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【課題】プロテアーゼの生産性がより向上された微生物、及
JP 2007-259725 A 2007.10.11 (57)【 要 約 】 （ 修 正 有 ） 【課題】プロテアーゼの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を用いたプロテ アーゼの製造方法の提供。 【解決手段】特定な配列で示されるアミノ酸配列における特定のアラニン残基、又はこれ に相当する位置のアミノ酸がバリン残基に置換される変異を含むことを特徴とするバチル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii ） の 変 異 株 。 当 該 変 異 株 を ア ル カ リ 性 培 地 で 培 養 し 、 その培養液よりアルカリプロテアーゼを採取するアルカリプロテアーゼの製造方法。 【選択図】なし (2) JP 2007-259725 A 2007.10.11 【特許請求の範囲】 【請求項１】 配列番号２で示されるアミノ酸配列における４７９番目のアラニン残基、又はこれに相 当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異を含むことを特徴とするバチル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の 変 異 株 。 【請求項２】 さ ら に 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rsbU遺 伝 子 の 不 活 性 化 又 は 欠 失 により生じる変異を含む請求項１記載の変異株。 【請求項３】 変異が、配列番号４で示されるアミノ酸配列における１７６番目のアスパラギン残基又 10 はこれに相当する位置のアミノ酸残基がグリシン残基に置換され、且つ２３４番目に対応 するコドン又はこれに相当する位置のコドンでフレームシフトし、２５１番目に対応する コドン又はこれに相当する位置のコドンで終止コドンとなる変異である請求項２記載の変 異株。 【請求項４】 配列番号４で示されるアミノ酸配列における変異が、配列番号３で示される塩基配列に おける５２７番目のＡをＧに置換すること、及び６９３番目∼７００番目の連続したＴの うち何れか１つのＴを欠失することにより生ずるものである請求項３記載の変異株。 【請求項５】 さ ら に 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rph遺 伝 子 の 不 活 性 化 又 は 欠 失 20 により生じる変異を含む請求項１∼４の何れか１項記載の変異株。 【請求項６】 変異が、配列番号６で示されるアミノ酸配列における１４９番目に対応するコドン又は これに相当する位置のコドンでフレームシフトし、１５１番目に対応するコドン又はこれ に相当する位置のコドンで終止コドンとなる変異である請求項５記載の変異株。 【請求項７】 配列番号６で示されるアミノ酸配列における変異が、配列番号５で示される塩基配列に おいて、４３９番目から４４５番目の何れか１ヶ所へＡを挿入することにより生ずるもの である請求項６記載の変異株。 【請求項８】 30 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２ ０ ７ ６ １ と し て 寄 託 さ れ た バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − １ ６ Ｍ −３７２株。 【請求項９】 さらに配列番号８で示されるアミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基又はこれ に相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１０ で示されるアミノ酸配列における１０番目のロイシン残基又はこれに相当する位置のアミ ノ酸残基がフェニルアラニン残基に置換される変異を含む請求項１∼８の何れか１項記載 の変異株。 【請求項１０】 40 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２ ０ ７ ６ ２ と し て 寄 託 さ れ た バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − ３ Ｍ − ３０株。 【請求項１１】 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rsbU遺 伝 子 の 不 活 性 化 又 は 欠 失 に よ り 生 じ る 変 異 、 及 び バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rph遺 伝 子 の 不 活 性 化 又 は 欠 失 に よ り 生 じ る 変 異 を 含 む バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） 変 異 株 。 【請求項１２】 配列番号８で示されるアミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基又はこれに相当 する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１０で示さ 50 (3) JP 2007-259725 A 2007.10.11 れるアミノ酸配列における１０番目のロイシン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残 基 が フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン 残 基 に 置 換 さ れ る 変 異 を 含 む バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus cla usii） の 変 異 株 。 【請求項１３】 請求項１∼１２の何れか１項記載の変異株をアルカリ性培地で培養し、その培養物より アルカリプロテアーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製造法。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 本発明は、プロテアーゼの生産に有用な微生物、及びこれを用いたプロテアーゼの生産 10 方法に関する。 【背景技術】 【０００２】 微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじ めとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その 種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用 品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。 【０００３】 こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題 の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われ 20 てきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え 技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えの ための宿主微生物の開発が進められている。 例 え ば 、 バ チ ル ス ・ リ ケ ニ ホ ル ミ ス （ Bacillus licheniformis） や バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rpoB遺 伝 子 に よ り コ ー ド さ れ る Ｒ Ｎ Ａ − ポ リ メ ラ ー ゼ の β − サ ブユニットにおける特定のアミノ酸を置換した突然変異体において、プロテアーゼやアミ ラーゼの生産性が向上することが報告されている（特許文献１）。 【０００４】 【特許文献１】特表２００５−５１２５９５号公報 【発明の開示】 30 【発明が解決しようとする課題】 【０００５】 本発明は、プロテアーゼの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を用いたプ ロテアーゼの製造方法を提供することに関する。 【課題を解決するための手段】 【０００６】 本発明者らは、界面活性剤に対する安定性の高いアルカリプロテアーゼＫ−１６を産生 す る バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） に つ い て 、 ア ル カ リ プ ロ テ ア ー ゼ の 高 生 産 化 を 検 討 し た と こ ろ 、 RpoBタ ン パ ク 質 他 、 特 定 の タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 変 異 を 含 む 変 異 体が、変異前の親株と比較して、高いアルカリプロテアーゼ生産性を有することを見出し 40 た。 【０００７】 すなわち本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列における４７９番目のアラニン 残基、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異を含むこと を 特 徴 と す る バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の 変 異 株 に 係 る も の で あ る 。 【０００８】 また本発明は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号 Ｆ Ｅ Ｒ Ｍ Ｐ − ２ ０ ７ ６ １ と し て 寄 託 さ れ た バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株に係るものである。 【０００９】 50 (4) JP 2007-259725 A 2007.10.11 また本発明は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号 Ｆ Ｅ Ｒ Ｍ Ｐ − ２ ０ ７ ６ ２ と し て 寄 託 さ れ た バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） ＫＳＭ−３Ｍ−３０株に係るものである。 【００１０】 ま た 本 発 明 は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rsbU遺 伝 子 の 不 活 性 化 又 は 欠 失 に よ り 生 じ る 変 異 、 及 び 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rph遺 伝 子 の 不 活 性 化 又 は 欠 失 に よ り 生 じ る 変 異 を 含 む バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii ）変異株に係るものである。 【００１１】 また本発明は、配列番号８で示されるアミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基 10 又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異、及び／又は配列 番号１０で示されるアミノ酸配列における１０番目のロイシン残基又はこれに相当する位 置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基に置換される変異を含むバチルス・クラウジイ （ Bacillus clausii） の 変 異 株 に 係 る も の で あ る 。 【００１２】 また本発明は、上記変異株をアルカリ性培地で培養し、その培養物よりアルカリプロテ アーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製造法に係るものである。 【発明の効果】 【００１３】 本発明の微生物変異株によれば、洗剤酵素として有用なアルカリプロテアーゼを効率よ 20 く生産することができる。 【発明を実施するための最良の形態】 【００１４】 本 明 細 書 に お い て ア ミ ノ 酸 配 列 お よ び 塩 基 配 列 の 同 一 性 は Lipman-Pearson法 (Science,2 27,1435,1985)に よ っ て 計 算 さ れ る 。 具 体 的 に は 、 遺 伝 情 報 処 理 ソ フ ト ウ ェ ア Genetyx-Win （ ソ フ ト ウ ェ ア 開 発 ） の ホ モ ロ ジ ー 解 析 （ Search homology） プ ロ グ ラ ム を 用 い て 、 Unit size to compare（ ktup） を ２ と し て 解 析 を 行 う こ と に よ り 算 出 さ れ る 。 【００１５】 本明細書において、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ａ」はアデニン、「Ｔ」 はチミンをそれぞれ示す。 30 【００１６】 本発明の変異株を構築するための親微生物（以下、「親株」という）としては、例えば バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 又 は そ の 変 異 株 、 あ る い は バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） に 属 す る 上 記 以 外 の 菌 株 が 挙 げ ら れ る 。 【００１７】 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ は 、 栃 木 県 芳 賀 郡 の 土 壌 より採取したアルカリプロテアーゼＫ−１６生産菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３７６）である （特開平４−２８１７８２号公報、特開平４−３４９８８２号公報）。 【００１８】 本発明の変異株における変異は、（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における４ 40 ７９番目のアラニン残基、又はこれに相当する位置のアミノ酸がバリン残基に置換される 変 異 、 （ ｂ ） バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rsbU遺 伝 子 の 不 活 性 化 又 は 欠 失 に よ り 生 じ る 変 異 及 び （ ｃ ） バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rph遺 伝 子 の不活性化又は欠失により生じる変異、から選ばれる１又は２以上の変異を含むものであ る。このうち、（ａ）∼（ｃ）の変異を全て含むものが好ましい。 【００１９】 上 記 （ ａ ） の 配 列 番 号 ２ で 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 に お け る 、 Ｄ Ｎ Ａ 依 存 性 Ｒ Ｎ Ａ ポ リ メ ラ ー ゼ ［ Ｅ Ｃ ： ２ ． ７ ． ７ ． ６ ］ β サ ブ ユ ニ ッ ト （ RpoB） の ア ミ ノ 酸 配 列 で あ り 、 （ ａ ） の 変 異 は 、 当 該 ア ミ ノ酸配列における４７９番目のアラニン残基、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が 50 (5) JP 2007-259725 A 2007.10.11 バリン残基に置換されたものである。 ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列における４７９番目のアラニン残基に相当 する位置のアミノ酸残基とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好まし くは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好まし く は ９ ９ ％ 以 上 の 同 一 性 を 有 す る 、 Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 以 外 の バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Baci llus clausii） 由 来 の RpoBに お け る 対 応 ア ミ ノ 酸 残 基 を 意 味 す る 。 【００２０】 （ ａ ） で 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 の 変 異 は 、 例 え ば 、 当 該 RpoBを コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ の 塩 基 配 列 （配列番号１）において、１４３６番目のＣをＴに置換することにより起こすことができ る。 10 【００２１】 上 記 （ ｂ ） の バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rsbU遺 伝 子 の 不 活 性 化 又 は 欠 失 に よ り 生 じ る 変 異 は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） に お け る 、 シ グ マ − Ｂ 活 性 の 間 接 的 な 正 の 制 御 因 子 で あ る RsbUの 機 能 を 変 化 さ せ る 変 異 で あ る 。 こ こ で 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rsbU遺 伝 子 と し て は 、 例 え ば 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 の rsbU遺 伝 子 又 は 当 該 遺 伝 子 に 相 当 す る 遺 伝 子 が 挙 げ ら れ る 。 rsbU遺 伝 子 に 相 当 す る 遺 伝 子 と は 、 Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 の rsbU遺 伝 子 と 実 質 的 に 同 じ 機 能 を 有 す る 遺 伝 子 を い い 、 例 え ば 、 Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 の rsbU遺 伝 子 と 塩 基 配 列 に お い て ７ ０ ％ 以 上 、 好 ま し く は ８ ０ ％ 以 上 、 よ り 好 ま し く は ９ ０ ％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する、Ｋ 20 Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 以 外 の バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） 由 来 の 遺 伝 子 が 挙 げ ら れる。 【００２２】 斯かる変異としては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列における１７６番目 のアスパラギン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がグリシン残基に置換され、 且つ２３４番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンでフレームシフトし、 ２５１番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンで終止コドンとなる変異が 挙げられる。 【００２３】 こ こ で 、 配 列 番 号 ４ で 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus cla 30 usii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 に お け る RsbUの ア ミ ノ 酸 配 列 で あ る 。 ま た 、 当 該 ア ミ ノ 酸 配 列 における１７６番目のアスパラギン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基、同アミ ノ酸配列における２３４番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンとは、配 列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは ９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する、ＫＳＭ−Ｋ１６株以外のバ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） 由 来 の RsbUに お け る 対 応 ア ミ ノ 酸 残 基 又 は 対 応 コドンを意味する。 【００２４】 尚、上記及び後記の「相当する位置のアミノ酸残基又はコドン」を特定する方法として は、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較 40 し、各蛋白質のアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えること により行うことができる。これにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、 相同アミノ酸残基の各タンパク質における配列中の位置を決めることが可能である。 【００２５】 （ ｂ ） で 示 さ れ る 上 記 ア ミ ノ 酸 の 変 異 は 、 例 え ば 、 rsbUを コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ の 塩 基 配 列 （配列番号３）において、５２７番目のＡをＧに置換すること、及び６９３番目∼７００ 番目の連続したＴのうち何れか１つのＴを欠失することにより起こすことができる。 【００２６】 上 記 （ ｃ ） の バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rph遺 伝 子 の 不 活 性 化 又 は 欠 失 に よ り 生 じ る ア ミ ノ 酸 変 異 は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） に お け る 50 (6) JP 2007-259725 A 2007.10.11 、 リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ Ｐ Ｈ で あ る Rphの 機 能 を 変 化 さ せ る 変 異 で あ る 。 こ こ で 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の rph遺 伝 子 と し て は 、 例 え ば 、 ま た 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 の rph遺 伝 子 又 は 当 該 遺 伝 子 に 相 当 す る 遺 伝 子 が 挙 げ ら れ る 。 rph遺 伝 子 に 相 当 す る 遺 伝 子 と は 、 Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 の rph遺 伝 子 と 実 質 的 に 同 じ 機 能 を 有 す る 遺 伝 子 を い い 、 例 え ば 、 Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 の rph遺 伝 子 と 塩 基 配 列 に お い て ７ ０ ％ 以 上 、 好 ま し く は ８ ０ ％ 以 上 、 よ り 好 ま し く は９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有す る 、 Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 以 外 の バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） 由 来 の 遺 伝 子 が 挙げられる。 【００２７】 10 斯かる変異としては、例えば、配列番号６で示されるアミノ酸配列における１４９番目 に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンでフレームシフトし、１５１番目に対 応するコドン又はこれに相当する位置のコドンで終止コドンとなる変異が挙げられる。 【００２８】 こ こ で 、 配 列 番 号 ６ で 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus cla usii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 に お け る 、 リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ Ｐ Ｈ （ EC 2.7.7.56） （ Rph） の ア ミノ酸配列である。また、当該アミノ酸配列における１４９番目に対応するコドン又はこ れに相当する位置のコドンとは、配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ま しくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を 有 す る 、 Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 以 外 の バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） 由 来 の Rph 20 における対応コドンを意味する。 【００２９】 （ ｃ ） で 示 さ れ る 上 記 の ア ミ ノ 酸 の 変 異 は 、 例 え ば 、 Rphを コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ の 塩 基 配 列（配列番号５）において、４３９番目から４４５番目の何れか１ヶ所へＡを挿入するこ とにより起こすことができる。 【００３０】 上記（ａ）∼（ｃ）の変異を有する微生物株としては、例えば、独立行政法人 産業技 術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７６１として寄託さ れ た バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − １ ６ Ｍ − ３ ７ ２ 株 が 挙 げ ら れ る。 30 【００３１】 また、本発明においては、上記の変異に加えて、又はこれとは別に、（ｄ）配列番号８ で示されるアミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基又はこれに相当する位置のア ミノ酸残基がバリン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１０で示されるアミノ酸 配列における１０番目のロイシン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がフェニル アラニン残基に置換される変異を有するものが包含される。このうち、好ましくは、（ａ ）∼（ｄ）の変異を全て有するものである。 こ こ で 、 配 列 番 号 ８ で 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus cla usii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 に お け る 、 ユ ビ キ ノ ン 生 合 成 タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 で あ り 、その変異は、当該アミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基又はこれに相当する 40 位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換したものである。 【００３２】 ここで、配列番号８で示されるアミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基に相当 する位置のアミノ酸残基とは、配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好まし くは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有 す る 、 Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 以 外 の バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） 由 来 の ユ ビ キ ノン生合成タンパク質における対応アミノ酸残基を意味する。 【００３３】 上記アミノ酸の変異は、ユビキノン生合成タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（ 配列番号７）において、１５８６番目のＣをＴに置換することにより起こすことができる 50 (7) JP 2007-259725 A 2007.10.11 。 【００３４】 ま た 、 配 列 番 号 １ ０ で 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus cla usii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 に お け る 、 ３ ０ Ｓ リ ボ ソ ー ム タ ン パ ク 質 Ｓ ２ （ RpsB） の ア ミ ノ 酸配列であり、その変異は、当該アミノ酸配列における１０番目のロイシン残基又はこれ に相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基に置換したものである。 ここで、配列番号１０で示されるアミノ酸配列における１０番目のロイシン残基に相当 する位置のアミノ酸残基とは、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ま しくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を 有 す る 、 Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 以 外 の バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） 由 来 の ｒ ｐ 10 ｓＢにおける対応アミノ酸残基を意味する。 【００３５】 上 記 ア ミ ノ 酸 の 変 異 は 、 RpsBを コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ の 塩 基 配 列 （ 配 列 番 号 ９ ） に お い て 、 ２８番目のＣをＴに置換することより起こすことができる。 【００３６】 斯かる（ａ）∼（ｄ）の変異を有する微生物株としては、独立行政法人 産業技術総合 研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７６２として寄託されたバ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − ３ Ｍ − ３ ０ 株 が 挙 げ ら れ る 。 【００３７】 本発明の、微生物変異株は、例えば以下に示す方法により得ることができる。 20 第１の方法として、例えば親株に突然変異剤を作用させるか、又は紫外線若しくは放射 線等を照射する等の一般的な変異誘発法、あるいは、自然突然変異の利用が挙げられる。 上 記 （ ａ ） ∼ （ ｃ ） の 変 異 を 含 む 変 異 株 を 得 る に は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 （ Ｆ Ｅ Ｒ Ｍ Ｂ Ｐ − ３ ３ ７ ６ ） 若 し く は そ の 変 異 株 又 は バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） に 属 す る 上 記 以 外 の 菌 株 を リ フ ァ ン ピ シ ン を 含 有する培地で培養し、当該リファンピシン耐性を有する菌株を選択することにより行うこ とができる。ここで、用いられる突然変異剤としては、５−ブロモウラシル、２−アミノ プリン等の塩基類似物質、亜硝酸、ヒドロキシアミン、ニトロソグアニジン、エチルメタ ンスルホン酸、アクリジン類等が挙げられる。また放射線としては、電離放射線等が挙げ られる。 30 【００３８】 ま た 、 上 記 （ ｄ ） の 変 異 を 含 む 変 異 株 を 得 る に は 、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus c lausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 又 は そ の 変 異 株 又 は 上 記 （ ａ ） ∼ （ ｃ ） の 変 異 を 施 し た 変 異 株 （ 例 え ば バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − １ ６ Ｍ − ３ ７ ２ 株 （ Ｆ Ｅ Ｒ Ｍ Ｐ − ２ ０ ７ ６ １ ） 又 は バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） に 属 す る 上 記 以外の菌株をバンコマイシンを含有する培地で培養し、当該バンコマイシン耐性を有する 菌株を選択することにより行うことができる。ここで、用いられる突然変異剤としては、 例えば５−ブロモウラシル、２−アミノプリン等の塩基類似物質、亜硝酸、ヒドロキシア ミン、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸、アクリジン類等の突然 変異剤が挙げられる。また放射線としては、電離放射線等が挙げられる。 40 【００３９】 第２の方法としては、ランダム変異や部位特異的変異等の遺伝子変異手段により、所望 の ア ミ ノ 酸 置 換 又 は フ レ ー ム シ フ ト を 生 ず る よ う な RpoB、 RsbU、 Rph、 ユ ビ キ ノ ン 生 合 成 タ ン パ ク 質 又 は RpsBの 変 異 と 適 当 な 相 同 領 域 を 含 む Ｄ Ｎ Ａ を 作 製 し 、 必 要 に 応 じ て こ れ を プラスミドＤＮＡにクローン化し、親株のゲノムＤＮＡとの相同的組換え反応を利用して 導入する方法が挙げられる。 【００４０】 例 え ば 前 記 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 の ゲ ノ ム 配 列はすでに公知であり、その塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータ ベ ー ス に Ａ ｃ ｃ ． Ｎ ｏ ． Ｎ Ｃ ０ ０ ６ ５ ８ ２ と し て 登 録 さ れ て い る 。 RpoB、 RsbU、 Rph、 50 (8) JP 2007-259725 A 2007.10.11 ユ ビ キ ノ ン 生 合 成 タ ン パ ク 質 、 RpsBの コ ー ド 領 域 に 対 応 す る 塩 基 配 列 が 上 述 し た 配 列 番 号 １、３、５、７及び９に示されるものである。従って、ゲノム配列情報を利用して、当該 ＫＳＭ−Ｋ１６株の染色体ＤＮＡまたは必要に応じてクローン化した所望のＤＮＡに対し て 、 例 え ば 、 部 位 特 異 的 変 異 や SOE（ splicing by overlap extension） − PCR法 な ど を 用 いることによって、各ＤＮＡにおける所望の変異を導入し、かつ、適当な相同領域を有す る DNA断 片 を 構 築 す る こ と が で き る 。 導 入 す る 変 異 に は 、 ア ミ ノ 酸 置 換 を も た ら す コ ド ン の変異、塩基又は塩基配列の挿入、欠失、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子等の選 択マーカー遺伝子の挿入、５’側の発現制御領域での変異などが含まれる。 【００４１】 更に必要に応じて、相同組換え用のＤＮＡを構築するため、所望の変異が導入されたＤ 10 ＮＡ断片、あるいは、上記ＤＮＡ断片に例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子等の選択 マーカー遺伝子を含むＤＮＡが付加された断片を相同的組換え用プラスミドベクターにク ローン化することができる。このベクターは、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子 等を選択マーカーとして有する。 【００４２】 構 築 し た 相 同 組 換 え 用 Ｄ Ｎ Ａ あ る い は プ ラ ス ミ ド を バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus c lausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 、 又 は そ の 変 異 体 に プ ロ ト プ ラ ス ト 形 質 転 換 法 な ど の 形 質 転 換法により導入し、相同的組換えにより変異を導入した配列と親株配列とが置換した変異 体を得ることができる。 【００４３】 20 斯くして得られた本発明の変異株を適当な培地に接種し、常法に従って培養すれば、ア ルカリプロテアーゼを効率良く生産することができる。 使用される培地としては、通常の微生物の培養に用いられ本菌株に利用可能なものであ れば何れをも使用することができるが、該培地中には資化しうる炭素源及び窒素源を適当 量含有せしめておくことが好ましい。 【００４４】 この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、その例としては、窒素源としては アミノ酸液、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母 エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー 、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベーター、アミフレ 30 ックス及びアジプロン、ゼスト、アジックス等が挙げられる。また、炭素源としては、資 化しうる炭素源、例えばアラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、フラクト ース、ガラクトース、蔗糖、マルトース、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノシト ール、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転化糖等、また資化しうる有機酸、例え ば酢酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Ｍｇ 2 + + 2 + 、Ｃａ 2 + 、Ｍｎ 2 + 、Ｚｎ 2 + 、Ｃｏ + 、Ｎａ 、Ｋ 等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加 することもできる。 【００４５】 斯くして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の酵素 の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。 40 すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等することによって菌体を分離し、その菌体及 び培養濾液から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（メタノー ル、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等）によって蛋白質を沈澱させたり 、また、限外濾過（例えばダイアフローメンブレンＹＣ、アミコン社製）により濃縮させ てアルカリプロテアーゼを得る。塩析法では、例えば硫安（３０∼７０％飽和画分）、溶 媒沈澱では、例えば７５％エタノール中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱 塩することによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能である。ここで脱塩の方法とし ては、透析又は、セファデックスＧ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が用いら れる。 【００４６】 50 (9) JP 2007-259725 A 2007.10.11 得られた酵素液は、そのまま使用することもできるが、更に公知の方法により精製結晶 化して用いることも出来る。更に酵素を精製するには、例えばヒドロキシアパタイトクロ マトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セ ルロース、ＣＭ−セルロースやＣＭ−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及び セファデックスやバイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて 分別精製すればよい。 【００４７】 斯 く し て 得 ら れ た ア ル カ リ プ ロ テ ア ー ゼ は 、 親 株 で あ る バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacill us clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ の 産 生 す る ア ル カ リ プ ロ テ ア ー ゼ Ｋ − １ ６ と 同 一 の 酵 素 学 的性質を有する（特開平４−２８１７８２号公報、特開平４−３４９８８２号公報）。 10 【実施例】 【００４８】 実施例１ バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ （ Ｆ Ｅ Ｒ Ｍ Ｂ Ｐ − ３ ３ ７６）を、培地Ａに接種し、３０℃で１８時間好気的に振盪培養したところで、ニトロソ グアニジン（ＮＴＧ）を３０∼１００μｇ／ｍＬになるように添加した後、同温度で３０ ∼６０分間振盪を継続した。その後、新たに培地Ａへ１％上記処理液を接種し、３０℃で ２４時間振盪培養を行った。この培養液をリファンピシン０．１μｇ／ｍＬ以上添加した 培地Ｂに塗布し、３０℃で３日間培養した。生育したコロニーを取り、同培地で３回純化 を 繰 り 返 し リ フ ァ ン ピ シ ン 耐 性 株 で あ る バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ 20 ＳＭ−１６Ｍ−３７２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７６１）を得た。 【００４９】 【表１】 【００５０】 30 (10) JP 2007-259725 A 2007.10.11 【表２】 10 20 【００５１】 実施例２ 親 株 と し て バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − １ ６ Ｍ − ３ ７ ２ （ Ｆ ＥＲＭ Ｐ−２０７６１）を培地Ａに接種し、３４℃で約１８時間好気的に振盪培養した 後、遠心分離を行い得られた菌体を、ＮＴＧを１０∼２００μｇ／ｍＬ含有する培地Ａに 懸濁し、３０℃で３０分間放置した。次に遠心分離により菌体を集め、培地Ａで数回洗浄 した後、この処理液を新たに培地Ａに１％接種し、３４℃で２０時間振盪培養を行った。 この培養液をバンコマイシン６．８μｇ／ｍＬ以上添加した培地Ｃに塗布し、３０℃で３ 日間培養した。生育したコロニーを取り、同培地、次いで、培地Ｃにて純化を繰り返し、 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − ３ Ｍ − ３ ０ （ Ｆ Ｅ Ｒ Ｍ Ｐ − ２ ０ ７ ６ ２ ） を 得 た 。 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − ３ Ｍ − ３ ０ （ Ｆ ＥＲＭ Ｐ−２０７６２）のバンコマイシン耐性は、親株であるバチルス・クラウジイ（ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − １ ６ Ｍ − ３ ７ ２ （ Ｆ Ｅ Ｒ Ｍ Ｐ − ２ ０ ７ ６ １ ） と 同 程 度 に まで低下していた。 【００５２】 30 (11) JP 2007-259725 A 2007.10.11 【表３】 10 20 【００５３】 実 施 例 ４ バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の ゲ ノ ム の 塩 基 配 列 決 定 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 、 同 Ｋ Ｓ Ｍ − １ ６ Ｍ − ３ ７２株、同ＫＳＭ−３Ｍ−３０株を染色体ＤＮＡ調製に使用した。染色体ＤＮＡのライブ 30 ラ リ ー 構 築 に 使 用 す る 宿 主 菌 に は 、 大 腸 菌 （ Escherichia coli） Ｄ Ｈ ５ α （ タ カ ラ バ イ オ ）を使用した。 【００５４】 （１）ホールゲノムショットガンライブラリーの作製 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） の 菌 株 を 、 １ ０ ％ 炭 酸 ナ ト リ ウ ム で ｐ Ｈ ８ ． ５ に 調 整 し た Ｔ Ｓ Ｂ 培 地 （ BD BBL Trypticase Soy BrothTM ;BD Diagnostic Systems） １ ０ ０ ｍ Ｌ 中 で ３ ０ ℃ に お い て 培 養 し た 。 対 数 増 殖 期 の 菌 体 か ら 、 斉 藤 と 三 浦 （ Saito & Miura） の 方 法 （ フ ェ ノ ー ル 法 ； サ イ ト ウ （ Ｓ ａ ｉ ｔ ｏ ） ら 、 Biochem. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963)） に よ り 染 色 体 Ｄ Ｎ Ａ を 得 た 。 ２０μｇの染色体ＤＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）を超音波破砕により断片化した。断片化 40 ＤＮＡは、３０℃、５分間のＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（タカラバイオ）処理により、突出 末端を平滑化した後、フェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿により精製した。 次 に DNA Blunting Kit（ タ カ ラ バ イ オ ） で Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ ポ リ メ ラ ー ゼ 処 理 後 、 フ ェ ノ ー ル ・クロロホルム処理とエタノール沈殿により精製した。続いて、精製ＤＮＡ断片のアガロ ー ス 電 気 泳 動 を 行 い 、 １ − ２ ｋ ｂ の 画 分 を Qiaquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を 用 い て回収した。 【００５５】 こ の Ｄ Ｎ Ａ 画 分 と 等 量 の ベ ク タ ー pUC18/SmaI/BAP（ Amersham Pharmacia Biotech） を １ ： １ の 比 率 で 混 合 し 、 DNA Ligation Kit Ver.1（ タ カ ラ バ イ オ ） を 用 い て 、 １ ６ ℃ で 一 晩 、 ラ イ ゲ ー シ ョ ン を 行 っ た 。 そ の 後 、 こ の Ｄ Ｎ Ａ に て コ ン ピ テ ン ト セ ル 大 腸 菌 E.coli DH5 50 (12) JP 2007-259725 A 2007.10.11 αを形質転換した。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含むＬＢ寒天培地に 6 塗布し、３０℃で一晩培養した。この方法により、約１ｘ１０ クローン／μｇベクター の形質転換効率のホールゲノムショットガンライブラリーを作製した。 【００５６】 （２）ショットガンシーケンシング用鋳型ＤＮＡの増幅 ショットガンクローンは、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含むＬＢ液体培地を用いて 、 ３ ７ ℃ で １ ８ 時 間 培 養 し た 。 こ の 培 養 液 を 鋳 型 と し て 、 イ ン サ ー ト Ｄ Ｎ Ａ を TaKaRa Ex TaqTM（ タ カ ラ バ イ オ ） を 用 い た Ｐ Ｃ Ｒ に よ り 増 幅 し た 。 こ の Ｐ Ｃ Ｒ に は 、 ベ ク タ ー の 塩 基 配 列 よ り 設 計 し た プ ラ イ マ ー Ｌ Ｆ （ 5'-CAAGGCGATTAAGTTGGGTAACG-3'） （ 配 列 番 号 １ １ ） と Ｌ Ｒ （ 5'-CTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3'） （ 配 列 番 号 １ ２ ） を 使 用 し た 。 10 【００５７】 （３）鋳型ＤＮＡの精製 Ｐ Ｃ Ｒ 産 物 に 残 存 す る 未 反 応 の プ ラ イ マ ー を 、 exonuclease I（ Amersham Pharmacia Bi otech） に よ り 分 解 し 、 そ の 分 解 物 を shrimp alkaline phosphatase(Amersham Pharmacia Biotech） に よ り 脱 リ ン 酸 化 す る こ と で Ｐ Ｃ Ｒ 産 物 の 精 製 を 行 っ た 。 【００５８】 （４）ショットガンクローンのシーケンシング ショットガンクローンのシーケンシングは、インサートＤＮＡの精製ＰＣＲ産物を鋳型 と し 、 Ｌ Ｆ ま た は Ｌ Ｒ を プ ラ イ マ ー と し て 、 DYEnamic ET terminator（ Amersham Pharmac ia Biotech） を 使 用 し て 行 っ た 。 反 応 産 物 は 、 エ タ ノ ー ル 沈 殿 に よ り 精 製 後 、 キ ャ ピ ラ リ 20 ー型ＤＮＡシーケンサーを用いてシーケンシングを行った。 【００５９】 （５）アセンブル（配列結合編集） シ ョ ッ ト ガ ン ク ロ ー ン よ り 得 た 配 列 デ ー タ は 、 大 型 ア セ ン ブ ル ソ フ ト Phred/Phrap（ Ewi ngら 、 Genome Res. 8, 186-194 (1998)） を 使 用 し て ア セ ン ブ ル し た 。 【００６０】 実施例５ ＫＳＭ−Ｋ１６株とＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株の間における変異点の抽出 バ チ ル ス ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 と Ｋ Ｓ Ｍ − １ ６ Ｍ − ３ ７２株の塩基配列を比較したところ、以下に示す様に、２遺伝子に各１ヶ所、および、１ 遺伝子に２ヶ所の変異が検出された。 30 【００６１】 第 １ に 、 本 発 明 の 配 列 番 号 ２ に 示 す Ｄ Ｎ Ａ 依 存 性 Ｒ Ｎ Ａ ポ リ メ ラ ー ゼ [EC:2.7.7.6]β サ ブ ユ ニ ッ ト （ RpoB） を コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ の 塩 基 配 列 （ 配 列 番 号 １ ） に お い て 、 １ ４ ３ ６ 番 目のＣからＴへの変異を検出した。この変異は、配列番号２に示すアミノ酸配列において ４７９番目のアラニン残基がバリン残基に置換された（Ａ４７９Ｖ）変異を生ずる。 【００６２】 第 ２ に 、 配 列 番 号 ４ に 示 す シ グ マ − Ｂ 活 性 の 間 接 的 な 正 の 制 御 因 子 （ RsbU） を コ ー ド す るＤＮＡの塩基配列（配列番号３）において、５２７番目のＡからＧへの変異および６９ ３番目∼７００番目の連続したＴのうち何れか１塩基のＴの欠失を検出した。前者の変異 は、配列番号４に示すアミノ酸配列において１７６番目のアスパラギン残基がグリシン残 40 基に置換された（Ｄ１７６Ｇ）変異をもたらす。後者の欠失変異は、配列番号４に示すア ミノ酸配列においてフレームシフトを起こし、コドン２３４からコドン２５０までに異な るアミノ酸配列をコードするコドンを生じ、コドン２５１に終止コドンを生ずる。 【００６３】 第 ３ に 、 配 列 番 号 ６ に 示 す リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ Ｐ Ｈ [EC 2.7.7.56)(rph)を コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａの塩基配列（配列番号５）において、４３９番目から４４５番目の何れか１ヶ所へのＡ の挿入を検出した。この変異は、配列番号６に示すアミノ酸配列においてフレームシフト を起こし、コドン１４９とコドン１５０に異なるアミノ酸配列をコードするコドンを生じ 、コドン１５１に終止コドンを生ずる。 【００６４】 50 (13) JP 2007-259725 A 2007.10.11 実施例６ ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株と３Ｍ−３０株の間における変異点の抽出 バ チ ル ス ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − １ ６ Ｍ − ３ ７ ２ 株 と Ｋ Ｓ Ｍ − ３ Ｍ−３０株の間で配列を比較したところ、以下に示す様に、２遺伝子において各１ヶ所の 変異が検出された。 第１に、配列番号８に示すユビキノン生合成蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列（配 列番号７）において、１５８６番目のＣからＴへの変異を検出した。この変異は、配列番 号８に示すアミノ酸配列において５２９番目のアラニン残基がバリン残基に置換された（ Ａ５２９Ｖ）変異を生ずる。 【００６５】 第 ２ に 、 配 列 番 号 １ ０ に 示 す ３ ０ Ｓ リ ボ ソ ー ム 蛋 白 質 Ｓ ２ （ RpsB） を コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ 10 の塩基配列（配列番号９）において、２８番目のＣからＴへの変異を検出した。本変異は 、配列番号１０に示すアミノ酸配列において１０番目のロイシン残基がフェニルアラニン 残基に置換された（Ｌ１０Ｆ）変異を生ずる。 【００６６】 実 施 例 ７ Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 か ら の Ｄ Ｎ Ａ 依 存 性 Ｒ Ｎ Ａ ポ リ メ ラ ー ゼ （ RpoB） 変 異 株 の 構 築 バ チ ル ス ・ ク ラ ウ ジ イ （ Bacillus clausii） Ｋ Ｓ Ｍ − Ｋ １ ６ 株 の 培 養 液 を 、 ０ ． １ μ ｇ ／ ｍ Ｌ リ フ ァ ン ピ シ ン 、 ０ ． １ ％ 炭 酸 ナ ト リ ウ ム 、 １ ． ５ %精 製 寒 天 を 含 む Ｔ Ｓ Ｂ 固 体 培地に塗布して、３０℃でインキュベーションした。形成したコロニーからゲノムＤＮＡ を 調 製 し 、 こ れ を 鋳 型 と し て Ｄ Ｎ Ａ 依 存 性 Ｒ Ｎ Ａ ポ リ メ ラ ー ゼ （ RpoB） β サ ブ ユ ニ ッ ト （ 20 RpoB） を コ ー ド す る 配 列 を 決 定 す る こ と に よ り 、 Ｒ ｐ ｏ Ｂ の ４ ７ ９ 番 目 の ア ラ ニ ン 残 基 が バリン残基に置換された（Ａ４７９Ｖ）変異株を取得した。この変異株をＫ１６ｒｐｏＢ −Ａ４７９Ｖ株とした。 【００６７】 実施例８ Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋ含有固体培地における透明帯形成によるプロテアーゼ分泌 量の検定 Ｋ１６ｒｐｏＢ−Ａ４７９Ｖ株、ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株の２菌株を、１０％炭酸ナ ト リ ウ ム で ｐ Ｈ ８ ． ５ に 調 整 し た １ ％ Ｓ ｋ ｉ ｍ Ｍ ｉ ｌ ｋ (BD Diagnostic Systems)、 １ ． ５ ％ Ａ ｇ ａ ｒ を 含 む Ｔ Ｓ Ｂ （ BD BBL Trypticase Soy BrothTM ;BD Diagnostic Sys tems） 培 地 で 調 製 し た １ 枚 の 固 体 培 地 上 で ３ ０ ℃ に お い て 培 養 し た 。 培 養 ２ 日 目 に 、 分 泌 30 されたアルカリプロテアーゼによるＳｋｉｍ Ｍｉｌｋの分解のために生じた透明帯の直 径を測定した（表４）。 その結果、透明帯の直径（ｎ＝４）は、ｒｐｏＢ遺伝子にＡ４７９Ｖの変異を有する変 異株Ｋ１６ｒｐｏＢ−Ａ４７９Ｖ株における１１．１±１．１ｍｍよりも、さらに変異が 導入されているＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株における１２．５±０．６ｍｍの方が有意に大 きかった（ｐ＜０．００３）。このことから、ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株においてｒｐｏ Ｂ遺伝子のＡ４７９Ｖ変異の他に更に導入された変異によるアルカリプロテアーゼ分泌の 向上が固体培地上で確認された。 【００６８】 【表４】 40 【００６９】 実施例９ 評価培養 1.５ ％ (v/v) アミノ酸液（アスパラギン酸２％、トレオニン０．８％、セリン１．１ 50 (14) JP 2007-259725 A 2007.10.11 ％、グルタミン酸３％、グリシン０．９％、アラニン１．２％、バリン０．８％、メチオ ニン０．１％、イソロイシン０．３％、ロイシン０．６％、チロシン０．１％、フェニル アラニン０．６％、リジン１．２％、ヒスチジン０．５％、アルギニン１．１％、プロリ ン１．２％）、０．２％ 酵母エキス、１．２％ 魚肉エキス、０．３％リン酸２カリウ ム、０．００６％チアミン塩酸塩、１％グルタミン酸ナトリウム、０．３％アルギニン塩 酸塩、０．６％ヒスチジン塩酸塩、０．２％メチオニン、２００ｐｐｍ 硫酸マグネシウ ム、４０ｐｐｍ硫酸マンガン、１０ｐｐｍ硫酸第２鉄、６ｐｐｍ硫酸亜鉛、２ｐｐｍ硫酸 ニッケル、０．６ｐｐｍ硫酸銅、１２％マルトース１水和物、０．３％炭酸ナトリウムか らなる培地（記述のない限り重量％）を、５００ｍＬ容ひだ付三角フラスコに２０ｍＬ仕 込み、ＫＳＭ−Ｋ１６株、ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株、ＫＳＭ−３Ｍ−３０株、Ｋ１６ｒ 10 ｐｏＢ−Ａ４７９Ｖ株の各培養液を０．４ｍＬ接種後、２１０ｒ／ｍｉｎで３４℃にて２ 日間培養した。得られた培養液を２５００ｒ／ｍｉｎ、１５分間遠心分離し培養上清のプ ロテアーゼ活性を測定した。すなわち、水酸化ナトリウムで ｐ Ｈ１０．５に調整した０ ．１Ｍ ほう酸／０．１Ｍ 塩化カリウムの緩衝液０．５ｍＬ、脱イオン水０．４ｍＬ及び ０ ． １ Ｍ Ｎ -succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanyl-p-nitroanilide(ペ プ チ ド 研 究 所 製 )０ ． ０ ５ ｍ Ｌ か ら な る 反 応 液 を ３ ０ ℃ で ３ 分 間 恒 温 し た 後 、 ０ ． ０ ５ ｍ Ｌ の 酵 素 液 を 加 え反応を開始した。３０℃で５分間恒温した後、２ｍＬの５％（ｗ／ｖ）クエン酸を加え 反応を停止した。４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロアニリンを定 量した。尚、プロテアーゼ活性はＫＳＭ−Ｋ１６株のｐ−ニトロアニリン生成量を１００ とした相対値で示した。表５に示したように、ＫＳＭ−Ｋ１６株よりもＫＳＭ−１６Ｍ− 20 ３７２株でプロテアーゼの生産量は増大し、ＫＳＭ−３Ｍ−３０株では更にプロテアーゼ の生産量は増大した。Ｋ１６ｒｐｏＢ−Ａ４７９Ｖ株は、ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株と同 等のプロテアーゼ生産量であった。 【００７０】 【表５】 【配列表】 2007259725000001.app 30 (15) JP 2007-259725 A 2007.10.11 フロントページの続き (74)代理人 100117156 弁理士 村田 正樹 (74)代理人 100111028 弁理士 山本 博人 (74)代理人 100101317 弁理士 的場 ひろみ (74)代理人 100121153 弁理士 守屋 嘉高 (74)代理人 100134935 弁理士 大野 詩木 (74)代理人 100130683 弁理士 松田 政広 (74)代理人 100140497 弁理士 野中 信宏 (72)発明者 影山 泰 栃木県芳賀郡市貝町赤羽２６０６ 花王株式会社研究所内 (72)発明者 高木 善弘 神奈川県横須賀市夏島町２番地１５ 独立行政法人海洋研究開発機構内 (72)発明者 島村 繁 神奈川県横須賀市夏島町２番地１５ 独立行政法人海洋研究開発機構内 (72)発明者 西 真郎 神奈川県横須賀市夏島町２番地１５ 独立行政法人海洋研究開発機構内 (72)発明者 小林 徹 神奈川県横須賀市夏島町２番地１５ 独立行政法人海洋研究開発機構内 (72)発明者 伊藤 進 神奈川県横須賀市夏島町２番地１５ 独立行政法人海洋研究開発機構内 (72)発明者 掘越 弘毅 神奈川県横須賀市夏島町２番地１５ 独立行政法人海洋研究開発機構内 Ｆターム(参考) 4B024 AA03 BA14 CA02 CA11 CA20 DA06 DA07 EA04 GA25 HA01 HA11 4B050 CC02 DD02 LL04 4B065 AA15X AA15Y AC14 BA18 CA33 CA57