number: AB196962).
MS system (Applied Biosystems, Foster City, CA) in the
negative-ion mode.
The gene encoding CAA67_WS was present immediately upstream of CAA43, at a distance of 267 bp. Putative
Shine-Dalgarno sequences, AGGAGG and AGGAG, were
UV-visible absorbance spectrometry
found in the upstream regions of the initiation codons of
The reduction of CAA67_WS-bound FAD was moni-
the CAA67_WS gene and the CAA43 gene, respectively,
tored anaerobically with a UV-visible spectrophotometer
but -35 (CTTGATGT) and -10 (TTTAAT) sequences
(UV-2450; Shimadzu, Kyoto, Japan) for which the cell hold-
were found only in the upstream region of the CAA67_WS
er was installed inside the anaerobic chamber. The reac-
gene. In addition, the inducible synthesis of both CAA67_
tion mixture (500 µl) contained 1 mM NAD(P)H, 0.05 mM
WS and CAA43 when the cells are grown in 2-CAA medi-
FAD, 60 mM Tris sulfate buﬀer (pH 9.0), and 20 µl puriﬁed
um suggests that these genes are present in the same op-
enzyme. The analysis was done at room temperature.
eron.
Primary structure analysis of CAA67_WS showed that
Molecular weight determination
it shares sequence similarity with FAD-dependent en-
The subunit molecular weight of CAA67_WS was de-
14）
zymes L-aspartate oxidase from Escherichia coli (NCBI
termined by SDS-PAGE. The molecular weight of the na-
accession number 5542180; 17.6 % identity) and fumarate
tive enzyme was analyzed by gel ﬁltration with an ÄKTA
15）
reductase (subunit A) from Wolinella succinogenes (NCBI
― 60 ―
accession number 37538290; 17.2 % identity). An FAD-
grown on lactate as the carbon source (Fig. 2B). In the
binding motif (GXGXXG) was also observed in the region
medium containing (S)-2-CPA, both the mutant strains
13 to 18 of the amino acid sequence of CAA67_WS. These
showed a poorer growth than the wild-type strain, but the
observations suggest that CAA67_WS is a FAD-depen-
overall growth of all the 3 strains was much lower than
dent enzyme and probably an oxidoreductase functioning
that in lactate medium (Fig. 2A). When grown in the
in the metabolic pathway of 2-CAA. However, since 2-halo-
2-CAA medium, the Δcaa43 strain did not show growth
acrylate reductase (CAA43) has been described as an en-
retardation compared with the wild-type strain (Fig. 2C).
zyme that directly acts on 2-CAA, we initially speculated
In contrast, 2-CAA did not support the growth of the
that CAA67_WS plays some supportive function to that of
Δcaa67_ws strain. This indicated that there is a CAA43-in-
12）
dependent 2-CAA metabolic pathway, in which CAA67_WS
CAA43, such as generation of NADPH .
In order to understand the physiological role of
plays a major role. The growth characteristics of the dif-
CAA67_WS, the mutants Δcaa43 and Δcaa67_ws were creat-
ferent strains suggest that this second pathway is physio-
ed by disrupting the genes for CAA43 and CAA67_WS, re-
logically more important in Burkholderia sp. WS, enabling
spectively, as described in the Materials and Methods.
this strain to utilize 2-CAA as a sole carbon source.
The growth characteristics of these strains in 2-CAA, (S)-
To estimate the function of CAA67_WS, 2-CAA degra-
2-CPA, and lactate media were examined and compared
dation activities of the cell-free extracts of the wild-type
with that of the wild-type strain. (S)-2-CPA and lactate
and ∆caa43 strains were analyzed by ESI-MS. Under aero-
were used as both are supposed to be metabolites of
bic conditions, using the wild-type strain extract in the
2-CAA (as shown in Fig. 1). No signiﬁcant change in the
presence of NADPH, the peak corresponding to [ Cl]-2-
growth proﬁle was observed when the 3 strains were
CAA at m/z = 105 decreased, while the peaks correspond-
35
37
ing to [ Cl]-(S)-2-CPA (m/z = 109) and lactate (m/z = 89) increased in a time-dependent manner (data not shown).
This was expected due to the action of 2-haloacrylate reductase (CAA43). In contrast, the reaction did not proceed
when the cell-free extract from the ∆caa43 strain was
used as 2-haloacrylate reductase is not expressed. When
Fig. 2 Growth of the wild-type, ∆caa43, and ∆caa67 strains of Burkholderia sp. WS on various carbon sources. The carbon
sources examined were (S)-2-CPA (A), lactate (B), and
2-CAA (C). Wild-type strain (closed circle), ∆caa43 strain
(closed diamond), and ∆caa67 strain (closed triangle).
the reaction was carried out under anaerobic conditions
and in the presence of NADPH and FAD, the cell-free extract of the wild-type strain converted 2-CAA into (S)-2CPA, lactate, and pyruvate (m/z = 87) (Fig. 3A). Under the
same conditions, peaks corresponding to lactate and pyru-
Fig. 3 Mass spectrometric monitoring of 2-CAA degradation in the presence of NAD(P)H and FAD under anaerobic conditions. Cell-free
extracts of the wild-type strain (A and C) and the ∆caa43 strain (B and D) were used. NADPH was added for A and B, whereas
NADH was added for C and D. In A and B, arrows indicate 2-CAA (1), (S)-2-CPA (2), lactate (3), and pyruvate (4). In C and D, arrows
indicate 2-CAA (1), lactate (2), and pyruvate (3). The peak at m/z value of 85.0 is of methacrylate, an internal standard.
― 61 ―
vate were detected when the cell-free extract from the
The earlier attempts for recombinant expression of
∆caa43 strain was used (Fig. 3B). However, (S)-2-CPA was
CAA67_WS in E.coli were not successful due to complica-
not produced because of the absence of 2-haloacrylate re-
tions in solubilizing and refolding the protein following its
ductase (CAA43), which catalyzes the conversion of
production in inclusion bodies. Therefore, in this study, the
2-CAA into (S)-2-CPA. When NADH was used instead of
enzyme was puriﬁed from a culture of the wild-type strain
NADPH in the above condition, cell-free extracts from
of Burkholderia sp. WS grown in a medium containing 0.2 %
both the strains converted 2-CAA into lactate and pyru-
2-CAA and 0.2 % 2-CPA (Table 1 and Fig. 5), as described
vate (Fig. 3C and 3D). These results conﬁrm the presence
in the Materials and Methods.
of a CAA43-independent pathway for 2-CAA metabolism.
The molecular mass of the puriﬁed CAA67_WS was ap-
It can also be inferred that in this pathway, 2-CAA is con-
proximately 60,000 Da as measured by SDS-PAGE, which
verted directly into lactate or pyruvate, without the gen-
agrees with the theoretical value of 58,684 Da deduced
eration of (S)-2-CPA.
from its primary structure. The molecular mass deter-
Recently, a homolog of CAA67_WS, CAA67_YL, from
mined by gel ﬁltration was 48,500 Da, suggesting that the
the bacterium Pseudomonas sp. YL was characterized as an
enzyme is monomeric. Puriﬁed CAA67_WS showed 2-halo-
FADH2-dependent 2-haloacrylate hydratase that catalyzes
acrylate hydratase activity, as expected from its structural
13）
the conversion of 2-CAA into pyruvate (Fig. 4) . CAA67_YL
similarity to CAA67_YL. The speciﬁc activity of the puri-
shares 84.6 % sequence identity with CAA67_WS from
ﬁed enzyme was 60 mU/mg.
Burkholderia sp. WS. Thus, it is highly likely that CAA67_WS
Purified CAA67_WS contained an oxidized form of
from Burkholderia sp. WS catalyzes the same reaction as
FAD, as judged by its absorption spectrum. The molar ra-
CAA67_YL.
tio of FAD to the protein was approximately 0.15. This ratio increased to approximately 0.45 after incubation with
an excess amount of externally added FAD, suggesting
that at least about 50 % of the puriﬁed enzyme was irreversibly inactivated during the puriﬁcation process.
The requirement of cofactors was further tested by an-
Fig. 4 Reaction scheme of conversion of 2-CAA by CAA67_YL
from Pseudomonas sp. YL.
alyzing the enzymatic activity under various conditions
(Fig. 6A). When the puriﬁed protein was incubated with
2-CAA in the presence of 0.1 mM FAD and 10 mM NADH
under anaerobic conditions, 2-CAA was degraded, and
chloride ions were liberated. The enzyme activity, as obA
B
FAD
FMN
NADH
+
+
+
-
+
+
+
50
70
40
Sp. activity
(nmol/min.mg)
Sp. activity
(nmol/min.mg)
60
50
40
30
20
30
20
10
10
0
0
Fig. 5 SDS-PAGE analysis of samples containing CAA67_WS at
diﬀerent puriﬁcation stages. Crude extract (1), Butyl-Toyopearl (2), DEAE-Toyopearl (3), and Superdex 200 pg (4).
NADH
Table 1. Puriﬁcation of CAA67_WS from Burkholderia sp. WS cells a
Puriﬁcation step
Total activity
（U）
NADPH
Fig. 6 Cofactor requirement of CAA67_WS. Enzymatic reactions
were carried out under anaerobic conditions.
Total protein
（mg）
Speciﬁc activity
（mU/mg）
9.6
Yield
（ %）
Crude extract
7.2
750
Butyl-Toyopearl
1.4
120
DEAE-Toyopearl
0.13
4.9
27
1.8
2.8
Superdex 200 pg
0.029
0.48
60
0.40
6.3
12
The enzyme activities were determined by measuring halide ions released from 2-CAA
― 62 ―
100
Puriﬁcation
（fold）
19
1
1.3
served by the release of chloride ions, decreased to 44 %
irrespective of whether NADH or NADPH was used.
when FAD was replaced by FMN. No enzyme activity
Hence, it can be considered that FAD is reduced to FADH2
could be detected when the reaction was performed with-
non-enzymatically by CAA67_WS, unlike CAA67_YL,
out NADH. The reaction in the presence of NADH, but in
which catalyzes the NADH-dependent reduction of FAD in
the absence of FAD or FMN, also did not result in the re-
addition to hydration of 2-CAA .
16）
lease of chloride ions. This clearly shows that reduced
From the results presented in this study, it can be con-
FAD (FADH2) is the cofactor of CAA67_WS. The results
cluded that 2-haloacrylate hydratase plays an important
also indicate that reduced FMN (FMNH2) serves as a co-
role in the metabolism of 2-CAA in Burkholderia sp. WS
factor, although less eﬃciently than FADH2. This is in
and is essential for the survival of the bacterium in a me-
clear contrast with CAA67_YL, for which FMNH2 does
dium with 2-CAA as the sole carbon source. 2-Haloacry-
not serve as a cofactor. The requirement of NADH
late hydratase is inducibly produced when Burkholderia sp.
showed that the presence of a reducing agent is essential
WS is cultured in a medium containing 2-CAA. The en-
to maintain the reduced form of FAD. The reaction pro-
zyme uses FADH2 and FMNH2 as its cofactor and is not
ceeded when NADH was replaced with NADPH (Fig. 6B)
biologically active if the ﬂavin is not in its reduced form.
or sodium dithionite (data not shown).
Therefore, the redox environment in the vicinity of the
The reduction of FAD into its reduced form, FADH2, by
enzyme is critical. It could be assumed that the enzyme
NAD(P)H can either be a chemical process or an enzymatic
catalyzes the hydration of 2-CAA to produce 2-chloro-
one. In order to understand this, the spectrum of FAD was
2-hydroxypropionic acid, which is chemically unstable and
analyzed at various time intervals in the presence of 1 mM
spontaneously dechlorinated to pyruvate, releasing HCl.
NAD(P)H, with or without CAA67_WS (Fig. 7). A decrease
Dehalogenation through hydration has been reported for
in the absorption spectra at 450 nm indicates the conver-
some unsaturated aliphatic compounds like cis- and trans-
sion of FAD into FADH2. The decrease in spectra observed
3-chloroacrylate
was similar both in the presence and absence of CAA67_WS,
6, 7）
and aromatic organohalogens like chlo-
17）
rothalonil . 2-Haloacrylate hydratase is diﬀerent from the
Fig. 7 Changes in the UV-visible spectrum of FAD bound to CAA67_WS. Incubation was carried out as described in Materials and Methods in Tris sulfate buﬀer pH 9.0 with 0.05 mM FAD. (A) 1 mM NADH was
added in the presence of 2.3 µM enzyme. (B) 1 mM NADH was added in the absence of enzyme. (C) 1 mM
NADPH was added in the presence of 2.3 µM enzyme. (D) 1 mM NADPH was added in the absence of enzyme. The changes in the spectrum were recorded at 0, 10, 20, 30, 60, and 90 minutes, displayed from top
to bottom, respectively.
― 63 ―
enzymes for dehalogenation of 3-chloroacrylate in its abso-
nistic and structural studies of the 1,3-dichloropropene
lute requirement for reduced ﬂavin as a cofactor. Further
catabolic enzymes. Bioorg. Chem. 32 : 376-392.
mechanistic and genetic analyses are required to explain
8）Endo R, Kamakura M, Miyauchi K, Fukuda M, Oht-
this mechanism more clearly. CAA67_WS and CAA67_YL
subo Y, Tsuda M, Nagata Y (2005) Identiﬁcation and
are similar to each other in their ability to catalyze the de-
characterization of genes involved in the downstream
chlorination of 2-CAA in a reduced ﬂavin-dependent man-
degradation pathway of γ-hexachlorocyclohexane in
ner. However, FMNH2 serves as a cofactor only for
Sphingomonas paucimobilis UT26. J. Bacteriol.
CAA67_WS, and NADH-dependent FAD reductase activi-
187 : 847-853.
ty is found only for CAA67_YL. Thus, comparative studies
9）Hasan AKMQ, Takada H, Koshikawa H, Liu JQ, Kuri-
of these enzymes would give us valuable information re-
hara T, Esaki N, Soda K (1994) Two kinds of 2-haloac-
garding the structure-function relationship of 2-haloacrylate
id dehalogenases from Pseudomonas sp. YL induced
hydratase. The information would contribute to the devel-
by 2-chloroacrylate and 2-chloropropionate. Biosci.
opment of enzymes that are useful in chemical industry
Biotechnol. Biochem. 58 : 1599-1602.
and bioremediation of environments polluted by organohal-
10）van der Waarde JJ, Kok R, Janssen DB (1993) Degradation of 2-chloroallyl alcohol by a Pseudomonas sp.
ogen compounds.
Appl. Environ. Microbiol. 59 : 528-535.
Acknowledgements
11）Marsden PJ, Casida JE (1982) 2-Haloacrylic acids as
indicators of mutagenic 2-haloacrolein intermediates
in mammalian metabolism of selected promutagens
This work was supported in part by a Grant-in-Aid for
Scientiﬁc Research (B) (17404021) from JSPS (to T. K.), a
and carcinogens. J. Agric. Food. Chem. 30 : 627-631.
grant for Research for Promoting Technological Seeds
12）Kurata A, Kurihara T, Kamachi H, Esaki N (2005)
from JST (to T. K.), and the Collaborative Research Pro-
2-Haloacrylate reductase, a novel enzyme of the medi-
gram of Institute for Chemical Research, Kyoto Universi-
um chain dehydrogenase/reductase superfamily that
ty (grant #2010-53 and 2011-50).
catalyzes the reduction of a carbon-carbon double
bond of unsaturated organohalogen compounds. J.
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Trace Nutrients Research 28 : 65−69（2011）
原著
日本酒中の D-アミノ酸の定量と生成機構の解析
岡田かおり，郷上佳孝，老川典夫
＊
（関西大学化学生命工学部生命・生物工学科）
The Quantitative Analysis and Studies on Biosynthesis of D-Amino Acid in Sake
Kaori OKADA, Yoshitaka GOGAMI and Tadao OIKAWA
Department of Life Science and Biotechnology, Faculty of Chemistry, Materials, and Bioengineering,
Kansai University, Suita Osaka 564-8680, Japan
Summary
We detected the D-amino acids forms of Ala, Asn, Asp, Arg, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Ser, Tyr, Val, Phe, and Pro in
141 bottles of sakes using HPLC. We used three individual derivatization methods of HPLC: precolumn & postcolumn
methods of o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cysteine and (+) -1- (9-fluorenyl) ethyl chloroformate/1-aminoadamantane
method. The D-amino acid content of the sakes was increased by using deep-sea water Kaiyoushinosousui , Kimoto yeast
starter , Yamahaimoto , and the long aging process Choukijukusei . After three months storage at 25 ℃, the sakes that
were brewed with the adenine auxotroph of sake yeast ( Sekishoku seishu kobo , Saccharomyces cerevisiae) without pasteurization ( Hiire ) contained large amount of D-Ala, D-Asp, and D-Glu.
D-アミノ酸は，かつて非天然型とみなされ，生体内で重
要な生理機能を持たないと考えられてきた。しかし近年，
酒を開封後 3 か月間，25 ℃で保存したものについても同
様に分析した。
ヒトを含む哺乳動物の特定の部位に高濃度の遊離型 D-ア
ミノ酸が存在することが報告され
1- 3）
，それらの由来や生
2．分析に用いた日本酒
理機能に関心が寄せられている。先にわれわれは，本誌で
分析には 47 都道府県 51 社の酒造会社からランダムに購
さまざまな野菜や果物などの食品中に各種 D-アミノ酸が
入した 141 種類の日本酒を用いた。またそれらの日本酒の
含まれていることを報告した
4- 8）
。本研究では，種々の日
種別ごとの本数は，大吟醸 9 本，純米大吟醸 14 本，吟醸
本酒中の D-アミノ酸を定量し，原料米，産地，仕込み方，
9 本，純米吟醸 42 本，特別本醸造 2 本，特別純米酒 9 本，
種別などの違いが，日本酒中の D-アミノ酸含有量に及ぼ
す影響を解析することを目的としている。
本醸造 15 本，純米酒 35 本，普通酒 6 本であった。
結果と考察
実験方法
47 都道府県 51 社の酒造会社の 141 種類の日本酒を分析
1．日本酒中の D-及び L-アミノ酸の高速液体クロマトグラ
フィーによる測定
した結果，141 種類の日本酒のうち，80%以上の製品には
D-Asp，D-Ala，D-Arg
日本酒中の D-及び L-アミノ酸の定量は，各分析試料を
が含まれていた。また，D-Pro，
D-Glu，D-Val，D-Lys，D-Phe，D-Ile
は約 70 ％，D-His，
50 mM 酢酸ナトリウム溶液で希釈後，含有アミノ酸を o-
D-Asn，D-Tyr は約 50％，D-Gln は 33.8％，D-Leu は 4.4％，
フタルアルデヒド（OPA）と N-アセチル- L -システイン
D-Ser
9）
（NAC）または（+）-1-（9-フルオレニル）エチルクロロ
10）
は 2.5 ％の日本酒にそれぞれ含まれていた。D-アミ
ノ酸含有量の高い日本酒上位 20 種類と下位 20 種類につい
フォルメート
（FLEC）/1-アミノアダマンタン
（ADAM）
て，原料米，産地，仕込み方，種別等の特徴を Table 1 及
と反応させ，蛍光キラル誘導体にして高速液体クロマトグ
び Table 2 に示した。生酛造りのものや長期熟成のものに
ラフィー（HPLC）で実施した。測定は少なくとも 3 回行い，
（Table
D-アミノ酸含有量が高い傾向が見られた
各アミノ酸について作成した検量線からそれぞれの D-及
海洋深層水仕込みのものにも D-アミノ酸含有量が高いも
び L-アミノ酸濃度を算出した。また，分析に用いた日本
のがあった（Table 4）
。しかし，日本酒度，酸度，アミノ
所在地：大阪府吹田市山手町3-3-35（〒564-8680）
＊
― 65 ―
3）
。また，
の D-アミノ酸含有量との関連性は認められなかった。こ
本研究の結果から，日本酒中の D-アミノ酸含有量には
日本酒の仕込み方が深く関わっていることが示唆された。
れらのことから，日本酒中に含まれる D-アミノ酸含有量
しかし，生酛造り等の D-アミノ酸含有量が高い傾向にあ
には仕込み方の違いが影響することが示唆された。さらに，
る仕込み方で製造した日本酒でも D-アミノ酸含有量が低
開封から 3 ヶ月後の日本酒の中には，D-Ala，D-Asp，
い日本酒もあったことから，酒造会社ごとの製造方法や醸
D-Glu の含有量が増加するものがあることが明らかとなっ
造に関与する微生物の種類の違いが日本酒中の D-アミノ
た。D-アミノ酸含量が増加した日本酒のうち，増加量の多
酸含有量に影響していると考えられる。今後さらに D-ア
ミノ酸の生理機能の解明が進み，日本酒を原料とする食品
酸度，アルコール度数及び原料米の品種や産地と日本酒中
い日本酒の上位 20 種類を Table 5 に示した。D-アミノ酸
含有量が増加した日本酒には，にごり酒や発泡にごり酒が
多く含まれていた。特に，赤色清酒酵母を用いたものでは
中の D-アミノ酸含量を高めた機能性食品の開発への応用
が期待される。
その増加量が多くなっていた。赤色清酒酵母を用いた日本
酒では，その特有の色を出すためにもろみを弱く搾ったに
ごり酒として製造されており，製品中に残存している微生
物やその酵素が D-アミノ酸含有量に影響を及ぼしている
と考えられる。
Table 1 The basic properties of the twenty sakes with the highest amount of D-amino acids
― 66 ―
Table 2 The basic properties of the twenty sakes with the lowest amount of D-amino acids
Table 3 Amino acid content of various in sakes brewed with Kimoto yeast starter , Yamahaimoto , and Chokizyukusei
― 67 ―
Table 4 Amino acid content of various sakes brewed with deep-sea water
Table 5 Basic properties of the twenty sakes that contained the highest amounts of D-amino acids after three months storage at 25 ℃
― 68 ―
20：121-124
謝辞
5）郷上佳孝，伊藤克佳，老川典夫（2006）野菜および果
物中の D-アミノ酸の定量と植物における D-アミノ酸
の生合成機構．微量栄養素研究 23：1-4
本研究は生物系特定産業技術研究支援センターのイノ
ベーション創出基礎的研究推進事業により実施したもので
6）老川典夫（2008）高等植物及び食品中の D-アミノ酸
ある。
とその代謝関連酵素．生化学第 80 巻第 4 号：
pp. 300-307
参考文献
7）老川典夫（2009）食品中の D-アミノ酸 ―おいしさと
の関連と食品産業への応用―．バイオインダストリー
Vol. 27 No. 1：44-48
1）Long Z, Lee JA, Okamoto T, Nimura N, Imai K,
Homma H (2000) D-Aspartate in a prolactin-secret-
8）Gogami Y, Ito K, Kamitani Y, Matsushima Y, Oikawa
ing clonal strain of rat pituitary tumor cells (GH3).
T (2009) Occurrence of D-serine in rice and charac-
Biochem Biophys Res Commun 276 : 1143-1147
terization of rice serine racemase. Phytochemistry
70(3) : 380-387.
2）Mothet JP, Pollegioni L, Ouanounou G, Martineau M,
Fossier P, Baux G (2005) Glutamate receptor activa-
9）Aswad DW (1984) Determination of D- and L-aspar-
tion triggers a calcium-dependent and SNARE pro-
tate in amino acid mixtures by high-performance
tein-dependent release of the gliotransmitter
liquid chromatography after derivatization with a
D-serine. Proc Natl Acad Sci 102 : 5606-5611
chiral adduct of o-phthaldialdehyde. Anal Biochem.
137(2) : 405-409.
3）Morikawa A, Hamase K, Ohgusu T, Etoh S, Tanaka
H, Koshiishi I, Shoyama Y, Zaitsu K (2007) Immu-
10）Einarsson S, Josefsson B, Möller P, Sanchez D (1987)
nohistochemical localization of D-alanine to beta-cells
in rat pancreas. Biochem Biophys Res Commun 355 :
Separation of amino acid enantiomers and chiral
872-826
(+)-1-(9-ﬂuorenyl) ethyl chloroformate and reversed-
4）老川典夫，山田高史，杉原裕貴，宮田智子，吉田宗弘，
左右田健次（2003）食品中の D-アミノ酸：定量的解
析と微量栄養素としての可能性．微量栄養素研究 ― 69 ―
amines using precolumn derivatization with
phase liquid chromatography. Anal Chem. 59(8) : 11911195.
Trace Nutrients Research 28 : 70−73（2011）
原著
緑色野菜中ビオチン含量の季節変動について
曽根英行，神山伸，守木葵
＊
（新潟県立大・健康栄養）
Seasonal differences of biotin contents in green vegetables
between summer and winter
Hideyuki SONE, Shin KAMIYAMA and Aoi MORIKI
Department of Health and Nutrition, University of Niigata Prefecture
Summary
Previously, we reported that there are no diﬀerences in biotin contents and expression levels of bio2 gene, which is a
key enzyme in biotin biosynthesis pathway, in pea sprouts among various cultivation conditions. We also found that biotin required for the growth of pea sprout is suﬃciently supplied from the seed. In this study, we investigated whether
biotin biosynthesis is aﬀected by cultivation conditions (temperature and insolation) using pea sprouts hydroponically
cultivated without seeds.
Seeds were removed after their germinations, and then pea sprouts were grown with culture ﬂuid without biotin under 5 conditions: Control (C), 25 ℃/12-h light; Small amount of insolation (SI), 25 ℃/4-h light; No insolation (NI), 25 ℃/0-h
light; Moderate low temperature (MLT), 12 ℃/12-h light; Low temperature (LT), 4 ℃/12-h light.
Biotin contents in SI and NI were approximately 67% and 43% of C, and decreased in proportion to the amount of
insolation (p < 0.05 and p < 0.001, respectively). Biotin content in LT was also lower than C (p < 0.05).
Secondly, to clarify the seasonal diﬀerences of biotin contents in green vegetables, we measured biotin contents in
garland chrysanthemum (shungiku), spinach, and potherb mustard (mizuna) harvested in summer and winter in Niigata,
Japan.
Bitoin contents in shungiku and spinach in winter decreased to about 56% and 47% of those in summer. (p < 0.001,
respectively)
These results strongly suggest that biotin biosynthesis in plants ﬂuctuates responding to the cultivation conditions,
especially the amount of insolation. This may lead to seasonal diﬀerences of biotin contents in green vegetables.
3）
水溶性ビタミンの一種であるビオチンは，4 種のカルボ
結果を報告している。つまり，野菜類におけるビオチン
キシラーゼの補酵素として生体内代謝において重要な役割
の成分表を策定するには，栽培環境の違いによるビオチン
を果たしている。食品中のビオチン含量は，平成 17 年度
含量の変動についても検討することが必要と考えられる。
の「五訂増補日本食品標準成分表」にはビタミンで唯一収
植物におけるビオチンの生合成は，5 段階の酵素反応に
載されておらず，ビオチン摂取基準においても「日本人の
よって行われており，3 段階目の酵素反応では ATP を必
食事摂取基準（2010 年版：厚生労働省）」で成人の目安量
要とする
が 50 µg/ 日と公表されているものの，科学的データの不
不可欠となる。そのため，ビオチンの生合成は日照時間や
足から推奨量を設定できずにいる。しかし，渡邊らの精力
光の強度，栽培温度に依存すると考えられる。本研究室の
的な研究により，次々と食品中のビオチン含量が測定さ
守木は，蒸留水のみで栽培が可能であり比較的栽培期間の
れ
1, 2）
，漸く平成 22 年度の「日本食品標準成分表（2010 年
4, 5）
。植物での ATP 産生には葉緑体での光合成が
短い豆苗を用いて，日照量と栽培温度が植物のビオチン含
6, 7）
度版）」で主要食品のみではあるが，ビオチンが掲載され
量に及ぼす影響について検討を行なった
ることとなった。
苗の種子は葉中よりも数倍のビオチンを含有しており，生
これまでに我々は，日本と欧米諸国との食品中ビオチン
含量を比較し，野菜類でビオチン含量の地域差を示唆する
。しかし，豆
育に必要な十分量のビオチンを供給するため，日照量と栽
培温度の影響を明確にすることができなかった（Fig. 1a）
。
所在地：新潟市東区海老ヶ瀬471（〒950-8680）
＊
― 70 ―
同試料を用いて，ビオチン生合成経路の律速酵素である
ん草を，対照となる淡色野菜には水菜を，各品目とも 3 個
biotin synthase（bio2 遺伝子）の発現についても検討した
体ずつ購入した。購入した野菜は，夏期は露地栽培，冬期
が，bio2 遺伝子の発現量は日照量のみならずビオチン含
はビニールハウスで栽培されたものである。寒冷時は暖房
8）
量によっても調節されるため，栽培環境による影響を見
機器を使用して 10 ℃前後に加温するが，照明器具などに
出すことはできなかった（Fig. 1b）
。
よる日照管理は行っていない。なお，気象庁による気象観
本研究では，種子由来のビオチンを排除した豆苗の栽培
測データでは，新潟市の 2009 年 7 月の気候は，平均気温
系を確立し，ビオチン生合成に及ぼす日照量および栽培温
21.4 ℃・日照時間 100 h/ 日・全天日射量 14.3 MJ/m ，
度の影響について再検討を行なった。また，夏期と冬期に
2011 年 1 月は，平均気温 1.3 ℃・日照時間 49 h/ 日・全天
収穫される緑色野菜のビオチン含量を測定し，その季節変
日射量 5.9 MJ/m であった（http://www.jma.go.jp）
。
2
2
動についても併せて検討した。
２．ビオチン測定と統計解析
b
試料は，1 個体あたり 0.5 g ずつ採取した。これらの試
10
120
料を 5 ml の 0.1 M リン酸緩衝液中で粉砕し，同量の 2.5 M
8
100
H2SO4 を加えて加熱酸加水分解（121 ℃，60 min）した。
80
同量の 5 M NaOH で中和した後，ビオチン測定試料とし
bio2 / actin (% of C)
Biotin contents (μg/100 g)
a
6
4
2
0
C
SI
NI MLT LT
て用いた。ビオチン含量は，先に報告したマイクロプレー
60
9）
トを用いた微生物学的定量法で測定した。
40
統計解析は，Stat View 5.0 を用いて，対応のない t 検
20
0
定あるいは一元配置分散分析（Post-hoc: Bonferroni）に
C
SI
NI MLT LT
より行なった。
Fig. 1 Eﬀects of cultivation conditions of temperature and isolation on biotin contents (A) and bio2 mRNA expression (B)
in pea sprouts. Data are expressed as means ± SEM (n = 4).
結果と考察
豆苗試料中のビオチン含量は，対照群（C）で 14.7 ±
0.35 µg/100 g，弱緑化群（SI）で 9.9 ± 0.16 µg/100 g，非
実験方法
緑化群（NI）で 6.3 ± 0.37 µg/100g，弱低温群（MLT）で
11.5 ± 0.73 µg/100g，低温群（LT）で 9.6 ± 0.33 µg/100 g
1．試料の調製
であった（Fig. 2）
。対照群（C）に対し，弱緑化群（SI）
，
1）豆苗の栽培
非緑化群（NI）のビオチン含量は，それぞれ 67 %，43 %
豆苗の種子は 24 時間浸水させた後，蒸留水で発芽させ
と光合成促進ランプの照射時間に従い低下した（p < 0.05
た。茎および根を 3-4 ㎝まで伸長させた後，種子を除去し
と p < 0.001）
。緑化の指標となる植物中のクロロフィル濃
た。これらを個別の容器に移し，植物栽培用培養液（アイ
度は，光の強度と日照時間に比例する。事実，豆苗中のク
リスオーヤマ株式会社）を用いて，以下の生育条件で 14
ロロフィル濃度は，光合成促進ランプの照射時間に比例し
日間栽培した。日照は，水草・植物・無脊椎動物専門光合
て低下しており，本実験においても本葉や茎の色付き等
成促進ランプ RB37（東芝ライテック株式会社）を用いて
に同様の傾向が観察された。以上の結果から，豆苗におけ
行なった。弱低温群・低温群の栽培温度は，恒温高湿機
るビオチンの生合成は，緑化の程度に従い低下し日照量に
BR-63SB（ホシザキ電気株式会社）を用いて調整した。1 群
強く影響されることが示唆された。また，低温群（LT）
あたり 5 連で栽培した。植物栽培用培養液のビオチン含量
のビオチン含量は，対照群（C）の 66 %まで低下しており，
7）
は，本研究室で測定したところ検出限界以下（< 50 pg/ml）
両群間に有意差が認められた（p < 0.05）。しかし，弱低温
であった。
群（MLT）では，ビオチン含量は対照群（C）の 78 %と
対照群（C）
：栽培温度 25 ℃，日照時間 12 時間 / 日，
比較的高い値を維持しており，栽培温度の影響は観察され
弱緑化群（SI）：栽培温度 25℃，日照時間 4 時間 / 日，
なかった。植物は，低温下におかれると弱い光の照射で
非緑化群（NI）：栽培温度 25℃，日照時間 0 時間 / 日，
あっても低温との複合ストレスを受け，光合成活性が低下
弱低温群（MLT）
：栽培温度 12℃，日照時間 12 時間 / 日，
する。低温下では，こうした光合成活性の低下が原因とな
低温群（LT）：栽培温度 4℃，日照時間 12 時間 / 日
り，過剰な光エネルギーを処理できず活性酸素へと変換さ
れ，細胞内器官を破壊するといった光障害（葉焼け）が引
2）野菜の収集
き起こされる
野菜は，新潟市内の直売所から夏期（2009 年 7 月下旬）
10, 11）
。本実験では，低温群において葉焼けの
形跡は認められなかった。しかし，少なからず光障害によ
と冬期（2011 年 1 月下旬）の 2 度に分けて購入した。緑
る光合成活性の低下を受け，低温下でのビオチン合成酵素
色野菜には周年供給され入手が可能であった春菊とほうれ
の活性低下との複合的作用により，ビオチン含量が低下し
― 71 ―
たものと推察される。しかし，弱低温群ではビオチン含量
けるビオチンの生合成には ATP を必要とする。また，最
は大きな変化を示さなかったことから，ビオチン生合成に
終段階の酵素反応は biotin synthase により進行し，その
は，栽培温度よりも日照量が強く影響するものと考えられ
活性は，グルコースやグルコース生合成系の中間体である
フルクトース-1, 6 -二リン酸，グルコース由来の電子伝達体
る。
12）
Biotin content (μg/100 g)
である NADH や NADPH によって亢進される。植物で
の ATP 産生やグルコース合成は葉緑体での光合成に依存
20
するため，ビオチン生合成経路の活性化には日照時間や光
の強度，栽培温度が強く影響すると推測される。事実，ビ
15
オチンは淡色野菜よりも緑色野菜に多く含有される（日本
*
10
*
6）
食品標準成分表 2010）。こうした傾向は葉緑体の含量に
**
左右される。淡色野菜では日照量の影響を受け難くなるた
め，水菜では季節変動が観察されなかったと推察される。
5
0
C
SI
NI
MLT
以上の結果から，緑色野菜中ビオチン含量には季節変動
LT
Fig. 2 Eﬀects of cultivation conditions of temperature and insolation on biotin contents in pea sprouts hydroponically cultivated without seeds. Data are expressed as mean ± SEM
(n = 5). *p < 0.05, **p < 0.001 as compared with C.
が存在し，その要因として栽培環境因子，特に日照量が強
く影響することが示唆された。冬期，日本海沿岸地方では
日照量が極端に低下するため，緑色野菜でビオチン含量の
低下が懸念される。正確な食品成分表を策定するためには，
冬期低日照地方における季節別の緑色野菜中ビオチン含量
野菜中のビオチン含量を Fig. 3 に示した。夏期に収穫
を詳細に検討することが必要と考える。
された野菜中のビオチン含量は，春菊 8.4 ± 0.34 µg/100 g，
謝辞
ほうれん草 5.3 ± 0.06 µg/100 g，水菜 2.5 ± 0.24 µg/100 g
であった。一方，冬期では，春菊 4.7 ± 0.33 µg/100 g，ほ
うれん草 2.5 ± 0.14 µg/100 g，水菜 2.3 ± 0.24 µg/100 g
であった。春菊とほうれん草では，夏期に対し冬期で，そ
本研究は，日本学術振興会科学研究費補助金（課題番号
21700776）を受けて行われたものである。
れぞれ 56 %，47 %と有意な低下を示し（p < 0.001）
，緑色
文献
野菜での季節変動が認められた。淡色野菜である水菜では，
こうした傾向は観察されなかった。
一般的に植物は，ビタミン B1 や B2，B6，葉酸といった
1）谷口歩美，大串美沙，武智隆祐，渡邊敏明（2005）わ
7）
B 群ビタミンを生合成している。食品成分の季節変動は，
が国の食品に含まれるビオチン量の分析．日本栄養・
食糧学会誌 58：185-198
日本食品標準成分表が五訂に改訂される際，詳細に検討さ
れている。しかし，多くの食品では成分値の変動に一定の
2）谷口歩美，武智隆祐，福嶋厚，渡邊敏明（2008）わが
傾向が認められず，科学的根拠による裏付けがなされな
国の食品中ビオチン含量の分析．日本栄養・食糧学会
かったことから，ほうれん草のビタミン C とかつおの脂
誌 61：27-36
質のみの記載にとどまっている。一方，ビオチンの生合成
3）曽根英行，安部恵，樋口睦，守木葵，小山田絵美，渡
経路は詳細に解明されている。前述したように，植物にお
邊敏明，宮西邦夫（2008）食品中ビオチン含量の地域
Biotin content (μg/100 g)
差と栽培環境因子による変動．微量栄養素研究 28：
54-58
10
8
6
4）Patton DA, Schetter AL, Franzmann LH, Nelson K,
Summer
Winter
Ward ER, Meinke DW (1998) An embryo-defective
mutant of arabidopsis disrupted in the ﬁnal step of
**
4
biotin synthesis. Plant Physiol. 116 : 935-946
5）Picciocchi A, Douce R, Alban C (2001) Biochemical
**
characterization of the arabidopsis biotin synthase
2
0
reaction. The importance of mitochondria in biotin
Shungiku
Spinach
synthesis. Plant Physiol. 127 : 1224-1233
Mizuna
6）曽根英行，守木葵，神山伸（2011）野菜中ビオチン含
Fig. 3 The seasonal diﬀerences of biotin contents in green vegetables between summer and winter. Data are expressed
as mean ± SEM (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.001 as compared
with Summer.
量の地域差および季節変動について．人間生活学研究
2：87-92
7）曽根英行，守木葵，神山伸（2011）栽培環境因子の違
― 72 ―
いがビオチン生合成に及ぼす影響について．人間生活
学研究 2：93-100
8）Patton DA, Johnson M, Ward ER (1996) Biotin synthase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol.
112 : 371-378
9) 小山田恵美 , 曽根英行 , 平岡真美 , 宮西邦夫 , 谷口敏
明 , 安田和人（2007）マイクロバイオアッセイによる
ビオチン定量法の確立とビオチンの栄養状態について．
微量栄養素研究 24：157-162
10) Ifuku O, Kishimoto J, Haze S, Yanagi M, Fukushima
S (1992) Conversion of dethiobiotin to biotin in cellfree extracts of Escherichia coli. Biosci Biotechnol
Biochem. 56(11) : 1780-1785
11) Sonoike, K (1996) Photoinhibition of Photosystem I : Its
Physiological Signiﬁcance in the Chilling Sensitivity of
Plants. Plant Cell Physiol. 37 : 239-247
12) Sonoike, K (1998) Various Aspects of Inhibition of
Photosynthesis under Light/Chilling Stress : Photoinhibition at Chilling Temperatures versus Chilling
Damage in the Light . J. Plant Res. 111 : 121-129
― 73 ―
Trace Nutrients Research 28 : 74−78（2011）
Original Article
Accumulation of manganese and zinc in growing Hijiki (Sargassum fusiforme) plants.
1）
†, 1 ）
1）
Masayuki KATAYAMA , Yohko SUGAWA-KATAYAMA , Motohiro KASAMA and Etsu KISHIDA
1）
Department of Health and Nutrition, Osaka Aoyama University ＊
2）
Department of Life and Health Science, Hyogo University of Teacher Education ＊＊
2）
Summary
Hijiki (Sargassum fusiforme) plants were collected during their growth period from the end of November through April
at the sea coast of Kushimoto, Wakayama, Japan. The samples were brought back to the laboratory under ice-cold conditions and washed thoroughly with artiﬁcial sea-water and distilled water successively. The plants were cut into pieces of a 10 cm length along the stalk, and separated into leaves and stalks. The samples were lyophilized, and decomposed in a mixture of conc H2SO4 and conc HNO3 (3 to 1, v/v) on an electric heater. Manganese (Mn) and zinc (Zn) in 1N
HCl were determined with an atomic absorption spectrophotometer.
Mn and Zn accumulated in the respective tissues at concentrations of 10 to 50 µg/g dry weight of tissues at the beginning of growth, and their concentrations remained at similar levels until the beginning of April. These may, as discussed,
suggest that the levels of Mn and Zn are their biochemically required concentrations in the tissues of Hijiki.
Keywords : Hijiki, Sargassum fusiforme; Manganese (Mn); zinc (Zn); growing Hijiki; atomic absorptionspectrophotometry;
seaweed.
Introduction
The harvested samples were immediately packed in an
ice-cold box and brought back to the laboratory on the
Brown algae, such as Hijiki (Sargassum fusiforme), grow
same day.
on rocks at the sea-coast of Japan, bathed by the Kuroshio
The sample plants were washed thoroughly with arti-
Current stream. Hijiki is familiar and used as a traditional
ficial sea water (three times) and distilled water (three
1）
food-stuﬀ in daily Japanese dishes . Hijiki is rich in some
2-3）
nutritionally beneﬁcial minerals
and it has high contents
4）
9）
times), successively. The samples, after blotted with ﬁlter
paper to remove extra water, were cut to pieces of a 10
cm length from the lower part to the top, and each piece
of dietary ﬁbers .
We intended to elucidate accumulation processes of zinc
was designated as a , b , c etc. They were separated to
stalks and leaves (Fig. 1), and placed in small polyethylene
and manganese during the growth of Hijiki plants.
bags, stored frozen under −30℃ , and lyophilized.
Materials and Methods
A-II
d'
1. Sampling of Hijiki plants
Hijiki, Sargassum fusiforme, (Harvey) Setchell*, were used.
c'
A-I
The embryos of Hijiki are ﬁxed on rocks and germinate
6-8）
in summer
.
b'
At the beginning of winter, they grow to
the primary-leaf stage through the germlings in autumn.
a'
10 cm
Early samples corresponding to this stage were collected
in November. After then, Hijiki grows to adult plants.
Filamentous
holdfast
The samples were collected at the time of the lowest tide
Branch, A
from the end of November through April on a ﬁxed rock
at the sea-coast of Kushimoto, Wakayama, Japan.
5)
* Newly proposed taxonomic name of Hizikia fusiforme Okam.
A stalk and leaves
Fig. 1 Fractionation of Hijiki plants.
After washing, the sample palnts were cut into pieces of 10 cm length, and
separated to respective tissues, a stalk and leaves. Their respective sections were designated as a', b', c', etc from the lower end to the upper end.
E -mail [email protected] To whom the correspondence should be sent.
Address：2-11-1 Niina, Mino-o City, Osaka 562-8580, Japan
＊＊ Address：942-1 Shimo-kume, Katoh City, Hyogo 673-1494, Japan
†
＊
― 74 ―
2. Ashing the samples
Table 1 Water contents in the Hijiki plants during growth.
Date of
harvest
A portion of each sample was decomposed in a mixture
of conc H2SO4 and conc HNO3 ( 3 to 1, v/v) on an electric
11/30/2008
heater for a few hr.
The decomposed samples were dissolved in 1 N HCl,
and Mn and Zn were determined with an atomic absorption spectrophotometer (Shimadzu AA-6200, Japan).
Date of
harvest
2/8/2009
of Wet weight Dry weight
Water contents
Samples* Tissues** Number
(g water/g wet weight of tissues)
leaves
(g)
(g)
A
B
E
F
K
Leaves
Stalks
A-2
Stalks
The samples in 1 N HCl were suctioned up with com-
A-3
Stalks
pressed air and burnt with acetylene gas using the Hol-
A-4
Stalks
A-1
Leaves
A-2
Leaves
A-3
Leaves
A-4
Leaves
low-Cathode lamps for manganese and zinc (Hamamatsu
Photonics Co. ltd.)
4. Reagents
The reagents were of the JIS Special Grade or its equivalent.
Manganese Standard Solution (JCSS) contained Mn, 1,000
mg/L as Mn(NO3 ) 2 in 0.1 N HNO3. Zinc Standard Solu-
Date of
harvest
3/11/2009
A-1
Stalks
A-2
Stalks
A-3
Stalks
A-1
Leaves
A-2
Leaves
A-3
Leaves
Results
1. Growth of the Hijiki plants
1-1.
The Hijiki plants, harvested at the end of Novem-
ber, were composed of 6 to 13 leaves in a stock (sample
number 1 to 5 in Table 1 ), the leaves show no visual
stalks, corresponding to the primary leaf stage. Their
lengths of the leaves were 2.13 ± 1.13 cm. The water contents in the fresh leaves were mostly 88 %. These plants
of the primary leaf stage contained several percent-less
water than those of the samples harvested in February,
suggesting that they were in a rather mature state.
Date of
harvest
4/12/2009
A-1
Stalks
A-2
Stalks
A-3
Stalks
A-1
Leaves
contents in the respective sections were 85 to 88 % of the
stalk weight and 90 to 91 % of the leaf weight.
These
trends were observed in the samples harvested in March
and April (Table 1 ). The leaves of the upper sections had
higher contents of water than those of the lower sections,
reflecting their maturity.
The water contents of the
leaves were higher than those of the stalks in the same
A-2
sections, suggesting that immature leaves co-exist among
these leaves, especially in the upper sections.
A-3
2. Accumulation of Mn (Table 2)
2-1.
In the Hijiki plants of the primary-leaf stage har-
vested in November, the manganese contents were 7
0.891
0.890
0.876
0.876
0.888
c
b
a
b
a
b
a
b
a
0.0688
0.6070
0.4863
0.1865
0.3741
0.2837
0.4080
0.1139
0.3808
0.0104
0.0850
0.0738
0.0212
0.0485
0.0342
0.0500
0.0134
0.0466
0.849
0.860
0.848
0.886
0.870
0.880
0.877
0.883
0.878
c
b
a
b
a
b
a
b
a
1.1991
2.1814
1.0568
1.1957
0.6428
1.1504
0.6423
0.5573
0.5837
0.1146
0.2354
0.1047
0.1142
0.0606
0.1095
0.0588
0.0525
0.0552
0.904
0.892
0.901
0.904
0.906
0.905
0.908
0.906
0.905
d
c
b
a
d
c
b
a
d
c
b
a
0.5369
0.7266
0.7363
0.5749
0.4166
0.7172
0.7184
0.5897
0.0742
0.6088
0.6382
0.5203
0.0801
0.1213
0.1282
0.1050
0.0587
0.1130
0.1219
0.0992
0.0102
0.0883
0.0942
0.0845
0.851
0.833
0.826
0.817
0.859
0.842
0.830
0.832
0.863
0.855
0.852
0.838
d
c
b
a
d
c
b
a
d
c
b
a
4.5252
2.7554
2.4778
0.7324
3.6957
2.5382
2.5854
0.2301
0.7658
2.7152
1.6423
0.6545
0.4458
0.3028
0.2658
0.0766
0.3680
0.2788
0.2720
0.0264
0.0699
0.2766
0.1652
0.0702
0.901
0.890
0.893
0.895
0.900
0.890
0.895
0.885
0.909
0.898
0.899
0.893
weight Dry weight
Water contents
Samples* Tissues Sections*** Wet (g)
(g water/g wet weight of tissues)
(g)
1-2. In February, the Hijiki stalks grew to 12-17 cm in
length, showing the shape of an adult plant. The water
0.1759
0.1174
0.0612
0.0734
0.0543
weight Dry weight
Water contents
Samples* Tissues Sections*** Wet (g)
(g water/g wet weight of tissues)
(g)
tion (JCSS) contained Zn, 1,000 mg/L as Zn(NO3) 2 in 0.1 N
HNO3.
1.6187
1.0672
0.4927
0.5906
0.4844
weight Dry weight
Water contents
Samples* Tissues Sections*** Wet (g)
(g water/g wet weight of tissues)
(g)
A-1
3. Atomic absorption spectrophotometry
13
9
7
12
6
e
d
c
b
a
d
c
b
a
c
b
a
e
d
c
b
a ****
Leaves
d
c
b
a
Leaves
c
b
a
0.7400
1.0452
1.0735
1.9837
0.7316
0.7298
0.9725
0.8293
0.6894
0.0996
0.6523
0.5625
0.0980
0.1534
0.1858
0.1923
0.1353
0.1033
0.1522
0.1495
0.1178
0.0147
0.0954
0.0899
0.868
0.853
0.827
0.903
0.815
0.859
0.844
0.820
0.829
0.853
0.854
0.840
5.4560
4.5284
4.0549
1.9361
0.5161
0.4521
0.4266
0.2163
0.905
0.900
0.895
0.888
―
―
―
5.1128
3.9871
1.7084
0.1075
0.9063
1.8905
0.6173
0.4923
0.4216
0.1765
0.0112
0.0847
0.1990
0.0571
0.904
0.894
0.897
0.896
0.907
0.895
0.907
* A,B, E etc are designated to the respective stocks.
** No stalks were recognized for the sample harvested on 2008-11-30.
*** a is designized to the bottom section (lower sectin of the stalk), and the valuecolumns were arranged in the order from the top section to the bottom section of
the stalks.
**** No leaves.
― 75 ―
Table 2 Manganese concentrations in the Hijiki plants during growth.
µg Mn / g dry
weight
6. 863
8. 782
7. 114
13. 259
15. 961
Dates of harvest
Samples*
Tissues**
Sections**
11/30/2008
A
B
E
F
K
Leaves
13
9
7
12
6
µg Mn / g dry
weight*
27. 873
62. 700
34. 062
32. 784
28. 159
µg Mn / g dry
weight
20. 630
9. 998
8. 840
25. 170
12. 635
Date of harvest
Samples*
Tissues
Sections***
µg Mn / g dry
weight*
2/8/2009
A-1
Stalks
c
b
a
b
a
b
a
b
a
Date of harvest
Samples*
Tissues**
11/30/2008
A
B
E
F
K
Leaves
Date of harvest
Samples*
Tissues
Sections***
2/8/2009
A-1
Stalks
c
b
a
b
a
b
a
b
a
A-2
Stalks
A-3
Stalks
A-4
Stalks
A-1
Leaves
A-2
Leaves
Table 3 Zinc concentrations in the Hijiki plants during growth.
Number of
leaves
13
9
7
12
6
―
10. 700
42. 117
12. 854
c
b
a
b
a
b
a
b
a
12. 894
5. 215
8. 055
6. 223
Stalks
A-3
Stalks
A-4
Stalks
A-1
Leaves
A-2
Leaves
Leaves
A-3
Leaves
A-4
Leaves
A-4
Leaves
Date of harvest
Samples*
Tissues
Sections***
3/11/2009
A-1
Stalks
A-2
Stalks
A-3
Stalks
d
c
b
a
d
c
b
a
d
c
b
a
µg Mn / g dry
weight
26. 014
5. 704
8. 220
7. 785
29. 587
11. 832
15. 139
16. 984
26. 471
8. 283
6. 187
23. 406
Date of harvest
Samples*
3/11/2009
A-1
Leaves
A-2
Leaves
A-3
Leaves
d
c
b
a
d
c
b
a
d
c
b
a
10. 915
14. 054
11. 725
17. 797
5. 620
7. 763
9. 285
36. 208
22. 570
9. 203
14. 855
26. 802
Date of harvest
Samples*
Tissues
Sections***
4/12/2009
A-1
Stalks
A-2
Stalks
A-3
Stalks
e
d
c
b
a
d
c
b
a
c
b
a
µg Mn / g dry
weight
5. 469
10. 804
17. 381
10. 692
17. 946
11. 750
9. 552
7. 480
10. 541
47. 347
8. 993
11. 548
A-1
Leaves
A-2
Leaves
A-3
Leaves
10. 411
8. 183
5. 899
4. 739
Tissues
Sections***
A-1
Stalks
A-2
Stalks
A-3
Stalks
d
c
b
a
d
c
b
a
d
c
b
a
µg Mn / g dry
weight*
12. 466
4. 835
8. 255
17. 314
29. 028
10. 923
12. 616
8. 408
74. 740
13. 013
11. 944
14. 773
A-1
Leaves
A-2
Leaves
A-3
Leaves
d
c
b
a
d
c
b
a
d
c
b
a
8. 699
9. 439
10. 839
12. 645
5. 873
9. 314
11. 856
41. 554
15. 670
7. 757
13. 869
29. 454
Date of harvest
Samples*
Tissues
Sections***
4/12/2009
A-1
Stalks
A-2
Stalks
A-3
Stalks
e
d
c
b
a
d
c
b
a
c
b
a
µg Mn / g dry
weight*
6. 637
4. 763
5. 248
6. 239
9. 869
5. 097
4. 955
8. 173
12. 686
29. 116
6. 087
8. 241
A-1
Leaves
A-2
Leaves
A-3
Leaves
14. 332
18. 067
20. 429
27. 943
2. 500
2. 642
4. 695
5. 108
―
5. 361
7. 601
14. 383
93. 346
14. 883
8. 082
25. 325
* A,B, E etc are designated to the respective stocks.
** No stalks were recognized for the sample harvested on 2008-11-30.
*** a is designized to the bottom section (lower sectin of the stalk) and the valuecolumn was arranged from the top section to the bottom section of the stalks.
**** No leaves.
*, **, ***, ****
― 76 ―
―
2. 132
3. 222
4. 189
c
b
a
b
a
b
a
b
a
―
A-3
e
d
c
b
a ****
d
c
b
a
c
b
a
A-2
―
4. 942
5. 085
3. 081
1. 617
e
d
c
b
a ****
d
c
b
a
c
b
a
Same as described in the legends of Table 2.
―
5. 241
9. 124
6. 543
6. 354
4. 366
5. 018
5. 811
7. 835
―
4. 135
6. 656
9. 716
46. 198
1. 283
6. 710
9. 131
to 16 µg Mn/g dry weight, corresponding to 0.12 to 0.29
leaves of the lower sections of the stalks showed higher
microgram-atom/g dry weight of the tissues.
concentrations of manganese than the stalk fraction. If
these elements are viewed as enzymatic active sites in
2-2.
The leaves harvested in February showed lower
polysaccharide biosynthesis, the higher accumulation of
manganese contents than those harvested in March and
manganese (Table 2 ) in the lower sections is interesting.
April. In most stalks, the leaves of the lowest sections,
The higher manganese accumulations in the uppermost
designated as a in Table 2, showed highest manganese
sections may also indicate greater necessity for enzymat-
concentrations in a stalk. These may indicate that a lon-
ic activities in polysaccharide biosynthesis and photosyn-
ger time of accumulation resulted in a higher concentra-
thesis.
The zinc accumulation may be related to carbonate de-
tion of manganese in the respective sections.
hydratase activity in the CO2 assimilating process, since it
2-3.
In the stalks, the highest concentration of manga-
is known that, under the higher CO2 utilizing conditions,
nese was often found in the highest sections designated as
greater activities of this enzyme occurred . It is our sub-
c or d , in contrast to the leaves.
ject to investigate the reason why the most upper sections
10）
including the apex accumulated highest concentrations of
3. Accumulation of Zn (Table 3)
zinc (more than 29 µg/g dry matter ) in a stalk, and why
3-1.
In the Hijiki plants harvested in November, the zinc
some samples, such as those harvested in March and April,
contents were 30 µg/g dry weight in most stocks, except
accumulated higher zinc concentrations in the leaves in
one which contained more than 60 µg Zn/g dry weight.
the lowest sections (Table 3 ).
Out of several brown algae used as food stuﬀs, Hijiki is
These values correspond to 0.43 to 0.96 microgram-atom
Zn/g dry weight of tissues.
an alga (seaweed) remarkably rich in nutritionally beneﬁ2, 3）
cial elements
3-2.
.
This will be an attractive property of
1）
In the leaves harvested in February, the zinc
Hijiki as a foodstuﬀ to contribute to the longevity of Jap-
contents were lower than those harvested in March and
anese. On the other hand, Hijiki often accumulates large
April. During the growth of the tissues, zinc is to be ac-
concentrations of arsenic
cumulated more in the mature tissues. In the leaves of
as a pre-cooking process of dried Hijiki, could be effec-
the lowest section, designated as a in Table 3, the highest
tively employed to remove most of the arsenic levels
concentration of zinc in the stalk was often found.
in Hijiki.
2, 11-14）
. However, water-soaking,
15-17）
Moreover, Hijiki has been found to have a remarkable
3-3.
In the stalks, the zinc content was also higher in the
samples harvested in March and April.
18）
preventive effect on colon carcinogenesis . Thus, Hijiki
will deserve recommendation as a daily usable foodstuff,
The zinc concentrations in the lowest section designated
by practicing appropriate pre-cooking processes.
as a in Table 3 in the respective stalks as well as those in
References
the highest sections designated as d often showed greater
levels than those of the middle sections.
1）Health service Bureau, Ministry of Health and Welfare, Japan (1989) Japan National Nutrition Survey, To-
Discussion
kyo, Japan.
During the accumulation of zinc in the tissues, some prop-
2）Suzuki Y, Tanusi S (1993) 15
th
group- ALGAE. in
erties of manganese, which is replaceable for zinc in the
Table of Trace Element Contents in Japanese Foodstuffs,
biochemical reactions of zinc-containing enzymes, may not
ed. by Suzuki Y, Tanusi S, Dai-ichi Shuppan, Tokyo:
be dispensed with, and this may aﬀect somewhat the ac-
pp.152-153 (in Japanese).
cumulating processes of these elements. In the samples
3）Resources Council, Science and Technology Agency,
of November, the levels of zinc as well as manganese are
Japan (editor) (2000) Standard Tables of Food Composition
not uniform; but when these concentrations are expressed
in Japan, 5th revised ed., Ministry of Finance, Tokyo,
in gram-atom and those of both elements are summed up,
Japan
the summed values are more uniform, 0.55 to 1.11 micro-
4）Mori B, Kusima K, Iwasaki T, Omiya H (1981) Dietary
gram-atom/g dry matter, than the individual concentra-
ﬁber content of seaweed. Nippon Nogei Kagakukaishi
tions.
(Jpn J Agr Chem Soc) 55: 787-791.
In the adult type plants harvested after February, the
5）Yoshida T, Yoshinaga K, Nakajima Y (2000) Check list
― 77 ―
of marine algae of Japan (Revised in 2000). Jpn J Phy-
13）Sugawa-Katayama Y, Katayama M, Sakiyama C, Nakano Y, (2003) Distribution of accumulated arsenic in
col (Sorui), 48: 113-166 (2000).
the seaweed Hijiki, Sargassum fusiforme (Harvey) Setch-
6）Suto S (1951) On shedding of eggs, liberation of embryos and their later ﬁxing in Hijikia fusiforme. Nihon
ell (5) Trace Nutrients Research 20: 73-79.
14）Katayama M, Yamamoto Y, Sawada R, Sugawa-Kata-
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7）Suto S (1951) On growth of Bush in Hijikia fusiforme.
yama Y (2008) Distribution of accumulated arsenic in
the seaweed Hijiki, Sargassum fusiforme (Harvey) Setch-
Nihon Suisan Gakkaishi 17: 13-14.
ell (6) J Osaka Aoyama University 1: 29-34.
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Atlas of the Life History of Algae (Uchida Rokakuho
15）Sugawa-Katayama Y, Katayama M, Arikawa Y,
Yamamoto Y, Sawada R, Nakano Y (2005) Diminution
Pub. Co. Lyd, Tokyo) 2: 166-167.
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Nutrients Research 22:107-109.
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Team, Biology Environment Control , Published by
the Japan Society for Promotion of Science) P337-340.
17）Katayama M, Sugawa-Katayama Y, Yamaguchi Y,
11）Katayama M, Sakiyama C, Nakano Y, Sugawa-Kata-
Murakami K, Hirata S (2008) Effect of temperature
yama Y (2001) Distribution of accumulated arsenic in
on the extraction of various arsenic compounds from
the seaweed Hijiki, Hizikia fusiforme Okam. (1) Trace
dried Hijiki, Sargassum fusiforme by water-soaking as
Nutrients Research 18: 29-34.
a pre-cooking process. Trace Nutrients Research 25:
134-138.
12）Sakiyama C, Katayama M, Nakano Y, Sugawa-Katayama Y (2004) Distribution of accumulated arsenic in
18）Sugawa-Katayama Y, Katayama M, Oku K, Yamaguchi
the seaweed Hijiki, Sargassum fusiforme (Harvey) Setch-
Y, Murakami K (2011) Suppressive eﬀect of Hijiki on
ell (4) Bull Fac Human Environ Sci. Fukuoka Women s
colon carcinogenesis induced by DMH in mice. XIth
University 35: 101-106.
Asian Congress Nutrition, Abstract book, 197 (PD2-046).
― 78 ―
Trace Nutrients Research 28 : 79−83（2011）
原著
市販離乳食からのヨウ素とクロムの摂取量の推定
吉田宗弘，野崎詩乃，乾由衣子
＊
（関西大学化学生命工学部食品工学研究室）
Estimation of Iodine and Chromium Intakes from Commercial Baby Foods
Munehiro YOSHIDA, Shino NOZAKI and Yuiko INUI
Laboratory of Food and Nutritional Sciences, Faculty of Chemistry,
Materials and Bioengineering, Kansai University
Summary
To estimate iodine and chromium intake in Japanese infants dependent on commercial baby food and human milk, 53
commercial baby food samples (24 samples for ≥ 7-month-old baby and 29 samples for ≥ 9-month-old baby) were collected
and their iodine and chromium concentrations were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry. The
iodine concentrations were markedly elevated by the use of kombu or hijiki and their medians (25-75 percentile) in baby
food for a ≥ 7-month-old baby and a ≥ 9-month-old baby were 30 (21-103) and 42 (27-1045) ng/g wet weight, respectively.
Mean iodine intake by 6 to 8-month-old babies and 9 to 11-month-babies was estimated to be 144 and 691 µg/d, respectively although their medians were estimated to be 89 and 84 µg/d, respectively. On the other hand, chromium concentrations (median (25-75 percentile)) in baby foods for a ≥ 7-month-old baby and a ≥ 9-month-old baby were 12 (7-12) and
10 (7-16) ng/g wet weight, respectively. Mean chromium intake by 6 to 8-month-old babies and 9 to 11-month-babies
was estimated to be 8 and 10 µg/d, which were about 10 times higher than the value shown as the Adequate Intake in
the Dietary Reference Intakes for Japanese. These results indicate that intermittent high-iodine baby food ensures suﬃcient iodine intake, and chromium intake is increased in Japanese infants after beginning to eat baby food.
わが国の食事摂取基準では，現在の日本の乳児において，
ン，セレン，モリブデン濃度を測定し，市販離乳食と母乳
栄養素の不足・過剰に起因する顕著な健康障害が認められ
に依存した場合の 6 か月以降乳児におけるそれらの摂取量
ないという事実をふまえ，各栄養素の母乳中濃度にもとづ
を推定し，報告した。今回，同じ収集試料について，ヨ
いて，生後 6 か月未満乳児の栄養素摂取の目安量を設定し
ウ素とクロム濃度を測定し，前報と同様に，市販離乳食と
ている。一方，生後 5 か月を経過すると，多くの乳児は母
母乳に依存した場合の 6 か月以降乳児におけるこれらの摂
乳とともに離乳食を摂取し始める。したがって，生後 6 か
取量を推定したので報告する。
2）
月以降に関しては，母乳と離乳食からの栄養素摂取量にも
実験方法
とづいた目安量の策定，もしくは 1 歳以降と同様に，推定
平均必要量にもとづいて摂取の推奨量を設定するのが妥当
である。しかし，微量ミネラルの場合，2010 年版食事摂
1．試料の収集
取基準では，6 か月以降乳児に対して，鉄が推定平均必要
2008 年の 6 月から 10 月にかけて，5 つの国内メーカー
量と推奨量，銅とマンガンが離乳食摂取を考慮した目安量
より，レトルト，もしくは瓶詰めの状態で販売されていた
が設定され，その他に関しては生後 6 か月未満乳児に対す
離乳食 53 食を購入し，微量ミネラル測定用の試料とした。
る目安量を体重にもとづいて外挿した値を目安量としてい
収集した離乳食は「7 か月頃より」の表示のあるのが 24
1）
る。これは，6 か月以降乳児を対象とした，栄養素必要
食，「9 か月頃より」の表示のあるのが 29 食であった。
量に関する研究や栄養素摂取量調査が不十分であることに
2．分析
起因している。
われわれは，市販離乳食の利用頻度が増加していること
収集した離乳食は，1 食ごとにすべてを凍結乾燥後，ミル
から，市販離乳食を収集して，その鉄，亜鉛，銅，マンガ
（Retsch GM200）で均一・細粉化した。細粉化した試料
所在地：吹田市山手町3-3-35（〒564-8680）
＊
― 79 ―
結果
200 mg に 20 ng/mL のテルルを含む 0.5 ％テトラメチルア
ンモニウムヒドロキシド溶液 40 mL を加え，室温で一夜
放置した。さらに，60 ℃で 4 時間加熱後，遠心および濾
離乳食のヨウ素濃度の測定結果を Fig. 1 と Table 1 にま
過を行い，抽出液を得た。抽出液中のヨウ素を，テルルを
とめた。離乳食のヨウ素濃度は試料ごとの変動が大きく，
内部標準として，誘導結合プラズマ質量分析器（島津
最小値と最大値との間に約 100 倍の差を認めた。すなわち，
ICPM-8500）を用いて定量した。一方，これとは別に，細
約半数は湿重量あたり 50 ng/g 未満であり，日本人の母乳
粉化試料 500 mg を磁製るつぼに入れ，550 ℃で 16 時間加
中ヨウ素濃度（133 ng/mL）よりも低かったが，湿重量あ
熱した。灰化後の残渣を 20 ng/mL のロジウムを含む
たり 1 µg/g を超える離乳食も 10 試料近くあった。7 か月
0.1 M 硝酸に溶解し，含有されるクロムを，ロジウムを内
以降用と 9 か月以降用を比較した場合，中央値には大きな
部標準として，誘導結合プラズマ質量分析器を用いて定量
差がなかったが，湿重量あたり 1 µg/g を超えるものがい
した。分析に用いた質量数は以下のとおりである。クロム，
ずれも 9 か月以降用であったため，75 パーセンタイル値
52；ロジウム，103；ヨウ素，127；テルル，126，128，130。
においては 9 か月以降用が大きく上回っていた。
今回収集した 53 種の市販離乳食中，15 の試料について
3．市販離乳食からのヨウ素とクロムの摂取量の推定
は，「昆布だし」，「昆布エキス」などのように，食材に昆
分析結果をもとに，各離乳食について，離乳食湿重量（g）
あたりとエネルギー（kcal）あたりのヨウ素とクロムの濃
布の使用が明記されていた。そこで，市販離乳食の湿重量
あたりヨウ素濃度を，昆布使用表示の有無別に比較し，
度を求めた。本研究で収集した離乳食は「7 か月頃より」， Table 2 にまとめた。両者のヨウ素濃度には極端な違いが
および「9 か月頃より」の表示があったことから，1 日の
10000
離乳食をすべて単一の製品に依存したと仮定し，6 ∼ 8 か
For 7 or more month baby
Iodine content (ng/g wet weight)
月児が前者，9 ∼ 11 か月児が後者を摂取した場合のヨウ素
とクロムの摂取量を以下の式にもとづいて算定した。
［ヨウ素またはクロム摂取量］
＝［各離乳食のエネルギーあたりのヨウ素またはクロム
濃度］×［ 6 ∼ 8 か月児，または 9 ∼ 11 か月児の離乳
食からのエネルギー摂取量の報告値の平均値（6∼8
3）
か月児 171 kcal/d， 9 ∼ 11 か月児 452 kcal/d）］。
さらに，この算定した市販離乳食からのヨウ素またはク
ロム摂取量に，日本人の食事摂取基準 2010 年版で採用され
ている母乳中ヨウ素またはクロム濃度（ヨウ素，133 ng/mL；
1）
クロム，1.0 ng/mL）と乳児の母乳摂取量（6 ∼ 8 か月児，
4，5）
600 mL/d；9 ∼ 11 か月児，450 mL/d）
For 9 or more month baby
1000
100
から算定される
10
母乳由来のヨウ素またはクロム摂取量を加え，市販離乳食
0
20
と母乳を摂取した場合のヨウ素またはクロム摂取量をもと
めた。
40
60
80
100
Percentile
Fig. 1 Percentile curve of iodine content of commercial baby foods.
Table 1 Iodine concentrations in commercial baby foods
For 7 or more month baby（n = 24）
ng/g wet weight
ng/kcal
Minimum
25 percentile
Median
75 percentile
Maximum
Mean
Geometrical mean
13
21
30
103
1152
159
53
For 9 or more month baby（n=29）
ng/g wet weight
ng/kcal
29
41
51
174
2818
378
99
16
27
42
1045
3558
629
125
28
41
54
432
9489
1396
205
Table 2 Eﬀect of use of kombu on iodine concentration of commercial baby foods
Use of kombu
＋（n＝15）
−（n＝38）
Mean
1340
51
Iodine concentration（ng/g wet weight）
Geometric mean
Median
Minimum
920
33
1151
37
149
13
Maximum
3558
614
The Mann-Whitney test showed that diﬀerence between + and − in iodine concentration was signiﬁcant（p < 0.05）.
― 80 ―
認められ，昆布使用明記の離乳食はいずれも明らかに高い
400
For 7 or more month baby
Chromium content (ng/g wet weight)
ヨウ素濃度を示した。昆布使用が明記されていない離乳食
の中で，一部の昆布使用離乳食よりも高いヨウ素濃度示し
たのが 3 試料あったが，これらは，
「鰹とヒジキの煮つけ」，
「とりヒジキごはん」などであり，相当量のヒジキが使用
されたものだった。
離乳食のクロム濃度の測定結果を Fig. 2 と Table 3 にま
とめた。離乳食のクロム濃度は試料ごとの変動が小さく，
そのほとんどが湿重量あたり 20 ng/g 未満であり，100 ng/g
を超えたのは 53 試料中 1 試料のみだった。また，7 か月
以降用と 9 か月以降用との間に差は認められなかった。
1 日の離乳食をすべて単一の製品に依存すると仮定した
上で，6 ∼ 8 か月児または 9 ∼ 11 か月児が，今回測定対象
とした離乳食と母乳を摂取した場合のヨウ素またはクロム
350
For 9 or more month baby
300
250
200
150
100
50
の摂取量を算定し，Table 3 と Fig. 3 にまとめた。ヨウ素
0
0
摂取量の中央値は，6 ∼ 8 か月児が 89 µg/d，9 ∼ 11 か月
20
40
60
80
児が 84 µg/d であり，母乳のみの摂取を想定して策定さ
Fig. 2 Percentile curve of chromium content of commercial baby
foods.
れている食事摂取基準 2010 年版における 6 か月以降乳児
のヨウ素の目安量（130 µg/d）を下回った。しかし，平
均値は，高ヨウ素濃度の試料が散見されたことを反映し，
Table 3 Chromium concentrations in commercial baby foods
For 7 or more month baby（n = 24）
ng/g wet weight
ng/kcal
Minimum
25 percentile
Median
75 percentile
Maximum
Mean
Geometrical mean
4
7
12
18
303
26
13
For 9 or more month baby（n = 29）
ng/g wet weight
ng/kcal
7
15
20
29
397
45
24
4
7
10
16
31
12
11
(a)
(b)
6 to 8 month baby
6 to 8 month baby
Chromium intake (μg/d)
Iodine intake (μg/d)
1000
100
10
6
11
18
25
63
21
18
80
10000
9 to 11 month baby
0
20
40
60
80
100
Percentile
100
Percentile
60
9 to 11 month baby
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Percentile
Fig. 3 Percentile curve of estimated iodine (a) or chromium (b) intake from breast milk and commercial
baby foods.
― 81 ―
6 ∼ 8 か月児が 144 µg/d，9 ∼ 11 か月児が 691 µg/d であっ
11 か月児のヨウ素摂取量の平均値 691 µg/d は，間欠的に
た。とくに 9 ∼ 11 か月児では，9 か月児以降用離乳食のい
生じる高ヨウ素摂取を含めた平均的な値に位置づけられる
くつかが湿重量あたり 1 µg/g 以上であったことを反映し，
だろう。
このように市販離乳食を利用する乳児においては，間欠
食事摂取基準 2010 年版の耐容上限量である 250 µg/d を
的に高ヨウ素濃度の製品を摂取する機会があるため，平均
上回っていた。
一方，クロムの摂取量は，試料間の変動の小ささを反映
的に食事摂取基準におけるヨウ素の耐容上限量を超える摂
し，6 ∼ 8 か月児，9 ∼ 11 か月児にかかわりなく，平均値，取が生じている可能性が高い。乳児のヨウ素摂取量の耐容
幾何平均値，中央値のいずれもが 4 ∼ 10 µg/d の範囲で
上限量は，高ヨウ素摂取の母親から出生し，甲状腺機能低
あった。
下を示した母乳哺育児のヨウ素摂取量にもとづき策定され
1）
ている。したがって，間欠的と考えられる離乳食からの
考察
高ヨウ素摂取が，母乳からの連続的摂取と同様に，ただち
に甲状腺機能低下を起こすとは考えにくい。しかし，離乳
Table 1 に示したように，9 か月以降用市販離乳食の湿
食開始月齢が以前よりも相当早期となっていること，およ
重量あたりヨウ素濃度の 75 パーセンタイル値は 1 µg/g
び以前の離乳食は重湯などのように味付けをほとんど行っ
を超えていた。このことは 9 か月以降用市販離乳食の約 4
ていなかったことを考慮すると，このような高ヨウ素離乳
分の 1 が高ヨウ素濃度であることを意味している。昆布を
食の 1 歳未満乳児への投与の歴史は新しいと考えられる。
はじめとする海藻類，および昆布を原料とした調味料には
体質的にヨウ素の影響を受けやすい乳児が存在するという
高濃度のヨウ素が含まれることがよく知られている
6, 7）
8）
。
指摘もあることから，とくに昆布だしを使用した離乳食
今回，Table 2 に示したように，高ヨウ素濃度の離乳食が
の摂取がもたらす高ヨウ素摂取の影響については注視する
いずれも昆布だしまたはヒジキを使用したものであったこ
ことが必要だろう。
とは，昆布だしやヒジキの摂取が多量のヨウ素摂取につな
がることを明確に示すものといえる。
一方，ヨウ素摂取量推定値の中央値は，6 ∼ 8 か月児が
89 µg/d，9 ∼ 11 か月児が 84 µg/d であった。平均的なヨ
今回測定した市販離乳食の中で，レトルトタイプのもの
ウ素濃度の母乳からのヨウ素摂取を 6∼8 か月児で約
は，ほとんどが 1 袋あたりの湿重量が 80 g（エネルギー量
80 µg/d（133 ng/mL×600 mL/d）
，9∼11か月児で約 60 µg/
が 30∼80 kcal）
，瓶詰めタイプのものは，ほとんどが 1 瓶
d（133 ng/mL × 450 mL/d）と見積もっていることから，
あたりの湿重量が 130 g（エネルギー量が約 100 kcal）だっ
この中央値は，離乳食の半数以上が 20 µg/d 未満のヨウ
た。この量は 1 日の離乳食全体の数分の 1 未満に過ぎない。素しか供給できないことを意味している。つまり，母乳と
それでも湿重量当たりで 1 µg/g を超える高ヨウ素濃度の
合わせて目安量相当のヨウ素摂取を実現できる離乳食はき
製品の場合，1 袋または 1 瓶を食べきった場合のヨウ素摂
わめて少なく，現実には間欠的に摂取する高ヨウ素濃度の
取量は 100 ∼ 350 µg となる。1 日の離乳食をすべてこのよ
離乳食によって必要なヨウ素量を確保しているともいえる。
うな高ヨウ素濃度の製品に依存することは考えにくいが，
さらに，乳幼児期に昆布だしを摂取させることは，日本人
1 回利用すれば母乳や他の離乳食からの摂取分が加わるこ
としての健全な味覚の発達にとっては必要と思われる。し
とで容易に 500 µg/d 近い摂取量となる。したがって，4
たがって，市販離乳食においては，昆布だしの使用を控え
分の 1 の確率で高ヨウ素の離乳食を利用することを考えれ
るのではなく，昆布だしやヒジキなど海藻類を使用してい
ば，Table 3 に示した離乳食と母乳を摂取した場合の 9 ∼
る場合は，ヨウ素濃度を明記し，適切な利用回数を示すな
Table 4 Estimation of iodine and chromium intake from commercial baby foods and breast milk in 6 to 8 or 9 to 11
month infants
Iodine（µg/d）
Minimum
25 percentile
Median
75 percentile
Maximum
Mean
Geometrical mean
Criteria in DRI-J 2010*
Adequate intake
Tolerable upper intake level
Chromium（µg/d）
6 to 8 months
（n = 24）
9 to 11 months
（n=29）
6 to 8 months
（n = 24）
9 to 11 months
（n=29）
85
87
89
110
562
144
116
72
77
84
858
4349
691
224
2
3
4
6
68
8
5
3
6
9
12
29
10
9
130
250
* Dietary Reference Intakes for Japanese, 2010.
― 82 ―
1
−
参考文献
どの対応を行うべきだと考える。同様に，家庭における離
乳食に対しても，昆布だしの適切な使用頻度について一定
の目安を示すことが必要であろう。
1）厚生労働省（2009）日本人の食事摂取基準［2010 年
なお，繰り返しになるが，乳幼児も含めて日本人は昆布
を利用することによって適切なヨウ素摂取を確保している。
版］，第一出版，東京，pp. 218-275.
2）吉田宗弘，乾由衣子，福永健治（2009）乳児におけ
前段とはやや矛盾した表現にはなるが，現実にヨウ素過剰
る市販離乳食からの微量ミネラルの摂取．微量栄養素
障害の報告がほとんどない事実をふまえれば，おそらく現
研究 26：41-45.
在の日本人の昆布の利用と摂取頻度に大きな問題はないも
3）中埜拓，加藤健，小林直道，島谷雅治，石井恵子，
のと判断できる。ただし，このような経験的事実を数値に
瀧本秀美，戸谷誠之（2003）乳幼児の食生活に関する
よって裏付け，そして高摂取にも関わらず過剰障害が生じ
全国実態調査．離乳食および乳汁からの栄養素等の摂
ない理由を解明することが研究者に課せられた使命である
取状況について，小児保健研究 62：630-639．
と思う。
4）米山京子，後藤いずみ，永田久紀（1995）母乳の栄養
他方，市販離乳食のクロム濃度は試料間の差が小さく，
大半が湿重量あたり 20 ng/g 未満だった。唯一 100 ng/g
成分の授乳月数に伴う変動，日公衛誌 42：472-481.
5）米山京子（1998）母乳栄養児の発育と母乳からの栄養
を超えたのは「豆腐と野菜とひき肉のあんかけ」だったが，
他の豆腐や肉類を使用した離乳食のクロム濃度が低値であ
素摂取量，小児保健研究 57：49-57.
6）菊池有利子，武林亨，佐々木敏（2008）日本で市
ることを考慮すると，この高クロム濃度は離乳食製造過程，
販されている食品中のヨウ素含有量．日衛誌 63：
もしくは分析中の汚染である可能性が高い。母乳と市販離
724-734.
乳食を摂取した場合のクロム摂取量推定値は，平均で約
7）布施養善，大橋俊則，紫芝良昌，入江實（2010）日
10 µg/d であり，75 パーセンタイル値もこれに近い値だっ
本人のヨウ素摂取量推定のための加工食品類のヨウ素
た。病院普通食の分析結果
9）
や一般家庭食事の分析例
10）
含有量についての研究．日臨栄会誌 32：26-51.
からは，成人のクロム摂取量が 20 ∼ 70 µg/d と考えられ
8）Nishiyama S, Mikeda T, Okada T, Nakamura K, Kotani
ることから，今回の市販離乳食を利用する乳児のクロム摂
T, Hishinuma A (2004) Transient hypothyroidism or
取量の推定値（約 10 µg/d）はほぼ妥当なものと判断でき
persistent hyperthyrotropinemia in neonates born to
る。この値は，母乳のみの摂取を想定して策定されている
mothers with excessive iodine intake. Thyroid 14:
食事摂取基準における 6 か月以降乳児に対するクロムの目
1077-1083.
安量（1 µg/d）の約 10 倍である。したがって，マンガン
9）吉田宗弘，児島未希奈，三由亜耶，森田明美（2011）
2）
やモリブデンと同様に，クロムは離乳食を開始すること
病院および介護施設の食事からの微量ミネラル摂取量
によってその摂取量が急激に増加するといえるだろう。た
の計算値と実測値との比較．微量栄養素研究 28：
だしクロムに関しては，必須元素ではないという報告も提
27-31.
11）
出されている。したがって，離乳食からのクロム摂取量
10）池辺克彦，田中之雄，田中凉一（1988）陰膳方式によ
については，極端な高摂取が生じる可能性がないことを確
る 15 金属元素の一日摂取量について．食衛誌 29：
52-57.
認するだけで十分かもしれない。
11）Di Bona KR, Love S, Rhodes NR, McAdory D, Sinha
本研究は，平成 23 年度厚生労働科学研究費補助金（循
SH, Kern N, Kent J, Strickland J, Wilson A, Beaird J,
環器疾患等生活習慣病対策総合研究事業：日本人の食事摂
Ramage J, Rasco JF, Vincent JB (2011) Chromium is
取基準の改定と活用に関する総合的研究）により行われた
not an essential trace element for mammals: eﬀects
ものである。
of a low-chromium diet. J Biol Inorg Chem 16:
381-390.
― 83 ―
Trace Nutrients Research 28 : 84−88（2011）
原著
成年女子の“貧血のない鉄欠乏症”における亜鉛値の一考察
1）
2）
澤田孝子，許斐亜紀，横井克彦
＊
1）
2）
（盛岡大学栄養科学部，愛知学泉大学家政学部
＊＊
3）
3）
，聖徳大学大学院人間栄養学研究科
＊＊＊
）
A Consideration of Serum Zinc Concentration in Non-anemic Iron Deficient Young Women
1）
2）
3）
Takako SAWADA , Aki KONOMI and Katsuhiko YOKOI
1）
Faculty of Nutritional Sciences, The University of Morioka
2）
Faculty of Home Economics, Aichi Gakusen University
3）
Department of Human Nutrition, Seitoku University Graduate School
Summary
Iron and zinc are essential micronutrients for human health. Deﬁciencies in these 2 nutrients remain a global problem
especially among childbearing-age women not only in developing countries but also developed countries. Iron-zinc interactions are increasingly important because deﬁciencies of these micronutrients often occur together. Subjects were classiﬁed
as iron deﬁciency anemia (IDA) (Hb < 12 g/dl and serum ferritin < 20 ng/ml), iron deﬁciency without anemia (ID) (Hb ≥
12 g/dl and serum ferritin< 20 ng/ml), and Normal (Hb ≥12 g/dl and serum ferritin ≥ 20 ng/ml). We examined hemoglobin (Hb), serum ferritin, serum iron, unsaturated iron binding capacity (UIBC), total iron binding capacity (TIBC) and
transferrin saturation as iron status and serum zinc in young women (age 19 to 20). The mean (±SD) Hb, and ferritin,
Fe, UIBC, TIBC, transferrin saturation and Zn concentrations in serum of the participants were 12.9 ± 0.8 g/dl, 12.3 ±
4.4 ng/ml, 90 ± 43 µg/dl, 312 ± 79 µg/dl, 408 ± 56 µg/dl, 22.8 ± 12.9% and 81.1 ± 12.1 µg/dl, respectively. Anthropometrics
of participants were consistent with the National Health and Nutrition Survey 2004 in Japan. The interesting observation
was found that serum zinc of ID (81.1 ± 12.1 µg/dl) was not signiﬁcantly diﬀerent compared to Normal s (87.8 ± 17.4 µg/
dl) regardless IDA (98.7 ± 15.9 µg/dl) was. It corresponds to the results of Yokoi et al. that zinc pool sizes declined in
premenopausal American women with ID. Further investigations of the association of iron and zinc nutriture are expected among Japanese young women.
鉄欠乏と亜鉛欠乏の併発は，両者ともに並行して解決し
常に共通点があることが報告されている
8，
9）
。Prasad らが
なければならないという認識が高くなってきている。一つ
発見した患者では，重度亜鉛欠乏に重度鉄欠乏性貧血を併
の解決策として，鉄と亜鉛を同時使用することが提案され
発していたことが報告されている。一方，Yokoi らは，
た。しかし，その代謝研究や培養細胞を用いた研究におい
鉄と亜鉛の摂取源と吸収阻害因子が共通であることから，
て，鉄と亜鉛の拮抗作用，鉄の添加による亜鉛の効果の減
米国人女性では，貧血のない鉄欠乏症に軽度亜鉛欠乏症を
弱，また，その逆の現象が示唆された
1 - 4）
10）
11）
。小腸の腸細胞
併発する者がいることを報告している。倉澤らの報告に
を用いた研究によって，divalent metal transpoter-1
よれば，日本の成人男性・女性 1431 人の血中の亜鉛濃度
（DMT1）による輸送の際の鉄と亜鉛の競合，拮抗作用が
12）
を測定したところ 3 人に 1 人は亜鉛不足であった。
5）
報告された。DMT1 に関してはその鉄と亜鉛の親和力，
近年の国民健康・栄養調査成績から明らかなように，血
2 つの元素の性質など，最近新しい知見が報告され，脚光
清フェリチン濃度 20 ng/ml を基準とすると，20 歳代から
を浴びてきている。
40 歳代の女性の約半数は，鉄欠乏（鉄欠乏性貧血と貧血の
世界人口の 40 億人以上が，鉄欠乏性貧血もしくはその
ない鉄欠乏）である。
6）
日本人女性における貧血のない鉄欠乏は，鉄欠乏性貧血
前段階である潜在性鉄欠乏を含めた鉄欠乏である。また
7）
亜鉛欠乏は世界人口の約 25 ％と考えられ，鉄欠乏とも非
と同様，各種の健康上の問題点をもつ可能性があると指摘
所在地：岩手県岩手郡滝沢村滝沢字砂込808番地（〒020-0183）
所在地：愛知県岡崎市舳越町上川成28（〒444-8520）
＊＊＊所在地：千葉県松戸市岩瀬550（〒271-8555）
＊
＊＊
― 84 ―
Table 1 Characteristics of Participants
a,b,c
Values not sharing common superscripts significantly differ (P < 0.05) by Fisher's protected least significant difference.
13）
されているにもかかわらず，潜在性欠乏として無視され
した。血清中亜鉛濃度は ICP 質量分析装置（島津製作所
ている状況がある。本研究は貧血のない鉄欠乏に着目し，
製 ICPM−8500）で測定した。
貧血のない鉄欠乏評価の指標として，ヘモグロビンと血
20 歳前後の若年女性の鉄栄養指標と血清亜鉛値の関連を検
清フェリチン 2 項目をとりあげた。ヘモグロビン濃度
討した。
12 g/dl，血清フェリチン濃度 20 ng/ml
実験方法
14, 15）
を評価基準値
として用いた。ヘモグロビン（Hb）
，血清フェリチンの値
から，Hb < 12 g/dl と血清フェリチン < 20 ng/ml を鉄欠
乏性貧血（IDA）
，Hb ≥ 12 g/dl と血清フェリチン
1 ．対象者
事前に調査の目的，方法を説明し，研究参加の同意が得
られた亜鉛や鉄のサプリメントを常用していない都内およ
< 20 ng/ml を貧血のない鉄欠乏症（ID）
，Hb ≥ 12 g/dl と
血清フェリチン ≥ 20 ng/ml を正常（Normal）とした。
び近郊在住の若年女性 52 名（19 から 20 歳）を対象とした。
対象者には，身体計測，血液検査，簡易質問票による問診
3 ．統計処理
本研究は 3 群間のみの比較であるので，データは全て
を行なった。なお，本研究は，聖徳大学ヒューマンスタ
Fisher の PLSD で解析し，全てのデータで有意水準は 5 ％
ディに関する倫理委員会の承認を得て実施された。
とした。統計処理には，エクセル統計付録ソフト Statcel
ver. 1 を用いた。分析値は，すべて平均値 ± 標準偏差で
2 ．研究方法
10∼12 時間絶食後，翌朝採血し，血清を保存した。採血
示した。
と同時に身長，体重を測定し，Body Mass Index
（BMI）を
結果
算出した。測定項目は，ヘモグロビン，血清フェリチン，
血清鉄，血清亜鉛，不飽和鉄結合能である。一般血液検査
は㈱松戸メディカルラボラトリーに委託した。総鉄結合能，
1 ．身体計測
トランスフェリン飽和率は血清鉄，不飽和鉄結合より算出
女性 52 名のうち 3 名は Hb < 12 g/dl にもかかわらず血
Table 2 Iron Status indicators
― 85 ―
16）
清フェリチン ≥ 20 ng/ml であった。すなわち，IDA 以外
フェリチン 20 ng/ml 未満の者の割合 53.3 %に近かった。
の貧血であったので比較の対象には含めなかった。その結
また，全対象者 52 名における貧血の割合は，19.2%（10 名）
果 49 名が統計解析の対象となった。3 グループ（Normal，
であった。これは，平成 18 年国民健康・栄養調査におけ
ID と IDA）の身体計測結果の平均値 ± 標準偏差は，Table
る 20 から 29 歳の女性における血色素（Hb）12.0 g/dl 未
1 に示したとおりである。Normal，ID，IDA グループ群
満の者の割合 18.7 %とほぼ一致した。このように，本調
間のそれぞれの身長，体重，BMI において統計学的有意
査の対象集団は少数ではあるが，鉄栄養の観点からは比較
差はなかった。
的偏りが少なかったと考えられる。
16）
鉄欠乏症の診断基準においては，鉄枯渇または貯蔵鉄欠
2 ．血液指標
乏の基準としていろいろ論議
17−19）
があるが血清フェリチ
ID における Hb と血清フェリチンの濃度は，それぞれ
ン濃度が一般的に用いられている。検査精度が高いとされ
12.9 ± 0.8 g/dl と 12.3 ± 4.4 ng/ml で，Hb は正常値の範囲
ている骨髄穿刺液の鉄染色は，集団のスクリーニングにお
であるが血清フェリチンは 20 ng/ml 未満であり，また総
いては個人への身体的負担，経済的効率により不適当であ
鉄結合能は 360 µg/dl 以上であることから鉄枯渇状態であ
り，鉄欠乏症の診断指標として血清フェリチン濃度が提唱
14）
ると診断された。すなわち鉄欠乏性貧血の前段階（貧血
された。その正常範囲としては，メルクマニュアルにおい
がないという意味で「潜在性の」鉄欠乏状態）に陥ってい
て示されているように 30 ∼ 300 ng/ml と広範囲であり，
る状態であり，IDA 以外の貧血を除外した対象者 49 名に
炎症，悪性疾患，肝臓病，アルコール症において上昇する
おけるその割合は 36.7 % であった。
傾向がある。本報の血清フェリチン値の最高値は 72.8 µg/
20）
18）
なお，IDA 以外の貧血 3 名を含む女性 52 名における，
ml，最低値は 2.5 ng/ml であり，被験者の年齢（Table 1）
血清フェリチン 20 ng/ml 未満の者の割合は 48.1%
（25 名）
と健康状態の把握（簡易質問票）より，炎症，悪性疾患，
であった。また，女性 52 名における貧血の割合は，19.2%
肝臓病，アルコール症などの疾患による上昇は考慮しなく
（10 名）であった。
ともよいと考えられる。血清フェリチン値の鉄欠乏症にお
血清亜鉛濃度は，ID が 81.1 ± 12.1 µg/dl であり，Nor-
ける基準値は，軽度鉄欠乏と軽度亜鉛欠乏の併発において
mal 87.8 ± 17.4 µg/dl と比較して低い傾向ではあったが，
横井らが提唱した 20 ng/ml を用いた。Table 2 の鉄の
それらの二つの群間の有意差はなかった。IDA は，3 群の
指標から，本研究における被験者グループ，ID（貧血の
内で，血清亜鉛濃度が最も高く（98.7 ± 15.9 µg/dl）ID と
ない鉄欠乏症）は明らかな鉄欠乏性赤血球産生（iron de-
の間に有意差が認められた（P = 0.013）
。
ﬁciency erythropoiesis）までは進行していない，鉄枯渇
15）
（iron depletion）であり，鉄欠乏症として軽度の状態であ
140
15）
ると推測された。
*
ID（81.1 ± 12.1 µg/dl）における血清亜鉛値は Normal
120
（87.8 ±17.4 µg/dl）より低い傾向であり，IDA（98.7 ±
μg/dL
100
15.9 µg/dl）は Normal よりむしろ高い値であった。Nor-
80
mal と ID あるいは IDA の間には有意差はなかった。一方，
60
ID と IDA の群間においては有意差があった。亜鉛安定同
40
位体をトレーサーとした米国人女性対象の研究で，貧血の
20
ない鉄欠乏症の女性は，鉄栄養正常の女性に比べて交換性
0
亜鉛プールが小さかったことが報告されている。また，
11）
Nor mal
ID
IDA
血漿亜鉛消失速度定数を亜鉛栄養指標とした米国人女性を
Fig. 1. Serum zinc of the subjects. *Values not sharing common
superscripts signiﬁcantly diﬀer (P < 0.05) by Fisher s protected least signiﬁcant diﬀerence. Abbreviations: Normal,
normal iron status (blood hemoglobin ≥ 12 g/dL and serum
ferritin ≥ 20 ng/ml); ID, non-anemic iron deficiency (blood
hemoglobin ≥ 12 g/dL and serum ferritin< 20 ng/mL); IDA,
iron deﬁciency anemia (blood hemoglobin < 12 g/dL and serum ferritin < 20 ng/ml).
対象とした研究では，貧血のない鉄欠乏症の女性は，鉄栄
養正常ならびに軽度鉄欠乏性貧血のある女性に比べて血漿
亜鉛消失速度定数が高く，亜鉛栄養状態が低下していたこ
21）
とが報告されている。血漿亜鉛と交換性亜鉛プールの間
には正の相関関係があることも報告されている
，血清
亜鉛を亜鉛栄養指標とし，日本人女性を対象とした本研究
の結果は米国人女性を対象とした Yokoi ら
考察
22）
11, 21）
の調査結
果と一致するものである。小腸刷子縁膜には，幅広い選択
性を持った２価陽イオントランスポーター，DMT1 が存
23）
本研究の調査対象者における，IDA 以外の貧血 3 名を
在する。このトランスポーターは２価陽イオンである鉄
含む全対象者 52 名における血清フェリチン 20 ng/ml 未満
や亜鉛を運ぶため，鉄欠乏性貧血においてこのトランス
の者の割合は 48.1%（25 名）であったが，これは平成 18 年
ポーターが誘導され，結果的に亜鉛の吸収率が上昇したこ
国民健康・栄養調査における 20 から 29 歳女における血清
とにより血清亜鉛値が高い値を示したと推測される。
― 86 ―
supplementation in Indonesian infants: interactions 生物学的に重要であり化学的性質の似通った元素（第一
between iron and zinc. Am J Clin Nutr 77 : 883-890.
遷移元素）である鉄と亜鉛は，人の成長，発達そして免疫
5）Institute of Medicine (2002) Dietary Reference Intakes
機能の保持に必要不可欠な微量元素である。何人かの研究
者は鉄を欠乏させた動物において亜鉛の吸収が促進し
24, 25）
26）
for Vitamin A,Vitamin K, Arsenic, Boron, Chromium,
，
と
Copper, Iodine, Iron, Manganese, Molybdenum, Nickel,
報告している。鉄と亜鉛は，それらの吸収や輸送機構を共
Silicon, Vanadium, and Zinc. National Academy Press,
また亜鉛欠乏のラットにおいて鉄の吸収が促進する
Washington, DC.
有している可能性があるため吸収経路において競合が起こ
ると考えられてきたがまだ不明な点も多い。特に吸収にお
6）WHO/UNICEF/UNU: Iron deﬁciency anaemia: assess-
ける鉄との競合は，鉄の主要なトランスポーターが，複数
ment, prevention, and control. A guide for pro-
種の２価金属（亜鉛も含む）を輸送する DMT1 であるこ
gramme managers, Geneva, World Health Organiza-
27）
とにより生ずると推測されている。DMT1 と鉄との親
tion, 2001(WHO/NHD/01.3). (http://www.who.
和性の方が，亜鉛との親和性より高く，しかも，鉄剤等多
int/nutrition/publications/en/ida_assessment_control/
量の鉄を摂取することが現実には多いので，鉄が亜鉛の吸
pdf, accessed on November 24, 2004).
収阻害をすることは容易に観察される。妊娠可能な日本人
7）Maret W, Sandstead HH (2006) Zinc requirements
女性は，鉄・亜鉛ともに摂取不足の集団であることはすで
and the risks and beneﬁts of zinc supplementation. J
に述べたが，鉄欠乏の予防のため，多量の鉄を補充した場
Trace Elem Med Biol 20 : 3-18.
合には，亜鉛吸収が拮抗的に阻害されるので，鉄・亜鉛同
8）Gibson, R (1994) Zinc nutrition in developing countries. Nutr Res Rev 7 : 151-173.
時欠乏者では，亜鉛栄養の更なる低下を招く危険性がある
と推測される。一方，亜鉛を補充した場合，鉄吸収が拮抗
9）Sandstead HH (1995) Is zinc deficiency a public
health problem? Nutrition 11 : 87-92.
的に阻害されるとの明確な証拠はないが，どの程度の亜鉛
量まで吸収阻害を起こさないのか，今後検討が必要であろ
10）Prasad AS, Miale A Jr., Farid Z, Sandstead HH,
う。鉄と亜鉛の吸収に関して報告されている研究の結果に
Schulert AR (1963) Zinc metabolism in patients with
28）
おいては矛盾も多い。本報が，鉄・亜鉛のサプリメント
the syndrome of iron deficiency anemia, hepato-
を摂取していないヒトの集団において，鉄栄養状態と血清
splenomegaly, dwarfism, and hypognadism. J Lab
Clin Med. 61 : 537-49.
亜鉛の関連について検討した意義は大きい。また妊娠可能
な成人女性の半数近くが貧血のない鉄欠乏症であるわが国
11）Yokoi K, Sandstead HH, Egger NG, Alcock NW, Ramanujam VMS, Dayal HH, Penland JG (2007) Associ-
では，亜鉛栄養にも配慮する必要があることが示唆された。
ation between zinc pool sizes and iron stores in pre-
謝辞
menopausal women without anaemia.
98 :
1214-23.
本研究の一部は，財団法人日本科学協会笹川科学研究
12）倉澤隆平，久堀周治郎，上岡洋晴，岡田真平，松
村興広 (2005) Zinc Deﬁciency in Aged Residents and
助成ならびに伊藤記念財団の援助を受けて行なった。
Lowered Serum-Zinc-Concentration As Population
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レビュー
消化管における必須微量金属の吸収
―トランスポーターによる制御機構 ―
橋本彩子，辻徳治，逸村直也，神戸大朋
＊
（京都大学大学院生命科学研究科）
Molecular mechanism of the absorption of essential trace metals
in intestinal epithelial cells
Ayako HASHIMOTO, Tokuji TSUJI, Naoya ITSUMURA and Taiho KAMBE
Division of Integrated Life Science, Graduate School of Biostudies, Kyoto University, Kyoto 606-8502, Japan
Summary
Iron (Fe), zinc (Zn) and copper (Cu) are essential trace metals for our lives. Recent advances in understanding of
the molecules involved in their metabolism have allowed for elucidation of the mechanism of their absorption in the
intestine. Fe-, Zn- and Cu-speciﬁc transporters operate in enterocytes. Transporters that locate at the apical surface
mediates uptake of Fe, Zn and Cu in the diet into enterocytes across the apical membrane, while other transporters
are involved in eﬄux of them from enterocytes across the basal membrane into circulation, although intracellular
traﬃcking of these metals between apical and basal sides of the enterocytes has yet to be deﬁned. Herein, we briefly review the molecular mechanism, focusing on the key players involved. Moreover, we discuss the possibility that
dietary components may increase the absorption eﬃciency of Fe and Zn through transporters, because recent studies have indicated that a number of dietary components aﬀect their bioavailability.
5）
はじめに
いる。鉄，亜鉛，銅は，発育期の成長に不可欠であるた
め，いずれの金属においても妊婦や授乳婦ではさらに付加
人体を構成する元素の約 97％は炭素，酸素，窒素，水
量を摂取することが推奨されている。一方，鉄，亜鉛，銅
素である。ここにカルシウム，リンを加えると実に体内の
の過剰摂取も生体にとって有害となるため，耐容上限量も
元素の 99%以上が構成される。これら多量に存在する元
設定されている。特に，鉄や銅は，フェントン反応を介し
素に加え，体内には極微量の元素も存在しており，生命活
て活性酸素種の産生源として強い毒性を有することから，
動の維持に必須の役割を果たしている。鉄および，鉄より
種々の疾患の原因となることが想定されており，長期にわ
存在量の少ない元素は，必須微量元素と呼ばれ，なかでも
たる極端な過剰摂取には注意が必要であろう。
鉄（Fe）
，亜鉛（Zn）
，銅（Cu）は，多数のタンパク質の
近年の研究から，食事由来の鉄，亜鉛，銅の消化管での
構成因子として，また生体調節因子として特有の働きをす
吸収に関与する分子が同定され，その分子機構が徐々に明
る。従って，これら金属元素を日々の食事で充足させるこ
らかにされてきた。小腸上皮細胞の頂端膜，基底膜上に
とは，我々の健康を維持する上で極めて重要となる。鉄の
は全く異なるトランスポーターが局在しており，それぞれ
不足が貧血の原因となることは言うまでもないが，貧血以
の金属をイオンの形態で輸送している（Fig. 1）。本稿では，
外にも幼児における重度の鉄不足は認知機能や運動機能に
消化管での鉄，亜鉛，銅の吸収に機能するトランスポー
1）
悪影響が出ることが知られる。亜鉛の不足は，成長遅延
2, 3）
6）
ターの発現制御機構，吸収調節機構について概説する。さ
。通常の
らに，最近注目されている金属の吸収に影響を与える食品
生活を送る限り銅の不足はほとんど認められないが，妊婦
因子についても議論し，必須微量元素の効率的な吸収を実
の他，味覚機能や免疫機能の低下の要因となる
4）
や乳児では，まれに軽度の銅欠乏症が生じることがある。
現させる食品の可能性について考察したい。
我が国の食事摂取基準では，一日あたり成人男性で鉄 7 ∼
7.5 mg，亜鉛 12 mg，銅 0.9 mg の摂取が，成人女性で鉄
10.5 ∼ 11 mg，亜鉛 9 mg，銅 0.7 mg の摂取が推奨されて
所在地：京都市左京区北白川追分町（〒606-8502）
＊
― 89 ―
Fig. 1. Transporters involved in the absorption of essential trace metals in intestinal epithelial
cells. . Transporters responsible for Fe absorption. Expression of FPN is negatively
regulated by hepcidin secreted from liver. . Transporters responsible for Zn absorption. Zinc deﬁciency enhances ZIP4 expression. In contrast, zinc excess induces ZnT1
expression. . Transporters responsible for Cu absorption. Precise mechanism for Cu
transport and release into the blood stream by ATP7A has yet to be elucidated fully.
鉄吸収に機能するトランスポーター
従って，FPN は体内の鉄量を調節する上で必須であり，
鉄代謝制御の鍵となる分子の一つである。FPN の発現は，
ヒトには体内の鉄を能動的に体外に排出する機能は備
肝臓から分泌されるペプチドホルモンの Hepcidin によっ
わっていない。そのため，体内の鉄量を厳密に制御するに
て厳密に制御されており，血清鉄が十分に存在する時には，
は鉄吸収に機能するトランスポーターの発現制御が非常に
Hepcidin は FPN に結合してリン酸化し，エンドサイトー
7, 8）
。鉄は小腸上皮細胞を介して体内に吸収さ
シスの後分解へと導く。この制御により，Hepcidin は体
れるが，その頂端膜には，二価の金属イオントランスポー
内への鉄の取り込みを負の方向に制御するホルモンとして
ターである divalent metal transporter （
1 DMT1, SLC11A2）
機能する
重要となる
9）
が発現している。
16, 17）
2+
。FPN を介して門脈側に輸送された Fe は，
遺伝子に変異を持つ microcytic
腸管上皮細胞の基底膜に発現する含銅タンパク質である鉄
）マウスや Belgrade（）ラットにおいては，
酸化酵素 hephaestin によって Fe に酸化された後，鉄輸
鉄の吸収が著しく減少することから，鉄吸収における
送タンパク質 transferrin に結合して末梢組織に輸送され
anemia（
10）
DMT1 の必須性がうかがえる。日常の食事には鉄（非
3+
ヘム鉄）は三価鉄（Fe ）として含まれるため，DMT1 が
3+
2+
3+
る
11, 12）
。DMT1 と FPN は，非ヘム鉄の吸収に必須の役割
を果たすが，食事に含まれるヘム鉄は別経路で吸収される。
鉄を輸送するには，Fe を Fe に還元する必要がある。
現在のところ，ヘム鉄の吸収の本体と考えられるトランス
小腸上皮細胞頂端膜には duodenal cytochrome （Dcytb）
ポーターは同定されていない
18）
。
という鉄還元酵素が発現しており，鉄は Dcytb によって
3+
2+
亜鉛吸収に機能するトランスポーター
Fe から Fe に還元された後，DMT1 によって小腸上皮
細胞内に取り込まれる
11, 12）
。Dcytb は鉄欠乏や低酸素条件
において発現量が増加するヘムタンパク質であることから，
小腸上皮細胞における鉄吸収に重要な役割を果たすと予想
13）
されている。しかしながら，
ノックアウト（KO）
ヒトの体内では，20 種類を超える亜鉛トランスポーター
が機能しており，その数は鉄や銅に比べ圧倒的に多い
19, 20）
消化管にも多数のトランスポーターが発現しているが，そ
。
マウスでは鉄欠乏の顕著な表現型は観察されず，小腸上皮
の中でも ZIP4（SLC39A4）と ZnT1（SLC30A1）の二つの
細胞には Dcytb 以外の鉄還元酵素の存在も予想されるが，
トランスポーターが食事由来の亜鉛の吸収に中心的な役割
14）
その実状は明らかになっていない。DMT1 によって細胞
2+
内に取り込まれた Fe は，基底膜に局在する ferroportin
(FPN, SLC40A1) によって門脈側に輸送される
11, 12）
を果たしている。小腸上皮細胞頂端膜に特異的に局在する
ZIP4 は，先天性亜鉛欠乏症である腸性肢端皮膚炎の原因
21, 22）
遺伝子として同定された
。
。ZIP4 の亜鉛輸送の駆動力な
KO マウスは胎生致死であるが，Cre-loxP system を用い
どに関してはまだ明らかにされていないが，近年の分子生
て出生後に FPN を不活性化させたコンディショナル KO
物学的解析により，その発現制御機構の一端が明らかにさ
マウスでは，食餌から摂取された鉄が基底膜から排出され
れてきている
15）
23, 24）
。ZIP4 の発現は，体内の亜鉛濃度に応
25）
ず，小腸上皮細胞内に蓄積して重篤な貧血症状を呈する。じて厳密に制御されており，亜鉛欠乏時には mRNA が
― 90 ―
安定化して増加する。それに伴い ZIP4 タンパク質の発現
な証拠は得られていないが，基底膜近傍に存在する膜小胞
は増大し，小腸上皮細胞の頂端膜に局在して亜鉛吸収に機
には発現が認められる。従って，ATP7A はこれら小胞内
能する。極めて重度の亜鉛欠乏状態が続くと ZIP4 タンパ
に Cu を送り込み，送り込まれた Cu は，exocytosis され
ク質のアミノ末端領域が細胞内で切断除去され（プロセシ
ることで門脈側へと輸送されると考えられる。
ング）
，プロセシングされた ZIP4 タンパク質は頂端膜に
伝子に変異を持つ Menkes 病患者は，小腸上皮細胞から
26）
+
+
遺
蓄積する。プロセシング部位と予想される領域には，腸
銅が排出されずに蓄積し，血中や末梢組織において銅が欠
性肢端皮膚炎の原因となる 2 カ所の変異が発見されている
乏することが知られる。血清中では，95％以上の銅は
ため，このプロセシングによる制御も ZIP4 による亜鉛吸
ceruloplasmin と結合しており，残りはアルブミンと結合
収の重要な制御機構の一つだと予想される。一方，亜鉛十
する。ceruloplasmin は，上述の hephaestin と同様に銅含
分時には ZIP4 は極めて速やかにエンドサイトーシスされ
有の鉄酸化酵素であり，鉄代謝に必須の役割を果たす。
た後分解されるが，この分解は過剰な亜鉛の吸収を防ぐた
従って，銅の吸収機構の解明は，鉄代謝との関連性におい
27)
34）
11）
めに重要な制御となる。通常の食事を摂る限り，亜鉛が
ても重要である。最近では，消化管での ATP7A の発現
極度に不足する事は稀であるため，ZIP4 は小腸上皮細胞
を促進させる因子が心臓から分泌されることを示す結果が
で常に分解を受けており，亜鉛が不足してきた場合にのみ，
報告されており，銅の吸収を調節する新たな制御機構と
分解を免れた ZIP4 が小腸上皮細胞頂端膜に局在するので
して注目を集めている。
35）
あろう。小腸上皮細胞に取り込まれた亜鉛は，基底膜上に
鉄，亜鉛，銅吸収の分子機構の解明に向けた課題
局在する ZnT1 を介して門脈側に輸送され，α2 マクログ
ロブリンやアルブミンを介して末梢組織に輸送される。
ZnT1 の発現は，細胞内の亜鉛センサーとして知られる
消化管での鉄，亜鉛，銅の吸収に機能するトランスポー
MTF-1 を介して亜鉛過剰時に発現誘導される。従って，
ターの生理機能や発現制御機構が明らかにされた結果，こ
消化管での亜鉛吸収は，小腸上皮細胞内の亜鉛量に応じた
れら必須微量金属の吸収過程を分子レベルで理解できるよ
ZIP4 と ZnT1 の発現量変化や細胞内局在変化によって厳
うになってきた。しかしながら，小腸上皮細胞内に取り込
密に制御されていると考えることができる。
まれた鉄，亜鉛，銅がどのようにして頂端膜側から基底膜
側へ輸送されるのかに関しては具体的な知見がほとんど得
銅吸収に機能するトランスポーター
られていない。必須微量金属の吸収過程のさらなる理解に
向けて，その細胞内輸送の分子機構の解明は，必要不可欠
小腸上皮細胞からの銅の取り込みには，CTR1 と ATP7A
28）
であり，それぞれのトランスポーターの機能と関わりに興
の 2 つの銅トランスポーターが機能する。小腸上皮細胞
味が持たれるところである。さらに，小腸上皮細胞内で，
頂端膜から食事由来の銅を取り込むのが，CTR1
（SLC31A1）
鉄，亜鉛，銅の存在量がどのように感知され，トランス
である。CTR1 は，ホモ三量体を形成して 1 価の銅イオン
ポーターを中心とした吸収制御につながるのかについて明
+
29）
（Cu ）を輸送する。従って，食事中に含まれる 2 価の銅
らかにしていくことも今後の課題となっている。
2+
イオン（Cu ）が CTR1 によって細胞内に送り込まれるに
+
は，還元酵素によって Cu に還元される必要がある。こ
トランスポーターを標的にした亜鉛栄養食品の可能性
の還元酵素の実体についてはまだ明らかにされていないが，
鉄還元酵素である Dcytb や Steap などがその候補と考え
30）
られている。小腸上皮細胞において，CTR1 は頂端膜に
31）
近年，先進国においても鉄や亜鉛を不足する傾向が強
まっている。様々な原因が考えられているが，食事に含ま
局在するとされているが，腸管特異的に CTR1 を欠損さ
れるフィチン酸やタンニン，食物繊維などは，一般に金属
せた
コンディショナル KO マウスでは，小腸上皮
の吸収を阻害することが知られ，これらを多量に含む食事
細胞内への銅の蓄積が認められる。そのため，CTR1 が頂
を中心とした食生活を送ると鉄や亜鉛を欠乏しやすくなる
端膜以外の部位にも局在し，細胞外からの銅取り込み以外
ことが予想される。一方で，カルシウムの吸収促進因子と
32）
の機能を有する可能性も示されている。また，消化管由
して見出されている CCM（クエン酸リンゴ酸カルシウ
来の培養細胞における解析では，CTR1 が基底膜に局在し
ム）や CPP（カゼインホスホペプチド），フラクトオリゴ
33）
36）
ていることを示す報告もあり，CTR1 を介した銅取り込
糖などのように，最近，難消化性二糖の difructose
み機構については，未解明の部分も多い。
anhydride Ⅲ
（DFA Ⅲ）が鉄吸収を促進し，鉄欠乏性貧
37）
小腸上皮細胞基底膜から門脈側への銅の排出には，P 型
血の改善に効果があることが報告された（DFA Ⅲは，カ
ATPase の ATP7A が必須の役割を果たす。ATP7A は，
ルシウムの吸収も促進する）
。鉄の吸収を高める食品因子
鉄，亜鉛，銅の吸収に機能するトランスポーターの中で，
としては，アスコルビン酸が古くから知られていたが，今
唯一の ABC トランスポーターであり，ATP のエネルギー
後も DFA Ⅲのような有用な因子が見出される可能性は十
+
を駆動力に Cu を輸送する。FPN や ZnT1 とは異なり，
分にあるであろう。鉄においては，ヘム鉄が特定保健用食
ATP7A が小腸上皮細胞の基底膜に局在するという直接的
品の「ミネラルの吸収を助ける食品」の関与成分として想
― 91 ―
Fig. 2. Intracellular regulations of ZIP4 expression: a potential target for enhancing
ZIP4 expression by food components. i ) stimulation of transcription, ii ) stabilization of mRNA, iii) stabilization of protein, iv) inhibition of endocytosis, and v)
stimulation of processing. Regulations except for stimulation of transcription operate to enhance ZIP4 expression during zinc deﬁciency.
36）
定されている。粒子径を小さくした乳化分散ピロリン酸
率を高める食品因子は今後一層注目されていくであろう。
第二鉄は，体内に速やかに吸収され高い生体利用効率を持
38）
おわりに
つことが示されており，鉄強化食品への利用が有望視さ
れている。亜鉛においても鉄と同様に粒子径の小さい酸化
39）
亜鉛の生体利用効率が高いことが報告されているが，亜鉛
飽食の時代と呼ばれる我が国とは異なり，途上国におい
の吸収を促進させるような食品因子は DFA Ⅲなどを含め
ては様々な欠乏症が深刻な問題となっている。鉄の欠乏は，
てもこれまでほとんど見出されていない。
ビタミン A やヨウ素の欠乏とともに，世界の三大栄養素欠
上述のように，鉄，亜鉛，銅の吸収に関与するトランス
乏症に数えられ，亜鉛の欠乏は，それに次いで問題となっ
40）
ポーターの制御機構が明らかにされてきており，今後これ
ている。従って，途上国における栄養問題の解決のため，
らトランスポーターの発現を直接的に制御する食品因子の
鉄や亜鉛の強化食につながる知見を充実させることの重要
探索が進んでいくと予想される。特に亜鉛に関しては，吸
性は言うまでもない。また，簡便化した食生活が浸透する
収過程に酸化や還元の制御を受けず，消化管に限局して発
先進国においても，鉄と亜鉛の不足は今後さらに進んでい
現する ZIP4 が亜鉛吸収に特化した役割を果たしているこ
くと予想されるため，食事から両金属を効率よく充足させ
とから，このような食品因子を想定しやすいと考えられる
る重要性は一層高まってくるであろう。我々が構築したよ
（Fig. 2）
。我々は，小腸上皮細胞と同様に亜鉛濃度に依存
して ZIP4 の発現を制御する培養細胞株と ZIP4 を特異的
に認識するモノクローナル抗体を用いて
うなトランスポーターを標的にした
スクリーニン
グ系を用いた食品研究の発展を期待したい。
スクリー
参考文献
ニング系を構築し，様々な食材・食品因子を対象に ZIP4
の発現を増加させる因子の探索を行っている。これまでに
ZIP4 の発現促進効果が認められる幾つかの食品因子を見
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出しており，その作用機構について現在解析中である。メ
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ムを用いて細胞内亜鉛量の変化を調べたところ，ZIP4 の
発現を促進する因子の中には，細胞内亜鉛量を増加させる
3）Sandstead HH, Henriksen LK, Greger JL, Prasad
ものも存在していた。ZIP4 の発現を促進する食品因子は
AS, Good RA (1982) Zinc nutriture in the elderly in
亜鉛吸収を促進させる可能性が高いことから，亜鉛栄養を
relation to taste acuity, immune response, and
改善する食品因子として極めて有望と考えている。消化管
wound healing.
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において亜鉛の吸収効率は 30%程度とされ，亜鉛不足の
4）Gupta A, Lutsenko S (2009) Human copper transport-
傾向が強まっているという事実を考えると，亜鉛の吸収効
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