分子生物学 160420

150413、オリエンテーションより
分子生物学　（Molecular Biology） (Numbering Code) 16533139
理系ディシプリン科目　前期 水2 担当教員 (Course Instructor) 酒井謙二（[email protected]­‐u.ac.jp) 中村崇裕（[email protected]­‐u.ac.jp) 学部2年箱崎地区
農）農学部5号館117
授業概要 (Course Overview)
細胞の構造と機能について、分子生物学的見地から基礎的事項を解説する。
指定教科書(Essential 細胞生物学 3版、南江堂) にそって講義を行なう。 （7ー14章）
講義はパワーポイントを使用し、章末の問題を解答する。各章ごとに小テストを行う。 キーワード (Keywords)
タンパク質合成、ゲノム、発現調節，遺伝子解析
細胞膜，膜輸送、糖・脂質代謝，ミトコンドリア、葉緑体，エネルギー生産
履修条件等 (Pre-‐‑‒requisites)
Essential 細胞生物学１～７章の講義を受け、単位（必修）を取得していること 授業計画：中村　崇裕 ([email protected]­‐u.ac.jp) 生命機能科学部門 生物分子機能化学講座 植物分子機能学研究分野 4月20日 転写と翻訳（7章） 転写と翻訳（7章）+introduc6on 4月27日 発現調節（8章） 転写と翻訳（7章） 5月11日 発現調節（8章） 発現調節（8章） 5月18日 遺伝子構造（9章） 遺伝子構造（9章） 5月25日 遺伝子構造（9章） 遺伝子構造（9章） 6月8日 遺伝子解析(10章） 遺伝子解析(10章） 6月15日 遺伝子解析(10章） 遺伝子解析(10章） １８年度 文部科学省 科学技術振興調整費 「若手研究者の自立的研究環境整備促進」事業
九州大学「次世代研究スーパースター養成プログラム（SSP）」
テニュア・トラック制度(*)を前提とした優秀な若手研究者の育成策の確立と同時に、「新
研究分野の開拓」、「既存の研究組織の改革」の推進を目的とし、世界トップレベルの
次世代研究スーパースターの輩出と大学全体の研究活動の活性化を目指す。
*テニュア・トラック制度…若手研究者が厳正な審査を経てより安定的な職を得る前に、
任期付の雇用形態で自立した研究者としての経験を積むことができるしくみ。
（5年間の試験期間を経た後に、正規の雇用体系に移行） 30歳過ぎの若手に研究室を主催させて、勝手にやらせる。 植物では3つの出自の違う遺伝情報が上手に生活する必要がある�
ミトコンドリア�
色素体�
57遺伝子�
366 kb�
128遺伝子�
154 kb�
液胞�
核�
25498遺伝子�
125 Mb�
ペルオキシソーム�
ゴルジ体�
・・・たまに喧嘩する�
細胞内共生に伴う遺伝情報の移動�
藍色細菌�
(3000遺伝子)�
蛋白質�
核�
（2万遺伝子）�
遺伝情報�
葉緑体�
(100 遺伝子)�
ミトコンドリア�
(50 遺伝子）�
植物では3つの出自の違う遺伝情報が上手に生活している�
植物オルガネラ（葉緑体）の遺伝子発現 - 植物オルガネラ遺伝子は主にRNAレベルで遺伝子特異的に発現が制御されている -�
葉緑体 (128遺伝子、154 kb)
核
(25,498遺伝子、125 Mb )
ポリシストロニックな転写�
PPR
A
複雑なRNAプロセシング�
（RNA editing, cleavage, splicing)
PPR
C
PPR
B
蓄積しているRNAの一部が翻訳�
ミトコンドリア
(57遺伝子、366 kb)
PPR蛋白質とは？
・2000年にゲノム配列情報よりコンピュータ解析によって発見された蛋白質。
・通常、PPRモチーフ(pentatricopep6de repeat:35アミノ酸の繰り返し) 約10個の繰り返
しで構成される。
例、 HCF152 PPRモチーフ (35 アミノ酸) ・植物で大きなファミリーを形成している。 ・オルガネラ （ミトコンドリア(1/2)、葉緑体(1/4)）で働く。 ・転写、RNA切断、スプライシング、RNA編集、RNA安定
化、翻訳、など、様々な核酸代謝に遺伝子特異的な
因子として働く。 ・90%以上がRNA結合型、DNA結合型は少数。 ヒト (7) 酵母 (2) 高等植物 （500）
原核生物 (0) ラン藻 (0) 古細菌 （0） PPRタンパク質を利用した次世代型ゲノム編集技術�
1
4
ii
vtYntlIsglckaGrleeAlelfeeMkek-GiaPdv
：PPR 蛋白質
C G A U C U A G C G C :35アミノ酸�
・植物に多く含まれるオルガネラ制御因子�
・蛋白質はPPRモチーフの連続で構成�
・RNA結合種が90%、DNA結合種が10%�
・モチーフと塩基は1対1で対応�
・3つのアミノ酸で結合塩基を指定�
FTN
VNS
ヒト
(7) 酵母 (2) INN
VTD
YND
FPD
**L (1,4,ii)
1
高等植物 （500）
・RNAまたはDNAの両方でルールを共有�
ii
4
*
A
原核生物 (0) ラン藻
(0) 古細菌 （0） Hs mitochondrial RNA pol.
(Ringel et al., Nature 2011)�
*
U
*
U
*
C
レゴブロックを積み重ねるように、好きな配列
に結合する人工の蛋白質を設計可能。�
・RNAに結合する人工蛋白質の設計と利用
[PCT/JP2012/077274；九大]
・DNAに結合する人工蛋白質の設計と利用
[PCT/JP2014/061329； 九大&広大] PPRの産業化を目的としたバイオベンチャーの設立
(Established at May 2015)
■企業⽬目的・ミッション
グローバルで競争⼒力力の⾼高い核酸編集技術を
核としたプラットフォーム事業を展開し、
⽇日本はじめ世界の創薬並びに農業⽣生産技術
の向上に貢献する。
FUKUOKA !
KYUSYU UNIV.
PPR!
Z FN
TA LE N
C R IS P E R /C A S 9
現在・・・ ・生命機能科学部門 生物機能分子化学講座　植物分子機能学研究分野 准教授 ・エディットフォース株式会社　取締役 CSO（最高科学責任者） ラボメンバー 箱崎（博士課程1、テクニシャン5） 伊都（ポスドク6、テクニシャン4、秘書1、管理部門2名） 研究・開発対象 植物オルガネラ 共生 統合ゲノム制御 ゲノム編集（ゲノムからひとつの遺伝子を狙って操作）
第7章　DNAからタンパク質へ　ー　細胞がゲノムを読み取るしくみ DNAの構想の解明（1905年代初め） → 細胞の遺伝情報はそのヌクレオチドに暗号として書き込まえれている 遺伝子は4種類のヌクレオチド（DNA）で構成されている。 →遺伝情報を読み取って利用することで、様々な生物（植物、動物、最近）
が作られている。 遺伝情報 ≈ タンパク質情報 ≈ 細胞の構造や機能 （第4章 タンパク質（アミノ酸で構成）の構造と機能) DNAからタンパク質へ。 遺伝情報はタンパク質合成を指
令する。 セントラルドグマ DNA　→　RNA　→　タンパク質 (転写） (スプライシング） (翻訳） DNA: deoxyribonucleic acid RNA: ribonucleic acid ・ 化学物質としての名称 Gene ・ 生物の種類（形質）を決めるもの
（「生む」が本来の意味） Genome ・Gene + ome 一つの生物を構成する遺伝子全て。 （omeはギリシャ語で全て） 遺伝情報はタンパク質合成を指
令する。 セントラルドグマ DNA　→　RNA　→　タンパク質 DNA: deoxyribonucleic acid RNA: ribonucleic acid (転写） ・ 化学物質としての名称 (スプライシング） Gene ・ 生物の種類（形質）を決めるもの
（「生む」が本来の意味） Genome (翻訳） ・Gene + ome 問題7-­‐1: 遺伝情報がDNAからRNAを経てタンパク質へと流れるという“セントラルド
一つの生物を構成する遺伝子全て。 グマ”について考えよ。 （omeはギリシャ語で全て） “ドグマ（教義、信条）”という語が科学用語として用いられるのは適切か。 遺伝子は通常1コピーだが、転写（DNA→RNA）と翻訳（RNA→protein）の
過程で、発現効率が異なる。（= 遺伝子発現） 遺伝子発現の第一段階はDNAの塩基配列のコピー ヌクレオチド：糖 + 塩基 + リン酸基（ATP,ADP, AMP含む） ヌクレオシド：糖+塩基 核酸(nucleic acid）：ヌクレオチドがリン酸エステル結合で 重なった生体高分子 RNA(A,C,G,U)
DNA (A,C,G,T)
From Molecular Biology of the Cell
Watson-­‐Crick base-­‐pairing
Non Watson-­‐Crick base-­‐pairing (ex. A-­‐G pairing)
グループIイントロン
DNA = 二重らせん。：　情報の保持 RNA = 一本鎖で色々な形をとる。：　DNAからの情報の伝達だけでなく、 構造的な機能や触媒機能を持つものもある。
Movie 7-­‐1
Coding strand
A C G T C T T G G A
T G C A G A A C C T
A C G U C U U G G A
RNAポリメラーゼ（RNA polymerase）によって、転写がおこなわれる。
DNA dependent RNA polymerase
DNAに沿ってDNA二重らせんをほどきながら進む。 リボヌクレオシド3リン酸を取り込みながら、DNAと相補的な5’→3’方向にヌク
レオチドを1個ずつ伸ばしていく。 速度は30 nt/sec。エラー率は1/104 （DNA合成のエラー率は1/107） DNA合成とは違って、プライマー必要なし。
2個の隣接した遺伝子を多数のRNAポリメラーゼが同時に転写している様子 RNAポリメラーゼはDNAに沿った粒、RNA（転写産物）は細い糸状、として観察できる。 （糸の先にある粒子はrRNAに結合するリボソームタンパク質）
2個の隣接した遺伝子を多数のRNAポリメラーゼが同時に転写している様子 問題7-­‐2: RNAポリメラーゼはDNAに沿った粒、RNA（転写産物）は細い糸状、として観察できる。 上の電子顕微鏡写真では、RNAポリメラーゼの動く方向は、右から左か、
それとも左から右か、転写産物RNAの長さがそれを指令するDNAの長さよりはるか
（糸の先にある粒子はrRNAに結合するリボソームタンパク質）
に短いのはなぜか。 Table 7-1 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)
原核生物の転写
プロモータ認識
原核生物の転写
プロモータ認識
転写の方向は遺伝子によって様々 （転写方向は5’→3’のみ）
原核生物の転写 ・ RNAポリメラーゼはひとつ。→　コア酵素（ααββ’）+σ（シグマ因子：大腸菌で8個?）
真核生物の転写。 ・ RNAポリメラーゼが複数
Table 7-2 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)
植物ではPol4,5もあり
・ 多数のタンパク質（転写基本因子）の助けを必要とする。 → 複雑な制御が可能。 ・ 転写開始を制御する仕組みが複雑（多くの調節配列を利用；詳しくは第8章） ・ DNAは裸でなく、クロマチン構造をとる。クロマチン構造制御も必要。 原核生物の転写 ・ RNAポリメラーゼはひとつ。→　コア酵素（ααββ’）+σ（シグマ因子：大腸菌で8個?）
真核生物の転写。 ・ RNAポリメラーゼが複数
Table 7-2 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)
植物ではPol4,5もあり
・ 多数のタンパク質（転写基本因子）の助けを必要とする。 問題7-­‐3: 転写を行うRNAポリメラーゼを、複製に必要なRNAプライマーを合成するポ
→
複雑な制御が可能。 リメラーゼ（第6章）として使うことはできるか。 ・ 転写開始を制御する仕組みが複雑（多くの調節配列を利用；詳しくは第8章） ・ DNAは裸でなく、クロマチン構造をとる。クロマチン構造制御も必要。 真核生物の転写開始（Pol2の場合）
(A)  多くのプロモータにはTATAボックスが存在 (B)  TATAボックスにTFIID（TBP, TATA-­‐binding protein
含む）が結合。DNAが大きくゆがむ（次スライド）。 (C)  DNAの歪みを目印に、TFIIDの隣にTFIIBが結合。 (D)  残りの転写因子とPol2がプロモータに結合。 (E)  TFIIHがATP加水分解のエネルギーを使って転写
開始部位の二本鎖を解離。TFIIHがPol2のC-­‐
terminal tailをリン酸化。Pol2は転写基本因子か
ら離れて転写伸長期（elonga6on mode）に入る。 真核生物の転写開始（Pol2の場合）
(A)  多くのプロモータにはTATAボックスが存在 (B)  TATAボックスにTFIID（TBP, TATA-­‐binding protein
含む）が結合。DNAが大きくゆがむ（次スライド）。 (C)  DNAの歪みを目印に、TFIIDの隣にTFIIBが結合。 (D)  残りの転写因子とPol2がプロモータに結合。 (E)  TFIIHがATP加水分解のエネルギーを使って転写
開始部位の二本鎖を解離。TFIIHがPol2のC-­‐
terminal tailをリン酸化。Pol2は転写基本因子か
ら離れて転写伸長期（elonga6on mode）に入る。 TBP結合によるDNAのゆがみ
TBPは転写基本因子TFIIDのサブユニット。TATAボッ
クス配列に選択的に結合し、DNAの構造変化を引き
起こす。 この「歪み」が目印になって、ほかの転写基本因子
が引き寄せられる「らしい」。 TBPはよく似た構造のドメイン（ββββα）2個で形成さ
れる。8個のβシートが馬の鞍のようにDNAらせんの
上に乗る。 Movie 7-­‐4
Movie 7-­‐2
Movie 7-­‐3
転写後、 原核生物： 転写と同じ区画で翻訳（RNA → protein）がおきる。 真核生物：核で転写されたRNAは、核膜孔を
通って輸送された後に細胞質で翻訳される。 ただし、核外に出る前にRNAプロセシング
（RNA processing）と呼ばれる加工処理を受
ける。
転写後、 原核生物： 転写と同じ区画で翻訳（RNA → protein）がおきる。 真核生物：核で転写されたRNAは、核膜孔を
通って輸送された後に細胞質で翻訳される。 ただし、核外に出る前にRNAプロセシング
（RNA proseccing）と呼ばれる加工処理を受
ける。 RNA processing ・5’末端の加工（キャップ形成） ・スプライシング（イントロンの除去） ・3’末端の加工（ポリアデニル化） RNAプロセシングを行う酵素（群）は転写中
のPol2の尾部（リン酸化状態に依存）に集結
してくる。
RNA processing 5’末端の加工（キャップ形成） スプライシング（イントロンの除去） 3’末端の加工（ポリアデニル化） RNA processing 5’末端の加工（キャップ形成） スプライシング（イントロンの除去） 3’末端の加工（ポリアデニル化） キャップ形成 Pol2が25nt程度RNAを合成したころに行われる。 7-­‐メチルGが5’-­‐5’結合している。 (日本人が発見、まだ生きてる） RNA processing 5’末端の加工（キャップ形成） スプライシング（イントロンの除去） 3’末端の加工（ポリアデニル化） 真核生物の遺伝子の多くは、イントロンで分断されている。エクソンにはタンパク質
に変換される情報を含む（原核生物にイントロンがないわけではない）。 イントロンの数は1〜10000個以上。ヒトの場合、イントロン比率は90%以上。 βグロビン遺伝子：酸素運搬 ファクターVIII遺伝子：血液凝固（血友病の原因） 真核生物の遺伝子の多くは、イントロンで分断されている。エクソンにはタンパク質
に変換される情報を含む（原核生物にイントロンがないわけではない）。 イントロンの数は1〜10000個以上。ヒトの場合、イントロン比率は90%以上。 RNAスプライシング（イントロンの除去） イントロン除去に必要な配列 5’ splice junc6on, branch point, 3’ splice junc6on（距離も重要） R: purine; A or G Y: pyrimidine; C or U N: any nucleo6de
RNAスプライシング（イントロンの除去） 1.  イントロン中の分岐点（branch point)のアデニン
（赤字のA）が、5’スプライス部位の糖-­‐リン酸主
鎖を攻撃して切断。 2.  切断されたイントロンの5’末端がこのアデニン
のリボースの2’OH基に共有結合して、分岐構造
（Lariat form）を形成 3.  遊離したエキソンの3’-­‐OHが第2エキソンの先頭
と反応して、2つのエキソンがつなぎあわされる。 (イントロンは分解される） Movie 7-­‐5
RNAスプライシング（イントロンの除去） 選択的スプライシング 一つの遺伝子から複数の異なる機能のタンパク質を発現。 イントロンの意義：Exon shuffling
一つのエクソンは一つの機能単位（ドメイン）として保持される
場合は多い。 イントロンはL1レトロトランスポゾンの残骸（ゲノムの20&）。 Exon shufflingは、減数分裂時に活性化。
(補足） RNA processing 5’末端の加工（キャップ形成） スプライシング（イントロンの除去） 3’末端の加工（ポリアデニル化） (補足） RNA processing 5’末端の加工（キャップ形成） スプライシング（イントロンの除去） 3’末端の加工（ポリアデニル化） CF: cleavage factor
CPSF: cleavage and polyadenylation specificity factor
CstF: cleavage stimulation factor
PAP: poly(A) polymerase
PABII: poly(A) binding protein II
(補足） 転写の集結 Pol2の解離 (補足） (Nature 2004; Tollervey)
RNA quality control
（RNA surveillance；RNA監視機構)
(補足）
Offensive RNA degradation.
AAAAAA
AAAAAA
→　スプライシングが起きなければ分解
→　細胞質へ輸送
様々な段階で監視機構が作動
(補足） End of RNA, degradation
RNAの半減期は真核生物で数十時間（分子種によって異なる）、
真核生物では数分。 Cap構造、PolyA鎖に依存。 分解に関わる因子は明らかになりつつあるが、そのタイミングは
いまだ不明 TiBS 2012, Symmons et al
まとめ セントラルドグマとは？ DNAとRNAの化学物質としての違いは？ 真核生物におけるRNAの種類と転写に用いるポリメラーゼは？ 真核生物におけるmRNA成熟に必要なRNAプロセシングは？ 遺伝情報はタンパク質合成を指
令する。 セントラルドグマ DNA　→　RNA　→　タンパク質 (転写） (スプライシング） (翻訳） Question at late 1990:
The amount of RNA and protein
are inconsistent.
RNA was transcribed, but not
translated.
Protein with different information
from DNA was synthesized.
What could we learn from Genome project?
Number of protein coding gene / organism
Human
Mouse
Nematode
Fruit fly
A. Thaliana
Rice
Yeast
22,000
22,000
19,000
14,400
25,000
30,000
12,000
Genome project (gene + ome; 1990s〜early 2000s;
determination of DNA sequence) ↓
Transcriptome (late 1990s）
(Identification of all RNA in the organism)
- Unexpected number and huge variations of
alternative splicing
- Huge amount of non-coding RNA (NcRNA occupies 50% of the transcripts)
→ We have to re-consider definition of gene
→ We have only list of vocabulary cards
生物は有限である。
・・・ヒトのタンパク質遺伝子数が少ない
Human Mol. Genet. 15, R17-­‐19 (2006) Table 7-1 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)
(補足） Messenger RNA (mRNA)
Non-coding RNA (ncRNA)
Transfer RNA (tRNA)
Ribosomal RNA (rRNA)
Translation
(protein synthesis)
çSplicing
small nuclear RNA (snRNA)
RNA modification
small nucleolar RNA (snoRNA)
microRNA (miRNA)
small interfering RNA (siRNA)
CRISPER RNA
long noncoding RNA (ex., xist)
Others (retrotransposon, riboswitch, guide RNA,
telomere RNA, etc)
Molecular Genetics, 2006, Vol. 15, Review Issue 1
R19
(補足） box: genome (30 億塩基対)
Green: transcribed
Dark green both strand
gure 1. Graphical representation of the transcription in mammals. The area
the box represents the genome. The area of large green circle is equivalent
Human Mol. Genet. 15, R17-­‐19 (2006) the documented extent of transcription, with the darker green area corresnding to that on both strands. It should be noted that these estimates may
(補足） Protein-­‐coding RNA Non-­‐coding RNA Trends in Genet. 21, 289-­‐297(2005)