Untitled - 東京大学学術機関リポジトリ

てんかん様過剰神経活動による海馬神経回路の異常形成
東京大学大学院薬学系研究科生命薬学専攻
池谷裕二
目次
第 1主
はじめに
海馬帯状線維について ー
・
・・
ー
・
・
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...
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・
・
・
・
・
・
・
・
・
ー
・・
・・
ー
・
・
・
・
・
・ .
.2
てんかんと海潟 ・
・ ..........~ ...
本研究で伊I
を明らかにするのか ・
・ ・
・
・ ・・ー
・
・ ・ー
・
・ー
・
・
・
・ ・・・・・・・・...
.・u ・・3
第 2主
培養海馬切片を用いた検討
締 言 ー・・・・ ・
・・
・
.
.
..
.・
・
・
・
・ ・
・ ・
・
・・ .
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.5
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・
・ ・ ・
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・ ・
・ ・
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・ ・・
・・
・
・ ・
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・ ・・
・
・
・
・
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・
・
・
・ ・・
・
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・
・
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・ ・
・
・5
)
5法 ー・・
結
.
w
・ ・
・
・
・ ・ー
ー
・
・
ー
・
・ ー
・
ー
ー ・・
・・
・・
ー
・
・
・
ー
・
・ ・・
・
・
・
・
・ ・・・
・
・
・
・
・・
・ ・・
ー
・
・
・ ・ .
.7
考察
第 3章
・ ‘ ・ ー.
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..
..
.
...
. ・・
・ ・
・
・ ー
・
・
・
・
・
・
・
・
・・
・
・ ・・ー
・
.........
.1
3
歯状回wl'i粒細胞の単向l
t.培養を用いた検討
ー .
.
・
・
ー
ー
・
・
ー
・
ー
・
・
絡富 .
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・
・
・
・・
ー
・ ・ー
・
・ ー
・・ ・
・
・・
・
・
・ ・・
・ ・・・
・
・
・
・ 1
7
H法 ・・・・・・・・・・・・・・・ ・・
・
・ ・・
・
・
・
・
・・
・・
・
・
・ ー・ー
・ ー........・- ・
・
・ ・
・
・・
・
・
ー
・ 1
7
結果 ー
・
・
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・ ・・
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・
・ ・
・
・
・
・
・ ・・
・
・
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・・
・・
ー
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・
・
・
・ ・・
・
・ ・・
・
・
・
・
・
・ ・・・・
ー
ー
・・
・1
9
考終 ー.
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...
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・ ・・
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・ ・
・
・ ・
・
・
・ ・・
・
・ ・20
第 4主
主
小 児て ん か ん モ デ ノ レ を 用 い た 検 討
緒言・・ ・・・
・
・ ・・ .
.
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..
.‘
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・・
・
・ ー・
・
・・
・
・
・
・
・ ・・
・
・ ・・
・
・
・
...
.
.22
p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
e誘発技鍛 ・
・
ー
・ ー
.
...
.
.
.
.
.
...
.
・
・
・・
・・
・
・
・
・
・ .•.............. . 2
3
アニメート試験
.
...
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・・
・ ・
・
・
・
・
・
・ ・・
・
ー ー・ー・
・
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....
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.24
モリスの水迷路試験 .
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. ・・
・
・ ・・
・
・・
・・
・
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・
・
・
・
・
・
・・
・
・2
5
自発(t'~岐路交管理動 ・・・・・・
y、テップスノレー試験
ー.
.
..
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......
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.26
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・ ....
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.・
・
・
・
・2
7
組織化学的検討 ・
・
・
・ ............... ・
・・
・
・
・ ー・
・ ー.
.
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..
..
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..2
7
LTP" .
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・ ・
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・ ・
・ ・
・
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・
・ ー・・・ ・ ・ ・
・
・
・
考察 ・
・ ・
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・・
・
・
・
・
・ 目・
・
・
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・・
・・
・ 28
-・
・・
・
・ ・・・
・
・
・
・
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・
・ ・
・ ・・・・・・
・
・
・ ・・・
・
・・
・ ・・
・
・
・
ー ・ .
.
.29
第 5章 さ い ご に
なぜIfit.(!~ 答状線維なのかっ
.....................ー・ー
小児てんかんの後遺族について ・
・
・ ・・・
・
・
・
・
・
L ~Ca" チャネJレ阻害薬について ・・
. ...・........
・ ・ 33
・
・ ・・
・
・ ・・
・
・・
・
・
・
・
・
・・
・
・3
4
.
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..
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..
...・
・・
・ ・・・・
・・
・
・・
・
・
・
・ ・3
4
参考i
文献 ・
・
・
・
・ ・・・
・
・
・ ・・・・
・
・
・・
・
・ ・・・・
・
・・
・・
・・
・ ・・・
・
・
・・
・ ・・
・
・
・ ・・
・
・
・
・
・
・
・ 3
6
誘f
辞 ・・・
・
・ ・・
・
・ ・・・・・・・・・・ ・・
・
・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・
・
・
・・
・
・
・
・
・ ・
・ 4
1
E
言
語 1章
第 l章
はじめに
海馬苔状線維について
海馬符 ~Æk;操縦 ( mossy 日 ber) ，
立、筒状問就i
粒細胞から主に CA H
手錐体制1
1
泡または l
賞状!可門 (
de
n
t
在t
c
h
i
l
us
) の介 u
二仲経に投射する神経線t.
f
;
である(図 IB)
。“
答状線維"という名称 1
1
、1
8
9
3 停にス
j
alにより初めて付与され、これは線維のゴノレジ染色像が 、当時w
tにJ;!lられていた小
ペ インの Ca
]Ji~ .pi 状線維とま買似していたことに巾来しているヘ海鳥苔状線維の研究の歴史は古く、簡素かっ
布市町正な附 ~lV.造を保持しているために中枢神経系におけるイ1m な研究対象となっている海馬体のやJ'
経連絡の"'，で、最初に投射が解明 された神経線雑である 6'
苔:伏線維は、 ílll の r.1'相互利，~徒系の飢餓
とは大きく異なる 興味深い性質を数多く持ち合わせている 九 以下にその数例を挙げる ω
l
)型
軽悩神経線純である
'
経鞠h
;;f，はミエ Mン化された有髄神経線維の形態を示
通常アミノ酸系およびニコチン作動性のや l
m
操縦は終末の伝述物質が 興1i ，アミノ俄であるにも 刻
￨わらず1
¥
!
¥
lt;fi神経線維で あ る 九
すが.待状1
2
) 神終終末は巨大シナプニえを形成する
0μmにも逮し、これは苔状線維が起始する t
'
l
'
経細胞である矧粒細胞
その直絡は大きいもので 1
の大き 8そのものに匹敵する 7へ こ れ に 伴 い シ ナ プ ス 後側 スパインも巨大かっ綾維なJ
形態をと
る。
1 ) お よ び 2) の特徴は、興 ifiît'..tアミノ 俄作動性のやI' ~主総tf~ではなく、むしろカテコラミン系
のそれと類似したものである。 しかし、そのシナプスボタンは、 興奮性アミノ 般作動性神経に特
j
;
伺ンナフ スである。
有なシナプス後脱の裏打ち布前笠が厚し、非主将i
b
2
3
)神経終末に Zn
t
を監獄に含有司る
この 2n
"は
、 神経若号車i
)
に
{
半い欽出 され、王子状線
維終末に含まれるや'
l
経伝達物質や神経ベプチドま
A
T
J寸ることで、神経
たはそれらの受容体と 相互 作J
細胞の興奮性を調節していると考えられており
9
.
5
'.
1
$2
.
1風間、さらに近年になると、
Zn
l
-I
が紳緩栄長
因子や成長因子の活性を謝節し苔状線維の形成や
多鯵細胞lIf
維持に関与していることも示唆されている川，163
傾然回門
(
'
1
しかし Zn
'
"の正微 な役やl
は未だ不明である e 一方
、
Zn
'
φ
をt
2
b
Tに含有するというこの t
'
.
.
t
'
l
立を利用 して、
r
s状線維を選択的に染色する 百mmrEI立、
B
自
前
i
l
!
!
か
つ有月l
な 実験手伎として幅広く利用 され、苔状線
維の研究に多大な
n献をしている。
4) 生後に形成される
仁
川阪神経系の発生学的成熟の大半は胎生均jに行
われるが、 一 部の脳組織は生後に発達する 。 #~馬
では前状向車Iî粒 細胞 の発生が、 M1生後 J~J に始まり
生後早期 にまでわたるため ・5、それに伴い納采で
管官級鍾
貫通線1
1
図 1 海馬の模式図
A，海馬 t
調査.海軍白神経担睦 g
与は自信会天国骨髄祖細胞眉とア
ー
，モン伐の鍵体阻胞曙 に大別される. 6，湾民自主聾初梧回路.
貫通総経ー歯状回‘苦状線組ーCA3野‘S曲 師 e
r側篠ーCA1 野
田室経路が存在する.
第 1軍
める待状線維の発注も生後にれわれる。綴 U
f
綴の苔状車対北のJ
形成 1年J
U
Iは
、
七l
ご
〆l
ミ
後
m2-3迎 1で
。 ヒトの場合は詳しく研究されていないが、生後 2年程度{士 H
住民の発注が持続すると
ある
7_
5
6
，oS，
1
6
S
いう線作例からも軒、乳児期から幼児期l にかけての !~I Ili]が苔状線維の形成 11年 J~I に~:1I、当するものと
与えられる。また、苔状鋭U
4
t
のj
形成は、その速度は低い t
，
tがら成体にi
主してからも hわれ、Ii
t
f
r
J
な 11'1 械 を介した可制性を示す"，~功"#護系では極めて例外的なや"主主組織である 。 早川三のところ主主状
線維にこの織な特殊な性質が与えられている崎山は不明である(第 5市参
J
m.
5
) 記憶、学習への l
刻昭子が"訂唆されるI'f
f
H
日
朝l
'
終l
河野干を形成する
これまでの数多くの研究により、海賊が記憶、学現にm:~な JI首都伎であることが示されている
'
1.
1
5
1附則。海 J
号における主要神 経
l
当路を閃 IB に示した。この制1経団路の一 部を形成してし、る e
i
状線維は、前状回とアンモンタ1を辿合する町長ーのや"継投射として特に互主要な位 i
nを占めている。
6
) 1を J~I Ji'l強呪匁(I ong-胞nn p
o
t
e
n
t
i
a
t
i
o
n‘
じr
p)の形成機緋が特殊である
ある特定の刺激に応じて神経伝達効率が長J
V
I
(
(
1に充進する現象である LTPは、記憶、学習の越
，
tすシナプス pfW1
'
:
I
の l例として峨んに研究されている
艇を l
~lV， I -l: 、
i
丘3
4
.
8
8
.
1
へ持状線級の
LTPの形成機
般的な LTPの機構と比較して極めて特妹である凹。一般的な LT
PのJ
形成機併としては、
シナプλ 後!伐の N
-m
e
t
h
yトD
a
s
p
a
巾 t
c (NMDA) 受章~i4'が情性化され Ca，.tJ; 流入し"、これが Ca子
/カノレモジュリン依存性キ 7ーゼ 1
1(
C
a
"
/
c
a
J
r
n
o
d
u
li
nk
i
n
a
s
c1
1
，CaMKI
l) 1
0
'
.
'価やタンパタキナー
ゼC(
p
r
ot
c
i
nk
i
n
a
s
cC，PKC) 2などの隣おを活性化しシナプス後膜の反応性を上げ、また Ca
1
+
は
-)
iで
、
ー
際化君主来
(
NO
) 合成併議を符:ー性化し、窓生した NO がシナプス前終末に逆行伝達さ
れ四'"、グノレタミン殿の政 1
1
1散を上回大させるげというカスケードが想定されている。一方、答
状線維の LTPでは、 NMDA受容体の
m性化l土必要なく師、むしろシナプス前終本の p1'1Ca'・チ
ャネノレ凹または代謝型グノレタミン殿受容体問の活性化l
こ伴う絢j
胞内 C
a
"のi
f
V
J
.Qにより、カノレモ
ジームリンを介して l型アデニリノレシクラーゼを賦r.号化し '
" これにより産生した環状 AMPがタ
p
r
o
t
e
i
nk
i
n
a
s
eA，PKA) をf
活性化して町、グノレヂミン俊の政 1
1
1盈を明大させる
ンバタキナーゼ A (
P の形成機桝には一般的なものとの
附という機怖が考えられている。すなわち、 符状線維の LT
J1~ÌJ.I]部分はなく、その特砿般からも興味深い研究対象となっている。
7) てんかん.1J.¥.ffまたは実験モデノレ動物において兇常発芽が観察される
明日米枠1(
s
t
r
a
t
ul
l
1lu c idum ) およひ1寄状閉門に分布している(診考 ~I
士五状線制1:の終末は、 CA3出f
J
A)
。しかし、てんかん発作を発したヒ卜あるいは実験動物では、 CA3 野多 l
杉細胞侶 (
st
r
at
u
m
o
ri
c
n
c
c
) または1
賞状回内 f
J
l
!
J
分子制 (moJ
c
c
uJ
a
rJ
a
y
cr
) に苔状線維が異常発芽することが報告されて
いる
1
1割問問。この現象は特に側政策てんかん!占、イ苦で頻繁に観察される。
てんかんと海馬
n
'
，
経発射に r
J
J来した発作を反復する疾忠の総林である。 I
l!I民全体
てんかんは、大脳皮質の異;汗 '
の約 J%という多数の忠者ーが干利主し
7
0、とりわけ乳児期から幼児期にかけて山i
い発依存1
を示すこ
とが報行されている l担。てんかんと rflJ，I]~の |苅係 I:l:占くから示唆されており、とりわけ 11UJ ilfíJl:'てん
かんにおける海馬の亙裂な役割は多くの研究により主被されている
1
16
.
1
l
t
iJ頭集てんかんは、 i
量も
)~íl支が í:'~ くかっ治療が困難なてんかん山としてこの分野における主~な研究対象になっており、
同
1
I
.
f
'
に、キンドリング
1
7
t ..1やカイニン般モテツレ国等の似IllÏJ'l~てんかんをよく模i枕ずる実験モデル
も1
m
:立され.臨床および実験動物の阿レベルでの解明が進んでいる。そして、(lJ
U
頭集てんかん忠
2
第 1重
荷または実験動物のj悩の解剖学的fiJt.ftrにより、数多くの病里iJJF作~~、性が海!!;Iこぷめられているず
以ドにその数例を挙げる。
止血豆鑑i
包
これはてんかん発作にf'
'
1うや'
l
経細胞の脱滞に r
l
J来したグリア細胞の別勉の結果である川。 こ
Jによる興事!
J
t
器
官t
が旅闘であると t
包
括f
されているが Z却、初，
Y
}Q
}
悦
の神経細胞の脱務は過剰な神経祈j)l
終に脱落が観察される部位は街状 I
!
i
lr
r
lであり、続
紘のパターンは非常に特徴的である川。最も路I
の錐体制I
J
}
胞の脱熔が凡られる。 -)
j、l
制丈￨副1
雪地剣 I
J
}
自および CA29
糊B
いて CAJ野または CAJ盟F
体制 s
}
!
包では一般にや'
l
級制胞死は観察されなし、。 この特見な細胞死のパターンは、興需百毒性に刻す
お来したものであると考えられている，
る耐性の廷に l
2) 脊状線維の J'i~ 古発J;f
詳細はI;VE述の通り 。 なお、この災常発:!4'は街状回門に存在する介i
.
1
'
.
神経であるぢ状細胞の1
此終
に伴い~じる現象であると考えられている 112. 1.5 1。 この現象が注目されるlÆ由{士、これによりす毎
J鳴神経回践のパターンが変化する点にある。 すなわち、苔状線維の兵常~芽により海馬は新たな
性質を役得する可能性が与えられる . 特に歯状巨!~頃;f.古~~IJ}!包にIt[ j疫反阿性回路を形成することから
4
i
r
状'
l
可の興 m
t
l
，1l;上昇することが予想される。 この可能性を検討した研究が数グループにより行
われているが、現在のところ統一的な見解は得られていないe 本現象が、海鳥の恒常的な 興悠性
:封ー
に寄与し、てんかんの慢性化の基礎機構になっているとする報告がある 一応で目J肱川明、
のJ
むしろ抑制判ーの賦活に対する影響の )jがより重姿であるとするデータも報告されている九異常
~J.fの生活!がH主l味は今後解明されるべき重要な課題である 。
立ぷ信手盗塁
幾多の報告がなされているが、
N
'経栄養因子または成長凶子の
mRNA 発現 i
孟の変化は引A 師
、
1
)および 2
) の現象との関連からもとりわけ興味深い況象である。
本研究で何を明らかにするのか
l
) 形成中の苔状線維に対する研究
士
5
状線維は生後に形成されるにも i
関わらず、これまでの省状線維の研究は専らl)!Eに形成された
i
t
i
calpe
ri
od・と呼ばれ、 t
長I
む
線維に対して行われている。 一方、設状線維が]形成される時期はーcr
や外(j)jに声fする j~受性が上昇する l時期に相当する 。 当然 、 形成中の苔状紛t維に対してもこうした
要因が多大なi
影響を及ぼすことが想定される したがって 、苔私L
線維の形成に対する引先は、機々
u
に埋ー解する上で非常に亙裂となる. この観点から、本研究では、こ
な淡必や外傷の影響を包活保J
れまでにぬど研究されていない形成中の苔状線維に対して焦点を絞った. また 川町叩での研究は
級止な実験的 iI~1約を余儀なくされるため、 in
l
l
I
'
r
oで苔状線維の形成i
白絵を再現する実験系の依立
n
i
;
よ実験モデノレを提供するもの
を試みた。 この尖験系は本研究のみでなく、今後多綴な用途に有 J
と.
'
J
1われる。
2
) 苔状線維のj形成に対するてんかん傑神絡活動の作用の検討
) てんかんは乳児期から幼児期にかけて沿も発
この倹討には人・きく 2 つの窓義が見出せる。 i
U
Jと一致する 。 したがって、若状線維の形成に
症率がおく、この 1抑制は苔状線維が形成される時!
対するてんかん織の過剰神経活動の影容を検討することは、小児てんかん !
.
!
J
1
晋}
I
出で生じる可能怜
のある現象を解明する上で後めて lli 袋な ;~:'*をもっ。 ii) 事l'終系においてJE織な神経凶絡のj形成
3
第 1章
歯切な神経発火のバターンが必要であるとされている刷。九これは
には、 i
u.神経筋俊介却を)TJ
いた研究により提閉されたものであるが、懐 t
f
tな例理主を有する中 M
i
判1経系を )
1
]
0
、f
て研究 l
土￨荷車並で
わるため、
r
l
'枢神経系におけるこの仮説の尖託 1
1
'
1
1"1未戸に少なし、。この .i.において、
1~状線品11:は
生後 l
こJ
形}
J
;i
X
されるため、{也の '
j
J
f
笹神経系の組織と比較してや'
l
経阿路の形成過程の観察が左手易であ
ると }
l
!
， われる。 したがって本検討には、苔状線維に文付る t
記の仮説の適合性剖史認するとし、う
5・1J.j(も合子容される .
t
tお、本検討の結果、てんかん織の条件ドでは、i)苔状線維の正常なシナプスの j形成が抑 i
h
'
l
れ、 %1i~. なシナプスが J形成される、 ii ) こうして形成された神経回路では N:'r;.t~神経伝達のパ
ターンが観察される、ことが明かとなった(第 2章参照)。
3
) 持状線維の形成に対するてんかん係争'
l
終祈動の効果の機憐解明
てんかんは比較的予後の良い疾思として分類されるが、 小児てんかんに関してはこれは当ては
まらず俄々な後 i立症を ill存することが知l られている 。 とりわけ認知、学習 11章~!H~最も 一般的にみ
られる後述症であるが、この原因 1
;1未だ解 I
Y
lされていない。 本研究では、 2
) で既 j
l
l
iした、てん
かん織の神経活動により記憶、学習に i
見渡である苔状線維が災常形成するという発凡を踏まえ、
こうした後遺症が訴状線維の発 i
主j
即日・に I
J
I
*した ものであると怨定した。この観点のもと で
、 2
)
で観察された現象の機構を前 l
列することは、学術的興味以外にも、小児てんかんの後遺J
，[の機材よ
解明1
という也2JJt
，
dJ
l
h
釘をも っ可能性がある .
第 2~4 躍では、
1 -3) の巨視的視点のもとに研究を行 った。
4
第 2章
第 2章
培養海馬切片を用いた検討
緒言
ìf1).I，!~苔状線縦 í1)発透過程を ;11 vUro で観察できる実験系を倣立することを目的として、?自1)}.!~切
J
tのJ
且品
i
(
)
U
'
l
t:L'主を行った伺 本初研f究
ヲ
E
では 前
I
的
切
附
ぺ
P
[
誼
丘高
培d
t
養
皇f
法去を採月
j
mした (図 2刈
A)
を介してL
精
寺j
義
華I
液
1
佼
Eから栄J
養主を供i
給令し、切 J
i
ー
上f
f
i
iの飽湿空気より鮫索を供給するという巧妙なイ l
車1
み
J
IJ
I
jされている@ この手法により焔 注された切れー
を川 いており 、簡便な培養法として近年頻繁に;f
は、 2 次 ;d~J椛i貨のみでなく、 他 の組織猪養法とは !j~ なり府養切IJJ干に垂直な方向の情築もある耗
l
主保持しており、より生体に近い状態が保存されている(図 2B)。
ょは主として生後第 2i!週口に形成されるため、本研究では苔状線維がまだ9f;ど形
ラット持状線制i
成されていない生後 6 日怖のラットから海鳥切片を調製し、応接下で苔状線維が形成される過程
を観毒事した。
方法
盗盆選1
盤盤益刷。 1品
6t
I
前t
iの W目 t
a
r系縦性ラットを氷冷麻酔した後‘迅速に全J
I
滋を摘出し、 0・
，CO:
J
95・
5を活気した
c
y
'
sb
al
a
n
c
e
ds
a
l
ts
ol
u
t
ion (
BSS) 中で約 Z分目l
i
$
t
i
"
t
fした。 l
瞬間後者剤を用いてステージに悶
氷冷 G
A:した後、前1
緩衝液中で v
ib
同 t
ome U
主坂イーヱム)を川い 300μ1
1
1)
平の水平切片を作成し、
1
1
)
篤
を摘山したe 適当なlfiJ馬切片を選択した後、 p
o
l戸e
廿a
n
u
o
r
o
e
t
h
yl
e
n
e製の多孔質膜 (
0.
4 μm1
歪)を
貼付した直径 30mmのウエノレ (
Mili
p
o
r
e)
上に切片をl'Iei
iTI:し、さらにこれを 1mlの
府長 1
伎を満たした 6穴プレート (
F
a
lcon)
に照人した(図 2A)
。 府養する海馬スラ
，
イ λ は lウェノレあたり上限 3枚とし、 CO
を.i!宣気した 36o
cの飽湿インキ ュベータ
f
.
5R 毎にJrt~事故 0.7
ー内で精義した.以後 3
ml を交換した。 川 いた培養液の縦1
1
或は
minimul
1
1
e
s
s
cn
t
i
a
l
medium:l
la
n
k
'
s
BSS:
h
o
r
s
es
erum
l
2
:1
:Iである。本条件で 50
日以上 にわたり安定して海馬切片を地粂
主了
望
!
?
叫
管←
&M
8
仁、
1
密集 8日目の濁思切片 -Ni
ss
l副
長色 像
することが可能であった。
培養海馬切片の切断
いくつかの実験では培養 8 日同 の海馬
切片の切断を行った。 ~jIJJJ)J を装備した
マニプュレーターを用い、 ;
t
;
'体顕微鏡下
mおよび下錐体裂の先端
で樹状回上錐体
図2
を通過する線沿いに切 j
干を被l
析 した(図
A.1
1置 1
8聾由手法. ;生後 6 8齢 的ラッ ト箇より 3
0
0μm車の切片 を作
成し.摘出したiIa/!lを.多 R哩鼠上で組樟治 をした. B
.組蝿
した調
葺の N
，副捻色像.右はこれに対応しと鍵j(園.
7A)。
海馬切片の組織倍養
a
I
S
.
5
第 2輩
誘発泡位のr
W
I
胞外記録
t
g
'
1
毒した海馬を多孔 i
'
ln
英と共 l
こi
菌当な大きさに摘 I
t
I
し
、 32 .
C人工脳脊髄液中で 11時間以上安
定化し危後、:Æl級にf!g m した。 特に断りのない場合は、的tJ~回l-'lïjf;ï.細胞 h'l (
s
t
悶1
1
11
1
1gr
an
u
lar
c
)を
I
J
血病 (
sl
r
a
tul
1
1p
yr
amidal
e
) より言語発電位を細胞外記録した(鼠.
1
6A)
句 記録
刺激し、 CA3担f錐体Ml
ν
200μA) を
、 fま 溺 E
斜E
・CA3野シナプス数の指伎とし
された誘発電位の最大値(刺激強度は 700-1
て)J] v 、た田. 1 ~7。 人工 j悩守髄液の主 lJ戎は、 NaC I : 1
271
1
1
M、KCI
:1
.6m M、KH，
PO
，
:1
.
24m M、MgSO，
1
.
3m M、CaCI
，
:2.
4m M、NaHCO
，
:26mM 、 Gluc明日~: 10m Mである。
3
.3
'
di
l
i
nol
envl
o
制 c
a
巾o
c
v
an
i
noer
ch
l
o
r
a
ω (
Di
I)蛍光染色
。
i
l は細胞I
J
英に姉入され、 !
民の流動性に依存して釧j
泡表而を受動鉱 i
放する蛍光色楽で、同定さ
可能な双l
向性の神経トレーサーとして広く利用されているぺ
れた組織においても使片l
I許:長押ι，e !~ 切片を 4 % pa
r
a
f
ormalde
hyde
/
0
.1 M !)ン般緩衝液で悶定し、 24時間後に￨
司￨遡定液中で
ilの微校結晶を注意深く静位した。色素の非特具拡散および退光を抑え
的状回矧粒制1細胞上に D
る
n
的で 4 .(の低拓l
遮光下にて
1i
/
!
il
J
U
保存した後、蛍光{
裂を共焦点レーザー顕微鋭 (
M RC600
s
ioRa
d.Her
cu
le
s
) を朋いて観察した。 ザ!視野観然により測定視野を決定し、アルゴンレーザー由
来 q)51
4n
0
1"
f
税法'で G 励起し、 550nmのバンドパスフィノレターを介して蛍光像を符た。
D
r
opi
d
i
u
mi
o
d
i
d
e(
P
I) 蛍光染色
P
I はJ
負傷を受けた細胞1突から取り込まれ DNA に結合することにより蛍光を強する色素で、 神
経細胞 Aを評価する良いすーカーである
90
1
1
7
.
140
.1
0
0
.
5% 1
刊を合イTした防長械に 36.Cで 24時間 l
総践し、 I
青養海馬切 J
t
(こ色素を取り込ませた。蛍
順じた。必要がある場合は、醤:光{象を 5回の却]r):平均に付した後、 256
光イ生の観祭は上記の下法にl
￨
階
湖
、 51
2X768 岡泰の画像として沌{
磁気ディスクに保存し、 Co
MO
S Ver
.6.
0
1 (
BioRad) をJHい
1
包層、 CAJ!JIfおよび CA3野錐体細胞精の全 3部{
立に、
てオフライン解析を行った。償状回籾粒納 I
各 3つの 20X20断言告ピクセノレ (
82
.
5 μm
'相当)を作成し、そのピタセノレ内の蛍光強度の平均値
を鉱山した
曲。
1
2
6
.1
主旦旦益 金
Ti
l
1
l
l
l
1 染色法は Z
n
'
‘に対する化学反応を利用した染色法であり、同イオ νを多く含有する海馬
苔状線維の神経終末を選択的に検出する染色法として広くJflいられている
九
3
，
.
81
4
n
地養海J
詰切 j
干を 0.
1M !
)ン般緩衝阪で 10分 日洗浄した後、 0.
37% sod
i
u
0
1s
u
l日de に 4.Cで 1
5
分間l
援し、直ちに 1
0% f
o
r
m
a
l
i
nで周定した (4.C、 1
5 分間)。再び、 0.
1M リン酸緩衝液で洗浄
5分間、各 2回
)
、 70%
、 96%の希釈系列 el
h
a
no]でl
凶イ オ ン し た (1
5分間、各 2回)。
した後 (1
1
5分以上風位し、 phy
si
c
aldev
elopmen
rをJllいて お 。
C、50分間の迷5(;反応を遮光下で行った。
phy
si
悶 1
dev
elopmen
lは
、 1
.7 %AgNO，
と 0.
085% hydroquinoncをクエン般により pH緩衝した 20%
ar
a
b
i
c gU I11 に溶解したものを 用 いた。書~Il'i水を用いて反応を停止した後、明視野顕微鏡を加いて
Ti01m 染色像を観察した。 必~iJlîな場合には 、 これを白黒写真に収めスキャナーを Ifl いて繭像を JI5t
り込んだ。 CA3野明￨
僚層、 CA3野多形細胞層、歯状回門およびt
，Jt
状四分干胞の全 4部位に、約 1
0
0
μm1に相当する問点ピクセノレを各 3つ作成し、そのピクセノ
レ内の白黒レベノレの平均値を算出した。
白銭レベノレは 1
0
1階調からなり白を 0、
県を 1
0
0と定義し、得られた平崎依と、 CA3野敗訴i
屑(
st
r
a
l
u
m
i
度として採用した。
r
a
d
i
a
l
u
m) における平均値との遂を Timm染色9n
6
第 2章
脱i
'
創立の光生理学的測定
f庁長 8 円口の討1j'，I.!~切片を多孔í'rJ院と共に切り出し :Æ事前に 使用し た。 oxo nol 系の目見rH1f立感受性色
M RH482 2.0 mg
l
m
lで 5分間染色した後、人口l
向。髄液中で 1
5分間以上耽伶し て光学的測定を
開始 した。 tungs阻n/halo~叩 ランプ ( 1 2 V/I
OOW)
、干渉フィノレター (
70
0土 初 nm)お よび 4俗 対
物レンズを装備した倒立顕微鏡と I
IRD
e
l
l
a
r
o
n1
700 (
FI
h
o
l
OF
i
l
r
n)をmいて測定を 1
1'った。 1
l
リiP
試行の測定時間は 51
2f
r
a
r
ne (1f
r
ame
=0.
6I
1
1S
) とし、 S州 比を向上させる日的で述統した 1
6試行
の紡呆を )
)
1
1
算平均した。危険シャッターを用いて l試行あたりの政光時間を l秒間 とし、 色系の
退色を極力抑えた。ま た
、 測定中は海流を停止し、権流i
孜前の隠れを回避した。
結果
てんかん 機神経発射
1
翠鍛 薬 と し て 知 ら れ て い る y
-ア ミ ノ 酪 酸
A Conl
r
o
l
_
j
!
(GABA)A受是正体肌害柴 p
ic
r
o
r
o
x
in5
0μMを培
養 8n
nの海馬切片に適用すると、 43 i~J '1J 42
B PTX5
0μM
--，
m
m
一
'
a
例 (
9
7
.
7%) で CA3野錐体細胞侶から阿部1
性自
発発火が誘導された。 これは、多 l
f
i発火を伴っ
一隅
﹄
U
たやl
'
経発射(図 3sb) が胤則性をもって繰り 返
主れるものであり (
I
g
j 3Ba
)、屯位感受性 Na"
チ
ヤネ川町'Ji~ 0.
5 μM l
e
l
r
o
d
o
t
o山 nで完全に￨
阻害
C PTX5
0州 +TTX0.
5~M
_
j
!
m
された(図 3C)。 また、滋綾薬をiiJ しな い場
'(
2.
4 %)においてのみ自発
合は、 8
2例中 2伊1
図3 p
i
c
r
ot
o
x
i
nにより誘発される CA3塁手てんかん
様神経発射の典型例
A，通常町通斑，夜中で由挺樟冊. 8，p
l
c
r
o
l
o
l
d
n5
0
μ
M存在下での配
録冊.・ で示した 発射を b
'
こ世コにした.C
，p
i
c
r
o
l
o
x
m5
0
μMとl
e
l
r
。
d
o
l
o
x
l
n0
5
μMの存在下で由 2fL PTX~ p
j
c
r
o
t
O
)
(l凡TT)C.t
e
t
r
出。
t
o
x
m
.
.
q経 1
;
5
発火が観然されたが 、これは j
i
.
l
回発火の 1
f
!
o
Jであ りj
現則的:
も 見られなかった。
p
ic
r
ot
oxi
n誘発神経発射 には濃度依存t1
，が認め
られ、 や
'
l
続発射が観綴された切Jlの
割合(悶 4Aa)および神経発射が観
察 さ れ た 切 片 に お け る 発射 の頻 度
(
図 4Ab) は
、 p
i
c
r
o
l
o
x
i
nの濃度 と
一
-1ij-・一一二
AP
l
c
r
回o
x
r
n由 理 度
aR
a
l
l
o
("1
Bt
告聾日散
aR自
民
同
'
'
'
'
114/
iEに相関 し50μMでほぼ最大の効果
il -~.__〉L
られず(図 4Ac)、神経発射の発火
o
∞
R
E
E
-
FaZ主き轟
o
苅I
t
立に誘浴することができ たが 、
‘
1
3
)。神経発射 I
立海馬の全ての
(
図4
E-aMa
雪
片で安定・して誘導することができた
関関
般的誘導しにくく、数日地養した切
ロリ
部
変化しない と考えられた。 また、神
経発射は培j室開始直後の切片では比
F
C 刷吻-割
:[一九一一
p しW
パ ター ンは p
ic
r
Ol
o
x
inの濃度により
t cF
E
m
.
u
u
u
g
l
位
山
ける発火同数には濃度依存性が認め
b 臥 畑 山 町m町 加 川 }
•
が得られた。 しかし 1住l
の発射 にお
1
1
M
H
'.
.
-.
.
ー
ープ o.
0
1
0
加 ， .
50
v
i
h
f
図4 p
i
c
r
o
t
o
x
in誘発神経発射の性質
A.
置E依存性. B
.1
f
t
饗臼叡との関陣. C剖 位 墨 <
1
睡状回 C
A
3軒 C
削 野 ).
a 神 軽 発 射 が 阻 索 さ れ た 洛 聾 海 昌 明 片 町 割 合 .b 神 経 尭 射 由 主 主 じ る 醐 度 日 分 あ
たりの 由倣)
. c，1回白河経発射 1
=毘 られる平崎尭火 J
I
.m回 n企 S.
E
.
.M.
.n ~5-7.
フ
第 2章
CAJ型f
で肢もう三じやすく CAI'
l
fと歯状回で
A Bicuculline 10IJM
lLJ.
.L， 1j ι
.
1
は比般的生じにくかった(閃 4C)。
ぃ
p
i
c
r
o
l
o
x川 とは呉なる作用機j
芋を有する f
皇
陵薬 b
iじu
cu
l
l
i
ne 10μM ( GAß礼A 受谷体問1~写
~~
十+
B Pentylentetrazol 1m M
楽)‘ p
en
l
yl
e
ne
t
e
t
団z
ol11
1
1
M (GAsA 受草子体
U
l寄楽)、 4または泡位感受性 }
ぐチャネノレ I
C 4"aminopyridine 2m M
aminop
ヅr
i
d
pi
ne2 m M (芯イ立感受性 K・
チャネ
l
l
i
L
L_
_
_
ノ
レ
ド1
1'
d
f!
J
I
i
:) お よ び pilocaゅi
n
e 10μM
、
(
1
1
1凶 c
a
r
ine
l受 i
f
j体作動薬)を用いても、て
_，
1，_ ， . •
"
D Pil
ocarpi
ne 10μM
んかん綴神経発火が誘導された(凶 5
)。
￨L
苔状線維の}形成
[
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
111111111111
対ìj}J~ 切片の培養開始後、世主状線維が形成
される過程を泣気生理学(j(
J
に総事話した。 的
状回脳続制1
砲府を刺激し CAJ 野錐体細胞庖
より得られる誘発亀位の大きさの最大値を、
図5
様々な薬物による CA3野てんかん線神経発火
A，B
l
c
u
c
u
l
l
i
n
e(GABA~ 畳容体阻害車) 1
0
μM. B，P
e
n
t
y
l
e
r
凶e
t
r
a
z
o
l
(GABA畳容体または電位畢畳性 K・チャネル阻害葺) 1mM
"C，4a
m
i
n
o
p
y
r
i
d
m
e(電位思量性 Kチャネル閏害車)2mM
.
.O.P
l
l
o
c
a
r
p
l
n
e
品 n
n
e
，畳容体阻害車) '
0μM
.
(
mu
s
苔状線維ー
CAJ野の機能的シナプス数の指僚とした(ぼ16A)。誘発危イ立はふ 1
0r
nsの1
替時を持った
国立として記録され(凶 68)、この大きさは倍長日数を経るに従い徐々に明大し府主主 1
1 I
J
陽 性f
円
:
r
i
¥
皮で安定した大きさが得られるようになった(図 6C)，この条件下で駿養液中に p
i
c
r
o
t
o
x
i
n50
μM を慢性的に添加した場合、誘発電位の附
A
大は有~に 1 I且 省された. 以下の沿気 tt 辺学
的検討においては培養 8 日目の誘発泡位の
大きさを比較に用いた。 p
ic
r
ot
o
x
i
n の作用は
B
濃度依存i1を示し、その作用は 50μM穣度
2DN
Con
t
r
o
lー
}ぱ'-一一一一
PTX
-ー~、一一一一一ー
ふーふ
」トーふ主
かった(表 1
)
。 また、この pl
cr
o
t
o剖 nの作用
はt
el
r
o
d
o
t
o
xi
n0.5μMにより完全に 1
1
[l害され
た(表
1
)
。てんかん傑神経活動を誘発した
司
l
en
e
lel
r
az
o
l、 4
dmi
nop
y
r
i
d
pi
ne、 p
il
o
c
a
r
p
i
n
eの
点
値
マ
全 4 種の作用を検討したところ、全ての薬
q'ιn
物に苔状線維のシナプス j形成に対する 1
1
1
1待
作fIIが認められた(表 1
)
.
u
(
﹀E)W
恥
ω
ω巴
U22aEぬωωc
oa
pl
C
r
o
t
o
xlO以外 の 妓 録 薬 b
icuculi
n
e、 pen
t
y
1
0
DiV
図6
でi
最大になり、 1
50μMの高濃度下で時養し
ても誘発泡{立の駒大は完全には阻害されな
1
5
2
0
苔状線維の形成に対する p
i
c
r
o
t
o
x
i
nの阻害作用
A，剰融及び犯録申部位.B，CA3野t
量発電位由典型嗣. C，最大抵発電
位田大きさの時間経過.. 0 p
i
c
t
o
t
o
x
i
n非存在下で泊聾した切片 . .
仰αUIO
州 n5
0
μM存在下でl!饗した切片.島発電位のt
曾大が有意に抑制
され士 (P<O01.加 。 同 yANOVA)G
活 費 S白目以 降 問 巾 岡 山 存 在
下で鳩聾した切片 .
DG 歯状園、 p
γ
X.
p
i
c
r
o
l
問問、D
iV
:
day
si
n哨r
o
.m
e
a
n
時 五 M.
.n
=
3
7
.
.
.
，
防止された苔状線維に
t
.
:
に
、 plcroloxm が l
対してはどの様な影響を及ぼすかを検討し
た。岐に苔状線維のj
形成が進んでいる土音義 8
日目以降に慢性的に添加した場合には、 p
ic
r
o
t
o
xU
1の作加は観察されず、対照鮮との
f
m
に差は見られなか った (
1
週 6CT)， この結
B
第 2章
来は p
i
c
r
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‘ 8 ( ) ) ， .q
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・
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l併 40n
打
7
.
.
.
2
6
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企
‘ 9J
1 苔状線維の形成に対するてんかん線神経活動の作用
各援物由存在下で 1
&
葺し 18.8 8目に苦状輔絞ンナプス応答を犯餓し
。
。
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T
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X
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y
'
s絶叫【 m
e
a
n企 S
.
E帆).
対してのみ効果を示すことをぷ唆してい
る. そこでこの与えを縦泌するために附
養 8 日目に苔状線維を一皮切断し、これ
がfl+tJ'形成する i
白血に対する p
l
C
r
o
l
O
XITl
の{乍
mを検討した。切断されたi
l
i
t
X
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は局長を継続すると I
存接合し(凶 7
)、そ
l
!
O
、
I
j
)
J
I
折直後には全く観察されなか
れに f
った苔状線維のシナプス応答は徐々に凶
復した(図 8
)。切断直後から p
icr
o
t
o
xi
n
を添加すると、シナプス応答の回復はイ}
~:(こ 1111容された(凶 8) 。
以上の検討で認められた p
l
c
r
o
t
o
XI
nによるシナプス j
形成の阻害効果が、苔状線斜級l
主
，
CAJ野 シナフ
限
1
縦
i
;
t
H
弓
戸
局jしたものである坤か、を I
確
龍3
夜
官
スに川I
ナフスに l
除
閃
具
則l
しても問綴の検討を行つた(図 列
9l
，培養 8 1
"固に、 T
釘状回型自殺荊U
s
白胞 を刺激 し CA3
~IH;t体細胞府から符られる誘発電位と、 CA I l
J
!
.
f
J
i
l
!
総局を刺激し CAJ野錐体制)
J
胞照から得られる
誘発む{立を同一切)，より記録し各占比l除 した.卦一状線14ιCA3~ザ シナプスの形成は picrOlOX 川 の適
J
刊により 1
1
1l.?iされたが、シャツ 7 7ー似1
1
校
ーCAI'
l
!
f
のシナプス反応は pi
cr
ot
oxi
nにより影轡安受け
なかっ t
-(
関 9A)
。 また主音1¥:8日rJに切断した海鳥切I
J
)
'
，
.
に対しでも同様の小舟サを行った。切断直
icr
Ol
oxi
nの存在下で、持状級車j
f
，
-CA3
後から p出 rotoxmを添加し 7 日後にシナプス応答を記録した。 p
1
野 シナフスの T
l
}j形成は有意に阻害され、シャツプ 7-;1¥11
校
二CAI 野シナプスの 1
年形成も阻害され
る強い傾向が認められた (
1
'
=0.0502，
S
t
u
d
e
nl
'sI
l
eS
l
)(
図 98)。
Dil蛍光色素を J
甘いて苔状線維の (
1
1
1)
震
.を観察した. J
者養 2 日目では苔状線維は殆ど鋭祭されな
F6) (
極110A)、
士吉養 8 日目 には(，g状巨l
か ら CA3野 に J
i
i]かつて苔状線維が仲良してい
か勺たが(
，
1=6
) (
図 108)
。こ れは p
ic
r
ol
oxi
n存 在 F
でも同級に鋭然された (
1=5) (
医1
る依子が観察された (
JOC)
。
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・ PTX50ドM
内
4
4
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百
三 -aEmwωEoagα
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二
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図8
作用
図7
!告養海馬切片の切断と再接合
A 切断直後. B
. 切断 7 8桂，写真は t
li
s
s
l怨色像苦.右はこれに対
応した岨式図を示している.
1
8饗 7 回目に海罵切片を図 7に示した織に切断し .その前
後で苦状措雄シナプス応署を E揖した . O.
p
l
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x
l
n非存在
下. ..p
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μMを切断置佳から添加.酷発電位町田
恒1J~ p
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l 加。ぃ.w
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1
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第 2章
た。 カイ ニン僚は測定した全ての部位において
絢
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包死を誘導した。
;
治状 線維 の シナ プ ス 形成 に お け る p
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i作用 を薬 理学的に解析 した。 p
i
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の向l
誘発するてんかん傑発射 は事1
経細胞 に断続的 な
'
脱分傾 を誘潟 し、 i
i
i
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感受性 チャネノレを 透泊 し
Jl
流入すると 考えられ たため、 ni
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1として褐殺 し
M3210
検出 されなかった (
極11
1
)
。 なお、 凶 日 にはや1
'
経 1~Þ カ イニン鮫 400μM に 40 分 1/11 暴稼 し 24 時
t
e
a
t
をイ慢性総加 しても 筑紫 14 日 I~ で作意な 細 JJ& 9Eは
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)串2
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川 蛍光色系を)
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生作 に対す“る 作 H
lを検討した。 p
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0μM
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、t
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主張)、
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C
o
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r
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図 9 苔状線維と S
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l
国育e
r側伎のシナプス形成に
r!
担 Ca
'
チャネノレ1
1
[
1)
[
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薬)および 2
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nの効果の比較
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o
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i
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d 50μM (AP5) (
NMDA
受容 体~Ii '，写楽 ) の picrotoxin の 作用 に対するダJ
A.槍 蓑 8 日目的酷発電位回大きさ . B.培聾 8 日目に切片昔
明断し .7 B間l&葺後の揖発電位回大きさ . PTX'p
i
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n企 S
.
EM.
n
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3
).
月L
を倹討した(表 2
)0 nicardipinc は picrotox i n の作j刊 を濃度 依イF的 に 抑制 した。 同様の ~1型作JH
をもっ n
i
f
e
d
i
p
i
n
eを適用 した場合にも p
i
cr
ol"Ox
i
nの作用 が抑制 されたa また 、n
i
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ncを僚主
主4
，
8日同 の pi
c
r
o
t
o
x
i
n処 置後 半の 5 日間のみに適用 しても 、問機の抑制効果を示 した。 一方、 N
i
C
I
および AP5は pi
c
r
ot
o
x
inの1
1
三
J
.
f
H:影 響を与えなかっ
A 2DiV
岡 山 nが誘発するてんか
た。 なお、 ni
c
a
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ipi
n
eは pi
c
r
o
1
到 1
2
)。府l
図に
ん係 発 射には影響 を与えなかった (
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A Con
t
r
o
l
B 8Di
V
苔故線維
↓
蜘
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Vi
nPTX
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CK
a
ina
t
e
2旦~
C筒、旬叫
図
10 p
i
c
r
O
l0
x
i
n存在下における苔状線維
の伸展
苦宅来線組苦神経トレーサー D
i
lより睡状回頼粒相胸倉、ら
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i
c
r
o
t
o
x
i
n
闘行性染色し‘共焦点顕微量下で破事した o A
非存在下で 2 8問喝獲した明片.
. B，p
i
c
r
O
I
倒的非存在下で
8日間 J
&
.した切片 .C，p
i
c
r
o
旭 川n
5
0
μ
M存在下で 8日間
培養した切片. D
G
:~状回 . PTX-p
i
C
fO!
O
X
Jn.
PT
K
'"'加首鎗
11 神経細胞生存に対する p
i
c
r
ot
o
x
inの効果
培聾 1
4B目に PI色素で染色し死亡した神睦細血を共焦点顕微植下で後
A，p
f
C
f
回。抑 n
4
j;存在下で 1
4臼間給養した切片.
.8，p
i
c
r
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l
o
l
f
l
O5
0
μ
M
出した .
存在下で，.日間治接した切片. C
.
開α
o
t
o
x
mi~存在下で 13 日間地聾し た
切片を、カイ ニ ン験 4
0
0
μ
Mに 4
0分 間a
暴露し . さらに 2
4時間 1
&
餐した
もの.
0，蛍光歯車を種めたもの.OG
-樹挟図、PTX，p
I
c
r
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a
x
j
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M 情 的.
図
，
10
第 2章
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p!u¥
Jd
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Druss
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.
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四己三
比
PTX PTX
c
a
r
picrotoxin の効果に対する C a'
・
透過性チャネ ル阻害奈の
PT
混 PTX
Ca
l
図 1 2 picrotoxin 誘発発射に対する n卜
各車楠田存在下で )
8
1
脅し 8 8E
1に苦扶 崎 健シナプス応答を記障した . Ni
cおよび
n
.
f
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'l型 Ca
・
'
l
"チャネル阻奮薬. NI
C
I，
.T型 Ca
'
・チャネル阻害獲. AP5 NMOA
受容体徳容姦.. PTX P
応用ω
x
i
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J
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1V
S.G叩 I
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P<O0
1V
5 PTX50μM，ANQVAf
o
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l (mean主 S.
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icarbachol1μMのデータを positivcc01
1
l
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l として示し
t
た
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9
1
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・ ，127
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PTX5
01
1
M
A N
I国 r
d
i
凶ne叩ドM
作品
国
rdipi
neの効果
指聾 88自の切片を周いて、 m日 r
d
r
p
m
e10μM適
用前後で由 p
i
c
r
o
t
酬 nI
量発発射を.初経発射由 輯 度
{左}および縛 桂 発射 1回あたり田平均発火敏{右〉
i
l
lv
e白 川 耐 と し て
を 抱 栂 に 評 価 し た ( 川 . 田s
国 巾 田hω(mus
由n
n
e
.畳 容体作動襲 ) 1ドM を用い
た (B). PTX p
i
ClOt
o
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in. Nl
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l
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t
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t
opa
carbachol は picrotoxin が誘発する神経発射の頻度を
1
ーさせたω
有意に上 1
8n 嗣の海，1J~ I;IJHーにお ける苔状紙日~g のやl 続終末の分布を Tim l11 染色により観察した。対照
'
野I
!
t
J
Iuit照およびf
針犬回門に苔状線維の終末が観察されたが(図 I
3A)、 picrolo則 n f
l
i
力I
H
呼ではゆ]瞭脳のTtm m染色の強度は低下し、 CA 3'
I
l
f
多形細胞庖が T
im l
1陽性となった(図 13D)。
月苦~
j
洋では CA3
また、 plcrotoxm と
A
Contr
ol
B pTX
nicardi
pi
nc を共
僚層の
添加 した場合には、明 i
Timm
染色強度が f
l
i
J復した(図 13C)
。各
部{立の
Ti
l
T
I
l
T
l 染色の強度を図
に緩めた。 ザi阪府 では
130
picrotoxjn に
より答状線維の終末の絃度が平行蛍
C
に低下し、これは n icard i pine の J~
PTX+Nic
添加で阿復した e ー か 、CAJ 野多
1
移
剥1
1
)
)
包府では、 picroLOxin
⋮
図 1 3 picrotoxin による筈状線維シナプスの異所性形成
勉君除 8日目に海島田片を 11m附粂色した.写 真 l
乱 無処置切片 (
A
)
. pi
c悶 t
o
x
i
n5
0
μM存喜 下 (8) ま た は p
i
c
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x
I
n50ドM および r
羽 田r
d
i
p
l
n
e10μM (c) 由共存在下
1
で培養した 切片 町Tim m染色明視野像である. 各部位由Timm染色的強度を D に 1
めた. SL明暗層、 so 多影細胞照 OH I!i組問門. ML分 子 層 PTX'P町 o
l
o
x
l
n
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四 国 明n
eO • P<0
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，
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Tukey
'
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sl(mean会 S.
により苔
;J:有意に上昇
状線維の終末の密度 I
T
Iは
し
、 このイ
乍J
nicardipine
によっ
"
J
て影響を受けなかった。歯状 回 !
では有意な援は見られなかった。
:
ipicrotoxin
また、病状回分子胞で i
により若状線維の終ノ転の密度が ￨
二
詞寸ーる傾向が見られた。
守オ
第
応援
2章
8n日に a
i
f状回 W
I
J激による誘発電イ立を同
A
一切 )
i
ー
から多点氾鍛し、省状線維の般射の様子
を'
，
¥t気生理学 (
1
0に解析した。 CAJ 聖子明脱層、針t
体細1
I
包腕および多j
彩分子胞の全 3 部位から細胞
外記録を hった(図 1
4A)。錐体制1
1
包筋から記録
l
!
eに述べた結'*と同
した誘発泡伎では 、図 6 で!
50
SL
慌 の結果が符られた。 明 1
T:t陪からは、 I
l
I
'
W、突 j包
で~}. られる 典型的な シナプス反応である陰性電
位が記録された。 この陰性'
，
T
I
:
{
.
立
の
大
き dはp
l
c
r
o
-
阿+州
pmeの共処慨により完全に回復した。一点
、 CAJ
f多
盟
xc
t
oxi
nの添加により有意に減少し、これはn
ica
r
di
-
v
ー
ー
ー
一
ー
γ
PlX
M細胞屑からは対照併 では殆ど誘発"樹立は
山
←
"
¥
_
.
.
一
一
aE伺
r
n
t
鮭馬切 t
i
の解析
これまでの検討から p
i
c
剛
2
1
)
i
c
r
o
t
ox
in処
E
_
_
j
!
帽
"
~ーー一一一
EコCon
l
r
o
t
. PTX
o PTX+Nic
5
'4
告
ヨ
一
泡イ立が記録されたg
1
¥
一
r
e
記録されなかったが、 pi
c
r
o
t
o
x
i
n 単独処置併お よ
び n
i
c
ar
d
i
p
i
n
e の共添加鮮では、明!IJ'
;
U
，
:
陰性誘発
1
"
'
-
i
n の存住下で地
延した海鳥切片では、持状線維が巽常な神経図
絡を形成していることが示された。したがって 、
この海鳥切片ではや1
経伝達のパターンが何 らか
'
の彪科を受けている可能性が想定される 。 そこ
で府長 8 1
'
1I
ヨに、光生，@学的手法により神経 1
百
i
I
l
J
の伝備 を 2次元的に観察した. I
調
1
5A は謝状
58 は各部位
回刺激後の神経伝達の綴予を、図 1
20
E
2
“
5L
5P
50
図 14 p
ic
r
o
t
o
x
I
nによる苔状線級シナプスの異所
性形成
p
l
c
r
o
l
o
x
l
n5
0
μM 存在下.またはがむ町 1
0
泊 n5
0μMおよび
p
i
n
e10μM町共存在下で増養し 、1
島獲 8 日目に践発電位
を飽録した. A，刺激及びE緑町部位{上国 )
.1
書尭電位の典型酬
{下司). B，，長大誘発電也由大きさ田植め .OG i!i状回. SL
;明
睡指 5
P .体幅脂層、 5
0 割多細胞局、 P
lX陣附帥凡 N
i
c
:
円 四 国 刷n
e
.
..
'P<Q0
1v
sC
O
n
l
r
，
!
O "P<
O
，
O
市 v
s
.P
T
X，ANOVA
f
O
ll
o
w
回 byT
U
k
e
y
'
Sl
e
s
t(
m
e
a
n金 S
.
E.
M.
n=日.
両国国
における H
英首位の時間経過を示している。 通 常
j
♂
では、記録した全 7例で前状回の刺激後、歯状回→CAJY
年→CAI3
!
J
へと 神経活動が順
の府長切 )
次伝』略する係
Fが観察されたが(参考: 1
通 18)
、 pi
c
r
Ol
oxi
n50μMを処世した 切
)
，では、
7例中 6
例で挺)1
5に示した織に ij状回か ら CA3野への神経伝達が観察 され なかった。 n
i
c
a
r
d
i
p
i
n
eの共存
権下で地養した切片では 7 例中 5例で通常の神経伝達が観察された。また、p
icr
ol
oxi
nの存在下
で府養した切片では、歯状回の!
l
l
!
1
!
'
i
時
聞
が
延長しており 、これは n
ic
a
r
di
p
i
n
eの 1
1
<添加により回復
した。 I
止大1
1
際f
創立変化の 50%以上の変化盆を維持する s
j
NIi)は、対照 t
l
1
:
で 1
7
.
3土 3
.
2ms
、p
icr
Ol
oxi
n
処世併で 58.
6士 8
.
7ms
、p
icr
O
l
o
xi
nと n
ica
r
d
i
p
i
neの共添加
mで 20.1
土
3
.
9msであった。
次に主主状線紘一CA3野シナプス伝達の，頒回刺激 (1
00 Hz
，5回)に対 する応答を記録した。 通常
f
H
耳切片で観察される応答を図 16Aに示した。 p
i
c
r
o
t
o，
'
¥
Inで処 t
aした切片では、 17例中 8炉l
で
のf
000msに反復寸る微少陽性電伎が綴喜話されたe これは AP550μMにより完全に￨
阻害
刺激後 250-1
CI
ひl
o
xi
n en
ica
r
di
p
in
eの共存症下で培養した切片ではこの械な遅発性後発射は全
され た。 また pl
く観 察されなかった。
オ2
第
A
、
0"s
5ms
1
0ms
1
5ms
40ms
2章
2
0
0ms
P町 o
t
.
o
x
i
n処 置
切片における神経活動
伝矯パヲ ーンの変化
図 15
C
o
n
t
r
o
l
P剛 o
t
o
演
:I
n50~M 存在 下‘ま
たは p
即 o
t
o
x
mS
O
υM および
n岨 r
d
!
p
i
n
e10μMの 共 存 在 下
で地聾し. 1
&轟 8 臼 目 に 電 位
畢見性色，艇を用いて館状回剰
融桂の~縫活動的伝播を組事実
した .
A，神経転車の係予.8 各
PTX
部 位に お け る 臨電 位 変化 由 時
﹀C
阿+附
間 経 過 . DG 歯状回‘ PTX
‘ Ni
c
;m
c
a
r
d
l
p
l
n
e
.
p
i
c
r
o
t
o
x
i
n
8
Con
t
r
o
l
23
¥J
ここご二
.
出
.
.
.
r
一
一
一
一
』
di
国J--…一一
ケ~こここここ
A C
o
n
t
r
o
l
_j!
~
図 16 picrotoxin処置切片の
頻回刺激に対する苔状線維シ
ナプス応答
網処理E
切片 (
A
J
. 仰c
r
o
t
o
x
i
n50μM
存 在 下 (8
司、またはがCf
o
t
倒的 5
0ドM
および n
附a
r
d
i
p
i
n
e叩 μM(
C
)の 共 存
在 下 で 8 日間培養した明片方、ら苦状抽
本高頼
維シナプス応答を配臨した.・ 1
度 調 お い 00Hz.5回)を与えた崎聞
を示している .
Baと同一切片で AP550
μM華道流した後由記時間経 Bbに示し
たD PTX
;p
l
c
r
o
t
o
x
i
n
. Nに
c
I n回 r
d
i
炉開.
_j
l
i
l
，
ド付品一一ーー
mAP5
C PTX1'NiC
~
考察
I
音義海馬切片において、苔状線紺ーCAJ野シナプスの形成は
picr
otox
川 の存.
(
[
:Fで1
1
且'書された。
pi croto則 n の 11~m は、 1 ) 濃度依存性を示し 、 この絞庄は picroloxin が て んかん傑発射を誘発する
濃度とよく 一致した 、2) lelrodotoxin により阻害された、 3
) picrOloxin とは作用機序の巣なる 他
の鐙後楽を JI1 ~、て模倣された、という 3 .
s
.
か
ら
、
plcrot
oxlOが誘発したてんかん械のや"絞活動が
苔状線維のシナプス形成を￨
但書したことが示唆された。苔状線維の形成が進行した後に
plcroto
山n
を添加した場合は、 ￨
両E
廷の効果が符られなかったという結果は重要である。形成された苔状線維
を一皮切断した後に再生される過程が
plcrolox川
で阻嘗される という紡洪も仰せて考えると、 J拶
13
第 2章
h~j，品ねの持'状級品，ffi に i.j しては異常な"þj lfi毛市!fVl は抑制作(;に作llJするが、既に l形成 さ れている持状線
総に対しては彩燃を及ぼさないことが示唆される. これは、倍義を開始した時点でr
.ocに形成が i
t
.
fしているシャツファー f
i
t
U枝
ー C^I!J!Í'シナプスには p i crot oxi n が~;~轡を及ぼさなかったが、切断 さ
れたシャァファー仰l枝が再生す る過艇に対しては picrotox in が間 '，_l~:効果を示したという結決から
も支持される 。 t，t. お、シャツプ 7-iJUI~支に対する p i crOlox in の作月1 が、t'f r: sJ~ かったのは、同薬
物が CAI里子においては CA3野ほどの神経発射を誘発しなったことに依存していると考えられる。
形成を阻害する作用は、 1
)形成中の線
以上を考え合わせると、てんかん傑神経活動がシナプス j
維に対してのみE見れ、 2) 苔状線維に 1!)l! J司したものではなく比較的一般的な現象である、と ~tÆ:
れた。
過剰な1'1'~まñf，ill出により村 3緩和l胞が j悦滋する例が報侍されているため凪8S， 'I9 曲、死細胞を選択的
に染色する PI蛍光色素を j
刊いた検討を 1
rった。 しかしながら、本研究では p
ic
r
o
l
o
xi
nによる CA3
mは苔状線維の然的で
仰の神経剥1
I}f包の脱滋は観察されなかったロ このことから、 p
i
c
r
o
l
O
則 n の作
ある CAJ野 の神経細胞が脱滋し たことよるものではないことが示された。
苔状線制I~の形成過穏は、 1 ) 刺I ;.{対 l'展、および 2) シナプス形成の大きく 2 段階に分額される 。
神経トレーサーである防 I蛍光色素を汀]¥，、た検討により、苔状線維は p
i
c
r
o
i
ox
in存在下でも対照
I
古l
かつて仰反することが示された。 このことから、 p
i
c
r
Ol
oxi
nは判i
来イ
1
1
1
呆で
鮮と同級に CAJ野に l
はなく、シナフス l
形成の過程に作用することで、苔状繊維の形成を阻害したことが示唆される。
本研究では、 ítt(:立感受性 L 型 Ca~・ チャネノレ 111l:;tJ~長が pi crOloxin の作用を 抑制 することを見出し
た， -jJ 、 T 明白"チャネノレ11[l'~~>I'Jおよび N MDA 受3字体11ft害楽にはこの織な作用が務められ右
*
1
土、てんかん様神経 f
f
o
動に応、じて活性化した し型Ca"チャネノレを通じて細胞
かった。 これら絃
内に流入した C
a
"が、シナプス形成を抑制したことを示している。 一般的に、シナプス]形成に細
胞内 Ca
'
ゅ
の存イEが必援であることを考l
告、すると"、シナプス形成には至適な細胞内 Ca
"濃度が存
ic
r
ot
oxi
n.
(
.
F
{
E下ではCa'・の濃l
交が過剰に上昇したために、逆にシナプス形成が阻害され
在し、 p
たものと理解される。
Tim In 染色法を}IJ~、た検討により、 pi crOloxi n が苔状線維の CAJ !ll!明瞭胞におけるシナプス形
成を胤:号することが問機認されたが、同時にさら興味深い事実が明かとなった
Q
p
ic
r
o
t
o
x川 存在
列￨僚層のシナプス数が減少しただけでなく、正:市な条件下では苔状線維が決してシナプ
下では、 1
子多形納1
I
1
包庖 において神経終末が官官認された。 この現象は、 7
区気生辺学的
スを形成しない CA3 里
i
在1
認された。 したがって、 p町'
o
l
ox
in のf
子イ
E下で形成され士異常なシナプスは生
検討によっても (
程学的機能を有していることが明らかとなった。
7の依式l
笥に示した。本研究で観察された p
i
c
r
o
t
o
x
i
nの作
以上の検討から恕定される現象を図 1
JIiは、単純に答状線維のシナプス形成の阻害効果というより、むしろ苔:伏線維がシナプスを形成
するべき対象の混乱化であると考えることができる。神経系において正俄なや 1経阿路 が形成され
'
るためには、適切な神経活!日jノ4ターンが必要で、あるとされている町九 適切な神経活動が欠如し
た場合には、1
'1経 は i
Eji在な標的とシナプスを形成できず、過剰なシナプ λ が異常形成されると考
'
しては、この仮説の盤合性に対する l
立t
量的な 3
日処は
えられている。脊状線維のシナプス形成に除l
ないものの、士主状線中n，;1~)形成される 11寺均1 に相当する生後第 2 遡口で CA3 里子 に特徴的な神経発火
パターンが記録されることが級告されていることから回、
f
E状線維のj形成にもこうした適切な神
経活動バターンが必要であると必定される。 したがって、てんかん織の過剰神経活動 により苔状
1L
1
空事つ三歪
線維の
w常なや'
l
縫 M路が形成されたという現象 r
t、 J
E A
C
o
n
t
r
o
l
;守な発注過保に必須な中'
l
経発火パターンの}仇 l
袋に起凶
する標的の混乱化であると考えられる，なお、 L型 Ca2T
チャネノレ阻害薬が帯状線刻1
，の本来投射すべき 4
史的にお
けるシナプス形成に対してのみ効巣を持ったという事
実から、
4
5
;
伏線祁=の正常なシナプス形成と、異常なシ
mに、機構内
旬 な援逃が存在することが
ナプス]形成との 1
B
示唆される 。 これらを詳細に解明していくことは、今
後の重要な課題である。
輸銀のガイダンスには接泊二分子が 1
M:援な役割l
を信託じ
Hの 役
ている山九本研究は苔:伏線総の形成における Ca
1;11 を示唆しているが、実際、細胞 ri~
Ca"(
立後者分子の
ヲ
e:
f
)
，
l '"や活性<5，刷， 143.147，
1
87 を調節していることが知られ
ている。 例え I
王、府養 t
i
1
i
創I
I
R
包 l制やt
荷養上j
支細J
J
包日にお
いては、 LJl
1
lCa"チャネノレI
1
且安楽が接者分子の発現金を
上昇させることが示さ;1
1.ている。さら に、細胞内Ca"
の上%によりある禄の接持分子の細胞内領域が切断さ
れるこ，1-f
，
搬告されている '"・へまた、 Doheny らは数
多くの実験を行い、後'{(分子による神経突起のfiIi皮作
川が L 製および N~巴 Ca 11 チャネルの活性化を介してい
ることを示唆している九答状線織と後消分子という観
点から比た場合、 pi
cr
o
t
o
x
in により苔状線中，1の正維な事 l
'
ー 正常な苔状線維
ー
p
ic
r
o
t
o
同 n が苔状線維の投射 に及
I
ます影響(想定図)
無処置切片 (A). p
l
α明
。)(In50μM存在下(町、また
!
志
向
。t
o
xi
n50州 および n
闘 r
d
l
p
i
n
e10凶 (
C
)の尖
存在下で1&.した切片.p了x._p
，
c
r
o
t
o
J
O
n
. Ni
c
:n
i
，
曲d，
隣
図 17
耐
a
経J
世射が失われるという結果は、 limbicsyst
ema
s
s
o
c
i
a
ted membr
ane pro
胞i
n(
LAMP) との関 i
i
l
iか
ら興味深 L、
。LAMPは、辺縁系に広く分布する免疫グロプリンスーパ - 7 7ミリーに属する 646
8
叩
aの糖蛋白である
伺，
81
.
1 1
930
膜下投与すると皆状線維
近年、抗 LAMP 抗体 を幼務ラ γ トにくも l
l
経投射パターンが失われることが示 E
された問。さらに最近、 neu
r
alceladhe
s
i
o
nmolecu
le
の正確なや'
(NCAM) の I
)
!
J与も示唆されている。ポリシアノレ化された NCA M は、新生細胞に段富に発現し
v
t
- シアノレ主主を酵素処且Iにより除去すると、やはり苔状線副長が異常発達し刷、 CA3
ているが、この ，
野から記録主れる昔状線維シナプス応答の大きさも減少する刷。こ れらの報告された結果と、本
h
研究の給処は極めて額似しており、細胞内 Ca
がこうした援活分子の活性を調節しさ5
状線維の刺1
2転ガイダンスを行って L 、る可能性 iJ~ 示唆される 。 これらのことから、的維な神経回路形成におけ
る神経活動依存性の機構 と接着分子を介した機構 を広くとらえるうえで、本研究は司
I
婆な示唆を
与えるものと思われる。
pí crotox in 処位により苔状線維が呉 í;~' なや1 1 経同絡を形成した切片では、
1 ) 能状阿から CA3 I
J
!
}
へのや'
l
経 伝達が生じなかった、 2)備状回の.lHiT!i時間が延長した、 3
)歯状回の頻回刺激により CAJ
野に遅発性後発射が観袋された、等の.$.~;;-;.な:J};I.象が観察された。 1 ) の結果から、歯状図 ー CAJ ~Ir
J
v
r
問め泉州な線維連絡の下では、歯状lElの刺激により CA3 野錐体細胞に活!f 凶立を惹起できる穣
皮の十分なシナプス後電位を誘導することができなかったことが示された。これは picr
ot
o
xi
nで
位した切片ではシナプス応答の大きさが千f
:
i
主に小さかったという給』長からも支持される e また、
処i
第 2章
2) および 3) の結決 Ii:、凶 1 7 で示した傑な的状阿における l任後j支 1"1性州路の形成に ('I'~ 、 l指状 Inl
の典型H
'i:が上外した結果であると考えられる a さらに 3
) の現象が AP5で I
I
J
L
'
;
"
!jされたこ とから 、
]
t
i
l
l
ーされた筒状回の興底的i
村終伝達に NMDA受絡体の所性化が関与していることが示唆された。
てんかん忠者または動物モデルにおいて、 l
制止 l
凶の NMDA受答体 mRNAの発現i
立がヒ昇し、1:
t
通級品ι
1歯状回シナプス伝達の NMDA 受2主体成分が胤大するこ と が 示 さ れ て い る 九 こ う し た
NMDA 受絡体の異常な機能 li:逃が、 æ j~回の恒常性興奮に関与していると思われる 。
p
l
c
r
ot
oxl
I
1処世切J
片ーでは1
賞状阿 CAJ I
貯のi
'
l
経伝達が生じなかった。苔状線織は海馬の主要事'
l
経
同日告を J形成している ため、この~Id患は海馬の機能に遊館な支ド躍をきたしていることをな味してい
る。 たとえば、この現象を
mVI聞
に適j
刊した場合、小児てんかんではずイ去に海馬の機能障害によ
定される.実際に、小児てんかんの予後には認知、学
る何らかの後遺娠が観察される可能性が怨l
習降:ヰを生じる W~ が報告されているが、こうした後ì.C!!iEはまさに海馬の発達異常・に rl lJ~し たもの
でめるかもしれない 1
官。ま た
、 pl
c
r
o
t
o
xl
O処置切片では鎖日刺激の後、数百 ms にわたりてんか
ん織の神経伝達が観察された。 この結巣は、てんかん保条件に抹露された切片は自らてんかん原
、
。実際に、
性を獲得することを意味している . これはてんかんの慢性化の怠礎機構かもしれな u
小児てんかんが慢性化する痕例は数多く報告されている幻Jヘ本研究では、さらに、これらの現
象が 1
創立J
t
;
i
受
性 LJí~ Ca"チャネノレ阻害薬で阻;
!
dれることを示した。したがって、同薬が 川町叩
においても有効であれば、てんかんの後泣症および慢性化に対する治療薬の候補として期待され
る.
16
第 3章
第 3章
歯状回頼粒細胞の単離培養を用いた検討
緒言
rìíí r~[ では御馬.HH~t音袋を用いて、てんかん傑の条 1'1:下で待状線維のシナプスが泉純'形成するこ
とを 明かにした
。 しかし、組織j
管長系は、 1
) グリア細胞を多く合有している、 2
)t
t
i
長液中に J
f
n
.
mを合イfしている、等の 1Jl魁点があり、
I
v
i
.
I
iで行つ定以 ￨
二の枠制1
1
な解析は困難であった。 そこで
本章では、若状線維の J包始細胞である謝状 Iwll-~i*切\111 )胞の 1~.Ji.ífH音義を行い、苔状線維のシナ プス形
成金鋭袋した。こ の単縦培養系に{士、 1
)グリア細胞の混人が少なく、かつ神経細胞同士も互い
に接していないため、グリア細胞や神経細胞同士の相互作用などの復維な妥悶が比較的少なく実
，
)1
!
W
J
f
l
l
l
i
守主音養が i
J
u
1
5となり機構解明 t
こ必須な薬白
血学的解析が森喜吉
験結栄の考察が容易になる、 2
1
.
'
:
1
が
あ
る。
になる、等の手1
"
1頼粒細胞の大半は周波J
V
Iに形成されるべそこで、 i
張粒剥1
1
胞を効串良く得るために、生
筒状 1
泡安調製し、 f
音義 Fで形成されたシナプスに対して薬局!学的検討を行った。
後のラ ット から上告養絢l
方法
』間約剖1
1
胞の増舵館長
，，
3n
併の WiSl
a
r系ラットを氷冷麻酔した後、迅速に全J
j
i
過を摘出し、 O :CO/
95
:
5を通気した氷冷
G
c
y
'
s sSS 中で海馬 体を摘 f
Hした。さらに許証潟支脚復合体、続いてアンモンj
唱を切除し、歯状回
のみを慎重に 摘出した([g] 1
8A)。 組織片をメ λ で粉飾し、 0.
2
5% t
r
ypsi
n(
D
i
f
c
o)、 0.
0
1%
deoxy
r
ibonucl
e
a
s
e1 (
Si
gma
)、0.
5%邑l
uc
o
s
eを含有するリン般緩衝液 2
.1ml中
、 370C で 30分 間!
の解案処苅!を行 った。 馬 f
I
I
l
l
n(
I
CN b
iome
d
ic
al
) 1mlを深加した後、 1
200rpmで 5分j
1
j
iの遠心に
何し上析を除去し た
。 組織J
i
ー
をj
f
j:び府議液 21
1
1
1で満たし、内径 850μmのプラスチック製チップ
J
莫 (
2
5μm径)で総過し組織地を除去した
で数回放射!を反復し細胞を単縦した。 2m:のナイロンI
後、予め p
o
ly
L
-I
ysi
ne (
S
igma) でコ ーテ ィングした 48穴プレート (Cos
t
町)に、 40，
000c
els
l
印手
の非:;JJ[ で ~;II)胞を舵種した。 以上の手法により、ラット 1 I
Z!;あたり約 500，
000倒の細胞を得ること
伎は、
が可能であった。幾っか:実験では、アンモン角から件た細胞も問機な手法で精一獲した。!
g
，
養i
Lgl
Ul
.
1mine73μ品/
0
1
1および 2% s2
7s
u
p
p
lcmen
t(
L
if
eTec
h
n
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l
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) を含有する Neu
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l(
L
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Te
c
h
n
o
l
o
gi
es
) をf
l
j
v、
た。 また、様車i
l
H
産は細胞の生存率の l
向上を図り、 Ne
u
r
oba
s
alにさらに等1J:の
出
l
r
o
cy
t
e
c
o
n
d
i
l
ion
e
d medium (
ACM) を添加して使用し、 241
1
刻U
'
H去に ACM を含有しない倍長波
に交換した。 また、笑!
験によっては、 24 時 I
tI1後以降は、c
y
t
os
i
nes
D
ar
a
b
i
n
o
f
u
r
a
no
s
i
de (
A悶 C)
) 2μMを培養液に添加した。府議 4 日目に上苦養液を再換し、府養 7 F
I同に笑験に用いた。
(
S
i邑ma
企皇陛笠週製 192
3 目的の Wis
t
ar系ラットより大脳皮質を摘出し、上記と問機な手法で細胞を単縦した。 751
1
1
1
f
占後フラスコ(I
'
a
loon) に 1
，
500，
000c
e
l
ls
/
cm'の符度で細胞を機種した。 l
f
f
養 21
3
1
ヨに、高官養 フラ
スコそ 2分間、200rpmで計 2回仮滋し、 1J
型アストロサイト以外の釧胞を剥除した e 培養液 l
立
、
，
NaCO 1
.
89 mg
l
l
1
1l
、sodium pyr
u
v
at
e1
20μ畠/
0
1
1:および 1
0 %牛胎児血清(三光純薬)を含有する
n
Dulb
ecco
'
sm
o
d
i
l
iedea
gl
eme
d
i
ul
1
1を使用し、 3 日毎に交換した。機事 してから約 1カ月後、アスト
¥i}('Iの石境状になったことを確認し、 5m M EDl
礼
、 0
.25% t
r
y
p
s
i
nを含有するリン駿
ロサイトが l
第 3意
A
図 18 歯状回顎粒細胞の単敵
1
音義
A.18聾 浴. ~佐世 3 日齢的ラット闘より樋
状回(またはアンモン角}を摘出した桂.
醇紫処理により掴胞苦単組し掴画した. B
i
:
l
&
聾 7 日 呂 田 縛 経 幅 胞 白 州 制 粂 色 像.7
1
;1:信伏阻.相手アンそン角から得た細胞の
明視野像.C
.神睦輯阻およびグりア掴胞の
生存に &1
ます A悶 C (ONA 合成阻害集】 2νM
の劫累.A
r
a
Cを1
8
聾 2白目から嵩掴し、 i
釜
餐 7 8自に生存細胞を計数した .0，j島 ~7
呂田町縛経圃胞の葺置. ・・内 0，
0
1
.Slu
血 n'
l
s
t
t
e
S
I
.
緩市llJ液中、 370C で 2分間の
処理に付した後、
B
.
.
Oentategyrus
・t
A町 mon'shom
‘、‘
， - 、•
，
.
た。 再びアストロサイトが
定常状態に達した後、 3 1
'
1
ー
・
汗? f
〈
F
4
I
J
i
l
条件付けしたj
者養液を
-
30μm
C
5
.
0
0
0
c
cls
/
CJ
1
1'の密度で再指事f(し
0.22μm径のフィノレター で泌
過し ACMを得た。
FMト43蛍光染色
D
FMI
4
3 はシナプス小胞の
ロ
C伺
'
'
'
'
'
. A田 C2μM
エンドサイトーシスに作い
細胞内に取り i
主まれ蛍光を
E
~
N剖 r
o
n
発する色素で、機能的シナ
E 5 1 B
をu lA m M S M n
プスを染色するために J
よく
m
阿
i
ー
l
Neu伯 作
山
C
G
l
i
a
lc
:
.
e
ll
IAmmon'
sh
o
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n
."恕嶋却ト
主
言
。n
利用されている 15，
1
ぺ t帝王警
主凶n
ロ
ー
。
。
…
一
1
0
自'aIα釧
h
rPr
o
b
e
) 20μMおよび KCI40酬
7
悶日にI
昔養液を sSS0
.
2
5 ml
l
!
i
<
0
.
.
，
.
，
.
..1"州
を含有する 附
20
に換院し 11
/
年間以!
こ安定化
した後、さらに、 FMI43
0
.
2
5州 を1
)
[ 1 刷 峨 伽e
s
s
畑創
でi
点王立に 2 恒l
洗浄し、 共焦点顕微鏡を円)
o、
て FM1
43の蛍光像を得た。詳細川立第 21
;
i
の DI
i蛍光
観察の方法に準じた。 小さな赤い蛍光政E;，誌は、 KCI40m Mの暴院により消失寸るため、機能的な
1X317μ J
1
1'X4の領域を任意に
シナプスが染色されたものであると判断した。 lクエノレにつき 21
選択し、領減内の蛍光斑点を計数することで
I?エノレ中の総シナプス数を逆算した。なお吾十数の
際は、グ リア崩l
胞によるものと思われる非特集染色に細心の注意を払った。 ま た 実 験 後 に 精 細
s
sl染色し、明視野顕微鏡下で神経嗣1
1
胞を計数し、 l クエノレあたり の神経 K
l
I
l
)
J
包教を逆算し
胞を Ni
l
'
(と
た。 総シナプス数を事1経細胞数で除算し得られるや￨】絞細胞 l側あたりの平均シナプス数を指e
'
ケて実験に{史札た。 また 図 l
円
9の笑験では、問 H
恥奇
，
染色を?行
Tつた. この色索は、 1
)水治性に富み、 2
) .
1
1性が傾めて低い、という性質から't細胞の
染色に頻繁に用いられている
ヘ1% LuciferyellowCHアンモニウムJ恒 川 叫 日 州
l
j
バしたガラス電傾で地姿創1
1
胞を パッチクランプし
を充
2n
点、200J
1
1Sの内向き電流を 1Hzで 2分間適
万lした。 FMI
4
3に対しては 488nJ
1
1J
i
J
i
J
起 で 515nmバンドパスフィノレターを用いて、また、 L
u
c
i
f
c
r
yclowCHに対しては 51
5nm 励必 で 550nm バンドパスアイノレターをJlj ~ 、て蛍光像を観察した。
第 2章
結果
まず始めに、鋭H
本細胞が優位
A Control
でめるアンモン角かられト t
-J
f
f
主
i
:
制U
J
I
包 (
昆
[11
8B A
i
) と比'
絞寸
ー
る
ことにより、
4
以下法で 1
!
J
た
副U
I
I
包
(
f
記11
8
B 17.)が実際に航続制l
1
I
包であることを縦必した ω 消長
71
1
1
1の .
)
'
1
'
終細胞主た 1
:
1
:
グ
リ
ア
，
.
"
，
細胞の句作数を l
;
:
i
l1
8C に縦め
た
I
'で !
g
'
N
する
通常の術主主治 L
と
、 tl
j
縦剤U
J
I
包とグリア鮒!胞の生
図 19 h
i
g
hK
・含有権地のシ
ナプス形成促進効果
¥Ii干状""とアンモ
存細胞数には、 1
酒税田堵葺液 (
A
)
.K
C
I3
0mM存在
下{目、 K
C
I
3
0
mMおよび n
i
c
a
r
d
i
p
m
e
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岩盤し.1&葺 7 8
自に L
u
o
f
e
ryelJowC
H<
I
t
)
.F
M
1.
4
3
{シナブス吾余色する色素)【赤〕を
用いて蛍光二重染色在行い .共焦点顕
微睡下でき俊光像を鰻曹した.
ン(
1
1との 1
11
で溢は比られなか司
工
/.
ONA介成1
1
['
，ヰ泌である A
raC
2μM のイF(Eド
で
J
:
i
'
'
t
t
すると、
T
1
グリア細胞の供仔教はイ {M~ に 1氏
ドした
，
1
.
.
1円 た
このとき、アンモン戸!の神続制n
Jl包教も減少したが、
t
aW
I
¥"
1のや'
l
終細胞の 11
:
イnこは変化が
二の結果{士、アンモン f
f
lからねたや'
l
続長1
I
J
I
I
包0)/1
'
μはグリア細胞のイ:
r
t
Eにl
何度に依イ了し
ているが、 1':N ~x l"l の神経細胞はグリア細胞には依存しないことを示唆している
次に、
N'
縦細胞
の細胞体の 1
"
(
符を計測した(閃 1
80)
0凶状I
!
'
]のや'
l
経細胞の 0
・
[
千
葉
は 1
0.
46土 0
.
0
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μ
1
1
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l
1
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.
E
.M
..
，
戸
28
8)
、アンモン f
i
lの細胞 1
:
J
:1
4
.1
2土 日 I
1
μ
1
1
1 (n~277) であり、陶状 Fil から斜られた嗣IJ胞の )jが
{L
也に小さかった (
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O.
O
I.S加 d
e
n
l
'
sIt
e
s
l
) 夫￨
際、所WJでは錐{本側I
I
包よりも見切粁i
j
l
l
l
l
抱のんが小さ
いえめ 8 、本~験系で的状 1"" より得られた細胞問I~l絞制 IJ胞 であると判断したは剛山()，1. 川固 また、
以ドの』よー験では. J
こり優位な脳粒制U
J
胞を得るために、続長液中に AraC2μMを添加した
以 I~ のf.法によりねた ~Æl1吐制U胞 を 7 1l
!
U
J
:
/
i
4:すると、告状線維がI
{I
'
J
長しシナプスを形成するこ
とが際l~君主れた(1詞 19A ) ω そこで、内喰楽 picrotoxill 5
0μM、b
i
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1ト
1
から 7~I 1の 6I
l
ll
i
J
慢
1
'1
'
適J
I
IしたlI!
fに、形成されるシナプ
ス数がどの慌た彬料を受けるかを検討した。 しかしながら、これら薬物は形成、ンナプス数には影
併を与えなかった。 これは、本N'iI~ 系ではl'i{fif薬が効率良 < 1際電伎 の!胤分慨 を誘将できないこと
に IMt~ しているものと身えられた珂 刷。 そこで、 l悦分慨を誘噂する允めに I41波及 ( 30 1
1
1
M)の K・
を~イ了する防長波 ( h igh K'
)'
1
'で、神経細胞を培養したところ、 l
苅 1
9
s にぶした様にシナプス
l形成が à~'l;:; に /Ci止された。 結よt!:をぷ 3 {. ~.線めた引 high K<
処 院により J
形成されるシナプス数は約 2
併に1¥
¥
1
1
)
1
1した。 この紡来{立、第 2市ーの組織I
汗擦を川 いた研究で見られたてんかん線条件下におけ
る持:伏線制1; の民~'i;-:; Jf;hl{とよく 一致し、本現象はその).1;縫・機構を j11. 司ていると~えられた
次に、 h
i且hK ' の効果に刻して薬理学的検討を行った。 まず、 11提ílt位感受性のCa2. ~重過性チャ才、
ノ
レ1
!
[
[
7
1
薬の{乍
，
mを検討した(
0 LJ~~ Cat
チャネノレ I
!
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主
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型Ca"チャネノレ 1
1'
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C
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ghK'
と同時にi
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di
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i
n
cのみが hi
ghKーによるシナプス形成促進行'tTJを!
I
t
[
オ9
第
3章
符し たが、他の薬物による;;話轡は凡 ら
I
)r
u
g
れなかった。 また、これらの援物は、
1
I
I1
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1
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1K
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r098059
Vl
l
.n
munmn
ス形成には影響を与えなかった。次に、
21
Ca により活性化される細胞内
細胞内
情朝日伝達系の¥
1
1
1
;
存薬の作用をいくつか
検討した.CaMKl1阻害薬
KN935μM
、
1
t主 calphostinC 30n M、非特異ー
PKCs
[
l
的チロ γ ンキナーゼ阻害泌
、
gen
is!ei
n3
結後条件 下 で観察されるシナプス形成
を促進したが、{也の薬物には通
:
常 の条
件では彩轡がよLられなかった。
様々な細胞において、 j
悦分優に
wい
内
m
'
l
経栄養 l
扇子やj
成長因子が分 f
必される
や
同州刊
α
KT5720はj
屈指・の
hHHUn9
KN93 のみが h
i
邑h Kサ
の作
1
5
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したところ、
mを 1!得した. また、
喧M025 劃
l リ
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m 3 M 山刀直叫 m
dh 川 田
E 劃剛 岡
，
、口 代J叩 ゆ m
引 白 川 附 ω川町臼印刷山町山間
μ M、PKA阻
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888888886666
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1
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1
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6
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曲
1
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2
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，
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2
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9
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l3
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4
3.
2
1三 4倒
1
9.
0
4:
i1
20~
3
9.
5
0土 3.
7
3
5
0制 念3，
75
2
4536土 4R
4
2
.
8
7全 5
.
2
9
4088全 115
4
4021;を2.1
守
8
.
7
九これらの因
こ とが鰍告されている 1
.
.
t
町田やて
表 3 high K'含有崎地の細胞生存およびシナプス形成促進
効果に対する各薬物の作用。
州立、波状線維の形態変化
各車楠由存在下で l
a
葺し.
la
聾 7 日目に盆存細胞数およびシナプス敏を調
んかん}i;{性1.13
4，1
自に関与すると考えられ
ている。したがって、
i
g
hK
' KC130mM.N
l
c
a耐 p
i
n
e
:
l型 白E・
チ 、・ネル図書車 2μ
帆 N
I
C
I
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定した..h
T 聖 Ca~テャネル阻害車 20μM 、 ω c。聞10刈n GV
I
A
: N型 ca
杏
守ヤネル悶審
h
i邑h K
ゐ
の効果が、
薬 1μM
、 A
P5
:NMDA畳容体阻害型 30μM.KN9J
;CaM剛 阻害 薬 S
μM‘
C
a
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t
i
nC:PKC阻害車 3
0n帆 G
e
n
i
S
l
e
i
n 非特異的チロシンキナー ゼ岡
j
悦分極に伴い放出された神 経栄英国子
容易13
μM.K
τ
'
5720
.PKA 阻害~ 10μM‘ U73122:P
l
C
γ阻 害 車 5μM、
PD98059
.MAPKキ ナー ゼ阻 害 車 30μM_ Wi
副m
a
n
n
i
n円 3
K阻嘗 葺 1
0
0
05，
"P
叫 01¥
15.C
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:0.
0
5.
H P
<O0
1¥
lS
.
Conl
r
o
l
nM
d'P<0.
刷 K'
，
ANOVAf
o
l
l
o
w
e
db
yT
u
k
e
y
'
5t
回【問剖企 S
.
E.
M)
.
i
n
h
J
能性が怨定
や成長因子を介している "
される。 これらの因子は、
phospholipa
se
;
v
a
ledproleinkinase
Cy (PLCy)、ml回 gen-acl
の釧1
I
包内 f17報伝達系を活性化するため引目、
(MAPI
く)やphosphalidylinosilol3-kin酪 ;
e (PI3-K) など
h
ighK+
のが'
J
!
長に対する PLCyIIF
l'
i
言
語sU731225μM、M A P K
キナーゼ 1
5
且符薬PD9805930μ Mおよび PI3-K阻害虫[wartmannin
100 n Mの作用を検 討 した。
しかし
ながら、いずれの薬物も hi品hK+の作用 には影響を与えなかった。
神経絢胞 の生存数も同時に計 測 した(表
l
科加
し、この
3). h
igh K'
処置により神経細胞の生存数は X
F
J1
.2倍 に
h
igh K
噌の効果は、 nicardipineおよび geni
s
l
e
i
nにより
阻得された。
考察
本研究の手法により得られた熔義細胞は、アンモンタl
から得られた細胞と比 I陵し剰1
1
1
胞体の泣緒
方t小 さかったため粉粒細 胞であると 判断 した。 また、アンモン角の細胞は AraC の存t
EFでは生
存率が極めて f
ほかったため、より優位な穎粒細胞を得るために布告養液に
により殆ど綴粒納胞のみの培養系(但し
Ar
a
C
を添加した。 これ
10 %未満のグリア細胞を含む)を作成することが可能
となった。 したがって、本実験系で観察されるシナプスは、その大半が帯状線維のシナプスであ
ると身えられる。
highK+の条件
Fで縫養すると 、や"経細胞の生存数および形成されたンナプス数は共 lこJi"l大した。
20
第 3章
しかし、 1 ) 生存細胞数が約 1.2 他にJ:i，'!l)J11 したの対し、シナプス数はが~2 併にlfI大した、 2) h
i
邑hK
時
のシナプスJl
%
J
Gの充進作用は KN9Jにより
m
n
.されたが、神経細胞の生(f'促進効巣は影響を受け
s
t
c
i
n は生存促進W
J
.
*のみを問 122し、シナプス形成立逃作用には影響を
なかった、 J) 逆に、 geni
t
lから、 h
i品hK'
処院によるや'
l
経細胞の生作数附加とシナプス数のJirl大は日)
1
与えなかった、望号;のJ:l!l
の機怖を介したものであると考えられる。
本 tì~1.Yf系ではグリア剥IIJ)包が少ないため、 ~qb 索が 11.jr 展しシナプスを形成する際のガイダンス機能
をJ
担う制)
)
包はないと考えられる。しかも、:E休または組織熔長とは災なり、単雌I
音f
t系では、阪
舵細胞が厳然とした庖術造を有して ilf?: ~11 していないため、シナプス形成の適所性、災所性を論じ
ることができないω しかしながら、 1
)組織地ー発切片において、てんかん般の激しい脱分悔を伴
う条件 Fでは台一状線維のシナプス j
形成が兵常克進し共所性を示したこと、および、 2
) 単向f
l
:
t
r
r
;
毒
剤1
1
)
)
包では、悦性的j
批分憾の条件によりシナフス数が激別したこと、の 2つの現象の )j向性は合致
i
c
a
r
d
i
p
i
n
eが 1
)および 2) の阿現象を共に￨
阻害したことも併せて考えると、 2
)は
し、さらに、 n
1
)の現象の(少なくとも部分的な)l，!;礎機桃を知っているものと考えられる。 したがって、本
恨の実験系は、苔状線維の ~1~'形成のより簡略化されたモデノレであると思われたg そこで 2 ) の
瓜象に刻して詳細な薬理学的検討を試みたe
h
igh K
'の効果が n
ic
a
r
d
i
p
i
n
eにより問答されたことから、 l
民分極に伴う L
製 Ca"チャネノレの t
i
奇性化
l
C進の引き金となっていると考えられる。 また他の Ca'
活過性チャネノレ阻
がシナプス形成の射:
;
後薬が有効でなかったことから、 L型 Ca'令チャネノレの重要性が示された。 これまでにも数多くのグ
J
レープが、神経突起の伸長や分岐j形成およびシナプス j
形成が剰1
1
1
1
包内 Ca1+により調節されているこ
とを報告している百.33.~S. 11九 Aud回 i rk らはゆ、ニワトリ H両 の培養神経細胞を用いて、 1'1'経突起形成に
Ll~í~Ca" チャネノレの活性化が不可欠であることを斥しており、また当研究室の志腐らは'"ラ ット
2
海馬の.1%養神経細胞をfIlいて.神経突1
包の分岐形成と L.
J
匂
巴 Ca
令
刻性:を被告して
- チャネノレの発境の倒 l
5
Q
e
a
"チャネルの活性により 訓節 されていることを示し
いる 。 これら報告は、主主状線維の形成方lL!
た本研究の粘土*とよく 一致する。さらに本草では、 CaMKII 阻害~KN93 により hi邑h K'
の効果が抑
制されることも示された。 これは、これまでに報告のない全く新しい知見である。 PCI2悶または
J
線維詳細胞 l叫では、 J
悦分極や栄養凶チの突起j
l
!
1
長に対する促進U1
王
矧が CaMKI胤審議でj
l
i
J
i
t
1
)さ
3T
れることが示されている a さらに、 N
、
司
」
叫r
悶
0
勾
2
a
およびNG
引1
0
ω
8
ι
引1
凶
5等 の科
を
:
鈎
活
倹H
州
制
i
刊
削
H
削
I
副
H
j
発9
現Z
させると、突起イ
制
や
】展が{
ド
}
時
l
促
起近
進
Eされることも報告されている。これらを考慮すると、
ニy 卜
h
igh K・
の作用は制l
索1
1
1
1長の花i1主克J
/
巣に基づいたものである可能性が挙げられる，この可能性を解
明していくことは今後の課題である。
n
i
c
a
r
d
i
p
i
n
cおよび KN9J は、通常の !
f
f養条件下ではシサープス形成に影響を及ぼさなかった。こ
の紘一換は、これらの薬物が異常なシナプス形成のみを拘1
1
1
i
リし、通常・のシナプス形成には影響を与
えないことを示している。第 2f.'tの組織培養を J
I
jいた検討でも、
1
1
1阻
r
d
i
p
i
nc は p
i
c
r
o
t
o
x
i
n が存自
する場合のみ作用を現しており、第 21言と買~3 章で極めて -tt した結呆が繰られている . このこ
とからも、本章の災験系が、第 2主
章
主
でF
見
Lられた 高
t
t
指
5
次元のE
現見象を J
忠
」
心
3
Z
実葺に内羽
強虫く議衷一付けられる@今後、本笑験系が傑々な角度からより有用に平1
)
H
'
ldれることを期待す
ことが g
るe
21
第 4章
第 4章
小児てんかんモデノレを用し、た検討
緒言
てんかんの4搭
~J品綻
2定E 率'+耗1 は乳児J期
9切IJ 1Jカか、ら小y
児己J期切にカか、けて飛y縦
J必t的に |七二釘
4
係長々な後立
i
迎
ωJ
徒定をi
泣
t
立
I
すことが知られて才お
4り、とりわけ認知ノ1および記憶、学習能ノJの防 t
i
・は顕著に
鋭叙 される 3.
s
2
，
5S
.
l
，
l
1
lIJ9，
円
相
曲。尖際に、国民全体の 2 %を占める知的障害者のうち
J
，甲J ~sj もの忠布ー
が小児~øJ にてんかんを発縦しているという本子11 のデー タも伐されている 。 しかし、認知命学符隙
害といった後ill:症の発生機構の解明は不十分であり、現在のところこれらの後述旋を予防する手
段は確立されていない。
てんかんによる学習ド読書の実験動物レベルでの再現は、幾つかのグパ(プが試みてし、るが、未
だ完全には成功していなし、。 キンドリング川やカイニン般 '
2>処理を施した実験的なてんかんそ
デ
ノ
レ
耳
目J
物で学習障害が観察されているものの、それは成体においてのみであり、未成熟な動物で
は
、 てλ
んA
ノ
カ
か
、
/
ん
υ よる学習
i
菅
F
智
l
附Z
答
芸
キ
や
'
中4
椛
f
寂
互
討
や
判
神1
ド
l
縫系の機能陣;g:穿引』は立軽
1
怪i
皮変であるか観察されないのが一般的
f
が
H
内
J
であ
る
仰
円
『
川
'
.
叩
'
山 出.
帥
'
s
目91
7
九
7
@
ヒトではより低年由齢令でてんかんを発症した方が後遺 J
痕定の t
銭t
J泣
i
立が 量
顕
民4
著5
であり
剖抑
3巾判
0
.
'
バ
，
4
1.
んにおける認知、 学習 Ilj;~得の研究を遅滞させている主要な原因の l つである。てんかんに対する
感受性に見られるヒトと実験動物との差i
主ががI
に依存するのかは不明であるが、最も重要と考え
られるJll!由は、 1
)てんかんが内肉的事象として発綻したものであるのか、外的に誘導されたも
) てんかんを誘発する l
僚に;l
J
沿動物では、発症率および致死率の問 題によ
のであるのかの慈、 2
り君主犠誘発の条件の緩和を余儀なくされる、の 2点であろう 。
こうした現状の中で、現l
f
.
報告されているてんかんモデJレの内、 p
i
l
oc
a
r
p
i
n
e てんかんモデノレの
みが、幼少l
時のてんかんが後に学習隙容を誘引すると報告されている刷。 p
i
lo
c
a
巾i
neてんかんモ
デノレは比較的近年に際立されたモデルであり、 1
)観察されるてんかんの綴式がヒ卜の側頭集て
んかんをよく模倣し叫問、かつ 2
) 手法が併i
使であるという理由から、現在のてんかん研究の分
野における危も有 J
i
Jな手法の lつとして
mいられている問。 piloc町l'lneによる悠聖書の狸は、特徴
的な 2つの段階に分かれる。投与数分後から数時間に渡り鋭祭される急性初は、 品
長
官1
および筋附l
代に代表 E
される凶 J
出盗事韓から
r
u
積発作
(
S1
3
t
u
Sep
i
le
p
l
i
c
u
s
) に至る、 p
i
l
o
c
a
r
pi
n
e による直後作用と
A
J
J
U
Iが続く 。 この 1
mは、動物
考えられる痩蟻を主症状とする. この急円相の後には、数日に被る f
は平常状態を保ち、発作は観察されない。 問
j
J
1
J
に絞く俊性中o
では、 I ~I に数回の大発作を生じる
ようになり、これは数カ月以上にわたり観察される。本研究ではこの p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
eモデノレを採用し
た。
I者ト幾百止)J~-lffJ}午をJF!いた第 2 :
t
j
t
の研究で、てんかん機環J".iiによる苔状線維の異常形成が n
ic
a
r
di
p
i
ne
で改善されることを示した司 したがって、小児てんかんの後泣症に見ちれる記憶、学溜陣容が、
第 i準で身察した様に苔状線維の発達巣常に出来するのであれば、こうした後 i
l
l
:
症もやはり
n
i
c
a
r
d
i
p
i
n
eで予防される可能性がある。 そこで、未成熟の官官j物 を用いた p
i
lo
c
a
r
p
in
eてんかんモデ
o
ar
d
i
p
i
n
eの作mを検討することを目的として、 p
i
lC
)
c
a
r
p
i
n
e投
ノレで観察される学習陥容に対する ni
与と同1
I
;
!
j
'
に ni
印 r
d
ip
i
n
cの巡回投与ーを開始し、動物が成熟した後に、行動3
霊
感!試験を試みた。
22
第 4章
p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
e誘発症患
PO
P14
主
主
主
4
+lne
p
i
l
oca
r
p
;
情
， 処 盤
1
4 円齢の未成熟の ddY系u
4
t
性マウスに、高
pl
ioca
r
pi
neの
)
f
J:
!
!
l
l
立
、x
i
l
政上では通常 380mg
l
kg
が汀I
v
、られるが'"、 この
J
f
J
.
I
立
を 1
4 日指令のマク
mした場合、対照J
洋の生存率は
同町
t
、噌叫
V
e
h
i
c
l
e
生
」ー+
宇官行動観察
総指化学的検討
実験スケジュール
1
4自酎の幼若マウス に p
i
l
o
c
a
r
p
f
n
e200mgJ同 を腹腔向投与してん
d
l
p
l
n
e1府羽 I
k
gを連日皮下
かん尭作を隊喝した. 乙れと岡崎に "
'
曲r
位与し.マウスが 40日齢に軍した時点で各種実騒を開始した，
80.
0%
n
i
c
a
r
d
i
p
i
n
c投与併では 6
.
7 % (1
5[
L
C
中 l匹)と良
1
86
0
Ni
c
a
r
d
i
p
i
n
e
Sal
i
n
e
図 20
(
5匹'1
.
'4[
L
C) と比般的良好であったものの、
い成紛が符られなかった
.
.
1
P
i
l
o
団叩
月1
盆の p
i
l
o
c
a
r
p
i
nc を役与し磁穫を誘導した。
スに適
P40
A Pilocarpine役与前
したが って、本研究
ではj
日肢を 200 mglkgと低〈設定した i
刷。 この凡1
@では死亡する動物はなく、かっ投与した全ての
il
o
動物 に沌犠を誘発寸ることが可能であった。 p
，i
.
p.
)適
)
1
"
1
時 には、問主主の末悩
c
a
r
p
i
n
c(
2
00mglkg
神経系に j付する作 m を 抑 il~1寸一ること念日 的 として、
B Pilocarpine投与30分後
30分前に s
c
opol
aminc'McBr (1mglk
仏 i
.
p
.
) を投
与 した。 p
il
o
c
a
r
p
i
n
e設与後には海馬 CA 領域から
のj
脳波の記録お よび穏懲￨可数(筋 1
:
J代のみ)の観
祭を行った。則cardipine処置椛では s
∞polamineの
投与と同時に、 ni
c
ar
d
i
p
i
n
e(
2 mglkg，Sι) を投与
し、加えて翌日から同舟l
琶の n
i
c
a
r
d
i
p
i
neを l 日 l
l
司の狐皮で連続投与した。 行動車
l
f
J
l
j
j
試
験
は 7 ウス
図 21 p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
e誘 発 震 強
p
¥
肱a
r
p
m
e世与問 (A) および彼与 30分後 (8) のマウス.
;t路間代田峰子を表している.
控与後のマウスの写.
l
{I
が 5週申告に達してから行った(図 2
0
)。 薬物 は 1
0 mlf
kgの投与容積ーを j
羽い、溶媒は n
i
c
a
r
d
i
p
i
n
eの
mいた。各f平全 101[1;のマウスを使用した。
1
0% dimethyls
u
l
f
o
x
idc
/
s
a
l
i
n
eを除き s
a
Ji
n
eを
J
磁波記録
.
m.
) で麻 酔 した 1
3 日併の7 ウスを、 )
1
滋定イ世間A:装位に悶定し.ステン
xyl
a
z
ine (1mg
l
m
O
t
lS
e，i
レス製双侮j
:
:r板(直後 0
.
2m m
)生梅馬 CA 鎖域に押入した (
AP:ー1
.5mm，
LM:J
.
3m m
，DV:ー
1.
51
1
1
m)
。
対侃1
1
の頭設に傾 小ネジを怖入し、 Tou
ghron
'Re
b
a
s
e(
三 木化学工業)で頭益金体を回定した(凶 23A)。
mまでの回復H与問 は
この日 併 のマワスは頭畿のJ
1
X
長が馨しいため 、手術から実験 使
1
2"
寺1丹とし
た。 また 、術後は 、38 wの白熱ナ1を約 50 Cm の 距凶tから照射し体温 をj，j~J<!j を図った. 脳波 の 訓11
定は、鉄網13:(
20x20x 1
0cm) の中で行い、双極?占憾の一方から単級誘導訟により記録した (
h
i
g
h
cu:
t2kH7
owc
u
l
:0
.
5J
Jz
)。 不￨
澗屯悔は、鉄網干苦 l
こb
産地した(この場合の双徳間の低抗は 1
4Mfl
1 l
であった)。動 物 を鉄網君主に移して 1I
均1
m以上の国i
I化時間の後に、脳波測定を l
)
f
1
始した。実験後
に vi
bratome (堂版イ ーヱム)を用い、 400pm_
)
享の新鮮1;I
J
片を作成し泡係の位置を確認した。
益基
r
pl
ioca
叩 IOC 投与 の'
x
(
.
) 5分後から媛綾が l
)l.祭された。鐙娘は、 凶肢の振販 を主症状とし、これに
筋問 f~が車なる jf~ で観察され(@ 21)、数1
1
寺
n
:
l
にわたる霊獄 発作に陥 る個 体 も見られた (
30伊I
L
J
J
1
71
[
1
;
).筋 I
:Ji¥;;の回数は、 pilocarpine投与後の 30分から 1I
時間が長大であり、 6時間後には消沈
23
第 4叢
5
A
海J
ll
I
l
領
口
LM 13t
f
1
m
ov1
5mm
CZコ司)
F由
(
伊
一
s0 5
E
{
巳
一
ω
一
苦旦 UZo一
00﹄
E
Eコ
Vehi
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e
• Nl
c
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r
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l
p
i
n
e
慢性鍵極を植え込んだマウス(14日 齢)
・0 Z
0
﹄
l宝
B
20mi
n
2h
r
a 8ase
l
同
一 」書
6h
r
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f
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l
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i
l
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e
n
tw
i
l
hp
l
l
o
c
a
r
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i
n
e
V酎lc
1
e
図 22 p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
e 誘発筋間代に対するnI回 r
d
ipineの効果 (1)
刑 囚 渇'
p
，
間 世与 2
0骨‘ 2時間 .6時間後か ら 叩 分 間 白 筋 m
山州山川酬i.l
I
tを 計徹 した. n向a ，d刷冊は 凶!恥a~詞ne 処冨 3 0 分間 に間与し
た. me
a
n乏 SE.
M ，n
叶 O
.
N
i
c
a
r
d
i
p
I
n
e
図23 p
i
l
o
回rpine投与後の脳波発作に対する町田 rdipine
の効果(ー)
州州州棚
A.副議定揖聞に慣性電極告植え込んだ 叫自酎由マウス.B.凶 臨a
r
p
l
n
e
段与嗣 (
a
】およ び投与 6
0分 証 (
0)田海臨脳波. N回曲師同!ま剛院 a
l
p
l間
担 置 担 分前 に揖与した.AP 吻 眉 司 .LM 外内側、DV 苛臨欄.
した。 院j 22 は、設与後各 l
時における筋 I
I
J代の
1
0
分あたりの回数を示している 。 Jli~ 肢 は 、 pil ocarp ine 投与 前 に観察されていた0放 が rì~ 失し 、 てん
かん発作u
.
y.の脳波の特徴である日出
品百幅徐絞および多厳波が観察された。 これらは発作間以}切 にも
認、められず。 pi
locarpine 投与
l時間後の海馬)
J
i
追放を幽 23B に示した。 m阻 rdipine を投与したマク
スでは、者下の車工絡が観察されたが、脳波および筋間代の回数に対照i
r
f
.のすクスとの差は観 察さ
れなかった(隠121、22). また 、if1獄発作の持続H
与
p
il
ocarpine
ω
(
1
F
6) であ り、何者に有意な王室は認めら れ なかっ
た.
凹)豆 町一言
(
、 AUO国
230.7土 22.
3分 (
me
剖吋
刊却却叩
J
，
'
l
]は、溶媒を前処ti1した i
咋で
S
.
E
.
M
.
.11"'6)、nicardipine前処世鮮で 25)_) 土 36.9分
ベコー 5a
l
i
n
e+v
e
t
Ji
d
e
ー
.
P
明ocaq>餅e
+
V
e
h
l
c
俊
一マー 50同e~ N捻...1凶ne
同 償 却 向e
+N刷 川i
p
i
1
e
苧
'
を投与した 7 ウスでは、体重 l
首j
川の遅
滞が観察された(図
1
0
24)。 これは n
icar
dipine の連 続
失し、行革J薬瑚試 験 を行った時点では各t
止に{本車差
3
0
4
0
5
0
P
o
s
t
nat
al
days
投与により影響 を受けなかった。 また 、この 体重期
)
J
J
Iの遅滞は
、 p
i
locar
p
i
ne 投与の約 3 週間後までに 消
2
0
図 24 p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
e投与による体重増加の遅滞
F
初 回a
r
p
l
n
e揖 与 群 で l
主体重田lIt加 が有置に直河野した
(
P
<O
.
0
1.
t
w
c
トw
ayANOVA) ~ mean主 S.
E
.M.n
=10.
は認められなかった。
アニメート試験
左盗
図
25A
に示した傑な二重同心円状の円筒形ケージ
1
l
lめ込んだ全
運動註を測定 したe ケージ墜に.t
AT-320
(東洋 産 業 ) の 中でマウスを欣ち
144側の赤外線検知 :
l
f
}
ーから 10Hzでサンプリングし、
マウスの運動 を評 価し た。!
I
l
i
J
物 を測定期のケージに移 して 5 分間の却
1
/
化の後、
30 分間の巡 l
i
J
:
h
l
を
、 水 平移動回数 、方向転換回数および立ち 上が り回数を術保 として測定した。立ち 上が り!
日数
I
立、ケー ジ氏より 65m mの高 さに設位 した検知総によって検出 した。
24
第 4章
盆盆
各i
作で運動 l
a
i
の差は認められなかった(図 25s)。
A
B
EコR . _
・圃・ H=~前"""""'"旋訓I
言。。﹄
acO
抑捌咽
E忍 τ~ O!l
002
図 25 p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
e てんかんマ
ウス における 自発運動量
s
ω首 "
・
Veh
一
一 一
一
一
;
軍
一
一
一
一
ー
ー
一
一
ー・
剛
広抱
，
内初"'"別
n
e
・
Vehtc
!
e
S&
ll
o
o
巴
A 実 睦 に 用 い た 装 置 の 僚略 国 . 単 位
mm.B，蓮 昌 向 で 由 立 ち よ が り 行 動 方
向転機行動および水平移動田各国散を 30
分間謝定した. m四 円 全 S.
E，
M n=10.
N
lcatC為的糧
一
・
N a
r
d
l
p
o
n
e P
I
I
e
民.."司自
モリスの水迷路試験
)
J
i
主
0
1
8-1
9 C の透明水を満 たした i
立符 680m mの内筒形の青色プラスチック製プーノレにi
夜径 1
0
0
1
1
1
1
1
1
の透明 なプラットフォームを壁面から 1
70m m縦して設位した(J苅 26A)
。試験は、vi
s
i
b
lepl
at
f
o
f
l
n
試行、6 日間の試験試行および probe試行の全 8 日間 (Day 0-7) の日程で行った。 なお、試験前
Q
⋮U
鐙泳により遊泳への掴1
1
化 をl
濁った。
日には 60秒間の自由 i
百
一
白
ブL ノレの縁ょにJ
l
主阿南北 (E，w
.S.N) の 90ofijに l
i
l
l
l定された 4点を遊泳開始位置 として川い、
遊泳 1)1]始 JI，\'にはマウスをプール~
にl
向けた 状 態 で 水 而 に 放 し た.
A
sehavi
orTracingAna
l
yze
rsTA2A
をj
刊いて遊泳の機子を 観察し 、プ
.5秒以上滞
ラ y トフォームヒに 0
宛したi
時点で、プラットフォーム
達したものと 判断した。各試
へ剣l
行では、遊泳を 開始し てからプラ
面
ットフォームに到達するまでの l
￨ の割合
必浴降、遊泳していた H寺悶
(遊泳 H祁l]率)および遊泳速度を
指僚として学習過程を ~1~価した。
;
h
川
;
;
じ
一
一:
遊旅I
J
者l
I
J
fは 90 秒 を上限 とし、出J
I
1
1
良時間内 にプラットフォームに到
達しなかった側体は、実験者の手
でプラッ トフォームへ誘導し、凶
借H
与を 90 l
昔
、とした。 また 、i
遊
遊1
泳後 1
;
)
:
<ウスをプラットフ 1 ーム
上に 60 秒間j
欣鐙し、 j
司凶を卜分
に観策させた。
vi
si
bl
epl
at
f
of
l
1
1試行 (
DayO)は
、
マクスの侃党および水 に対する嫌
j
U
陶
図 26 p
i
l
o
国 r
p
l
n
eてんかんマウスの水迷路学習障害に対する n
i
c
a
r
d
i
p
i
n
eの改善作用
A，ホ遺品訟轄に聞いた聾置由概略国.単位二mm
.8，回 i
b
l
l
時 (3)‘遊泳時間事 (
b
)
および逝泳速度 (
c
)即時間経過. p
i
l
o
c
a
r
p
i
四単独処置裂で学官過程の有意な量珊が田
泰され(P=
O.
0
179.加 。 w
a
yANOVA). これは n
同 国i
p
l
n
e白亜世でa
毎
週
摩 される傾向 を
示した (P=
O.
1235 同). C.Day3 に/5 1 する車泳軌陣田典型開 ~ O.p
f
'
O
t
抽担韓由結果.
m
e
a
n.
:
tS.
EM.n=1
0.
25
第
2章
i
l
!
?t
市
i
l
l
I
J
/J>正;干;であることを確認するための試験である。黒色プラットフォームを区 l
函陶 J
f
t CSW)
J心の水
の'
i
f
f
u1
二5mmに設 ;
aし、遊泳￨
刻始点 Eからマクスを遊泳させた。 試 験 制T C
Da
y1
6
)で
は無色プラットフォームを区￨阿 SW の水面下 5 mmに設位し、 1~1 4回の遊泳により 、7 ウスが
l
t
l位 i
丘を学習する過程 を観察した。各日の 4向の遊泳は 4つの遊泳
プラットブオームの絶対的安 I
開始点を各 1 @Jずつ{史)JJ し、遊泳開始点の使m 順位は連日 1!~作為に選択した。 probe 試行 (Day7
)
では、プラ
y
トフォームを副主サヂ、遊泳 I
J
f
l始点 Eからマウスを
9
0秒間自 s
lに遊，泳させ、各 4
区間 I
:
k
Jに居留した総1
守l
I
l
j
を測定した。
益基
v
i
si
b
1
ep
1
a
t
f
o
n
n試行では、各r.f.の遊泳の綴子に廷は見られなかつだが(図 26B.Day0
)、試験試
i
1
0c
a
中i
n
e処 i
u':マウスの'金 I
IiJ学習の獲得過程に務干ではあるが有意な遅滞が認められた(図
行で、 p
26B.)。試験試行 Da
yJまでの前半 3R聞は特に学習障害が顕著であ った.この￨
獄舎は n
i
c
a
r
d
i
p
i
n
e
の連続投与により改善される傾向を不した。また p
i
1
0
c
a
r
p川 eで処置していないマクスに n
i
c
a
r
d
i
p
i
ne
を設与しても、学習過程には影響が見られなかった。図 26Cに DayJにおける遊泳軌 跡の典型例
1
寺I
1
司率および遊泳速l
支の 2つの指標に群差は
を示した. ま た 、試験試行中に同時に記録した遊泳1
)oJ
泣終日に行った p
r
o
b
e試行では、各Il下に差は観察されなかった
観察されなかった(図 26Bb，c
(J:~126D) 。 なお、凪 26D では、区 11m SWがZ
式験試行中にプラットフ才 一ムを設 i
f
tした位置であ
る。
自発的岐路交管運動
左箆
関 27A に示す様な対称な 3/1>:の黒色アームからなる政身、f
状迷路内に 7 クA を放ち、その i
直後
からマクスが迷路内を探索する依子を 8分間観察した。迷路内では、マウスは作業記憶に，.IJ;づき
1~ 発的にア ーム選択するが、その選択順伎の機式は空間記憶の ー形 態として評耐1iすることが可能
であるけ 1
。アームには予め議日I
J
帯 号を附記し、実験者のみがそれを識別することができる。 i
坐続
した 3問のアーム選択の中で、各アームを 1@)ずつ選択する運動(向発的岐路交替運動)の達成
準を測定した。
盆
主
主
p
i
1
0
c
a
r
pi
n
c処位 7 ウスでは、自発的岐路交替運動率が有意に低下し、これは ni
c
a
r
d
i
p
i
n
eの
l
!
I
!
投
により改善された。また n
i
c
a
r
d
iー
A
p
i
n
e 単独投与による作用は認め
7B
8
)。なお、
られなかった(図 2
この試行で各アームの選択回数
の鮮差および選択昔話向は見られ
.
.
伽
.
V
'
"院 梅
・
脈
p掬 U'p
s
訓帽
，，~剖"納・
V
e
h
i
c N
c
，
・d仰
，1111 1-41
陸
四"側同
mmm
珂加凶。
・
-
(
b
)
.
.'P<O0
5v
s
.
S
a
h
n
e
φ
V
e
h
l
d
e，.P<O
.
0
5
時
P
i
k
回 r
p
i
n
e
+
V
e
h
凶e
，
A
N
O
V
A刷 l
o
w
e
d
b
y
.
E
.
M
.
.n
=
1
0
).
γ
u
k
e
v
'
sl
e
s
t(
m
e
a
nま S
Z2c 5昂る。z
A，自量的岐路交管運動時置穏に鳳いた珪
置の概略国.単位 m
m
.
.B.自発的岐措置
笹 運 動 的 割 合 (a) と各アー ム由選択回験
MW
図
b
27 p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
eてんかんマウ
スの自発的般路交香運動障害に対
する n
日 r
d
i
p
i
n
eの改善作用
;
(
l
HE
盟
1一
1一
i
・
・
圃
。
なかった(図 27Bb)
・・削除伺"'~・ S・
M・ P
i earp
・
"
SM
l
O
・
ー
v
同
・
1
・ Vll.
t
ll
C
均 N
，.
刷
.
附 . N回
，
創
刊
・
26
第 4章
ステップスルー試験
主盗
1
9I
I
l
r
i
符に床グI}"，ドを倣えた 2
i
i
l
l
式ステッフスノレ一学習主主位 M
odelP
A
M
I(
小j
京)を使月]した
(
凶 28^)。試験は学T
5
1
試行と試験試行の名 !日 づっ全 2 n
，rn
の日程で行った@学留試験で 1
1
:
<
ウユを I
Y
l室に入れ、 f
町
i
庭塀から 5 cm
の位置Eにある暗室内の検j，~l~tfを遮l析したHキに 11官室の床グリ
w
ッドに 36 V の屯圧を負荷した。 この嫌:i!¥取 置に反応しマウスが I
Y
I釜に回遊した l
時点でい苧習試験
を終了した。試験試行では、マウスを
r
m
主に入れ 3
00秒間放償し、'i1};庄の負術は行わなかった内
各試行では、陥に入れられた動物が検知1総を繊切るまでの時間(反応酬)を指標とした
た試験試行では 3
00秒以内 に動物が検知総を償切らなかった場合は反応潜l
特
J
ミ
3
0
0秒とした; な
お、各試行て寸土 1
1
)
主側に背を l
向けた状態で7 ウスを I
Y
1室に般した。
益基
学習試行では併差が見られなかったが、試験試行では p
i
l
oc
ar
p
i
ne処製マウスの反応潜時が有意
に短縮し、これは n
ic
a
r
d
i
p
i
n
eの述続投与で改千存された(図 28B)。 なお、 n
ic
ar
d
i
p
i
nel~rtt処位によ
る試験試行への~~轡は見られなかった 。
B
CJ'
働噌・柑困.
・
図 28
oSo伽 R・"相刷 ...
p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
eて ん か
んマウスの受動的回遊学習
隠忍拘恥帽開， 'N
幅削 d仰 喝
障害に対する n
i
c
a
r
d
i
p
i
n
eの
改善作用
畑田
21
(
u
E
)
E
C旦3
300f ・ 内四~.V'"岨
Day1
Day2
A， ス テ タ フ ス ル 詰揖 に 用 い
た裳置白線開箇.単位 m問 . 8，暗
室 に λ るまでの治時を測定した.
.P<O05v
sS
a
h
n
e
+
V
e
h
l
C
l
e
.'
P<O.
05
同 P
i
l田 a
r
p
i
n
eT
V
e
h
i
c
l
e
，A
NQVAr
o
'
.
1
0
愉
I
e
db
yT
U
k
e
y
'
St
e
s
l (mean 企
S.
E
.M .fi-'O)
.
組織化学的検討
左塗
行動試験が全て終了した後、各j符 71
&ずつを組織化学的検討に使用した。 マウスを塁側;
(
1
悦l
ヨし
立ちにl
I
i
1を摘出し、 ドライアイスを用いて急速に凍結した。これをー
15 .Cで 1
1
1
寺
市1
以上保
た後、 i
存した後、 OCTcompound (Mil
e
sLaboralory) をJ
'
I
J
いてステージに l
濁定し、 ー10からー
20.Cで保 l
l
u
l
したクリオスタツト(クリオカット 1800、プアイテック)を
mい
1
4 μm /.事の冠状切)!，-を作成し
1
1i
n をコーテイングしたスライドガラス(訟波ガラス)にtJ
J
片を l
砧殺し、室 t
l
f
i
.で 11
1
寺間
た。 albul
以上風乾した。これを 0
.
1M リン鮫緩衝液で 10分間
]
洗浄した後、 0，37% sodi
l
ll
1
1sul
f
i
deに授し (
40C、
1
5分間)、 l
直ちに 10% formalinで l
習定した (
4oC、 1
5分間 )
0f
l
I
び
、 0
.
1 M Vン酸緩首f
l
!
夜
1で洗伸
した後 (15分間、 2回
)
、 70 %、96% の希釈系列 ethanolでj
説イオンし (15分間、各 2回) 1
5分
以上風乾した。 その後、 1
.7% AgNO、
， 0.085% hydroquinoneおよび 20% ar
a
b
icgll
1
1を含有する
タエン飴緩衝溶液を J
Hいて、 26 Cで 50;
分間の遮光反応を行い、蒸!t{水で反応を停止した。対比
0
染色として Ni
s
sl染色を mいた。 malinol (武線化学)封入プレパラートを作成し、ゆH
日野顕微鏡
下で海馬の Timrn染色像の観察を行った。また同 H
寺に細胞密度の測定も行った。
27
第 4宣
盆塁
対照i
洋では、 CAJ野明 1
派層および的状回￨
吋 が Timm陽性であった(凶 29A，E)α p
il
ocar
p
i
oe処
償マウスでは、全ての例において CAJ野多彩細胞府が Ti
l
1
lI
T
I陽性となった(図 29F)。 また、全
7
f
自I
)
r
l
)2例では賞状!国内イJ
U
I分 子府
(
i
n
nerI
T
I
o
le
cu
larl
ayer
)もT
il
1
1I
T
I陽性 となるものが凡られた(図
29s)
。しかし 、これら貌象は n
ic
a
r
d
i
p
i
neを巡回処理したマウスでは全〈 観察されなかった (
1
主1
29D，
1
。
)
術状同!思j
j
喧
剰1
1
胞層、的状回門、 CA3野および CAIl
J
!
f
錐体細胞周の全 4 仰位の細胞総皮 を
百)
1
定
した。 p
i
lo回 叩lI1e 処 1
i
J
."
"
1
'ウスで前状回門の細胞が j
民荷主し ている {
鋲
向が見られた以外は、 i
洋差は見
られなかった (
図 30)。
Sal
t
n
e・
V
e
h
i
c
l
e
P，
I
白
:
;
ar
p
l問 令 V
e
h
i
d
e
Sal
l
n
e N同 柑i
p
i
n
e Pito国 『 問 問 .N，国 国 I
p
.
n
e
喝
DG
SG
A
図 29 p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
eてん
かんマウスにおける苔状
。
ML
線維発芽に対する ni
c
ar
d
i
p
i
n
eの 効 巣
S
折鮮2
車結帯馬切片 (
J
)T
I
m
m~金
色明檀野像. 対 比 粂 邑 と し て
Nl
s
s
l染色を行った.A・0 は睡状
回世創1
， EHは CA3野 由 師 分 館
大俄である .OG 筒状回‘ OH 曾
CA3
G
81
A
6ιB
笠且旦
H
』
ド
ー
C
一
一
42
E
EB8
円
守口
E
一星宮町口
円 長
64
，
・・
Eコ $aJln
e
'
"Ve
h
氾J
e
p
，回'"刷用...V
e
h
i
d
e
1
2
1S
a山穂...Nl
c
a
r
d
i
j
:
時
間
l<SOl同国a
刑問...N
i
田 r
d
i
p
ァ
:
;国
CA
状回円、 SG‘輯粒掴胞J!I. Mし
分子層. S
R:I
t
i踊 層 .S
し 明暗
層、S
p
.It体岨担局、 SO 多 形
幅胞層.
冊
F
図3 0 p
i
l
o
c
a
r
同n
e てんかんモデルにお
ける海馬細胞密度
Su
ヨt
u
mg
r
a
n
u
l
a
r
e
Den
t
a
l
eh
i
l
u
s
St
r
a
t
u
mp
y
r
a何時d
a
l
e
鯖粒細曲摺 (A).筒状回門 (8).CA3野または CA1
野鈍体細胞屠 (C) における待桂細胞の宙直. m
e
a
n企
S，
E.
M.
，
n=
7
.
LTP
左盗一一
行動試験が全て終了した後、各I
作 3匹ずつを電気生政学的検討に使用し た。マウ y、を額推ーI
既日
した後、 i直ちに J!自 を 摘出 し 、 02 : CO j95:5 を ìill 気した氷冷人工m通脊髄液 中 で約 2 分 IJlJ~先浄した。
瞬間後精子刊を
}
f
.
)
いてステージに固定した後、 v
i
b
r
a
l
Ol
1
1eで 300μm厚の水平
1
>
I
Jnを作成し海1
号体を
悩脊鎚脊髄f
夜中で 1
1
1
寺間以上の安定化1
1
寺I
f
)を姶き、実
摘出した。その後
、 32"C の同組 成の人工j
t
mした。 f
お状回頼粒制I
I
R
包腐を刺 激 し
、
験にも
CA3野 l
列
!
旅j
帝より誘発電伎を細胞外記録 した。誘発
dexci
l
a
t
o
r
ypo
s
t
s
yn
a
p
t
i
cp
o
t
c
n
t
i
a
l，
r
EPSP) の大きさが最大の半
泡伎は、興続性シナプス 後 電 位 (日el
分を与える 刺 激 強 度 (100400 μA) で記録し、これが十分に安定したと考えられる時点から 20
28
第 4章
分後に、テタヌス 刺泌 を J溜月l した。 テグヌス刺激は、最大の 厄"sr の大きさを与える刺激 1~ui[
(
500
800l
I
A) で
、 1
0
0Hz、 l秒間を 20秒￨尚附で 2凶与えることにより行った。 テタヌスr.l!
1
j
激の
適用後は厄 pSPの変化を 6
0分間 l
i
J
l
J
詰 した。記録中は誘発揚 i包イ立を随時デジタル変換した後、オ
詮大似きを算出し た。
フライン解智子により氾 rspのi
鼓翠
各鮮で記録された厄rspの傾き (
1
位
大の半分)は、対照併で 0.
5
2土 0.10V/
s
(
l
1
1e
a
n土 S
.
E
.M.，n=9
)、p
i
l
o
c
a巾 I
I
1C持
1
1
1
l処 i
丘併で 1
.03土 0.
1
1 V/
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一
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一
川
一ν
一
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同州!!;1み
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叫
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印刷 p
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!処 置j
l
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tで 0
.
5
2土 0.
07
V/
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8)、 p
i
l
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c
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巾 me お よ び
n
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i
pi
n
e共処i
注総で 0
.
7
0土 0.09V/
s
有 意 に 大 き な 偲rsr が記録された
i1 ￨ 悼
_曲_
1
目国 』
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A
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1
1
1
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・一一平司柑婦側
20
'0
した 7 ウスで!は立 口
L
.
TPが鋭察されなか
つた(t闘迦 3
引1
8人
)白これは、 さらに
も問機であった(図 31D)。 なお、
n
ic
ar
d
i
p
i
ne を 1
i
1狐処位した 7 ウスで
は じrp が lE~:~'ー に観察 Eされた(1羽 3 1 C) 。
剖
2
0
本研究では、文献値よりも低m哉の
pi
loca
巾川 e2
00mg
!
kgを適用した。こ
'0
60
.
.
i吋 'γつ'
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-"2 九~
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口.
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語
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れもたが (
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1
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neを投与
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e を連続投与したマクスで
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鮮 手ではテタヌス刺激に{
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巾i
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c
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一
一
，
(=6) であり、 p
i
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c
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n
e処世排で
叫栴》楠
2
0
20
60
l
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m
e
(
m
i
n
)
図 31 p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
eてんかんモデルにおける苔状線維CA3野
シナブスの L
T
P
AD の各図的上邸にテタヌス置問 (1)および適用 日 分後 (2)の臭型波形 を
示 した. グラフ田繍軸 l
まテタ又ス適用時から即時聞を‘縦軸 l
まテタヌス直前田
f
EP
S
P由帽ぎを基準とした相対値を示している.阿国n全 S
.E.M.
n
:
:
:
6
.
の用量でも全てのマクスに阪航およ
ぴ 筋r
::
H
;
:
¥
等の明瞭な発作を誘導することができた
J
1
0
1
。この発作は、 1
)疲蟻の1'、2
) 高仮幅徐被
および多練彼の脳波的t&祭、および 3
) これらの脳波が発作間 1
制現 にも観察されたことの 3点か
ら、比但的な p
i
l
o
car
p
i
n
e誘発控室鎮でありかつ似1
1
頭柴てんかん悠者の精神運動発作をよく筏倣して
いると与えられた 1
3
0
.1
九 た だ し 1) 屯一税発作に陥る割合が低かった、 2
) 慢性相の反復発作が観
'
.
主体動物に商用盆の p
i
l
o
c
a
r
p
i
n
eを投与した場合に観務される発作製との相具
祭されなかった等、 1
点も挙げられる。 1
) に際l
しては他報によると、成体では 8 割以上の動物で重続発作が観楽され
るが2:
8，
川、本研究では、 57% (
30例中 1
7例)であった。また、 2
) に￨
到 しては、同僚の!l!E報が
存在するものの 1
0
1
、J
)、2) いずれの差兵もその .
@
E
8は定かでない。考えられる可能性として 1
)
、
告2
)種
、3
)薬物の投与 J
T
I
l
i
f、等の相 i
をが挙げられる。ただし通常通りの 380mg
l
kgの p
i
l
o
c
a
r
p
i
ne
1
]申
29
第
.
4
霊
を投与した場合においても 200mglkgの場合と同係 t
t
成績が得られたため、 J
)1
;
1I~~な主主凶で
はないものと忠われる a なお、成 f
4
q
f
s
J
物の場合でW
E
tこ報告がある織に t司、本研究でも pilocarpi
ne
設与後与体重地!JII の遅滞が観然された。 しかし、投与後 3 迎 1m 限度で対照時との体illlf~はなくな
り、行革IJ占~Jlli試験 では 体の大きさによる影響を考 l包に入れる必要はないと思われた。
pi loC3rpine 誘発1!i!明日付る nJ四rdipine の前処f(lの~惨を検討したが、経鍛回数およびJli岩波上
で1
II
C
町d
i
p
i
n
eの影粋は観察されなかった。 d
i
hydropyr
i
d
i
ne系の1
樹立感受性 Ca2"チャネノレI
I
J
l
'
;
音
楽
は
抗1事務作用を示さないという報告は既にあり 111 1.1目、このことは、府長 ffifl，~ 切h~ における pl crOlOX II1
誘発てんかん傑発射が 山 町州 neによる影轡を受けなかったという第 2躍の結果によ っ九 支 持
される。
本研究における学習行動観祭では、水迷路試 験、自 発的岐路交幸子運動およびステップスノレ-;t;t
i
lo
c
a
r
pi
ne処世 7 ウスに記憶、学習能力の低下が観察された。水iA
験の全 3綴の試験において、 p
E
再試験 と自発的岐路交畿運!Jj}
J
は、共に宅 1
m学習試験 に属する試験 であるが、自発的 l
岐路交符運動
I
土作業記憶により遊行される試験であるのに対し山、水迷路試験は作業記憶と参!
J
日記憶の 2積の
空I
l記憶を手跡かりとして遂行されるものである
B
ヘ p
i
l配町1'l
I
1e処理により自発的岐路交砂j，Is
動の附が凡られたという制比このてんかんモデノレマクスでは作業記憶に呉市が生じたこと
を示している。 また、水迷路試験の Day 3以降は殆と'
学習附害が鋭需要されなかったことからも、
参照記憶ではなくむしろ作業記憶の隊舎が生じていることが示唆される ヘ
p
il
沢 町 mcに よ る 学 刑l
陪が、 1
)p
i
loc
町 四 によって誘引されたてんかんに起因したものなの
か
、 2
) pi locarpi nc の何か)]1) の作用 に依存した現象なのか、という点は ill~ な 問題である 。一般
的 円 、 コ リ ン 作 臓 は む し ろ 学 習 能 力 を 充 逃 す る と さ れ 叩3
、戸l
oc
抑 i
ncに!
品lしても短期 的に
向上させるとの報告がある吐 137。 すなわち、コリン作!W
J
J
i¥[としての o
i
lo
はヂ臼行動試験の成Mを1
吋 ineは今回の学習行動試験の結朱と逆の作加 を有 しており、さらに投与・スケジューノ
レおよび投
il
oca
巾t
ne の薬物 としての直接的な作
与抵の差を考慮すれば、本研究でみられた学習附
'
J
f
は
、 p
m
ではなく、 pi
lo問 中 meが誘発する発作を介した作用 であると忠われる。
J
とステップスノレ一試験 においては、p
il
o
c
a
r
p
i
n
e 処 世7 クスで生じる記憶、
向発的岐路交主主連!Jj}
学汚ド純子治{ni
ca
r
d
i
p
i
neの述紘投与により 抑制 され ることが示された。 水迷路試験では、 oi
c
a
r
di
p
i
n
e
の作月
]は傾向 のみであったが、これは 山
C叩
neの水迷際試験に対する作用自体が微弱であーた
ために 、有意な差が検出できなかったものと 判断 した e なお、p
i
l田 a巾 i
neや ni
c
a
r
d
i
p
i
neを処位し
たマウスで見 られたこれらの学智行動試験における遂行能力への影響は、
1
)アヱメート試験
水迷路試験における遊泳H寺問率および濫泳速度 、自発t'I'~ilJj占路交筏運動 におけるアームの選択回数
で1
作差が見/lJせなかったこと 、2
) 水迷路試験における vi
s
i
bl
ep
lat
f
orm 試行で併笈が見 られなか
i
J
;
1
T
Jモチベーションに差がなかっだと 解 釈 される)、
s
ったこと(視覚兵常および嫌泌刺激に対する t
3
)n
ic
a
r
d
i
p
i
ne l
t
i
.
d
虫投与併 には仰 れの試験 でも対j
梅鮮と 差が丸 られなかったことの 3 点から 純粋
こAーづくものであると考えられる。
な記憶
、 学習能力の変化 l
i
lo問 中 1
l
1eによる学習陣容が n
ic
ar
d
i
p
i
neをi
主役 したマクスで見られ4
以上の点を考慮すると、 p
かったという結果 l
土、てんかんによる 何 らかの後質的または機能的な変性を n
ic
ar
d
i
p
i
neが抑制し
患者ま
たことを示唆 している 。 そこで怨 定 される変性に￨
刻して盟主つかの検討を行った。 てんかんl
たはてんかんモデノレ動物において最もしばしば観察 される 中継神経系の機質的変性は、海馬予年状
線 維の異常発芽と
却
げ込山川、 i
f
i
j
馬神経翁1胞の脱落 (
h
i
p
poc
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1
1p
als
c
l
e
r
o
si
s
) である 1
3t これらの
1
1
30
第 4章
変1'j，は成f.j.動物を 11]1，、た p il o回 rpine てんかんモテツレでも1ì{~認l されているが 116、本.Qf:先では、未成
熟のマウスを
mいているため、同現象が今回のマウスで生じているかを検討した 。そのi古来、
p il oc釘p ll1e 処 i註俳 で、 討ìH~ 苔状線級 の N ;'活発芽が認められえが、神経細胞の狐著な l批終 I士 t.u綴さ
れなかった@ 後者に関しては既に報告があるものの刷、前指は、 ~J流動物の pi1 0c町pi nc てんかん
モデルにおいては初めての所見である。 異常発非は、小児てんかんや未成熟な動物でも生じるが
崎、
l
師、成体の場合に比ペててんかんに対するがI
性が高いと報告されている lヘ今回のてんかんモ
デノレでは、成体の場合と同線に苔状線純の呉常発芽が観察された。しかし、この氏一常発芳三は、 CA3
l
!
l'では全ての動物において観察されたが、前状厄i
では 7例中 2匹にしか観察されなかった。通常.
。
持状線維の兵(官発j.j'は、協状回によりしばしば見られる易象でめるため、この結果は興味深 b、
ただし、これが、 1
) 用いだ動物の l
ヨ齢に依存したものなのか、 2
) pi
1
0
c
a
r
pi
ne によるて んかんの
発作型の廷に起因したものなのかは不明である。なお、有立な廷は認められなかったが、 pl
io
c
a
r
pi
ne
処世マタスの t
4
f状回 I
J
Jにおいて、細胞密度が減少する傾向が児られた。 i
J
i
f状回門には多種の介在
神経がイf-(:
f
.
し 6、ある舗のやl
'
緩和l
胞は てんかんによって脱絡するこ とが示さ れている。 近年、筒
状l
司門の子干状細胞のj
見繕と苔状線維のJ
2
7
2
・発芽のf:)!
l
i
i
l
i
性が示唆されており
、今回の研究で
I
I
，
2UI
!lf状同門の神 経j
税務{
立、同 H
寺に観察された苔状線維の呉常発非との関連からはよく 一
観 察された i
致する。
f
E状線維の』主主<<.発芸l'が、てんかんによる産物なのか、てんかんの原因であるのかは、いまだ統
一的な見解は得られていない九少なくともこの現象が、てんかんまたはてんかんによる神経組
織の部分的 J
u
i峻により誘導されることは 6
在実であるが
川、その一方で、苔状線維の異常発芽
1
7
4
に1
]来した t
l
l
接的な反回性の!R!-1l5性入力回路の形成により海馬歯状回の!R!-密性が上昇し、てんか
ん原性に帯与していると他測している報告も多数存在1る目 IOR，17l，176 したがって、本研究で、苔
状線維の異常発芽が歯状回において十分に観察されなかったことと、 p
i
loca
r
p
i
ne による車税発作
Q
や傑性杭!の渡僚が見られなかったこととの囚巣関係は双方に解釈され議論は困難である e しかし
重品~ーなことは、 liff状I凶で苔状線維の発芽が見られた2f日l の動物は伊Tれも、他の動物と比較して学
習隙宮が重度であったという点である。 さらに、 n
ica
r
d
i
p
i
neが p
i
lo
c
a
r
pi
neによる学留障害と答状
線維の異常発芽の何者を共に抑制l したことも IJH士て考えると、 7 クスの学習能力と呉~;f~'発芽の関
係が強く示唆される.これまでに苔状線維の異常発芽と学習能力の中自民i
は弘、ど議論されておらず、
この意味で今回の結果は重要な側面l
を有していると思われる。 しかし銭念ながら、今凶の研究で
は動物の例数が十分でないこともあり、慾慾の!fV夏、苔状線対t
の災 1
;
t
発芳三の程度および学習降筈
の筏ocの 3 者の十U[却をより深〈論じることはできな~\これらを解明することは.今後のこの分
野における最も重要な課題の 1つである。
海i 馬じfP は、記憶、学習の基伎をなすシナプス可 ~l性の 11111 として士n られている山側 107. LTP
にj
付するてんかん発作の影響に関しては幾つかの背反する報告があり、統一的な見解が得られて
いないものの、木研究では、 p
i
loc
町p
i
ne を処世したマウスにおいて首状線維ー CA3 盟f
シナプス伝
達 の じrp は鋭祭されなかった。 てんかん後発射自体がLTP を誘導するという報告を考I
位すると
刀
、 pl
ioca
r
p
ineを処置したマウスでは、てんかんまたは泉?話発芽 r
l
l
来の過剰な神経活動により、
H
L
TPの機怖が既に飽和していた可能性がある明川由。実際に、 p
i
lo
c
a
r
p
in
e処目立マクスの海鳥から
i
lo
c
a
r
p
i
nc処 r
tマウスの CA3
記録されたfEPSPが、対照俳よりも有意に大きかったことからも、 p
野では長 J
o
J地強i
が先砲ーしていた可能性が支持される。 p
i
l侃 ar
p
inc処置による LTP形成の障害は、
3サ
第 4章
川c
a
r
d
i
p
i
n
c
では改返されなかった。 n
i
c
a
r
d
i
p
i
n
cは p
il
o回 巾lI1e による学習 l
滋容を改淫したためこの
~'i1i~ はー凡」手一周する 。 1 ) 務状線維ーCAJ 野シナプ只以外のじrp が何らかの彩縛を受けている、 2)
近年様んに議論される傑に、 I
汀 P はそもそも記憶、学習の)0¥;磁機十時ではない22.
7
9
.
8
9、などの説明
il
o
c
a
r
p
i
n
c による学習院 '
d
fを n
ic
ar
d
i
p
i
n
e
が可能であろうが、本研究の結果から砕かれる結論は、 p
が改善する作m は苔状線維ーCA3 野口P を介していな~ "という点のみである 。
山
c
ar
di
p
i
n
eは p
i
l
o
c
a
叩i
ne誘発発作には彩電車を与えなかったが、発作の後遺l
iEと与えられる学習
111~'，'干と持J伏訴lt~~の~I\常発芽を拘J(f，iJした。 本 TE の主要な目的 l士、てんかんの後泣症を生じる実験系
をl
確立し、更にこの実験系で有効な袋物を探すことにある。そして n
i
ca
r
d
i
pi
n
eがその薬物として
良い候補となることを見出した。現在のてんかん治療は、てんかん白体の抑制 に主1良が泣かれて
いる。もち ろん、てんかんを抑制することが可能である場合は、これが最良の手段である。 しか
し、てんかんの発生を薬物によって制御できない場合には、てんかんによる後泣症を予防すると
いう 2次的な考え方が必要である e 実際に、 1
)現在のてんかんの薬物治療による炎効率は 50%
u
未満と極めて低く2.
M8.11
1、しかも、 2
) 生後 間もない l
時期は興需E
性と抑制 や
j
J緩系の均衡が変遜す
るため列、
冊目、この l
時期にてんかんの危険率が上昇するのは避けられない円刷、といった理由か
ら、てんかん自 体の抑制より も、てんかんによる 副次的な l
憶害を抑制しなければならないという
臨床的要求が現実には多いと，思われる。 しかし現住のてんかん研究は、てんかんの抑制、治癒に
多くの努力がなされているにも関わらず、てんかん忠者の予後に注意が払われることは少ないよ
うに思える。この意味で、 てんかんの近袈な後遺症の lっ として認知、記憶防筈を取り上げ、こ
れを後J誌に再現できる実験系を確立した本研究の，~~査は大きいと考えている。さらに、この実験
系を)j]い n
i
c
ar
d
i
p
i
n
eが有効であることを見出 した。 ni
c
a
r
d
i
pi
neには抗てんかん作用こそないもの
の、問先E
を臨床応用する意味は少なからずあると思われる。今後、本研究が基礎となりてんかん
研究に新たな光明が扮J
かれることに期待している。
32
第 5章
第 5章
さし、ごに
なぜ海馬苔状線維なのか?
m l 1iéで言及した様に、昔、状線維は{也の中~神経系には見られない特性を示すロ 特にØ~ !，必 と の
￨
刻.i!ff性に関しては占くから議論されており 、本研究でも七日民を置い てきた。 しかし、なぜ卦'状線
f
究を行う l
こで:官:f.号する
維だけに こ うした現象が観察されるのであろうかe これは、今凶の傑なイ!l
m 本 1'11疑問 で あり、中継神経系の機能や疾患を巨視的に掌保する |二 で解決 tされる必姿のある I~題
でもある。 しかしながら、現H
寺点ではこの I
I
Jに刻する満足のいく回答は得られていない。近年、
n
Dudckらは岨、 この疑問に対し興味深い提言 をしている。契約すれば「他のや何日 織とは撲なり、
苔状紙側主には τImm染色という選択的な染色泌が存権する。 すなわら苔状線維は比 l校的容易に研
主ー
;
f のj
脳部位であり、てんかん等では尚日号の全ての部{立に病変が生じているのであろう
究可能な I
が、われわれ研究者には苔状線維の研究のみしか許されていなし、 j という考えである。 これは部
Eしいと思われる 。実際にてんかんの研究で、 CAl'
lf
の変性に I
刻する報告例も多少では
分的には i
1
1 また、第 2!
1
f
で1
9
1らかにした織に、てんかん機条件
あるがイf-(tする 1
Fで重篤な￨
賄容を受ける
c
h
a
f
f
e
rイ
W
J枝でも問機であった。 しかし、 i
誌
のは形成中の総純であり、 これは主主状線維に￨恨らず S
も
亘
l
l
l
!
な こと は
、 S
ch
a
汀c
rイ
m
l伎などの苔状線維以外の神経線維は、胎生，U
}
Jに既にその j形成を完了
i:にお「して I
量も高い感受性を示す過程が「発達過程 J
して いる という事実である。てんかん綴の!l1lJ
というこ とであれば、生後に形成される者状線縦が生後♀J
1
(
J
に頻発するてんかんの影響を最も受
け易いことは自明である 。 したがって、てんかんで幸子状線維の可塑性がしばしば取り上げられる
理的 i士 、子干状線維が~易な研究対象となるということではなく、脊状級14主の形成 11寺jl}1 が生後であ
るという)，¥{にある と考えられる。寸す占なわち、 これまでの疑H
附司の J
諭論首命}点は「なぜ苔状紙ぽi
札主は生?後圭に 1
形
隊
成
f￡されるのカか、リ」 という点に集集-約されると 忠
j
巴
の利 点
J訳は{何可でめろうか。 これへの回答は逆に、 一般的な神総組織はどうして胎生J
1
t
1
に形成される
のかという疑問にもつながる。神経系は言うまでもなく生命の維持に必須な恨滅的活動を管腿す
る仮~な組織である 。 そして、この規矩は個体の生涯を逝じて ü微寸る不変の基礎規段である 。
逆に、この制御機桃の崩壊は個体の終駕への危機を示顕している。 この崩壊を生じないために、
中継制t経系 f;t可塑11'や再生を認可しない ~ lðIたる椛造を持続する必1&'がある 。 これが中4穏やl'経系
が1
台生J
1
(1
に形成される理由であると考えられる. これにより誕生時に術祭されていた神経構成は
死ぬまで保持されるのである. これこそが生命維持のために生体が採用 した最良の手段であった
のであろう 。 しかし、これだけでは生命の維持は閤嫌である。生体がより延命するためには外界
への遮応能力を例せ持つ必要がある ω 臨機応変に外界の変化に適応するとと、換言すれば認知
学習ー記憶一変成という行為、このために必婆な性質こそが可知性である。 可&t!性は生理学 t
'
t
J可
塑性と構 造学的可塑性に分類されるが、生体は生命維持のためにこうした可塑性という特性も 一
方で必要とした。 神経組織が仮性と可塑性という相反する阿現象を共有してし、るのは、まさにそ
うした理山が級幹にあるのであろう . ここで鼠婆なことは、生体制御の変容を，意味するこの可塑
性という性質は一方で、
1
M絢l機備の脳級すなわち生体機能l
障害(疾患)という f
t
I
.
始と隣接してい
るという点である 。 この危険性を長小!
I
良にJ
l
i
J
備するために生体が採用した手段は、可F
担性を与え
る神経組織を限局するという方法である。 古くから記憶、学習に重要な脳部位であるとされてい
33
第
5章
る打'(iJ渇で "H型性という現象が極めて屡次に観察されるということは、海X!~ こそが選ばれた神経組
縦であることを示している 。 なかでも詫状線維に比られる "1理H'I:は蹄r~: である 。そ して、この線
維だけが ~1::i;去に形成されるJ1I! r1 H立、より rf!j 炊 の可年!伎を与えるためなのであろう。
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般に形成さ
れた直後の線維は高い可盟仙を示すし、なによりも、生後に次有と形成させることで村総l
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神経であるにも関わらず例
外的に然髄申1
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1である。ミエリン押i
は可潮位や再生の妨締になることを考慮すれば
3.
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1
索
であるという点は高度な司湖性を発現するために傾めてイ苦手1に作用すると脅える。この傑に 5
主体
は、苔状線維というやl
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レベルに肢も近い村1総組織となってしまった。 E5状線~4f， 1こは、疾患としづ危険因子を代償として、
高次な司勉性を支持するための分子機材i
が施与されている。 これが本文節のl
最初で行った問いか
けへの回答であると考えている 切
小児てんかんの後遺症について
てんかんは比較的良好な予後を示す疾患として知られているが、Y，i
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Iにてんかんを発した場
合には i
立鰐な後 i
世症を生じる危険率が飛脳的に上昇する 。一方、てんかんの発症率 l
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に向上し、したがって、てんかんの後遺症が問題になる臨床例は相当数に昇る。てんかんの後遺
泌としては様々なものが炊挙されるが、とりわけ、認知障害、学管障害といった脳同次機能1
1
章宏:
が j註も問題脱されている 。 臨床からの報告によると、小児てんかんの数 ~
I O%程度はそ うした後
出:tEを生じているし、 一方で、知的l
障害者の 3割弱が、 ;
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ii:しているという 。
これら数似は、てんかんの後 i
立疲が問題 となるケースの多さを物議っている e 一方、 小児てんか
んの慢性化も軍要な問題である.成年のてんかん、特に)
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切に発
症したてんかんが慢性化した結巣であると考えられている。しかしがなら、歓迎されざるこれら
の予後に対する臨床的対処法は、銭念ながら未だ十分に確立されていなし、。こ れには、後遺症の
発生偽情が卜分に解明i
されていないため対処が I
dS縦であるという理由もあるが、そもそも、てん
かん自体の発徒機作でさえやl
然としないため、これまでのてんかん研究が、てんかんそのもの、
あるいはその治療といったレベノレにしか焦点が当ててきていないということが機底にある。て ん
かんの治療が完全に行われれば、当然後遺症への中日憂も必~なく、最良の対処法となるであろう 。
しかし、現従のてんかん治療法は米だ完全ではなく、その奏功率は 50%以 fであり、いわゆる
襲撃治性てんかんの;則合が少なくない. しかも、幼少W
Iにてんかんの発症率がヒ男ーすることは、基
本的に脳の発注過程上避けられない。 こうした現状下では、てんかんを抑制することよりも、て
んかんにより生じる副次的な紡糸にもっと日を向ける必要性があるのではなかろうか。てんかん
を抑制できない場合は、てんかんによる後遺症を制御するという考え方こそが、現在の臨床で要
求される対応法であると思われる。本研究では、この視点のもとに研究を行い、てんかルの後遺
絞または慢性化の機併が.海馬の発達奥常に基づくという可能性を提唱した。これが契機となり、
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する研究がより感んに行われることを期待する 。
L型 Ca2+チャネル阻害薬について
2
本研究で、 L盈Ca
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害薬が、てんかん発作(発射)による車1
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34
第 5章
抑制することを示した。しかし、 1
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とした n
い。 本研究は、雄治性てんかんでは後泣佐の予防に着服する必要があるという観点によtづいて行
ってきたが、 ~I然に臨床応m を考lI\t寸る場合は、他の L 1
QCa"チャネノレ閉じ!;:薬の様に抗てんかん
作用 合併行する薬物の方が、てんかん発作の抑制 と後追症の予防という 2震の仰￨
而が期待される
ためより好ま しいと~・えられる。さらに重要なことは、第 2 市および第 4 市の î，;liJlーからも IJIl らか
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Jl害薬は部分的にしか弱J
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たが、より多くの薬物をスクリ ーニングすれば同薬よ円も迎合性の尚い薬物を見出すことが可能
でめろう。そのためにも、本研究において確立された第 2~4 なの全 3 般の笑験系は有用なス-7
リーニング系を従供するものと忠われる a
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参考文献
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夫教授をはじめ蔚藤洋名誉教授、西山信女子助手、阿部和総助手、香月隙芯助
手の御指導、御鞭縫に心より感謝致します。
博士研究にあたり終始暖かな励ましと御協力を頂きました薬品作用学教室の皆織に
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