エストラジオール-17β 投与によるウミネコ血中ビテロジェニンの動態

Title
エストラジオール-17β投与によるウミネコ血中ビテロジ
ェニンの動態
Author(s)
盛田, 祐加; 中田, 聖子; 藤田, 真紀子; 小城, 春雄; 原, 彰彦
Citation
北海道大学水産科学研究彙報 = BULLETIN OF
FISHERIES SCIENCES, HOKKAIDO UNIVERSITY, 54(12): 21-28
Issue Date
2003-07
DOI
Doc URL
http://hdl.handle.net/2115/21980
Right
Type
bulletin
Additional
Information
File
Information
54(1_2)_P21-28.pdf
Instructions for use
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
北大水産業報
5
4
(
1/
2
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2
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エストラジオール1
7
β 投与によるウミネコ血中ビテロジェニンの動態
盛 田 祐 加1) ・ 中 田 聖 子 1) ・ 藤 田 真 紀 子 2) ・ 小 城 春 雄 1) ・原
彰彦2)
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7
)やセグロカモメの甲状腺異
の性比の変化 (
常 (Moωiae
ta
，
.
l1
9
8
6
) など海鳥に関する報告がある。高
緒 言
次栄養動物である海鳥類は食物連鎖の上位に位置し，生物
近年，環境汚染問題の lつとして化学物質による生物の
内分泌機能の撹乱が取り上げられ，人や野生生物への影響
が危慎されている。この外因性内分泌撹乱化学物質(環境
ホルモン)の作用による現象として，雄ニジマス O
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加の雌化 (
H
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，
.
l 1
9
9
7
)，雄ワニ
hynchus myk
濃縮を受け最も高濃度の化学物質の蓄積が起こると考えら
れる。さらにカモメ類はエストロジェン作用に高い感受性
を示し，エストロジェン樹乍用を持つ催奇形物質に対して
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s gaUusやニホンウズラ C
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初等，他の鳥類より 1
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7
)。これらのことから，カモメ類が環
れる (
1
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9
6
)，生殖障害が原因と考えられるゼニガタアザラシ
Phoca v
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.
肋 aの個体数激減(&吋 n
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s，1
9
8
6
) など野生生
境汚染の指標生物として有効であることか守佐測される。
一方，魚類において環境エストロジェン(エストロジェ
ン作用を持つ環境ホルモン)の影響を評価する上で有効な
指標蛋白質としてビテロジェニン (
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)が注
目されている。 Vgは卵生脊椎動物において，エストラジ
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1
7
β ，E2) の作用のもと肝臓におい
オールー 17β(
物における生殖機能異常，生殖行動異常等が報告されてい
る。これらの現象は貝類，魚類，~中類および晴乳類など
広範囲に及んでおり，主に水棲生物や水辺に生息している
生物で起こっている。鳥類においては，オオセグロカモメ
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sおよびセグロカモメ Larus a
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北海道大学大学院水産科学研究科資源生態学講座
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)
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) 北海道大学大学院水産科学研究科生命機能学講座
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1
)
2
1ー
∞
北大水産業報臼(1/
2
)，2 3
.
て合成され，血液中に分泌される卵黄蛋白前駆物質であ
る。血流を介して卵母細胞に運ばれた Vgは，一般に卵黄蛋
白質のリポピテリン(l
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) とホスビチン
(
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n，Pv)に分子解裂する (
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)。最近，ニワトリにおいて YGP40(
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質が報告された (Yamamurae
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.，1
9
9
5
)。一方，魚類では
Lv
，Pvに加え，硬骨魚類に特有な存在である β，
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omponent
が知られている (
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.，
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)。本来， Vgは卵
マーケットで購入し，卵黄を抽出して使用した。
抗血青
家兎抗チョウザメ(ベステル H
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omponent血清 (
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ベステル β')，抗ベステル
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)β，
Vg血清 (
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ベステル Vg)，雄血清で吸収した抗エゾメバ
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)雌血清 (
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エゾメバル FS)，抗
g
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) は，先に作製
エゾメバル卵抽出液血清(ルエゾメバル e
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，
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∞匂)ものを使用し
した(原ら， 1
とにより合成か誘導される。即ち，雄動物に Vgが検出され
た
。
また，家兎抗ウミネコ Lv血清は精製 Lv を等量の
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t と混合し， 1週間隔で 4回家兎
ることは，環境中のエストロジェン様作用を有する化学物
質，環境エストロジェンに曝されていることを示唆する。
に免疫することにより作製した。この抗血清を等量のウミ
ネコ雄血竣で吸収し，抗ウミネコ Lv血清 (
a
g
L
v
) とし
これまで鳥類において Vgをバイオマーカーとし，環境
汚染の影響を評価している報告はほとんどない。 Vgを指標
蛋白として用いるためには対象種の Vgに関する基礎的知
見を得ることが必要である。しかしながら，鳥類において
血中 Vg量の動態は，ニワトリ，ウズラ，アヒルなどの家禽
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類においての報告 (
andRobinson
，1
9
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2
;Gschwendte
ta
，
.
l1
9
8
2
) のみで，野生
た。抗血清は使用するまで -30Cで保存した。
黄形成期の雌血中にのみ特異的に出現するが，通常これを
合成しない雄動物においてもエストロジェン処理を行うこ
鳥類への E2処理による Vgの誘導性および Vgと卵黄蛋
白に関する詳細な知見は得られてない。本研究では，カモ
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sを対象種とし Vg
メ類の一種ウミネコ L
0
カラムクロマ卜グラフィー
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aFPLCシステムによるゲル渡過法は S
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6HR1
0
/
3
0カラムを用い， O
.
位 MT
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C
1緩径市丸 pH8.0
(
2
% NaC1，0.
1
%NaN3含有)てす容出した。操作は室温で行
.
5ml
/minでチューブあたり 0.5m1づっ分取
い，流速は 0
した。
2
.
5x20cm
，B
i
c
トR
ad)
ハイドロキシノレアノ fタイトカラム (
に関する基礎知見を得ることを目的として， Vgの構成成分
を用いた吸着クロマトグラフィーには H
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(Na
悶 1
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) を用いた。リン酸カリウム緩衝液，
である卵黄蛋白の主成分 Lvの精製および Lvに対する特
pH6
.
8 (KP) を用いたステップワイズ法により 0.
2M，
0.
4
異抗血清の作製を行った。さらに作製した抗血清を用いて
Vgの免疫測定法を確立し， E2投与に伴う血禁中の Vg量
M，
0
.
6M，
0
.
8M およびl.2M KPを用い溶出を行った。流
/hとして 4Tで行った。
速は4Oml
の変動を観察した。
材料と方法
試料
実験に用いたウミネコは，北海道利尻島に生息する繁殖
9
9
8年 6月 1
4
-1
9日 (
2
2個体)
期の雌雄成鳥を用いた。 1
および 1999 年 5 月 25~27 日 (9 個体)に捕獲した全 31 個
体より翼部血管から血液を採取した。卵は， 1
9
9
8年 6月お
9
9
9年 5月に同場所で採集した受精卵を用いた。
よび 1
E2投与実験は， 1
9
9
9年に捕獲した雄成鳥 1
0個体(平均
体重 5
21
.5:
t20.
5g
)を用い， p
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1に溶解した E2
を0
.
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2
)，0
.
5(
n
=
2
)，5(
n
=
3
)，5
0(
n
=
3
)mg/kg体重
(BW) の濃度で筋肉注射により l回投与した。投与直前 (
0
時間)および投与 1
8，
2
4
，
4
8時間後に翼部血管より約 0
.
5
m1ずつ部分採血を行った後， 60時間後に頚動脈より全採
血をした。
血液は抗凝固剤 (EDTA
・
2Na) を用いて採血し，得られ
た血液を 3
，側 rpm
，
2
0分間遠心分離して血祭を得た。血媛
および卵は分析するまで -30Cで保存した。
0
ニワトリおよびニホンウズラの未受精卵はスーパー
免疫学的手法及び電気泳動法
M
a
n
c
i
n
i法)による血中
寒天内一元放射免疫拡散法 (
Vg量の測定は Mancini e
t a
l
.(
19
6
5
) の方法に従った。
0
.
9
%NaC1 (
0
.
1
%NaN
%にな
3含有)溶液にアガロースを 1
6C とし， a
g
L
vを 0
.
7
5
%加え
るように加え，加熱溶解後 5
0
たゲルプレートを作製した。このゲルプレートに試料添加
用の w
e
l
lを作製後，標準液 (Lv濃度 2
5，
5
0
，1
∞，
2
∞
，4
∞
μg/m1) を 5μl添加し，室温で 4
8時間反応させた。反応後，
0
.
9
%Na
Clによる洗浄を繰り返した後，プレートを乾燥さ
1
せ
， 7%酢酸に溶解した 1%Amidob
1
a
c
kl
O
B溶液にて染色
を施し， 7%酢酸で脱色を行った。 Vg濃度は精製 Lvの標準
O
u
c
h
t
e
r
l
o
n
y
直線より算出した。寒天内二元免疫拡散法 (
法)および免疫電気泳動法 (IEP法)は常法に従った。
Sodiumd
o
d
e
c
y
1s
u
1
f
a
t
e(SDS) ポリアクリルアミドゲル
(
p
o
1
y
a
c
r
y
1
a
m
i
d
eg
e
l
)電気泳動 (SDS-PAGE法)は，濃度勾
配スラプゲノレ (5~22.5%) および均一スラプゲル (7.5%)
を用いた T
r
i
s緩衝液系による Laemm1i (
19
7
0
) の方法に
i
r
a
i(
19
7
8
) に準じ，試料に
従った。試料は， Hara and H
2
m
e
r
c
a
p
t
o
e
t
h
a
n
o
1および SDSをそれぞれ 1%になるよう
∞℃で 2分間処理した。染色には判%エタノー
に添加後， 1
0%酢酸の混合溶液に溶解した 0.
1
% Coomassie b
r
i
1
ル
， 1
22 -
盛田ら
E，投与によるウ ミネコ血中ピテロジェニンの動態
l
i
a
n
tb
l
u
eR-250溶液を用い，脱色は 2
0%エタノール，5
%酢
酸，2
.
5%グリセロールの混合液で行った。分子量マーカー
(Amer
s
ham Phar
m
a
c
i
aB
i
o
t
e
c
h，
Sweden) は Low mo
l
配 u
l
e
r
Lvの精製
markerとして ， a
l
a
c
t
a
l
b
u
m
i
n(
14.
4kDa)，t
r
y
ps
i
ni
n
h
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b
i
t
o
r
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r
b
o
n
i
c anhydra
se(
3
0kDa)， ovalbumin (
4
3
(
2
0
.
1kDa
)，c
す。精製には 1
9
9
8年 6月に採取した受精卵の卵黄を用い
た。約 50gの卵黄に 1
0倍量 (v/w)の 0.
0
2M T
r
i
sHCl緩
kDa)，albumin (
6
7kDa) および phos
p
h
o
r
y
l
a
s
eb (
9
4kDa)
衝液，pH8
.
0(2%NaCl，
0.
1
%NaN3含有)を加え，ミキサー
を用い，Highmol
e
c
u
l
e
rmakerとして ，
l
a
c
t
a
t
ede
hy
d
r
o
g
e
na
s
e
およびガラスホモジナイザーを用いて卵黄蛋白を 抽出 し
た
。 抽出液は 4C中で 1
5
，
α泊 中m，30分間の遠心分離を行
c
at
al
a
s
e(
6
0kDa)，
albumin (
6
7kDa)，
f
e
r
r
i
t
i
n(
2
2
0
(
3
6kDa)，
ウミネコ卵抽出液からの Lv精製の概略を Fig.
2に示
0
kDa
，1
8.
5kDa) お よ び t
h
y
r
ogl
o
b
u
l
i
n(
3
3
0kDa
)を用い
い，上清を卵抽出液 とした。卵抽出液 5
0mlを高純水で l娩
たo We
st
er
nb
lotは Kwone
ta
.
l(
1
9
9
0
) の方法に準じた。一
次抗体 として抗魚類血清は 1
:1
，
側 ，a
gLvは 1
:1
6，
仰 の
透析した後，遠心分離して得られた沈澱物を水沈澱分画と
した。沈澱分画を上記の T
r
is
-HCl緩衝液で溶解し， 0.
2M
希釈で行った。
KP (
pH6
.
8
) に l晩透析後，ハイドロキシルアパタイトカ
ラムに供した (
F
i
g.3A)
。これらの溶出分画を SDS-PAGE
により解析した結果， 0.
4M 溶出分画に卵抽出液のメイン
結 果
バンドと一致する顕著なバンドが観察され，a
エゾメバル
e
g
g を用いた O
u
c
h
t
e
r
l
o
n
y法において l本の沈降線が認
抗 鰍馳 清による ウミ ネコ Vgの検索
められた。 0.
4M KP溶出分画を Superos
e6カラムに添加し
ウミネコ Lvの精製に際して， ウミネコ雌血竣および卵
抽出液と免疫交叉性を示す抗血清の検 索を Ouchterlony
法および W田 t
e
r
nbl
o
tにより行った。 a
エゾメバル e
g
gを
た結果，2つの主要なピークが観察された (
F
i
g.
3
B
)
。第 2
用いた Ouc
h
t
e
r
lony法においてウミネコの雌血竣，E，処
た l kDaのバンドと同位置に泳動されたととから (
d
a
t
a
，処理血竣)および卵抽出液に対し
理した雄血竣 (以下 E
てj
;
本の沈降線が観察された (
F
i
g
.1
)
。また ，We
s
t
e
r
nb
l
o
t
n
o
ts
hown)，ウミネコ Lvと同定し， このピークを精製 Lv
においても ，雌血竣， E，処理血祭中に高分子蛋白のバンド
および卵抽出液中のメイン蛋白が染色された (
dat
a n
o
t
ピークの分子量は 280kDaと算 出 された。この分画の
SDS-PAGEにおげるメインバンドは，卵抽出液で観察され
∞
とした。
shown)
。しかしながら ，a
ベステル β，a
ベステル Vgお
抗血清の検討
a
gLvの特異性を Ouch
t
e
r
l
o
n
y法 お よ び IEP法により
よび a
-ェゾメバル FSは， ウミネコ 血禁中 の Vg様蛋白を
行った (
F
i
g
.4
)0a
gLvは雌血祭および卵抽出液に対しての
明確に認める特異的な反応は観察されなかった。
みそれぞれ一本の沈降線を形成し，雄血祭とは全く反応し
なかった。同様に We
s
t
e
r
nb
l
o
tにおいても a
g
L
vは雄血祭
半
ァ
…
勾
剖
Eggextracts
nstD W
Pp
t
.
Sup.
0
.
2
0.
4
0
.
6
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.
8
1
.
2M KP(pH6.
8)
Lv
F
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g
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とは反応せず，雌血竣および卵抽出液にのみバンドが観察
F
i
g
.5
)
0
2
2
0kDaのバンドは雌血禁中のみに特異的
された (
であること，および高分子量であることより Vgであると
同定した。
E2 投与によるウミネコ血援の変化
5mg/kgB Wで E2処理した雄個体の血襲の経時的変化
l
o
tにより
を SDS-PAGEおよびかgLvを用いた Westernb
解析した (
F
i
g
.6
)
0SDS-P
AGEにおいて， E2処理血祭には
(
0
時間)に見られないバンドが多数
コントロール雄血竣
l
o
t
観察され，これらのバンドはかgLvを用いた Westernb
において特異的に検出された。 E2処理血祭には主に 2本の
，
a 110kDa) が観察され，そ
メインバンド(分子量 220kD
のうち 220kDaのバンドは E2投与 1
8時間後から検出さ
OkDa
れはじめ，時間経過に伴い濃く染色された。一方， Il
のバンドも同様 E2投与 1
8時間後から検出されたが，経時
- 24-
盛田ら
E，投与によるウミネコ血中ピテロジェニンの動態
MFE
A
M FE
~220kDa
4
・
100kDa
B
a
A
B
F
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g
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M: mal
epl
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的に減少する傾向が見られた。他の E，処理群 (
0
.
0
5mg
，
0.
5
mgおよび 5
0mg
/kg BW) でも同様の結果が得られたが，
0
.
0
5mgと 0
.
5mg
/kgB WE，投与群では 24時間以降にメイ
d
a
t
an
o
tshown)
。
ンバン ドが観察された (
Lv濃度既知の卵抽出液を標
血築中の Vg量の測定は
準蛋白とした Mancini法により行った。 確立した Mancini
∞
法において ，Lv濃度 25μg/ml
-4 μg
/mlの範囲で直線的
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L
v
)
ウミネコ Lvの精製はニワトリ Lvに用いられたハイド
なスタンダー ドカープが得られ， これをもとに血竣 Vg量
を Lv量相 当量 (mg/ml equival
e
n
tt
oL
v
) として算出 し
r
ロキシルアパタイトカラムによりf'った (Bernardi and
9
6
0
)。ウミネコ Lvの分子量は，ゲル滅過で 280kDa
Cook，1
∞
た。各 E，処理群の Vg量の測定結果を Fig.7に示す。 50
mg
/kg B Wの E，処理群では 60時間まで増加傾向を示し，
であり ，SDS-PAGEにおいては l kDaにメインバンド
最高値で 61
.
7mg/mlを示した。 5mg/kg B Wの E，処理群
(Lv heavy cha
i
n
)の 1
20kDaとよく一致した (Yamamura
の血紫 Vgは 24時間 もしくは 48時間後にピークを示し，
他の処理群 (
0
.
0
5mgおよび 0
.
5mg
/kg BW) では 24時間
e
ta
.
l
，1
9
95
)。精製 Lvに対する抗血清 (
a
gLv) は O
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および卵抽出液に対してそれぞれ l本の沈降線を形成し，
Lvが免疫学的に高度に精製されたことおよび a
gLvが雌
agLvの免疫交叉性
a
gLvを用いてニワトりおよびニホンウズラの卵抽出液
血祭中の雌特異蛋白，即ち Vgおよび卵抽出液中の Lvと特
異的に反応することが示された。 agLvを用いて Wes
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との反応を Ouchterlony法により観察した結果を Fig.8
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tを行った結果， ウミネコ雌血築中には雌特異的な 220
に示す。両卵抽出液とも a-gLvと反応し，ウミネコの沈降
kDaのバンドが観察された。ニワトリ Vgの SDS-PAGE
を示した。このサプユニットの分子量はニワトリの Lv 1
l
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ny法および IEP法において ，雄血祭とは反応せず雌血祭
における分子量は 2
αい 256kDaであり ，抗原性，サブユ
線と s
purを形成する l本の沈降線が観察された。
ニットの分子量およびアミノ酸組成の異なる 3種の Vg
(
1
: 260kDa，1:246kDa，川 210kDa) が存在すること
考 察
が報告されている (WangandWilliams
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ウミネコ Vgおよび Lvを検索するため ，4種の魚類 Vg
あるいは卵黄蛋白に対する抗血清を用いた。そのうち aエ
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のバンドはニワトリ Vgの分子量によく一致したことか
血塁走，E，処理した雄血祭並びに卵抽出液に対して明瞭な免
ら， ウミネコの Vgであると 同定した。
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tにおいて E，処理したウミネコ雄血援に新
疫交叉反応性を示した。さらに ，We
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tにおいても
たに出現した 220kDaのバンドは， 雌血祭に観察された
雌血祭，E，処理血祭中の高分子蛋白および卵抽出液のメイ
ン蛋白 と免疫交叉性を示し，ウミネコの Vgおよび Lv様蛋
白を特異的に認めた。本研究では ，a
-エソ.メバル e
g
gを用い
Vgバ ンドと 一致した。また ，Vgのバンドは時間経過に伴
い強く染色された。一方，鳥類では Vgが分解されて低分子
化しやすいという報告があり (
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てウミネコ Lvの検出を行った。この結果は，エゾメバルと
ウミネコの Vgあるいは Lvの分子内に一部共通した抗原
決定基が存在することを示唆している。
1
981
)
，a-gLvと反応した低分子量のバンドは Vgの分解産
物である可能性が考えられた。
異なる濃度の E，処理群における Vg濃度のピークは投
- 2
6-
盛田ら:E2投与によるウミネコ血中ビテロジェニンの動態
与した E2量に依存して増加し，またピーク時までの時間
御礼申し上げます。
も長くなる傾向が観察された。魚類では，サクラマス Onc
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) において， E2 の濃度依存的に血中 Yg量の
Wa
増加が報告されている。魚類同様，ウミネコにおいても血
禁中に誘導される Yg量は投与した E2量に依存的であり，
Ygが E2 により直接的に誘導されることが確認された。ま
た，低濃度の E2処理群では，Yg濃度のピークが 24時間後
に観察されたことから， 1回の E2処理により 24時間以内
に E2の作用が現れ， Yg合成が開始されると考えられた
50mg/kg B Wの E2処理群においては他の群とは異なり，
0
60時間後まで高値が維持された。
血中 Yg濃度を測定する初期の手法は，リンおよびカル
シウムを定量することによる間接的な方法が使用されてき
た (MommsenandWalsh，1
9
8
8
)。鳥類においてもこの手法
が用いられていたが (Berginke
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アッセイ法 (RIA法)による定量 (Redshaw 加 d F
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) も開発された。しかしながら，リンによる定量は間接
的であり直接的な値を得られないこと，また， RIA法は放
射ラベルの必要'性があり，ラベルされた蛋白の分解が起こ
るという問題点がある。本研究で用いた Mancini法の測定
限界は 10μg/ml前後と， RIA法などよりも低感度である
が，定量に必要な操作が著しく少なく，簡便であるという
利点をもっ。さらに，血中量が数 ng~数十 mg/ml の広範
囲に変化する Ygの測定法の一次スクリーニングには適し
ていると考えられる。今後，より高感度な酵素免疫測定法
(EIA法)と併用することでさらに詳細な解析が可能にな
ると思われる。
一方， a-gLv を用いてニワトリおよびニホンウズラの卵
抽出液との免疫交叉反応性を Ouchte
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1ony法を用いて観察
した結果，両種の Lvはウミネコ Lvと交叉反応性を有する
ことが示された。これらの知見は，本抗血清が広く他の鳥
類の Ygおよび Lvの検索に利用可能であることを示唆し
ている。
以上，本研究では，ウミネコの Lvと Ygを同定して免疫
学的測定系を確立するとともに， E2処理したウミネコ血紫
Yg量の動態を明らかにした。今後，野生のウミネコ雄 Yg
の出現を調査することにより，環境エストロジェンの影響
を評価する知見が得られるものと考える。
謝 辞
本研究を進めるにあたり，本稿の御校聞を賜った北海道
大学大学院水産科学研究科資源生態学講座，桜井泰憲教授
に深く感謝いたします。また，サンプリングにあたり御理
解と御厚意を頂いた札幌医科大学付属臨海研究所，高橋延
昭助教授，同研究所の皆様方ならびに本研究科生物海洋学
講座福本由利氏並びに生命機能学講座高橋みのり氏に厚く
- 27-
文 献
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