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Noninvasive Micromarkers
Review Noninvasive Micromarkers Janani Saikumar1,2,†, Krithika Ramachandran1,2,† and Vishal S. Vaidya1,2,* Author Affiliations 1 2 Renal Division, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, and Department of Environmental Health, Harvard School of Public Health, Boston, MA. * Address correspondence to this author at： Laboratory of Kidney Toxicology and Regeneration, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School and Department of Environmental Health, Harvard School of Public Health, Harvard Institutes of Medicine, Rm. 562, 77 Ave. Louis Pasteur, Boston, MA 02115. Fax 617-525-5965； e-mail [email protected]. Clinical Chemistry 2014； 60； 1158-1173 非侵襲性 Micromarkers 要旨 BACKGROUND：生物学および分子学的な診断法を変えた、ゲノム全領域の配列解析技術の近年の 革命的な技術進歩により、疾患特異的なバイオマーカーと成り得る可能性のある sRNA(小さな RNA)が発見された。無細胞 microRNAs(miRNAs)は、広い範囲の体液に安定して存在し、それらの 発現プロファイルが、各種の生理学的な状況を反映すると示唆されている。miRNAs は、疾病の非 侵襲性バイオマーカーとして機能する有用な分子として注目されている。 CONTENT：私たちは、miRNA の保護および細胞外スペースへの放出の既知のメカニズムについて の情報を要約し、20 報の異なる癌、11 報の組織障害および 10 報の疾病のバイオマーカーとして検 討された細胞外 miRNAs に関する近年の文献を集計した。 さらに私たちは、バイオマーカーとして の miRNA の発見までの研究手法に関連する様々な方法について議論し、この進化する研究分野が 直面している克服されるべき研究の障害となる重大な見解をまとめた。 SUMMARY：miRNA を中心とする診断分野は、まだ幼時期にある。また、疾病の病態生理学におけ る miRNAs の正確な役割に関する根本的な課題、および細胞から生体液の中への miRNAs の放出メ カニズムは、まだ完全に解明されていない。 しかしながら、これらの非侵襲性の小分子は、基礎研 究成果が医療に貢献できる大きな可能性を持っている。この小分子は効果的にまた安全に、治療過 程をモニタリングするだけでなく、疾病の進展や状態に関する危険性の解析、さらに重要なことは 治療方針の情報提供となる疾病の診断指針へ応用が期待される。 最初の microRNA(miRNA)の発見以来、20 年が経過した。発見当時、heterochronic な遺伝子として 3 lin-4 が、線虫の発育過程で発見された (1)。その後すぐに発見された lin-7 の遺伝子配列(2)は、すべ ての種の遅い発育の段階で発現されて、広範囲の系統で横断的に保存されており、同様にそれが一 1 時的な保存であることも解明された(3)。その時以来この分野の研究において、現在までに 21,000 以 上の遺伝子配列が合計 193 種発見されている。今日 miRNAs が遺伝子発現の長さとして、およそ 22 の核酸の小さなノンコーディング RNA 分子であることが知られている。ヒトゲノムでは、miRNAs の 52%は遺伝子内に存在し、イントロンとエクソン内にそれぞれ 40%および 8%が存在している(4)。 miRNAs は pri-miRNAs の一次転写産物として、RNA ポリメラーゼ II によって核の中で転写される。 それは、さらに RNase III 内ヌクレアーゼ Drosha と DGCR8 タンパク質(パシャ)の複合体によって、 70-nucleotide-long 軸を輪状した miRNAs の先駆物質に処理される(図 1A) (5)。その先駆体 miRNA （pre- miRNA）は、Ran GTP 依存的に Dicer や別の RNase III エンドヌクレアーゼによって分解され、 Exportin 5 によって細胞質に輸送される。この RNase III エンドヌクレアーゼは、活性化 (TAR)RNA 結合蛋白（TRBP）と一緒になって、機能的な破片(miRNA)と残存量の低い破片(miRNA*)の miRNAmiRNA*複合体を構成する。通常、miRNA はいくつかの蛋白と結合して機能を発揮する。その複合 体を RNA -inducing silencing complex (RISC)と言う。その RISC は、最小の安定した 5′ 位から始ま り、非対称な複合体になる。miRNA-miRNA*複合体からの miRNA と miRNA*の典型的な回収率は、 先駆体の両方の結合が等しく安定していて、同様の回収率があるまれな場合を除くと、約 100：1 で ある。(6)。 図 1 MicroRNA(miRNA)生物発生説と細胞外への分泌 2 (A)、生物発生説。1．RNA ポリメラーゼ II による,核内の遺伝子からの pri-miRNAs の転写。 2．補 助的に足場蛋白質として作用する p68(DDX5)および p72(DDX17)DEAD-box RNA ヘリカーゼによる Drosha-DGCR8 複合体は、70 のヌクレオチド(nt) の長さを持つ pre-miRNA の機能する一次転写課程。 3．Exportin 5 による Ran-GTP 依存的な細胞質への輸送。 4．RNase III 酵素である Dicer による premiRNA の分裂、22-nt の二重らせん構造の RNA は成熟した miRNA である“guide”と,残存量の低い miRNA*である“passenger”から構成されている；TRBP と タンパク質活性剤あるインターフェロン 誘導性のプロテインキナーゼ PKR(PACT)は、このステップを規制する分子である。5．主成分が AGO-2 および GW-182 である RISC への成熟した miRNA の結合；標的 mRNA の 3′の翻訳されてい ない領域に対する miRNA の seed 領域の部分的な相補性は、転写抑制に導かれた完全な相補性によ り翻訳停止をもたらす。 (B)，細胞外への miRNAs の分泌： 6． nSMase2 によって積極的に調節してセラミド依存の課程を 経て原形質膜を溶解し、exosomes（細胞外小胞体）として放出することで、多小胞体(MVB)への取 り込み。7．nSMase2 によって制御される過程で HDL 粒子中へカプセル化。 8．RNA 結合蛋白質(す なわち AGO-2 および nucleophosmin 1)(NPM1)との結合。 9．アポトーシス小体への編入。 10．最初 の研究では、まず骨髄から分離された exosomal な miRNAs は、肥満細胞； ヒト血漿中の HDLmiRNA；ヒト血漿(AGO-2)およびヒト細胞株(HepG2 と A549 の中の NPM1)中の蛋白質結合 iRNAs； ヒトの臍静脈内皮細胞(HUVEC)において、生体外の内皮細胞に派生したアポトーシス小体からの miR-126 を誘導する。 (C)、マトリックスの検出。11．細胞外の miRNAs が発見され、13 の異なるマトリックスが示された。 機能的な miRNA は、Dicer/TRBP および Argonaute タンパク質(AGO-2)から成る RISC に組み入れら る。それはエンドヌクレアーゼとしての触媒機能を有する（5)。miRNA の 5′end の seed sequence (2-8 ヌクレオチド)に対して、mRNA の 3′の翻訳されない領域は完全な相補性により、目標 mRNA の分裂に導く。一方、不完全な相補性は、ある形式の翻訳を抑制する。それは mRNA の目標を完全 のままにしておく(図 1A)。 miRNAs は、すべてのタンパク質をコード化する遺伝子のほぼ 60%を備 え(7)、増殖、分化および細胞死のような種々の細胞の課程と関係する(5)。 体液における miRNA 保護機序 近年、細胞外 miRNAs は血液や分泌排泄された体液に存在すると報告されており、これらの細胞外 の miRNAs は生理学上、機能として下流の標的細胞の遺伝子抑制に関与しているとされている(8)。 驚くことに、血液中で RNA に働く様々な酵素からの作用に対して miRNAs は作用を受けないが、こ のような保護作用の機序については、未だ解明されていない(図 1B)。内因性の miRNAs が不変のま まであるが、 人為的に導入した合成された線虫の miRNAs は血漿中で急速に分解される。それらの サイズか構造に起因して、無修飾の保護されていない miRNAs は、RNase 活性に対して先天的に抵 抗できない(8, 9)。最も多く検討された機序は、exosomes(10-100 nm)および microvesicles(0.1-1μm)の ような小胞体の中への miRNAs のカプセル化である。これに関して、2007 年頃に Valadi らが最初に 報告しており、彼らはヒトとマウスの肥満細胞によって放出された exosomes の miRNAs が、機能的 に受取側の細胞へ引き渡されることを示した(10)。小坂らは、exosomes の中への miRNAs の取り込 みが sphingomyelinase 2(nSMase2)の制御の下、セラミド依存下の機序であることを HEK293 細胞の 中で示した(8)。また、別の研究において、その過程で ATP が関与することが報告されている(11)。 Exosomal な miRNAs は血漿とは別に、ヒトの唾液、母乳および尿中で発見された(12-14)。別の分類 の 小胞体(アポトーシス性小体(0.5-2μm))により、miRNAs が近隣の細胞へ生存と成長のシグナルを 誘導することを、アテローム性動脈硬化症のアポトーシス性内皮細胞において実証された(15)。 Wang らによる実験は、HepG2 と A549 の培養細胞系にて加える血清量を減少させるに従い、細胞内 3 の miRNAs の量が低下し、細胞外の miRNAs の量が急増し、その現象は数時間の後に回復すること を示した (11)。これは搬送される miRNAs が、あらかじめ合成されてプールされていることに由来 するという仮定に結びつく。小胞体から分離した画分とは別に、小胞体を超遠心分離した後の上澄 みの中に miRNAs は分離同定された (11, 16)。これは、何らかの保護の機序があることを示唆して いる。また、それらは様々なタンパク質(すなわち nucleophosmin 1)と結合し、複合体を形成してい た(11)。HDL(17)また AGO-2 (16, 18). 受取側の細胞への HDL で結合した miRNAs の搬送は、スカベ ンジャー受容体クラス B タイプ 1 の制御の下にある(17)。興味深いことには、HDL の上に miRNAs を搬送することは、nSMase2 によって抑制されるように見える。それは、miRNA の exosomal な分 泌および HDL への取り込みという細胞の機序に対応していることを示す(17)。しかし、このことは 同じ細胞系の中で実験的に証明されてはいない。 循環系からの miRNAs のクリアランスは重要な研 究テーマであるが、解明されずに残っている。miRNAs の半減期は細胞外液中で測定されていない が、それらは安定した miRNA-protein/脂質複合体として長時間存在すると思われる。体液からのク リアランスの可能なルートは、miRNA に特有の分解過程、腎臓による濾過あるいは肝臓のシステム による代謝が考えられる。しかしながら、Weber らの報告書で、ほとんど miRNAs の血漿と尿のプ ロファイルの間に相関性が無く、腎臓での生理的な miRNAs のクリアランスや、尿へ濾過されて急 速に濃度を低下させることに関係ないことを報告した(19)。このことは、慢性腎臓病の患者の減少 した循環 miRNAs 濃度が、尿 miRNAs 濃度の増加に関係していなかったことを示した研究が証拠と なっている(20)。 バイオマーカーとしての体液中の miRNAs miRNAs は単に健康と疾病を規定する重大な役割を果たすと示されたばかりでなく、治療への介入 と疾病進行を同様に検知し、予知するためのバイオマーカーとして検討された。豊富な発現量、単 純さ、様々な検知するマトリックス中で安定であり、応用の拡大可能なシグナルは、様々な病態生 理学の条件を反映し、細胞外の miRNAs はバイオマーカーとして魅力的な候補になることを示唆し ている(21-24)(表 1)。タンパク質はバイオマーカー研究の発展に著しく貢献したが、いくつかの欠点 があった。例えばマーカー探索において、有効性評価と検出に関わる感度と特異性が課題であった。 タンパク質バイオマーカーの測定のための古典的免疫親和性を基本とする検出方法は、抗原抗体反 応を利用した様々なプラットフォームに応用されている。これらの技術(それらは ELISA を含んで いる)は、使用される抗体の特異性および濃度に極度に依存している(25)。1 つの試料を分析する中 で、いくつかの抗原を同時に測定するために多重測定を提供するプラットフォームを用いるが、 様々な濃度範囲を一定の増幅能力のみで結果を出す難しさに直面する。糖鎖形成、アセチル化およ び脂質付加のような翻訳後に起こる修飾反応が頻繁に生じて、さらに多くの複雑な生体のタンパク 質が生成される(26)。バイオマーカー分析に使用されるほぼすべての生体サンプル中には、タンパ ク質分解酵素が存在しており、測定試料の採取および保存において注意深く取り扱う必要がある。 ホルマリン固定パラフィンに埋め込まれた(FFPE)断片のように、保存されていた標本からのタンパ ク質の検出方法もあるが、広範囲な抗原を回収して抽出する処理が必要となる(27)。 4 表 1 理想的なバイオマーカーとなる miRNAs の特徴 血清中に安定して存在している miRNAs が 2008 年に発見されて以来(28)、この小さな分子は、尿、 唾液、母乳、羊水、涙、糞便、精液・膣液、唾液および脳脊髄液(CSF)のような、ありとあらゆる生 体の体液中で発見された(図 1C)。 生体中に広範囲に存在して、しかも安定な状態で存在している miRNAs は、バイオマーカーとして利用されている他のすべての分子に比較して明らかな利点であ る。血清中の miRNAs、は極端な温度変化、pH 変動、凍結融解の繰り返し、異なるサンプルの保存 方法および RNase A の作用や保存条件で変性しにくいことが報告されている(9, 24, 29)。いくつか のグループは、FFPE 標本を含む広範囲な試料(30)、骨髄標本 (31)または骨髄生検による試料 (32) か らも miRNAs の分離に成功している。miRNAs は mature な構造で保持されて、複数の組織に遍在し て存在している (33)。しかも、同一種内では、それらの表現系は共通している。一方で、転写後に 修飾を受けにくい性質を持つ miRNAs は、均一性を保ち、取り扱いを容易にしており、これらは魅 力的な特徴となる。いくつかの miRNAs は、疾患特異的な存在として特徴ある細胞や組織にも局在 しており、バイオマーカーとしての役割を果たすことができると考えられる。 生体の流体系のバイオマーカーとしての特徴をなす miRNAs は、個々の miRNA あるいはパネルを 使用した先駆的なコホート研究からの ROC 解析の結果で、ROC カーブ下面積が 70%から 95%の結 果が得られ、疾病の診断に対して有用性が示された (34, 35)。 これらの概念実証や実験の結果は、特異的疾患への miRNA の有用性を研究する基礎となり、研究 を促進している (36)。miRNA をベースとするマーカーは、疾病の原因、進行、予後予測および分類 も対して特徴的に識別可能であり、これらの沢山の長所によりマーカーとして特異性を有している と言える。今日、高い検出閾値、低い処理能力、遅れた表現情報および様々な感度を必要とする欠 点にも関わらず、抗原、タンパク質、脂質および酵素の測定と同じ目的のために、幅広く試験が実 施されている。それに対して、RNA 分離および miRNA 検出の普遍的に標準化された方法の統一が 待たれるが、量的 PCR(qPCR)のように増幅ベースの技術は、単純で、速く、複製可能で、コスト効 率が良いと考えれらる。 異なる疾病状態および体液からの検討結果の解釈のために健常人の解析は重要であるが、いくつか の研究で健康人の miRNAs の変化を検討している。ウェーバーらは、5 つの健康人サンプル中で 12 の異なる体液の miRNA 成分を測定し、唾液、母乳および精液が、尿または CSF と比較して多くの 検知可能な miRNA を含んでいることを明らかにした(19)。一般に表現される miRNAs の情報を基に、 5 これらの研究者らは、主な 2 つに体液を分類することができ、血漿がほとんどの他の体液とは異な るプロフィールがあることを明らかにした。私たちは、29 人の健康人の尿サンプルを使い miRNAs 量の変化を分析したところ、健康なサンプルにおいても背景的な相違があり、miRNAs 量の変動に 影響をもたらしていることを考慮しても、miRNA 濃度が疾病状態で著しく増加していることを観察 した(36)。 この生体に遍在して異なる分散を示す miRNA は、種々の臓器毎で正常な生理作用を維持 する際に重要な役割を果たしていることを示唆している。 癌マーカーとしての miRNAs miRNAs は細胞外に放出され各種の体液中に安定して存在することが知られ、通常は侵襲性の検査 が主流である癌の分野でもかなりの注目を受けており、バイオマーカーが細胞外に存在し非侵襲性 の試料が利用できることで、研究が急速に進んでいる(表 2)。ほとんどの研究は、血清または血漿で 行なわれが、いくつかのグループは病気に関係する他の体液を検討に用いている。例えば、喉頭癌 のための唾液(37)、腎臓癌(38)または膀胱癌(39) のための尿、肺癌のための唾液 (40)、中枢神経系の リンパ種(41)および神経膠芽腫(42)のための CSF などが挙げられる。 2008 年に、非侵襲性体液中の miRNA がバイオマーカー機能を実証する初期の一つの検討として実施された。それは、肥大化した B 細胞リンパ腫患者の血清中で、腫瘍に関係していると知られた 3 の miRNAs の濃度と、健常人コ ントロールの濃度を比較する検討であった (28)。miRNA 濃度は患者血清で高濃度を示し、特に高い miR-21 濃度は無再発生存期間を示した。同時期に別のグループは、miRNAs がヒト血漿中で非常に 安定して検出でき、前立腺癌異種移植片ハツカネズミとコントロールとの間で相違を示すことを報 告した(9)。 多くのグループが続いて行っている最も一般的な研究目標として、miRNAs が癌と非癌の組織中で の違いを検討することである。そのために、個々の miRNAs あるいはパネルは選択されており、選 ばれた流動性の試料で検討された(43, 44)。広く実施されたその他の検討は、プールした試料で初期 の結果を得、次に個々のサンプル中で結果を確認することであった(45)。少数のグループが、マウ スモデル中の miRNAs の調節異常を研究しており、その結果をヒトに応用した(46)。あるいは、患 者サンプルに研究を拡大する前に、癌細胞株で in vitro の実験を行なった(47)。研究設計の適切な取 り込み指標として、腫瘍削除の前後の miRNA の発現を治療の予後の指標として評価している(48)。 Friedman らは腫瘍の外科的切除の後に、黒色腫の再発を予言するために血清 miRNAs を利用する ことを検討している(49)。 いくつかの研究で、密接に関連する癌種あるいは疾病状態の miRNAs 濃 度を比較して、癌のバイオマーカーとしての高い特異性を示す候補 miRNAs を探索している。例え ば、膵管腺癌の潜在的な血清 miRNA バイオマーカーを識別するため、Kong らは慢性の膵臓癌サン プルを使用した(50)。 Hanke らのグループは、低度および高度の膀胱癌を持った患者からの尿サン プルを用いて、非癌の尿路感染症の尿サンプルと比較し、miR-196a の特異性を検証した(51)。いく つかの研究から、miRNAs が異なる癌ステージを分類する指標に成り得ることを示唆している。 Roth らは、初期と悪性化した乳癌患者の血清 miRNAs の濃度を比較し(47)、一方、Asaga らの研究 によると 乳癌の進行した段階を持った患者で、初期の段階のものより循環血中 miR-21 濃度が著し く高いことを実証した(43)。 表 2 癌バイオマーカーとしての細胞外 microRNAsa 6 7 8 9 組織損傷バイオマーカーとしての miRNAs miRNA を中心とした診断法は、さらに様々な組織障害状態でも検討された。それらのうちのいくつ かについて要約した(表 3)。心疾患での miRNA バイオマーカー研究が、組織障害の主な焦点であっ た。miR-1 および-499 は、急性心筋梗塞(AMI)のバイオマーカーとして提案され、従来の標準的に使 われるマーカーに匹敵することが確認された(52)。Cheng のグループは血清 miR-1 が、AMI のネズ ミ・モデルで発症初期に増加し、6h でピークに達して、かつ梗塞のサイズとよく関連していること を見出だした(52)。それらの発見をヒトに応用して、血清 miR-1 パターンが、従来の血清クレアチ ンキナーゼ-MB とよく相関することを確認している。ネズミとヒトの両方で、尿の miR-1 は、24h でピークに達して、AMI の初期の時間ポイントで著しく同様に増加していた(53)。 心不全、冠動脈 疾患および高血圧症は、他の心臓病に関して現在試験中である(52)。 尿は腎臓病との関係で、バイオマーカー探索で最も広く用いられている試料の 1 つである。miR-210 は、組織障害および末期慢性腎臓病(ESRD)の血漿および尿中のバイオマーカーとして提案された(20, 34)。尿では、急性同種移植拒絶反応を予測することができ、移植後の反応や薬物治療への感受性を 非侵襲的にモニターできる可能性がある(54)。尿と血漿中の miR-155 も、急性あるいは慢性障害お よび ESRD で研究された(20, 55)。 アセトアミノフェン毒性のような肝臓障害は、最も一般的な障害の 1 つであるが、いくつかのげっ 歯動物およびヒト研究で、血漿中 miR-122 を増加させた(21, 56)。miR-122 および miR-192(両方とも 肝臓に多く存在)は、薬物の初期用量依存的な反応を示し、それらを大規模な薬物および合成化合物 の選択において、毒性モニタリング使用に非常にふさわしい候補として、応用の可能が考えられて いる(21)。miR-122 は、さらに非アルコール性の脂肪肝疾病および C 型慢性肝炎中で応用が可能であ ることが示された(57)。 疾病状態を表すバイオマーカーとしての miRNAs 癌と組織障害とは別に、miRNAs がバイオマーカーとして研究された多くに、他の疾病状態の把握 がある。また少数であるが、類似の研究も存在する(表 4)。Zampetaki らは、糖尿病患者の血漿中の 5 つの miRNAs の濃度が、健康人の血漿と異なることを発見した。その後、この異常は糖尿病の、 あるいは糖尿病のない個人、約 200 例の血漿中で確認された。また miR-126 評価は、822 症例の異 なる血漿までさらに拡大して検討された(58)。迅速および早期検診を必要とし、理想的なバイオマ ーカーを欠く別の疾病として、敗血症がある。血漿 miR-150 が敗血症患者において著しく低く、濃 度がその病気の重症度と関連することが示唆された(59)。また血清 miR-146a および-223 の濃度が、 両方とも健全なコントロールより敗血症患者において著明に低いことがしめされた(60)。 表 3 組織障害バイオマーカーとしての細胞外の miRNAsa 10 11 12 表 4 疾病状態のバイオマーカーとしての細胞外の microRNAsa 13 本表は、様々な体液中の新しい非侵襲性のバイオマーカーとしての miRNAs の応用として、多発性 硬化症を含む他の疾病条件に関する研究(61)、HIV 脳炎に関する研究( 62)、また biopolar 障害 に関 する研究をまとめている(63) 。 miRNA バイオマーカーの研究で用いられるツールと技術 分離 従来方式の RNA 分離には市販試薬があり、phenol-chloroform による抽出工程がある。あるいはカラ ム技術を用いた glass-fiber は、様々なメーカーから市販されている(図 2)。exosome 分離および濃縮 用技術は、市販沈殿試薬、超遠心分離、クロマトグラフィーおよび Dynabeads を用いる(13, 64)。 Yoo らは、免疫親和性を使用して exosomes から miRNAs を磁気ビーズで直接分離する、革新的な方 法について報告している (65)。 抽出された RNA の定量は、Nanodrop 上で分光学的手法による分析 によって行なわれる。Agilent の microfluidics プラットフォームは、低分子量のものを RNA の総量お よび質を別々に評価するために使用することができまる。特異的な exosomes を分離する研究は、小 胞構造解析と intact での解析に送信電子顕微鏡検査(TEM)を使用し、CD63 と TSG101 のような exosome に特有のタンパク質を測定ために免疫ブロット分析を行なう (14)。 図 2 RNA 分画の中から miRNA バイオマーカー、候補マーカーの発見およびその検証段階、配列 決定に用いられたツールと技術 14 発見 プロファイリング 多数の会社から miRNA のプロファイリングが提示されて、交差反応や増幅に基づいた検出プラッ トフォーム (図 2)がある。交差反応システムは組織を特定するのに有利で、また増幅は誤差などの バイアスを回避する。細胞外液の低い RNA 量は、この体液からの検出の問題を提起している。した がって、前増幅の補足オプションを提供する増幅に基づいた技術は、非常に低い RNA 量で多種ある 尿検体に対する最良の選択かもしれない。市販のプラットフォームに加えて、いくつかのグループ は、発現プロファイリング用の他の技術を開発している(66)。 シーケンシング 核酸の次世代シーケンシングは、新しい種特異・組織に特有の miRNAs を識別するためにますます 使用される。最も一般に使用される技術は 454 pyrosequencing、Solexa 配列および ABI の固体の配列 である。HeliScope 単一の分子配列も、小さな RNA の配列決定で実証された(図 2)。包括的な調査に より、配列の完全なワークフローおよび各方法の利点および欠点が詳述されている(67)。 検出 配列が解析された単一あるいは多数の miRNAs の検出は、qPCR、Northern blot で測定されるか、あ るいは in situ ハイブリダイゼーションで検出する。従来の qPCR は、Taqman 社のような stem-looped リアルタイム PCR 用プライマー、miRNA に特有のプライマーおよび一般的なリバースプライマー を使用することにより PCR を行う。他の方法として、Qiagen 社のような、RNA に polyA タグを加 えて、かつリアルタイム PCR のために oligo-dT プライマーを使用して、特定または一般的なリバー スプライマー用いて PCR を行う。より特異性向上と簡易化を目指して、ポリウリジル化とリアルタ イム PCR に polyA stem-looped プライマーを使用するなど、いろいろ試されている(68)。in situ ハイ ブリダイゼーションを利用する検出方法は一般に用いられている方法で、ロックされた核酸プロー ブの使用により選択性が改善されている(69)。De Planell-Saguer らは、パラフィン固定した FFPE 標 本および細胞培養から、miRNAs およびタンパク質を同時に検出するために独特な技術を開発した (70)。この方法は、miRNA を指標する研究に特に役立つと考えられる。 検出方法に関するいくつかの文献によると、それらのうちの多くで蛍光や電気化学あるいは光学の 技術を採用した,オリジナルな検出方法が開発されている。これらの方法は miRNAs を臨床応用する 際に、効率的に組み入れることができる診断ツールへと可能性を広げている。紹介しているこれら の定量分析法は、迅速性、感度および特異性を向上させており、miRNA の増幅を行う前処理工程数 を軽減した方法である。例えば、on-chip isotachophoresis のような等速電気泳動を使用して、細胞溶 解物から小さな RNA を分離し、濃縮し、定量する方法が Schoch らによって開発された(71)。 miRNA の検出方法として、単純な分子の信号の変化を捉える方法(72)、グラフェン酸化を用いる蛍 光消光を捉える方法( 73)、及び銀(75)や金 (76)や炭素(77)の様なプローブを基にする異なるナノ粒子 を用いた酵素発光法(74)が存在する。等速電気泳動法 (78)とキャピラリー電気泳動(79)のような異な る形式の電気泳動法を組み合わせたり、指数関数的な信号の増幅 法(80)あるいは等温増幅 法(81)を 組み合わせたり、多種のハイブリダイゼーション法(82)を組み合わせる複雑な方法も開発されてい る。 15 挑戦 バイオマーカーとしての miRNAs の使用は、様々な疾病モデルの中で提案され確認されてきたが、 臨床の応用するに当たり、マーカーとしての使用を拡大する前に克服すべき課題がいくつか存在し ている。 起源 細胞外の miRNAs の起源は不明なままであるが、潜在的には結果に対して重要な影響が考えられる。 例えば、腫瘍が体液へ miRNAs を運ぶ exosomes を特別に分泌することが示された(83)。それはバイ オマーカーに対して適切に miRNAs を選択することで、細胞外の miRNAs が腫瘍の発現、進行ある いは転移を検出する役割を持っていることを示した。 最近の研究は、血清と唾液の中にある miRNAs が exosomes にて濃縮されることが示された(14)。しかしながら、Arroyo らによる研究、 Turchinovich ら研究では、体液での miRNAs が小胞ではなく、タンパク質複合体に主に見つかると 主張している(16, 18)。つまり検知された miRNAs が、小胞体由来でなく安定したタンパク質複合体 によって保護された死細胞の残存物である可能性が考えられている。 バイオマテリアルの選択 血清かまたは血漿を選ぶことが、結果の違いをもたらすかどうかは明らかではない。選択された miRNAs において、血清と血漿の間に大きな差がないと Mitchel のグループは報告している(9)。最 近の研究によれば、検出できる多量な miRNA と同様に、RNA の濃度が血漿より血清により高いこ とが示された(84)。そのグループは血液の凝固作用により、miRNAs の放出あるいは分泌を引き起こ すかもしれないことを示唆した。あるいは細胞融解による RNA の溶出が、結果に影響するかもかも しれない。臨床の血漿/血清サンプルの対処で、考慮に入れるべき別の重要な要因は、溶血の範囲で ある。Kirschner らは、溶血の程度の解析に一般に使用される miR-16 および-451 は、赤血球に相当 な量が存在し、サンプルのそれらの濃度を測定することで標準化できる因子であること実証してい る 85)。 分離技術 血液用の RNA 安定化システムの差は、qPCR 適用に下流に影響するようには見えないが、RNA の収 率と純度に差を引き起こすかもしれない(86)。RNA の分離は重要なステップである。また、収率は qPCR およびマイクロアレイに基づいた結果に相当な影響を与える(87)。カラムによる分離技術によ る TRIzol 抽出、および種々様々のサンプルの超遠心分離を用いた exosome の分離技術を比較するい くつかの研究が行なわれた(29, 87)。結論として、サンプルの種類、プロトコル、試薬変化および量 の測定方法が、分離された RNA の質および量に影響を及ぼすことを示しており、mRNA 分析で、 miRNAs の量測定に使用された異なるマイクロアレイ・プラットフォームがそれらの結果に矛盾が り、マイクロアレイおよび qPCR/Northern blot データ間でも差が見られる(88) 。シーケンシング戦略 でさえ、プラットフォームのライブラリーの準備および選択用のプロトコルは、結果に影響を及ぼ すことが知られている。 16 標準化 異なる組織と細胞外液、および疾病状態の間で、一貫している標準化的に準備された miRNA が設 定できていないことが、miRNA をバイオマーカーとして疾病の推定に使用する際の大きな障害とな っている(90)。試料に合成 miRNA を添加する標準的な代替手段は、技術的制御や初期段階の総 RNA 量を監視することで、分光学的な定量が可能である。しかしながら、総 RNA 量と miRNA 濃度 の間の相関性が低いことを示す研究もあり、疾病条件により変動する内因性の miRNA 濃度と、添 加した miRNA 濃度の差が説明できない可能性がある(84)。Meyer らは、マイクロアレイのデータ解 析のため、標準化できる 7 つの異なる分析方法の情報を提供した(91)。普遍的にマイクロアレイの データ解析で miRNA をバイオマーカーとして用いるためには、内部標準とポジティブコントロー ルを如何に疾病に合わせて準備できるかが重要である。(92)。 結論 miRNA を中心としたる診断法は、まだその幼時期にある。またこれらの分子には、大きな可能性が あるだけでなく、組織損傷および疾病状態のモニターや疾病進行の高感度な診断、特定および強健 なマーカーとしての可能性がある。The Center for Advancing Translational Sciences (それは NIH の一 部である) は、miRNAs を含んでいる細胞外の RNA コミュニケーションに関するプログラムに資 金を提供した。それらのイニシアチブは、バイオマーカーと治療薬の両方として、これらの分子の 臨床的有用性を評価し、様々な体液の中にある細胞外の RNA の正常な参照プロフィールを作成する ことである。ファイザーとイーライ・リリーと一緒に、クリティカル・パス研究所で安全性を予測 テストするコンソーシアム(PSTC)によって監視された産業コンソーシアムは、毒性に応じる睾丸の 損傷マーカーとして体液中の miRNAs を検討している(93)。しかしながら、疾病の病態生理学、お よびその影響を受けた細胞から生体液への放出される機序と、それらの正確な役割に関する根本課 題については、まだ回答が得られていない。miRNAs は新しい世代のバイオマーカーとしての応用 が始まったばかりである。また、様々な技術的・生物学的ハードルを克服することができれば、前 臨床および臨床研究おいてバイオマーカーとしての役割を持って、検査市場への導入の可能性が広 がる。 （訳者：岸 浩司） Footnotes † Janani Saikumar and Krithika Ramachandran contributed equally to the work, and both should be considered as first authors. 3 Nonstandard abbreviations： miRNA, microRNA； pri-miRNA, primary miRNA transcripts； pre-miRNA, precursor miRNA； 17 TAR, trans-activation response； TRBP, TAR binding protein； RISC, RNA- induced silencing complex； AGO-2, Argonaute protein； nSMase2, neutral sphingomyelinase 2； FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded； CSF, cerebrospinal fluid； qPCR, quantitative PCR； AMI, acute myocardial infarction； ESRD, end-stage renal disease. Author Contributions： All authors confirmed they have contributed to the intellectual content of this paper and have met the following 3 requirements： (a) significant contributions to the conception and design, acquisition of data, or analysis and interpretation of data； (b) drafting or revising the article for intellectual content； and (c) final approval of the published article. Authors' Disclosures or Potential Conflicts of Interest： Upon manuscript submission, all authors completed the author disclosure form. Disclosures and/or potential conflicts of interest： Employment or Leadership： V.S. Vaidya, Harvard Program in Therapeutic Sciences. Consultant or Advisory Role： None declared. Stock Ownership： None declared. Honoraria： None declared. Research Funding： V.S. Vaidya, National Institutes of Health/National Institutes of Environmental Health Sciences–Outstanding New Environmental Scientist Award (ES017543) and an Innovation in Regulatory Science Award from the Burroughs Wellcome Fund. Expert Testimony： None declared. Patents： None declared. Received for publication September 16, 2013. 18 Accepted for publication December 9, 2013. © 2013 American Association for Clinical Chemistry References 1. Lee R, Feinbaum R, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 1993；75：843–54. 2. Reinhart B, Slack F, Basson M, Pasquinelli A, Bettinger J, Rougvie A, et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 2000；403：901–6. 3. Pasquinelli A, Reinhart B, Slack F, Martindale M, Kuroda M, Maller B, et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature 2000；408：86–9. 4. Hsu P, Huang H-D, Hsu S-D, Lin L-Z, Tsou A-P, Tseng C-P, et al. MiRNAmap： genomic maps of microRNA genes and their target genes in mammalian genomes. Nucleic Acids Res 2006；34：D135–9. 5. Winter J, Jung S, Keller S, Gregory RI, Diederichs S. Many roads to maturity： microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol 2009；11：228–34. 6. Schwarz DS, Hutvagner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 2003；115：199–208. 7. Friedman R, Farh K, Burge C, Bartel D. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome research 2009；19：92–105. 8. Kosaka N, Iguchi H, Yoshioka Y, Takeshita F, Matsuki Y, Ochiya T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J Biol Chem 2010；285：17442–52. 9. Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, Pogosova-Agadjanyan EL, et al. Circulating microRNAs as s 表 blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A 2008；105： 10513–8. 10. Valadi H, Ekstrom K, Bossios A, Sjostrand M, Lee JJ, Lotvall JO. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol 2007；9： 654–9. 11. Wang K, Zhang S, Weber J, Baxter D, Galas DJ. Export of microRNAs and microRNA-protective protein by mammalian cells. Nucleic Acids Res 2010；38：7248–59. 12. Zhou Q, Li M, Wang X, Li Q, Wang T, Zhu Q, et al. Immune-related microRNAs are abundant in breast milk exosomes. Int J Biol Sci 2012；8：118–23. 19 13. Rani S, O'Brien K, Kelleher FC, Corcoran C, Germano S, Radomski MW, et al. Isolation of exosomes for subsequent mRNA, microRNA, and protein profiling. Methods Mol Biol 2011；784：181–95. 14. Gallo A, Tandon M, Alevizos I, Illei GG. The majority of microRNAs detec 表 in serum and saliva is concentrated in exosomes. PLoS One 2012；7：e30679. 15. Zernecke A, Bidzhekov K, Noels H, Shagdarsuren E, Gan L, Denecke B, et al. Delivery of microRNA126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci Signal 2009；2：ra81. 16. Turchinovich A, Weiz L, Langheinz A, Burwinkel B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res 2011；39：7223–33. 17. Vickers KC, Palmisano BT, Shoucri BM, Shamburek RD, Remaley AT. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol 2011；13：423–33. 18. Arroyo JD, Chevillet JR, Kroh EM, Ruf IK, Pritchard CC, Gibson DF, et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A 2011；108：5003–8. 19. Weber JA, Baxter DH, Zhang S, Huang DY, Huang KH, Lee MJ, et al. The microRNA spectrum in 12 body fluids. Clin Chem 2010；56：1733–41. 20. Neal CS, Michael MZ, Pimlott LK, Yong TY, Li JY, Gleadle JM. Circulating microRNA expression is reduced in chronic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 2011；26：3794–802. 21. Wang K, Zhang S, Marzolf B, Troisch P, Brightman A, Hu Z, et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc Natl Acad Sci U S A 2009；106：4402–7. 22. Sharma CM, Vogel J. Experimental approaches for the discovery and characterization of regulatory small RNA. Curr Opin Microbiol 2009；12：536–46. 23. Hede K. Small RNAs are raising big expectations. J Natl Cancer Inst 2009；101：840–1. 24. Chen X, Ba Y, Ma L, Cai X, Yin Y, Wang K, et al. Characterization of microRNAs in serum： a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res 2008；18：997–1006. 25. Oellerich M. Enzyme-immunoassay： a review. J Clin Chem Clin Biochem 1984；22：895–904. 26. Jensen O. Modification-specific proteomics： characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol 2004；8：33–41. 27. Addis MF, Tanca A, Pagnozzi D, Crobu S, Fanciulli G, Cossu-Rocca P, Uzzau S. Generation of highquality protein extracts from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Proteomics 2009；9：3815–23. 28. Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM, Pushkaran B, Liggins AP, Pulford K, et al. Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol 2008；141：672–5. 20 29. Mraz M, Malinova K, Mayer J, Pospisilova S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochem Biophys Res Commun 2009；390：1–4. 30. Siebolts U, Varnholt H, Drebber U, Dienes HP, Wickenhauser C, Odenthal M. Tissues from routine pathology archives are sui 表 for microRNA analyses by quantitative PCR. J Clin Pathol 2009；62：84– 8. 31. Morenos L, Saffery R, Mechinaud F, Ashley D, Elwood N, Craig JM, Wong NC. Evaluation of microRNA expression in patient bone marrow aspirate slides. PLoS One 2012；7：e42951. 32. Borze I, Guled M, Musse S, Raunio A, Elonen E, Saarinen-Pihkala U, et al. MicroRNA microarrays on archive bone marrow core biopsies of leukemias–method validation. Leuk Res 2011；35：188–95. 33. Lee CT, Risom T, Strauss W. Evolutionary conservation of microRNA regulatory circuits： an examination of microRNA gene complexity and conserved microRNA-target interactions through metazoan phylogeny. DNA Cell Biol 2007；26：209–18. 34. Lorenzen JM, Kielstein JT, Hafer C, Gupta SK, Kumpers P, Faulhaber-Walter R, et al. Circulating miR-210 predicts survival in critically ill patients with acute kidney injury. Clin J Am Soc Nephrol 2011； 6：1540–6. 35. Mi S, Lu J, Sun M, Li Z, Zhang H, Neilly MB, et al. MicroRNA expression signatures accurately discriminate acute lymphoblastic leukemia from acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 2007；104：19971–6. 36. Ramachandran K, Saikumar J, Bijol V, Koyner JL, Qian J, Betensky RA, et al. Human miRNome profiling identifies microRNAs differentially present in the urine after kidney injury. Clin Chem 2013； 59：1742–52. 37. Park NJ, Zhou H, Elashoff D, Henson BS, Kastratovic DA, Abemayor E, Wong DT. Salivary microRNA： discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res 2009；15：5473–7. 38. von Brandenstein M, Pandarakalam JJ, Kroon L, Loeser H, Herden J, Braun G, et al. MicroRNA 15a, inversely correlated to PKCα, is a potential marker to differentiate between benign and malignant renal tumors in biopsy and urine samples. Am J Pathol 2012；180：1787–97. 39. Puerta-Gil P, Garcia-Baquero R, Jia AY, Ocana S, Alvarez-Mugica M, Alvarez-Ossorio JL, et al. mir143, mir-222, and mir-452 are useful as tumor stratification and noninvasive diagnostic biomarkers for bladder cancer. Am J Pathol 2012；180：1808–15. 40. Xing L, Todd NW, Yu L, Fang H, Jiang F. Early detection of squamous cell lung cancer in sputum by a panel of microRNA markers. Mod Pathol 2010；23：1157–64. 41. Baraniskin A, Kuhnhenn J, Schlegel U, Chan A, Deckert M, Gold R, et al. Identification of microRNAs in the cerebrospinal fluid as marker for primary diffuse large B-cell lymphoma of the central nervous system. Blood 2011；117：3140–6. 21 42. Teplyuk NM, Mollenhauer B, Gabriely G, Giese A, Kim E, Smolsky M, et al. MicroRNAs in cerebrospinal fluid identify glioblastoma and metastatic brain cancers and reflect disease activity. Neuro Oncol 2012；14：689–700. 43. Asaga S, Kuo C, Nguyen T, Terpenning M, Giuliano AE, Hoon DS. Direct serum assay for microRNA-21 concentrations in early and advanced breast cancer. Clin Chem 2011；57：84–91. 44. Liu XG, Zhu WY, Huang YY, Ma LN, Zhou SQ, Wang YK, et al. High expression of serum mir-21 and tumor mir-200c associated with poor prognosis in patients with lung cancer. Med Oncol 2012；29： 618–26. 45. Zhang C, Wang C, Chen X, Yang C, Li K, Wang J, et al. Expression profile of microRNAs in serum： a fingerprint for esophageal squamous cell carcinoma. Clin Chem 2010；56：1871–9. 46. Yamamoto Y, Kosaka N, Tanaka M, Koizumi F, Kanai Y, Mizutani T, et al. MicroRNA-500 as a potential diagnostic marker for hepatocellular carcinoma. Biomarkers 2009；14：529–38. 47. Roth C, Rack B, Muller V, Janni W, Pantel K, Schwarzenbach H. Circulating microRNAs as bloodbased markers for patients with primary and metastatic breast cancer. Breast Cancer Res 2010；12：R90. 48. Liu CJ, Lin SC, Yang CC, Cheng HW, Chang KW. Exploiting salivary mir-31 as a clinical biomarker of oral squamous cell carcinoma. Head Neck 2012；34：219–24. 49. Friedman EB, Shang S, de Miera EV, Fog JU, Teilum MW, Ma MW, et al. Serum microRNAs as biomarkers for recurrence in melanoma. J Transl Med 2012；10：155. 50. Kong X, Du Y, Wang G, Gao J, Gong Y, Li L, et al. Detection of differentially expressed microRNAs in serum of pancreatic ductal adenocarcinoma patients： mir-196a could be a potential marker for poor prognosis. Dig Dis Sci 2011；56：602–9. 51. Hanke M, Hoefig K, Merz H, Feller AC, Kausch I, Jocham D, et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker： microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol 2010；28：655–61. 52. Creemers E, Tijsen A, Pinto Y. Circulating microRNAs： novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res 2012；110：483–95. 53. Cheng Y, Wang X, Yang J, Duan X, Yao Y, Shi X, et al. A translational study of urine miRNAs in acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol 2012；53：668–76. 54. Lorenzen JM, Volkmann I, Fiedler J, Schmidt M, Scheffner I, Haller H, et al. Urinary miR-210 as a mediator of acute T-cell mediated rejection in renal allograft recipients. Am J Transplant 2011；11： 2221–7. 55. Saikumar J, Hoffmann D, Kim TM, Gonzalez VR, Zhang Q, Goering PL, et al. Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury. Toxicol Sci 2012； 129：256–67. 22 56. Starkey Lewis PJ, Dear J, Platt V, Simpson KJ, Craig DG, Antoine DJ, et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology 2011；54：1767–76. 57. Cermelli S, Ruggieri A, Marrero JA, Ioannou GN, Beretta L. Circulating microRNAs in patients with chronic hepatitis C and non-alcoholic fatty liver disease. PloS One 2011；6：e23937. 58. Zampetaki A, Kiechl S, Drozdov I, Willeit P, Mayr U, Prokopi M, et al. Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes. Circ Res 2010；107：810–7. 59. Vasilescu C, Rossi S, Shimizu M, Tudor S, Veronese A, Ferracin M, et al. microRNA fingerprints identify mir-150 as a plasma prognostic marker in patients with sepsis. PloS One 2009；4：e7405. 60. Wang JF, Yu ML, Yu G, Bian JJ, Deng XM, Wan XJ, Zhu KM. Serum miR-146a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis. Biochem Biophys Res Commun 2010；394：184–8. 61. Haghikia A, Haghikia A, Hellwig K, Baraniskin A, Holzmann A, Decard BF, et al. Regulated microRNAs in the CSF of patients with multiple sclerosis： a case-control study. Neurology 2012；79： 2166–70. 62. Pacifici M, Delbue S, Ferrante P, Jeansonne D, Kadri F, Nelson S, et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J Cell Physiol 2013；228：1070–5. 63. Rong H, Liu TB, Yang KJ, Yang HC, Wu DH, Liao CP, et al. MicroRNA-134 plasma levels before and after treatment for bipolar mania. J Psychiatr Res 2011；45：92–5. 64. Taylor DD, Zacharias W, Gercel-Taylor C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods Mol Biol 2011；728：235–46. 65. Yoo CE, Kim G, Kim M, Park D, Kang HJ, Lee M, Huh N. A direct extraction method for microRNAs from exosomes captured by immunoaffinity beads. Anal Biochem 2012；431：96–8. 66. Duan D, Zheng K-x, Shen Y, Cao R, Jiang L, Lu Z, et al. Label-free high-throughput microRNA expression profiling from total RNA. Nucleic Acids Res 2011；39：e154. 67. Creighton CJ, Reid JG, Gunaratne PH. Expression profiling of microRNAs by deep sequencing. Brief Bioinform 2009；10：490–7. 68. Mei Q, Li X, Meng Y, Wu Z, Guo M, Zhao Y, et al. A facile and specific assay for quantifying microRNA by an optimized RT-qPCR approach. PLoS One 2012；7：e46890. 69. Song R, Ro S, Yan W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods Mol Biol 2010；629： 287–94. 70. de Planell-Saguer M, Rodicio MC, Mourelatos Z. Rapid in situ codetection of noncoding RNAs and proteins in cells and formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections without protease treatment. Nat Protoc 2010；5：1061–73. 23 71. Schoch R, Ronaghi M, Santiago J. Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis. Lab Chip 2009；9：2145–52. 72. Baker M, Bao G, Searles C. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res 2012；40：e13. 73. Dong H, Zhang J, Ju H, Lu H, Wang S, Jin S, et al. Highly sensitive multiple microRNA detection based on fluorescence quenching of graphene oxide and isothermal strand-displacement polymerase reaction. Anal Chem 2012；84：4587–93. 74. Sun Y, Gregory K, Chen N, Golovlev V. Rapid and direct microRNA quantification by an enzymatic luminescence assay. Analytical biochemistry 2012；429：11–7. 75. Dong H, Jin S, Ju H, Hao K, Xu LP, Lu H, Zhang X. Trace and label-free microRNA detection using oligonucleotide encapsulated silver nanoclusters as probes. Anal Chem 2012；84：8670–4. 76. Tu Y, Wu P, Zhang H, Cai C. Fluorescence quenching of gold nanoparticles integrating with a conformation-switched hairpin oligonucleotide probe for microRNA detection. Chem Commun 2012； 48：10718–20. 77. Wang L, Cheng Y, Wang H, Li Z. A homogeneous fluorescence sensing platform with water-soluble carbon nanoparticles for detection of microRNA and nuclease activity. Analyst 2012；137：3667–72. 78. Garcia-Schwarz G, Santiago J. Integration of on-chip isotachophoresis and functionalized hydrogels for enhanced-sensitivity nucleic acid detection. Anal Chem 2012；84：6366–9. 79. Jiang RM, Chang YS, Chen SJ, Chen JH, Chen HC, Chang PL. Multiplexed microRNA detection by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence. J Chromatogr A 2011；1218：2604–10. 80. Wang GL, Zhang CY. Sensitive detection of microRNAs with hairpin probe-based circular exponential amplification assay. Anal Chem 2012；84：7037–42. 81. Harcourt EM, Kool ET. Amplified microRNA detection by templated chemistry. Nucleic Acids Res 2012；40：e65. 82. Pohlmann C, Sprinzl M. Electrochemical detection of microRNAs via gap hybridization assay. Anal Chem 2010；82：4434–40. 83. Palma J, Yaddanapudi SC, Pigati L, Havens MA, Jeong S, Weiner GA, et al. MicroRNAs are exported from malignant cells in customized particles. Nucleic Acids Res 2012；40：9125–38. 84. Wang K, Yuan Y, Cho JH, McClarty S, Baxter D, Galas DJ. Comparing the microRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One 2012；7：e41561. 85. Kirschner MB, Kao SC, Edelman JJ, Armstrong NJ, Vallely MP, van Zandwijk N, Reid G. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One 2011；6：e24145. 24 86. Weber DG, Casjens S, Rozynek P, Lehnert M, Zilch-Schoneweis S, Bryk O, et al. Assessment of mRNA and microRNA stabilization in peripheral human blood for multicenter studies and biobanks. Biomark Insights 2010；5：95–102. 87. Eldh M, Lotvall J, Malmhall C, Ekstrom K. Importance of RNA isolation methods for analysis of exosomal RNA： evaluation of different methods. Mol Immunol 2012；50：278–86. 88. Jensen SG, Lamy P, Rasmussen MH, Ostenfeld MS, Dyrskjot L, Orntoft TF, Andersen CL. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics 2011；12：435. 89. Toedling J, Servant N, Ciaudo C, Farinelli L, Voinnet O, Heard E, Barillot E. Deep-sequencing protocols influence the results obtained in small-RNA sequencing. PLoS One 2012；7：e32724. 90. Ajit SK. Circulating microRNAs as biomarkers, therapeutic targets, and signaling molecules. Sensors 2012；12：3359–69. 91. Meyer SU, Kaiser S, Wagner C, Thirion C, Pfaffl MW. Profound effect of profiling platform and normalization strategy on detection of differentially expressed microRNAs–a comparative study. PLoS One 2012；7：e38946. 92. Latham GJ. Normalization of microRNA quantitative RT-PCR data in reduced scale experimental designs. Methods Mol Biol 2010；667：19–31. 93. Dere E, Anderson LM, Coulson M, McIntyre BS, Boekelheide K, Chapin RE. SOT symposium highlight： transla 表 indicators of testicular toxicity： inhibin b, microRNAs, and sperm signatures. Toxicol Sci 2013；136：265–73. 94. Sita-Lumsden A, Dart DA, Waxman J, Bevan CL. Circulating microRNAs as potential new biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer 2013；108：1925–30. 95. Fang C, Zhu DX, Dong HJ, Zhou ZJ, Wang YH, Liu L, et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers for diffuse large B cell lymphoma. Ann Hematol 2012；91：553–9. 96. Tanaka M, Oikawa K, Takanashi M, Kudo M, Ohyashiki J, Ohyashiki K, Kuroda M. Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patients. PloS One 2009；4：e5532. 97. Ho AS, Huang X, Cao H, Christman-Skieller C, Bennewith K, Le QT, Koong AC. Circulating miR210 as a novel hypoxia marker in pancreatic cancer. Transl Oncol 2010；3：109–13. 98. Liu R, Chen X, Du Y, Yao W, Shen L, Wang C, et al. Serum microRNA expression profile as a biomarker in the diagnosis and prognosis of pancreatic cancer. Clin Chem 2012；58：610–8. 99. Ali S, Almhanna K, Chen W, Philip PA, Sarkar FH. Differentially expressed miRNAs in the plasma may provide a molecular signature for aggressive pancreatic cancer. Am J Transl Res 2010；3：28–47. 25 100. Wang J, Chen J, Chang P, LeBlanc A, Li D, Abbruzzesse JL, et al. MicroRNAs in plasma of pancreatic ductal adenocarcinoma patients as novel blood-based biomarkers of disease. Cancer Prev Res 2009；2：807–13. 101. Heneghan HM, Miller N, Lowery AJ, Sweeney KJ, Newell J, Kerin MJ. Circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer. Ann Surg 2010；251：499–505. 102. Ng EK, Li R, Shin VY, Jin HC, Leung CP, Ma ES, et al. Circulating microRNAs as specific biomarkers for breast cancer detection. PloS One 2013；8：e53141. 103. Resnick KE, Alder H, Hagan JP, Richardson DL, Croce CM, Cohn DE. The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform. Gynecol Oncol 2009；112：55–9. 104. Taylor D, Gercel-Taylor C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol 2008；110：13–21. 105. Wang F, Sun GP, Zou YF, Hao JQ, Zhong F, Ren WJ. MicroRNAs as promising biomarkers for gastric cancer. Cancer Biomark 2012；11：259–67. 106. Li BS, Zhao YL, Guo G, Li W, Zhu ED, Luo X, et al. Plasma microRNAs, miR-223, miR-21 and miR-218, as novel potential biomarkers for gastric cancer detection. PLoS One 2012；7：e41629. 107. Menendez P, Villarejo P, Padilla D, Menendez JM, Montes JA. Diagnostic and prognostic significance of serum microRNAs in colorectal cancer. J Surg Oncol 2013；107：217–20. 108. Wu CW, Ng SS, Dong YJ, Ng SC, Leung WW, Lee CW, et al. Detection of miR-92a and miR-21 in stool samples as potential screening biomarkers for colorectal cancer and polyps. Gut 2012；61：739–45. 109. Kalimutho M, Del Vecchio Blanco G, Di Cecilia S, Sileri P, Cretella M, Pallone F, et al. Differential expression of miR-144* as a novel fecal-based diagnostic marker for colorectal cancer. J Gastroenterol 2011；46：1391–402. 110. Yu L, Todd NW, Xing L, Xie Y, Zhang H, Liu Z, et al. Early detection of lung adenocarcinoma in sputum by a panel of microRNA markers. Int J Cancer 2010；127：2870–8. 111. Li LM, Hu ZB, Zhou ZX, Chen X, Liu FY, Zhang JF, et al. Serum microRNA profiles serve as novel biomarkers for HBV infection and diagnosis of HBV-positive hepatocarcinoma. Cancer Res 2010；70： 9798–807. 112. Abdalla MA, Haj-Ahmad Y. Promising candidate urinary microRNA biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma among high-risk hepatitis C virus Egyptian patients. J Cancer 2012；3：19–31. 113. Tomimaru Y, Eguchi H, Nagano H, Wada H, Kobayashi S, Marubashi S, et al. Circulating microRNA-21 as a novel biomarker for hepatocellular carcinoma. J Hepatol 2012；56：167–75. 26 114. Miah S, Dudziec E, Drayton RM, Zlotta AR, Morgan SL, Rosario DJ, et al. An evaluation of urinary microRNA reveals a high sensitivity for bladder cancer. Br J Cancer 2012；107：123–8. 115. Kanemaru H, Fukushima S, Yamashita J, Honda N, Oyama R, Kakimoto A, et al. The circulating microRNA-221 level in patients with malignant melanoma as a new tumor marker. J Dermatol Sci 2011； 61：187–93. 116. Lin SC, Liu CJ, Lin JA, Chiang WF, Hung PS, Chang KW. miR-24 up-regulation in oral carcinoma： positive association from clinical and in vitro analysis. Oral Oncol 2010；46：204–8. 117. Liu CJ, Kao SY, Tu HF, Tsai MM, Chang KW, Lin SC. Increase of microRNA miR-31 level in plasma could be a potential marker of oral cancer. Oral Dis 2010；16：360–4. 118. Komatsu S, Ichikawa D, Takeshita H, Tsujiura M, Morimura R, Nagata H, et al. Circulating microRNAs in plasma of patients with oesophageal squamous cell carcinoma. Br J Cancer 2011；105： 104–11. 119. Zhang T, Wang Q, Zhao D, Cui Y, Cao B, Guo L, Lu SH. The oncogenetic role of microRNA-31 as a potential biomarker in oesophageal squamous cell carcinoma. Clin Sci 2011；121：437–47. 120. Hauser S, Wulfken LM, Holdenrieder S, Moritz R, Ohlmann CH, Jung V, et al. Analysis of serum microRNAs (miR-26a-2*, miR-191, miR-337–3p and miR-378) as potential biomarkers in renal cell carcinoma. Cancer Epidemiol 2012；36：391–4. 121. Redova M, Poprach A, Nekvindova J, Iliev R, Radova L, Lakomy R, et al. Circulating miR-378 and miR-451 in serum are potential biomarkers for renal cell carcinoma. J Transl Med 2012；10：55. 122. D'Alessandra Y, Devanna P, Limana F, Straino S, Di Carlo A, Brambilla PG, et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J 2010；31：2765–73. 123. Wang GK, Zhu JQ, Zhang JT, Li Q, Li Y, He J, et al. Circulating microRNA： a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans. Eur Heart J 2010；31：659–66. 124. Scian MJ, Maluf DG, David KG, Archer KJ, Suh JL, Wolen AR, et al. MicroRNA profiles in allograft tissues and paired urines associate with chronic allograft dysfunction with IF/TA. Am J Transplant 2011；11：2110–22. 125. Roderburg C, Urban GW, Bettermann K, Vucur M, Zimmermann H, Schmidt S, et al. Micro-RNA profiling reveals a role for miR-29 in human and murine liver fibrosis. Hepatology 2011；53：209–18. 126. Yi Z, Fu Y, Ji R, Li R, Guan Z. Altered microRNA signatures in sputum of patients with active pulmonary tuberculosis. PloS One 2012；7：e43184. 127. Fu Y, Yi Z, Wu X, Li J, Xu F. Circulating microRNAs in patients with active pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol 2011；49：4246–51. 128. Zahm AM, Hand NJ, Boateng LA, Friedman JR. Circulating microRNA is a biomarker of biliary atresia. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2012；55：366–9. 27 129. Wang HJ, Zhang PJ, Chen WJ, Feng D, Jia YH, Xie LX. Four serum microRNAs identified as diagnostic biomarkers of sepsis. J Trauma Acute Care Surg 2012；73：850–4. 130. Wang G, Tam LS, Li EK, Kwan BC, Chow KM, Luk CC, et al. Serum and urinary free microRNA level in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus 2011；20：493–500. 131. Wang G, Tam LS, Kwan BC, Li EK, Chow KM, Luk CC, et al. Expression of miR-146a and miR-155 in the urinary sediment of systemic lupus erythematosus. Clin Rheumatol 2012；31：435–40. 132. Li S, Zhu J, Zhang W, Chen Y, Zhang K, Popescu LM, et al. Signature microRNA expression profile of essential hypertension and its novel link to human cytomegalovirus infection. Circulation 2011；124： 175–84. 133. Rhodes CJ, Wharton J, Boon RA, Roexe T, Tsang H, Wojciak-Stothard B, et al. Reduced microRNA150 is associated with poor survival in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med 2013；187：294–302. 134. Gandhi R, Healy B, Gholipour T, Egorova S, Musallam A, Shuja M, et al. Circulating microRNAs as biomarkers for disease staging in multiple sclerosis. Ann Neurol 2013；73：729–40. 135. Gilad S, Meiri E, Yogev Y, Benjamin S, Lebanony D, Yerushalmi N, et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS One 2008；3：e3148. 136. Sheinerman KS, Tsivinsky VG, Crawford F, Mullan MJ, Abdullah L, Umansky SR. Plasma microRNA biomarkers for detection of mild cognitive impairment. Aging 2012；4：590–605. 28