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(57)【特許請求の範囲】 【請求項1】 タンパク質産物及び殺菌活性増強
JP 3922723 B2 2007.5.30 (57)【 特 許 請 求 の 範 囲 】 【請求項１】 殺 菌 性 ／ 透 過 性 増 強 タ ン パ ク 質 （ BPI） タ ン パ ク 質 産 物 及 び 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 有 す る 、 細 菌 感 染 を 処 置 す る た め の 治 療 用 組 成 物 で あ っ て 、 さ ら に EDTAを 含 み 、 該 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 が 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 及 び ポ ロ キ サ マ ー 403よ り な る 群 か ら 選 択 さ れ る 、 治 療 用 組 成 物 。 【請求項２】 抗生物質と組み合わせて投与される、請求項１に記載の治療用組成物。 【請求項３】 殺 菌 性 ／ 透 過 性 増 強 タ ン パ ク 質 （ BPI） タ ン パ ク 質 産 物 な ら び に 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 阻 害 10 を増強するポロキサマー界面活性剤を含む、細菌及び真菌の生育を阻害するための組成物 で あ っ て 、 さ ら に EDTAを 含 み 、 該 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 阻 害 を 増 強 す る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 が 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 及 び ポ ロ キ サ マ ー 403よ りなる群から選択される、組成物。 【請求項４】 殺 菌 性 ／ 透 過 性 増 強 タ ン パ ク 質 （ BPI） タ ン パ ク 質 産 物 な ら び に 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 阻 害 を増強するポロキサマー界面活性剤の組成物を用いて、細菌または真菌を処置することを 含む、細菌及び真菌の生育を阻害するためのインビトロの方法であって、該組成物がさら に EDTAを 含 み 、 該 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 阻 害 を 増 強 す る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 が 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 及 び ポ ロ キ サ マ ー 403よ り な る 群 か ら 選 20 (2) JP 3922723 B2 2007.5.30 択される、方法。 【発明の詳細な説明】 本 出 願 は 、 1995年 １ 月 13日 に 出 願 せ る 米 国 出 願 第 08/372,104号 の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 19 95年 ９ 月 19日 に 出 願 せ る 米 国 出 願 第 08/530,599号 の 一 部 継 続 出 願 で あ り 、 双 方 と も 引 用 す ることによりその内容を本明細書に組み入れる。 発明の背景 本 発 明 は 、 概 し て 、 殺 菌 性 ／ 透 過 性 増 強 タ ン パ ク 質 （ BPI） タ ン パ ク 質 産 物 の 活 性 を 増 強 するためのポロキサマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体 ）界面活性剤を利用した、改良された治療用組成物及び処置方法に関する。 BPIは 、 侵 入 し て く る 微 生 物 に 対 す る 防 御 に お い て 必 須 の 血 液 細 胞 で あ る 、 哺 乳 動 物 の 多 10 形 核 白 血 球 （ PMNま た は 好 中 球 ） の 顆 粒 か ら 単 離 さ れ た タ ン パ ク 質 で あ る 。 ヒ ト BPIタ ン パ ク 質 は 、 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー ［ Elsbach、 J.Biol.Chem.、 254巻 、 11000頁 （ 197 9） ］ ま た は 大 腸 菌 ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー ［ Weissら 、 Blood、 69巻 、 652頁 （ 1987） ］ の い ず れ か と 、 酸 抽 出 と を 併 用 し て 、 PMNか ら 単 離 さ れ て い る 。 こ の よ う に し て 得 ら れ た BPIは 、 本 明 細 書 中 で 天 然 BPIと し て 言 及 さ れ 、 広 範 囲 に わ た る グ ラ ム 陰 性 細 菌 に 対 し て 強 力 な 殺 菌 活 性 を 有 す る こ と が 示 さ れ て い る 。 ヒ ト BPIの 分 子 量 は お よ そ 55,000ダ ル ト ン （ 55kD） で あ る 。 ヒ ト BPIタ ン パ ク 質 全 体 の ア ミ ノ 酸 配 列 、 及 び 当 該 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNAの 核 酸 配 列 は 、 Glayら 、 J.Biol.Chem.、 264巻 、 9505頁 （ 1989） の 図 １ に 報 告 さ れ て お り 、 か か る 文 献 を 引 用 す る こ と に よ り 、 本 明 細 書 に 組 み 入 れ る こ と と す る 。 Gr ayら の ア ミ ノ 酸 配 列 は 、 本 明 細 書 中 、 配 列 番 号 ： １ で 示 さ れ る 。 米 国 特 許 第 5,198,541号 20 に は 、 BPIホ ロ タ ン パ ク 質 及 び BPIの 断 片 を 包 含 す る BPIタ ン パ ク 質 を コ ー ド す る 組 換 え 遺 伝子及びそれらの発現のための方法を開示している。 BPIは 、 強 い 陽 イ オ ン 性 を 有 す る タ ン パ ク 質 で あ る 。 BPIの Ｎ 末 端 半 分 は 、 高 い 実 効 電 荷 の 原 因 と な り 、 一 方 、 分 子 の Ｃ 末 端 半 分 は 、 -3の 実 効 電 荷 を 有 す る 。 ［ Elsbach及 び Weiss（ 1981） 、 前 出 ］ 。 約 25kDの 分 子 量 を 有 す る 、 BPIの タ ン パ ク 質 分 解 に よ る Ｎ 末 端 断 片 は 、 疎 水 性 領 域 と 親 水 性 領 域 と を 交 互 に 含 み 、 両 親 媒 性 の 特 徴 を 有 す る 。 ヒ ト BPIの こ の Ｎ 末 端 断 片 は 、 天 然 に 由 来 す る 55kDの ヒ ト BPIホ ロ タ ン パ ク 質 の 抗 細 菌 的 効 力 を 保 有 し て い る 。 ［ Ooiら 、 J.Biol.Chem.、 262巻 、 14891∼ 14894頁 （ 1987） ］ 。 Ｎ 末 端 部 分 と は 対 照 的 に 、 単 離 さ れ た ヒ ト BPIタ ン パ ク 質 の Ｃ 末 端 領 域 は 、 グ ラ ム 陰 性 生 物 に 対 し て ほ ん の わ ず か に 検 出 可 能 な 抗 細 菌 活 性 を 呈 す る に 過 ぎ な い 。 ［ Ooiら 、 J.Exp.Med.、 174巻 、 649頁 （ 199 30 1） ］ 。 「 rBPI 2 3 」 と 称 さ れ る 、 お よ そ 23kDの Ｎ 末 端 BPI断 片 が 、 組 換 え 法 に よ っ て 製 造 さ れ て お り 、 こ れ も ま た グ ラ ム 陰 性 生 物 に 対 し て 抗 細 菌 活 性 を 保 持 す る も の で あ る 。 Gazzan o-Santoroら 、 Infect.Immun.、 60巻 、 4754∼ 4761頁 （ 1992） 。 BPIの 殺 菌 効 果 は 、 例 え ば Elsbach及 び Weiss、 Inflammation:Basic Principles and Clini cal Correlates、 Gallinら 編 、 30章 、 Raven Press, Ltd.（ 1992） に お け る ご と く 、 グ ラ ム 陰 性 の 種 に 特 異 性 が 高 い と の 報 告 が な さ れ て い る 。 BPIは 、 酵 母 を 包 含 す る 他 の 微 生 物 や 、 さ ら に 高 等 な 真 核 細 胞 に 対 し て 、 通 常 非 毒 性 で あ る と 考 え ら れ て い る 。 Elsbach及 び W eiss、 （ 1992） 、 前 出 は 、 10 -8 か ら 10 -9 Ｍ 程 度 の 低 濃 度 で 、 BPIが 広 範 囲 の グ ラ ム 陰 性 細 菌 に 対 し て 抗 細 菌 活 性 を 呈 す る も の の 、 そ れ よ り 100か ら 1,000倍 高 い 濃 度 の BPIが 、 同 時 に調べたグラム陽性細菌種、酵母、及びさらに高等な真核細胞のすべてに対して、非毒性 40 で あ っ た こ と を 報 告 し て い る 。 グ ラ ム 陽 性 生 物 で あ る 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 （ Staphylococcus a ureus、 ４ つ の 株 ） 、 表 皮 ブ ド ウ 球 菌 （ Staphylococcus epidermidis） 、 ス タ フ ィ ロ コ ッ カ ス ・ フ ァ エ カ リ ス （ Streptococcus faecalis） 、 バ シ ラ ス ・ サ ブ チ リ ス （ Bacillus sub tilis） 、 ミ ク ロ コ ッ カ ス ・ リ ソ デ イ ク チ カ ス （ Micrococcus lysodeikticus） 、 及 び リ ス テ リ ア ・ モ ノ サ イ ト ゲ ン ス （ Listeria monocytogenes） に 対 し て 、 pH7.0ま た は 5.5の い ず れ か で 調 べ た 場 合 、 10 -6 μ g/mlの 濃 度 で 、 BPIは 毒 性 効 果 を 有 し な い こ と が 報 告 さ れ た 。 報 告 に よ れ ば 、 pH7.0ま た は 5.5に お い て 、 BPIは 10 -6 Ｍにて真菌であるカンジダ・アルビ カ ン ス （ Candida albicans） 及 び カ ン ジ ダ ・ パ ラ シ ロ シ ス （ Candida parasilosis） に 対 する毒性効果を有さず、ヒト、ウサギ及びヒツジ赤血球細胞ならびに種々のヒト腫瘍細胞 系 に 対 し て 非 毒 性 で あ っ た 。 や は り Elsbach及 び Weissの 、 Advances in Inflammation Res 50 (3) JP 3922723 B2 2007.5.30 earch、 G. Weissmann編 、 ２ 巻 、 95∼ 113頁 、 Raven Press（ 1981） を 参 照 さ れ た い 。 こ の よ う に 報 告 さ れ た 標 的 細 胞 の 特 異 性 は 、 リ ポ 多 糖 （ LPS） に 対 す る BPIの 強 い 誘 引 力 の 結 果 で あ る と 考 え ら れ て い た 。 LPSは 、 グ ラ ム 陰 性 生 物 の 外 膜 （ あ る い は エ ン ベ ロ ー プ ） に 独 特のものである。 BPIの グ ラ ム 陰 性 細 菌 殺 傷 に お け る 正 確 な 機 構 は い ま だ 完 全 に は 解 明 さ れ て い な い が 、 ま ず 、 陽 イ オ ン 性 BPIタ ン パ ク 質 と LPS上 の 陰 性 に 荷 電 し た 部 位 と の 間 の 静 電 気 的 相 互 作 用 及 び 疎 水 性 相 互 作 用 を 通 し て 、 細 菌 の 表 面 に BPIが 結 合 し な け れ ば な ら な い と 考 え ら れ て い る 。 LPSは 、 そ れ が 刺 激 す る 強 い 炎 症 応 答 （ す な わ ち 、 回 復 不 能 の 内 毒 性 シ ョ ッ ク を 最 終 的には惹起こしうる宿主炎症細胞によるメディエータの放出）のゆえに、「内毒素」と称 さ れ て い る 。 BPIは リ ピ ド Ａ に 結 合 す る の で あ る が 、 こ れ は LPSの 最 も 毒 性 が 強 く 、 且 つ 最 10 も生物学的活性を有する成分であると報告されている。 感 受 性 の グ ラ ム 陰 性 細 菌 に お い て 、 BPIの 結 合 は LPS構 造 を 崩 壊 さ せ 、 リ ン 脂 質 及 び ペ プ チ ドグリカンを分解する細菌酵素の活性化を惹起こし、細胞外膜の透過性を変化せしめ、最 終 的 に は 細 胞 死 へ と 導 く 事 象 を 開 始 さ せ る と 考 え ら れ る 。 ［ Elsbach及 び Weiss（ 1992） 、 前 出 ］ 。 BPIは ２ 段 階 に て 作 用 す る と 考 え ら れ る 。 第 一 は 、 即 時 的 生 育 停 止 、 外 膜 の 透 過 性 亢 進 （ permeabilization） な ら び に リ ン 脂 質 及 び ペ プ チ ド グ リ カ ン を 加 水 分 解 す る 細 菌 酵素の選択的な活性化によって特徴付けられる亜致死的段階である。この段階での細菌は 、 血 清 ア ル ブ ミ ン を 追 加 し た 培 地 中 で 生 育 さ せ る こ と に よ り 救 助 で き る ［ Mannionら 、 J.C lin.Invest.、 85巻 、 853∼ 860頁 （ 1990） ］ 。 第 二 段 階 は 、 血 清 ア ル ブ ミ ン で 回 復 し え な い 生 長 阻 害 に よ り 規 定 さ れ る も の で あ る が 、 細 菌 を さ ら に 長 い 間 BPIに 曝 し た 後 に 起 こ る 20 ものであり、細胞質内膜への明白な損傷を含む、広範囲の生理学的及び構造的変化により 特徴付けられる。 BPIが LPSに ま ず 結 合 し て 、 正 常 時 に お い て Ｍ ｇ ++ 及びＣａ ++ の結合を通して外膜を安定化 さ せ る 、 LPSの KDO領 域 中 の 陰 イ オ ン 性 基 へ の 結 合 に お そ ら く は 起 因 し た 、 組 織 的 な 変 化 が 惹 起 こ さ れ る 。 グ ラ ム 陰 性 細 菌 の 外 膜 へ の BPIの 付 着 に よ り 、 ア ク チ ノ マ シ ン Ｄ な ど の 疎 水 性 剤 へ の 外 膜 の 迅 速 な 透 過 性 亢 進 が な さ れ る 。 BPIの 結 合 及 び そ れ に 続 く グ ラ ム 陰 性 細 菌 殺 傷 は 、 少 な く と も 部 分 的 に LPS多 糖 の 鎖 長 に 依 存 す る も の で あ り 、 長 い O-鎖 を 持 っ て い る 「 ス ム ー ズ 」 生 物 は 、 短 い O-鎖 を 持 っ て い る 「 ラ フ 」 生 物 よ り も BPIの 殺 菌 効 果 に 対 し て 耐 性 で あ る ［ Weissら 、 J.Clin.Invest.、 65巻 、 619∼ 628頁 （ 1980） ］ 。 こ の BPIの 作 用 の 第 一 段 階 で あ る グ ラ ム 陰 性 外 側 エ ン ベ ロ ー プ の 透 過 性 亢 進 は 、 BPIの 解 離 に 際 し て は 30 可 逆 性 で あ り 、 こ れ は 、 二 価 陽 イ オ ン の 存 在 及 び 新 規 LPSの 合 成 を 必 要 と す る プ ロ セ ス で あ る ［ Weissら 、 J.Immunol.、 132巻 、 3109∼ 3115頁 （ 1984） ］ 。 し か し な が ら 、 グ ラ ム 陰 性細菌の生育力喪失は、エンベロープの完全性を修復するプロセスによっては回復せず、 従って殺菌作用は標的生物に誘導される付加的な障害により媒介されるのであり、それは 細 胞 質 膜 に 位 置 す る か も し れ な い こ と が 示 唆 さ れ る （ Mannionら 、 J.Clin.Invest.、 86巻 、 631∼ 641頁 （ 1990） ） 。 こ の 可 能 性 を 特 に 精 査 し て 、 モ ル ベ ー ス で 、 BPIは 少 な く と も ポ リ ミ キ シ ン Ｂ と 同 等 に 細 胞 質 膜 小 胞 機 能 を 阻 害 す る こ と が 示 さ れ て い る （ In't Veldら 、 Infesction and Immunity、 56巻 、 1203∼ 1208頁 （ 1988） ） も の の 、 正 確 な 機 構 な ら び に、このような小胞と無傷の生物の研究との関連は、いまだ解明されていない。 BPIは 、 そ の 結 合 対 象 で あ る LPSの 内 毒 素 特 性 を 中 和 す る こ と も で き る 。 グ ラ ム 陰 性 生 物 に 40 対 す る 殺 菌 特 性 及 び LPSを 中 和 す る 能 力 の ゆ え に 、 BPIは 、 菌 血 症 ま た は 敗 血 症 な ど の 、 グ ラム陰性細菌によって惹き起こされる疾患に罹患した哺乳類の処置のために利用すること ができる。 ポロキサマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体）界面活性 剤 は 、 疎 水 性 の ポ リ オ キ シ プ ロ ピ レ ン （ POP） の 単 一 ブ ロ ッ ク に 隣 接 す る 親 水 性 の ポ リ オ キ シ エ チ レ ン （ POE） の ２ つ の ブ ロ ッ ク ま た は 鎖 で 構 成 さ れ る 構 造 を 有 し て い る 、 非 イ オ ン性のブロック共重合体である。 本 発 明 に と っ て 興 味 深 い の は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 、 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 単 独 、 ま たはポリソルベート界面活性剤と組み合わせたいずれかとを含有する医薬組成物の、可溶 化 ま た は 安 定 性 の 改 良 を 記 載 し た 、 共 有 で 係 属 中 の 、 許 可 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/190,8 50 (4) JP 3922723 B2 2007.5.30 69号 （ PCT出 願 公 開 No． WO 94/17819） で あ り 、 こ れ は 参 照 す る こ と に よ っ て 本 明 細 書 に 組 み入れることとする。 また、さらに本発明にとって興味深いのは、ウイルス、マイコバクテリウム及びコクシジ オイデス感染症の処置において、「旧来の」抗生物質と共に、及び抗生物質なしでポロキ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 使 用 す る こ と を 記 し て い る 、 PCT出 願 公 開 No． WO88/06038及 び 米 国 特 許 第 5,183,687号 で あ る 。 当 該 技 術 分 野 に お い て 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 な ど の 殺 菌 剤 の 治 療 上 の 有 効 性 を 改 良 す る こ とができる方法及び組成物への要望がある。かかる方法及び組成物は、所望の治療効果を 成し遂げるために必要とされる薬剤の投与量を理想的に低減することができよう。 発明の要約 10 本発明は、改良された抗微生物性組成物及び処置方法を提供する。本発明の一つの特徴に よ れ ば 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 抗 細 菌 活 性 を 増 強 す る ポ リ オ キ シ プ ロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（ポロキサマー）界面活性剤を含む、改 良された治療用組成物が提供される。現在のところ好ましい殺菌活性増強ポロキサマー界 面 活 性 剤 に は 、 ポ ロ キ サ マ ー 333（ PLURONIC 103、 BASF、 Parsippany、 ニ ュ ー ジ ャ ー ジ ー 州 ） 、 ポ ロ キ サ マ ー 334（ PLURONIC 104、 BASF） 、 ポ ロ キ サ マ ー 335（ PLURONIC 105、 BASF ） 、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403（ PLURONIC P123、 BASF） が 包 含 さ れ る 。 本 発 明 で 使 用 さ れ る ポロキサマーは、組成物に配合する前に随意に熱処理してもよい。特に好ましいのは、ポ ロ キ サ マ ー 333ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 む 組 成 物 で あ る 。 本 発 明 の こ の 特 徴 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 前 掲 の ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 の 一 つ と の 組 合 せ に よ っ て 、 in vitro及 び 20 in vivoの 双 方 で 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 殺 菌 活 性 が 予 測 で き な い ほ ど 増 強 さ れ る こ と を 知 見したことに基づいている。本発明の改良された治療用組成物は、さらにエチレンジアミ ン 四 酢 酸 （ EDTA） を 含 ん で も よ い 。 本 発 明 の こ の 特 徴 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 （ ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403な ど ） と を 含 有 す る 治 療 用 組 成 物 に EDTAを 添 加 す る と 、 BPIタ ン パ ク 質産物の殺菌活性のさらなる増強が導かれるという発見に基づいている。 細菌感染を処置するための、前記に対応する改良された方法も提供され、その改良された 方 法 に は 、 感 染 が 疑 わ れ る か ま た は 確 認 さ れ た 患 者 に 対 し て 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 、 そ し て 随 意 に EDTAを 含 む 治 療 用 組 成 物 を 投 与 す る こ と が 含 ま れ て い る 。 本 発 明 は さ ら に 、 細 菌 感 染 の 処 置 の た め の 医 薬 製 造 の た め に 、 BPIタ ン パ ク 質 産 30 物 と 、 随 意 に EDTAと 共 に 、 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 （ ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403な ど ） を 使 用 す る こ と も 企 図 す るものである。 本 発 明 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 な ら び に 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 阻 害 を 増 強 す る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 、 そ し て 随 意 に EDTAを 含 む 、 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 を 阻 害 す る た め の 改 良 さ れ た 組 成 物 を 、 さ ら に 提 供 す る も の で あ る 。 発 明 の こ の 特 徴 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 細 菌 及 び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤との組合せで、予測できないほどに BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 生 育 阻 害 活 性 が 増 強 さ れ る と い う 発 見 に 基 づ い て い る 。 細 菌 ま た は 真菌を殺傷またはそれらの生育を阻害する、前記に対応する方法が提供される。その方法 に は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 、 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 阻 害 を 増 強 す る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 40 剤 、 そ し て 随 意 に EDTAを 含 む 組 成 物 を 、 生 物 に 接 触 さ せ る こ と が 含 ま れ て い る 。 現 在 の と ころ好ましい細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤には、ポロキサ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 及 び ポ ロ キ サ マ ー 403が 包 含 さ れ る 。 前記の細菌感染を処置するための改良された方法に関しては、細菌感染を処置するために 抗 生 物 質 の 治 療 的 有 効 性 を 改 良 す る 方 法 も 提 供 さ れ る 。 こ の 方 法 に よ れ ば 、 BPI活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 （ ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403な ど ） 及 び 随 意 に 用 い ら れ る EDTAで 製 剤 化 さ れ た BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 含 む 組 成 物 と 、 抗 生 物 質 が 同 時 に 投 与 さ れ る 。 本 発 明 の こ の 特 徴 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 添加した場合に認められる、抗生物質の治療的有効性の改良が、様々なポロキサマ製剤に よ っ て さ ら に 増 強 で き る と い う 発 見 、 な ら び に 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 ／ ポ ロ キ サ マ ー 製 剤 50 (5) JP 3922723 B2 2007.5.30 に EDTAを 追 加 す る と よ り 一 層 抗 生 物 質 の 治 療 的 有 効 性 が 増 強 さ れ る と い う 発 見 に 基 づ い て い る 。 本 発 明 の こ の 特 徴 は 、 抗 生 物 質 を 用 い た 細 菌 感 染 の 共 同 処 置 用 の 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 含 有 す る 医 薬 の 製 造 の た め の 、 随 意 に EDTAを 併 用 す る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 （ ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403な ど ） の 使 用 をも提供する。 以下の知見は、本発明のこの特徴を例証するものである。シュードモナス種については、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 セ フ チ ゾ キ シ ム の 改 良 さ れ た 治 療 的 有 効 性 が 増 強 さ れ ； ポ ロ キ サ マ ー 33 3、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 セ フ ト リ ア キ ソ ン に 対 す る 増 強 が な さ れ ； そ し て 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334 10 、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル に 対 す る 増 強 が な さ れ た 。 ア シ ネ ト バ ク タ ー （ Acinetobacter） 種 に つ い て は 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 セ フ タ チ ジ ム （ ceftazidime） に 対 す る 増 強 が な さ れ ； ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 セ フ ト リ ア キ ソ ン に 対 す る 増 強 が な さ れ ； そ し て ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル に 対 す る 増 強 が な さ れ た 。 ス ト レ プ ト コ ッ カ ス 種 に つ い て は 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 20 オ キ サ シ リ ン に 対 す る 増 強 が な さ れ た 。 エ ン テ ロ コ ッ カ ス 種 に つ い て は 、 ポ ロ キ サ マ ー 33 5ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 リ フ ァ ン ピ シ ン に 対 す る 増 強 が な さ れ ； そ し て ポ ロ キ サ マ ー 333を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 シ プ ロ フ ロ キ サ シ ン （ ciprofloxacin） に 対 す る 増 強 が な さ れ た 。 シ ュ ー ド モ ナ ス 種 に つ い て は 、 ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る BPIタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に よ っ て 、 様 々 な 抗 生 物 質 の 治 療 的 有 効 性 の 増 強 が な さ れ 、 そ し て BPI／ ポ ロ キ サ マ ー 403製 剤 に 増 加 濃 度 の EDTAを 添 加 す る こ と に よ っ て 、 よ り 一 層 の 増 強 が な さ れ た 。 本発明の現在のところ好ましい実施態様を記載した、以下の発明の詳細な説明をもとに考 慮すれば、当業者には、本発明の多くの付加的な特徴及び利点が明らかになるであろう。 詳細な説明 30 本発明は、改良された抗微生物性組成物及び処置方法を提供する。改良された方法及び組 成物は、細菌感染及びそれに関連するかそれに起因する感染症及び状態（敗血症及び菌血 症など）を処置するために有用であるのみならず、例えば、腹部もしくは尿生殖器手術を 行う予定の患者、または外傷の罹患者などの、細菌感染の危険性が高い状態にある患者の 予防のためにも有用である。 特 に 、 本 発 明 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 安 定 化 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 む 治 療 用 組 成 物 の 改 良 に お い て 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403な ど の 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 む と い う 点 が 改 良 さ れ て い る 。 本 発 明 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 、 前 掲 の ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 の 一 つ と の 組 合 せ に よ っ て 、 in vitro及 び in vivoの 双 方 に お い て 予 測 で き な い ほ ど に BPIタ ン パ ク 質 産 物 40 の殺菌活性が増強されるという知見に基づいている。本発明の改良された治療用組成物は 、 さ ら に EDTAを 含 ん で も よ い 。 本 発 明 の こ の 特 徴 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403な ど の 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 有 す る 、 あ る 治 療 用 組 成 物 に EDTAを 添 加 す る と 、 BPIタ ン パク質産物の殺菌活性のさらなる増強がなされるという発見に基づくものである。かかる 組成物は、医薬的に容認しうる希釈剤、佐剤または担体を随意に含んでもよい。本発明に は 、 天 然 BPIタ ン パ ク 質 、 組 換 え BPIタ ン パ ク 質 、 BPI断 片 、 BPI類 似 体 、 BPI変 異 体 、 及 び B PIペ プ チ ド を 包 含 す る 、 当 該 技 術 分 野 に お い て 既 知 の 、 多 岐 に わ た る BPIタ ン パ ク 質 産 物 のいかようなものであっても利用される。 細菌感染を処置するための、対応する改良された方法も提供され、その改良された方法に 50 (6) JP 3922723 B2 2007.5.30 は 、 感 染 が 疑 わ れ る か ま た は 確 認 さ れ た 患 者 に 対 し て 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 、 そ し て 随 意 に EDTAを 含 む 治 療 用 組 成 物 を 投 与 す る こ と が 含 ま れ て い る 。 本 発 明 は さ ら に 、 細 菌 感 染 の 処 置 用 の 医 薬 の 製 造 の た め に 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 、 随 意 に EDTAと 共 に 、 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 （ ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403な ど ） を 使 用 す る こ と も 企 図 す る も の で あ る 。 EDTAを 含 む か ま た は 含 ま な い 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 の 治療用組成物は、細菌感染の疑いがあるか、または感染が確認された披験者に対して、全 身または局所投与することができる。 ポ ロ キ サ マ ー 333は 、 BASF（ Parsippany、 NJ） に よ り 、 PLURONIC P103の 商 品 名 で 販 売 さ れ て お り 、 4950の 分 子 量 、 そ し て 7∼ 12の 親 水 性 ／ 親 油 性 バ ラ ン ス （ HLB） 価 を 有 し て い る 。 10 ポ ロ キ サ マ ー 334は 、 BASFに よ り 、 PLURONIC P104の 商 品 名 で 販 売 さ れ て お り 、 5900の 分 子 量 、 そ し て 12∼ 18の HLB価 を 有 し て い る 。 ポ ロ キ サ マ ー 335は 、 BASFに よ り 、 PLURONIC P10 5の 商 品 名 で 販 売 さ れ て お り 、 6500の 分 子 量 、 そ し て 12∼ 18の HLB価 を 有 し て い る 。 ポ ロ キ サ マ ー 403は 、 BASFに よ り 、 PLURONIC P123の 商 品 名 で 販 売 さ れ て お り 、 5750の 分 子 量 、 そ し て 7∼ 12の HLB価 を 有 し て い る 。 現 在 の と こ ろ 好 ま し い 殺 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 に は 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403 が 包 含 さ れ る 。 特 に 好 ま し い の は 、 ポ ロ キ サ マ ー 333ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 包 含 す る 組 成物である。 本発明において使用されるポロキサマーは、組成物に配合するに先駆けて、随意に熱処理 を行ってもよい。好ましい熱処理の方法は以下の通りである：（１）脱イオン水にてポロ 20 キサマーの溶液をつくり、（２）沸騰するまでその溶液を加熱し、（３）熱源から溶液を 離し、（４）室温にまで冷却させ、（５）ポロキサマーが完全に可溶化するまで攪拌する 。あるいは、加熱工程（２）において、溶液を３０分以上まで煮沸してもよい。 本 発 明 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 な ら び に 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 阻 害 を 増 強 す る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 、 そ し て 随 意 に EDTAを 含 む 、 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 を 阻 害 す る た め の 改 良 さ れ た 組成物を、さらに提供するものである。本発明のこの特徴は、細菌及び真菌の生育阻害を 増 強 す る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 が 、 予 測 で き な い ほ ど に BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 生 育 阻 害 活 性 を 増 強 す る と い う 発 見 、 そ し て 、 か か る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 及 び BPIタ ン パ ク 質 産物を含む改良された組成物が、優れた生育阻害、保存効果を呈するという発見に基づい ている。細菌または真菌を殺傷またはそれらの生育を阻害する、前記組成物に対応する方 30 法 が 提 供 さ れ る 。 そ の 方 法 に は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 、 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 阻 害 を 増 強 す る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 、 そ し て 随 意 に EDTAを 含 む 組 成 物 を 、 生 物 に 接 触 さ せ る こ と が含まれている。現在のところ好ましい細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー 界 面 活 性 剤 に は 、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 及 び ポ ロ キ サ マ ー 403が 包 含 さ れ る 。 これらの方法は、保存薬としての使用、流体及び表面の汚染除去のための使用、または手 術用及び他の医療機器ならびに人工関節を包含する移植可能な器具等を滅菌するための使 用 な ど 、 in vivoま た は 様 々 な in vitroで の 使 用 に お い て 実 施 す る こ と が で き る 。 こ れ ら の方法は、しばしば感染の病巣である、静脈内ライン及びカテーテルなどの内在させる侵 入 器 具 の in situ滅 菌 の た め 、 な ら び に 細 胞 用 生 育 培 地 の 調 製 に お い て も 用 い る こ と が で 40 きる。細菌及び真菌の生育を阻害するための改良された組成物の有効性は、後記の実施例 8に お け る ア ッ セ イ 、 ま た は 共 有 で 係 属 中 の 特 許 出 願 （ Cohenら ） で あ る 、 1993年 9月 22日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/125,651号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1994年 7月 1 1日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/273,401号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1994年 9 月 22日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/311,611号 、 そ し て 対 応 の PCT出 願 第 PCT/US94/1122 5、 そ し て 共 有 で 係 属 中 の 特 許 出 願 （ Littleら ） で あ る 、 1994年 1月 14日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/183,222号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1994年 3月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/209,762号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る （ Horwitzら ） 1994年 7月 11 日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/274,299号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1995年 1 月 13日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/372,783号 、 そ し て 対 応 の PCT出 願 第 PCT/US95/0065 50 (7) JP 3922723 B2 2007.5.30 6、 そ し て 共 有 で 係 属 中 の 特 許 出 願 （ Littleら ） で あ る 、 1994年 1月 14日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/183,222号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1994年 3月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/209,762号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1994年 7月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/273,540号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1995年 1月 13日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/372,105号 、 そ し て 対 応 の PCT出 願 No． PCT/US95/00498（ こ れ らはすべて、引用することによりその内容を本明細書の一部とする）に記載される種々の アッセイによっても評価することができる。） BPIタ ン パ ク 質 産 物 は 、 補 体 、 p15及 び LBP、 な ら び に 他 の 細 胞 及 び 免 疫 系 の 成 分 を 包 含 す る、全血または血清中に存在する様々な宿主防御要素と相互作用すると考えられる。かか る 相 互 作 用 に 起 因 し て 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 活 性 が 強 化 さ れ る の か も し れ な い 。 こ れ ら 10 の 相 互 作 用 の ゆ え に 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 は in vitroよ り も in vivoで 一 層 強 い 活 性 を 発 揮 す る こ と が 予 測 で き る 。 し か し て 、 in vitroの 試 験 は in vivoで の 有 用 性 を 予 見 さ せ る も の で あ る が 、 in vitroで 活 性 が な い こ と が 必 ず し も in vivoで 活 性 が な い こ と を 示 唆 す る と は 限 ら な い 。 例 え ば 、 BPIは 、 旧 来 の 培 地 を 用 い た ア ッ セ イ に お け る よ り も 、 全 血 ま た は血漿アッセイで、グラム陰性細菌に対してより大きな殺菌効果を呈することが観察され て い る 。 ［ Weissら 、 J.Clin.Invest. 90巻 、 1122∼ 1130頁 （ 1992） ］ 。 こ の こ と は 、 in v ivoで の 動 物 実 験 に も 示 さ れ る （ 例 え ば 、 共 有 で 係 属 中 の 、 1994年 9月 22日 に 出 願 さ れ た 米 国 出 願 （ Cohenら ） で あ る 、 米 国 特 許 出 願 第 08/311,611号 、 そ し て 対 応 の PCT出 願 No． PCT/ US94/11225（ こ れ ら は す べ て 、 引 用 す る こ と に よ り 本 明 細 書 の 一 部 と す る ） を 参 照 さ れ た い ） 。 こ れ は 、 旧 来 の in vitro系 が 、 in vivoに お け る BPIの 機 能 を 助 長 す る か も し く は 強 20 化 す る 血 液 成 分 を 欠 く た め か 、 ま た は 、 旧 来 の 培 地 が BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 抗 細 菌 活 性 の 典型的に阻害剤たるマグネシウム及びカルシウムを生理学的濃度よりも多量に含有してい る か ら か も し れ な い 。 さ ら に 、 宿 主 に お い て 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 は 、 ス ト レ ス で 誘 導 さ れるグラム陰性細菌の転位から、あるいはグラム陰性細菌の抗生物質を用いた処置から、 等 を 包 含 す る 宿 主 感 染 の 際 に 放 出 さ れ る 内 毒 素 を 中 和 す る た め に 使 用 可 能 で あ り 、 in vit ro試 験 に お い て 認 め ら れ な い 、 ま た は こ れ に よ っ て 予 測 さ れ な い 、 さ ら な る 臨 床 上 の 利 益 を提供する。 BPIタ ン パ ク 質 産 物 が 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 活 性 を 強 化 す る 他 の 産 物 と 共 に 投 与 さ れ る こ と も 企 図 さ れ る 。 例 え ば 、 血 清 補 体 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 殺 グ ラ ム 陰 性 細 菌 活 性 を 強 化 し 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 血 清 補 体 と の 組 合 せ に よ っ て 、 相 乗 的 な 殺 細 菌 ／ 生 育 阻 害 効 30 果 が 提 供 さ れ る 。 例 え ば 、 BPI抗 細 菌 活 性 を 強 化 す る 、 天 然 に 存 在 す る 15kDタ ン パ ク 質 に つ い て 述 べ ら れ て い る 、 Ooiら 、 J.Biol.Chem.、 265巻 、 15956頁 （ 1990） 、 及 び Levyら 、 J .Biol.Chem.、 268巻 、 6038∼ 6083頁 （ 1993） を 参 照 さ れ た い 。 ま た 、 1993年 7月 14日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/093,201号 の 一 部 継 続 出 願 と し て 1994年 7月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/274,303号 に 対 応 す る 、 共 有 で 係 属 中 で あ る 、 1994年 7月 13日 に 出 願 さ れ た PCT出 願 No． US94/07834も 参 照 さ れ た い 。 こ れ ら の 出 願 は 、 参 照 す る こ と に よ っ て 本 明 細 書 に 含 ま れ る も の と す る が 、 リ ポ 多 糖 結 合 タ ン パ ク 質 （ LBP） 及 び LBPタ ン パ ク 質 産 物 を 投 与 す る こ と に よ っ て 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 殺 グ ラ ム 陰 性 細 菌 活 性 を 強 化 す る た め の 方 法 が 記 載 さ れ て い る 。 CD-14免 疫 刺 激 特 性 を 欠 く LBPタ ン パ ク 質 誘 導 体 及 び 誘 導 体 ハ イ ブ リ ッ ド が 、 1993年 6月 17日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/079,510号 の 一 部 継 続 出 願 と し 40 て 1994年 6月 17日 に 出 願 さ れ た 、 共 有 で 係 属 中 で あ る 米 国 特 許 出 願 第 08/261,660号 に 対 応 す る 、 1994年 6月 17日 に 出 願 さ れ た PCT出 願 No． US94/06931に 記 載 さ れ て お り 、 こ れ ら の 出 願は、すべて引用することによってその開示が本明細書に含まれるものである。 本 発 明 に よ っ て 提 供 さ れ る 利 点 は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 、 よ り 有 効 な 細 菌 及 び 真 菌 の 殺 傷または生育阻害、ならびに増強された抗細菌または抗真菌活性を提供できることにある 。 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び BPIの 抗 微 生 物 活 性 を 増 強 す る ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 み 、 そ し て 随 意 に EDTAを 含 有 す る 治 療 用 組 成 物 は 、 全 身 に 、 あ る い は 局 所 に 投 与 す る こ と が で き る。全身投与の経路には、経口、静脈内、筋肉もしくは皮下注射（長時間放出用のデポ剤 に含有せしめられる）、眼内または眼球後部、鞘内、腹膜組織内（例えば腹腔組織内灌流 50 (8) JP 3922723 B2 2007.5.30 による）、エアロゾル化もしくは霧状にした薬物を用いた経肺、または経皮経路が包含さ れ る 。 例 え ば 、 非 経 口 的 に 与 え ら れ る 場 合 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 組 成 物 は 、 通 例 、 １ 日 当 た り 1μ g/kgか ら 100mg/kgの 範 囲 の 投 与 量 で 、 そ し て 好 ま し く は 、 １ 日 当 た り 0.1mg/kgか ら 20mg/kgの 投 与 量 で 注 射 さ れ る 。 処 置 す る 医 師 の 裁 量 に よ っ て 、 例 え ば １ 日 か ら ３ 日 間 、またはさらに長期間、１日当たりの投与量を同じか、または増減して、処置を継続して もよい。局所経路には、軟膏、眼用滴剤、耳用滴剤、潅注液（例えば傷の潅注用）または 薬用シャンプーの剤形での投与が包含される。例えば、滴剤の剤形で局所投与するために は 、 約 10か ら 200μ Lの BPIタ ン パ ク 質 産 物 組 成 物 が 処 置 に 当 た る 医 師 の 裁 量 に 基 づ き 、 １ 日当たり１回以上適用すればよい。当業者であれば、良好な医薬実務及び個々の患者の臨 床 状 態 に よ っ て 決 定 さ れ る 通 り 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び BPIの 殺 菌 活 性 を 増 強 す る ポ ロ キ 10 サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 み 、 そ し て 適 宜 に EDTAを 含 有 す る 治 療 用 組 成 物 の た め の 、 有 効 投 与 量及び投与に際した規制をたやすく至適化することができる。 前記の細菌感染を処置するための改良された方法に関して、細菌感染の処置用の抗生物質 の 治 療 的 有 効 性 を 改 良 す る 方 法 も ま た 提 供 さ れ る 。 こ の 方 法 に よ れ ば 、 BPI活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 （ ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403な ど ） を 用 い て 、 そ し て 随 意 に EDTAを 配 合 し た 、 製 剤 化 さ れ た BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 含 む 組 成 物 と 共 に 、 抗 生 物 質 が 同 時 に 投 与 さ れ る 。 本 発 明 の こ の 特 徴 に よ り 、 BP Iタ ン パ ク 質 産 物 の 添 加 に 伴 っ て 認 め ら れ る 抗 生 物 質 の 治 療 的 有 効 性 の 改 良 を 、 様 々 な ポ ロ キ サ マ ー 製 剤 に よ っ て 増 強 す る こ と が で き る と い う 発 見 、 そ し て BPIタ ン パ ク 質 産 物 ／ ポ ロ キ サ マ ー 製 剤 に EDTAを 添 加 す る と 、 抗 生 物 質 の 治 療 的 有 効 性 が さ ら に 一 層 増 強 さ れ る 20 という発見に基づいている。本発明のこの特徴は、抗生物質を用いた細菌感染の共同処置 用 の 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 含 有 す る 医 薬 の 製 造 の た め の 、 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 （ ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403な ど ） と 随 意 に EDTAと の 使 用 も 提 供 さ れ る も の で あ る 。 本 発 明 の こ の 特 徴 の た め に 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と の 同 時 投 与 に 際 し て 認 め ら れ る 抗 生 物 質 の 改 良 さ れ た 治 療 的 有 効 性 を 、 数 多 く の 方 法 で 観 察 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 BPIタ ンパク質産物は、臨床上抗生物質に対して耐性を有する生物を臨床上抗生物質に対して感 受性の生物に変換するか、あるいは場合によっては、かかる生物の抗生物質への感受性を 改 良 す る か も し れ な い 。 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 抗 生 物 質 は 、 単 一 の 治 療 的 有 効 性 の た め に 充 分 な 量 を 下 回 る 投 与 量 で 双 方 を 与 え た 場 合 に 、 治 療 的 効 果 を 有 す る か も し れ な い 。 BP 30 Iタ ン パ ク 質 産 物 製 剤 に 、 BPI活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 配 合 す る と 、 こ れ ら の 活 性 が さ ら に 増 強 さ れ る 。 1993年 9月 22日 に 出 願 さ れ た 、 共 有 で 係 属 中 の 特 許 出 願 （ Cohenら ） で あ る 米 国 特 許 出 願 第 08/125,651号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1994年 7月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/273,401号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1994年 9月 2 2日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/311,611号 、 そ し て 対 応 の PCT出 願 No． PCT/US94/11225 、 そ し て 共 有 で 係 属 中 の 特 許 出 願 （ Littleら ） で あ る 、 1994年 1月 14日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/183,222号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1994年 3月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/209,762号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 （ Horwitzら ） で あ る 、 1994年 7月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/274,299号 、 そ し て そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1995年 1月 13日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/372,783号 、 そ し て 対 応 の PCT出 願 No． PCT/US95/0 40 0656（ こ れ ら は す べ て 、 引 用 す る こ と に よ り 本 明 細 書 に 含 ま れ る も の と す る ） は 、 抗 微 生 物 剤 と し て の BPIの 使 用 を 評 価 す る た め の 方 法 、 及 び 抗 生 物 質 の 有 効 性 を 増 強 す る た め の 方法を開示している。 抗 生 物 質 の 改 良 さ れ た 治 療 的 有 効 性 は 、 in vivoの 動 物 モ デ ル で 実 証 し て も よ い し 、 あ る い は 、 以 下 の 試 験 を 包 含 す る 様 々 な in vitro試 験 を 基 礎 と し て 予 測 し て も よ い 。 か か る 試 験は、（１）２４時間でグラム陰性生物の成育を阻害するのに必要な抗生物質の最小阻害 濃 度 （ MIC） の 測 定 、 （ ２ ） グ ラ ム 陰 性 生 物 の 動 的 生 育 曲 線 に 対 す る 抗 生 物 質 の 効 果 の 測 定 、 （ ３ ） 抗 生 物 質 の 連 続 希 釈 液 単 独 で 、 ま た は BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 連 続 希 釈 液 と 組 み 合 わ せ て の 、 MICの チ ェ ッ カ ー 板 ア ッ セ イ を 包 含 す る も の で あ る 。 上 記 の 改 良 さ れ た 有 効 性 は 、 （ ａ ） 生 物 の 数 の 減 少 、 （ ｂ ） MICの 低 減 、 及 び ／ ま た は （ ｃ ） 抗 生 物 質 に 対 す る 50 (9) JP 3922723 B2 2007.5.30 生 物 の 耐 性 の 逆 転 に よ っ て 実 証 さ れ る か も し れ な い 。 例 示 的 な モ デ ル ま た は 試 験 は 、 Anti biotics in Laboratory Medicine、 第 ３ 版 （ Lorian， V.編 ） 、 432∼ 492頁 、 Williams and Wilkins、 Baltimore MD（ 1991） の 「 Eliopoulos and Moellering」 に 記 載 さ れ て い る 。 本明細書中で使用される「同時投与」あるいは「共同処置」には、薬剤を併用すなわち組 み 合 わ せ て 、 一 緒 に ま た は 相 前 後 し て 投 与 す る こ と が 包 含 さ れ る 。 BPIタ ン パ ク 質 産 物 （ 活性増強ポロキサマーを用いて製剤化されたもの）及び抗生物質は、異なる経路によって 投 与 さ れ て も よ い 。 例 え ば 、 製 剤 化 し た BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 静 脈 内 投 与 し 、 一 方 抗 生 物 質を筋肉、静脈内、皮下、経口または腹膜組織内に投与してもよい。あるいは、製剤化し た BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 腹 腔 組 織 内 に 投 与 し 、 一 方 抗 生 物 質 を 腹 腔 組 織 内 も し く は 静 脈 内 に 投 与 し た り 、 ま た は 製 剤 化 し た BPIタ ン パ ク 質 産 物 を エ ア ロ ゾ ル も し く は 霧 状 の 剤 形 に 10 て 投 与 し 、 一 方 抗 生 物 質 を 例 え ば 静 脈 内 投 与 し て も よ い 。 製 剤 化 し た BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 抗 生 物 質 は 、 好 ま し く は 双 方 と も 静 脈 内 投 与 さ れ る 。 製 剤 化 し た BPIタ ン パ ク 質 産 物 及び抗生物質は、同じ静脈内ラインを介して（間に水洗をした後）引き続き与えるか、ま た は 異 な る 静 脈 内 ラ イ ン を 介 し て 与 え て も よ い 。 製 剤 化 し た BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 抗 生 物質は、双方の薬剤とも感染の部位において有効濃度に達することを許容するに充分なよ うに与えられる限りにおいて、同時にまたは引き続き投与することができる。 製 剤 化 し た BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 抗 生 物 質 の 同 時 投 与 に よ っ て 、 細 菌 感 染 の さ ら に 効 果 的な処置が提供されると予測される。２つの薬剤の同時投与で、どちらかの薬剤を単独で 投 与 し た 場 合 よ り も 、 in vivoに お い て 一 層 大 き な 治 療 効 果 が 提 供 さ れ る か も し れ な い 。 それによって、同等の治療効果を達成しつつ、一方または双方の薬剤の投与量を低減させ 20 ることが可能となるかもしれない。あるいは、同時投与によって、いずれかの薬剤を単独 で用いた場合に達成可能な効果よりもさらに迅速または完全な殺菌／静菌効果が生み出さ れるかもしれない。 治 療 的 有 効 性 は 、 首 尾 良 い 臨 床 上 の 成 果 に 相 関 す る も の で あ り 、 感 染 に 関 わ る 生 物 の 100 ％が抗微生物剤または複数の薬剤により死滅せしめられることが必要なわけではない。成 功は、宿主にとって利となるようにバランスを傾けるよう、細菌を阻害するに充分な、感 染部位における抗細菌活性のレベルを達成することに依存している。宿主の防御が最高度 に 有 効 で あ る 場 合 に は 、 必 要 な 抗 細 菌 効 果 は 、 低 く て も よ い 。 １ の 対 数 （ 底 （ factor） 10 ）にまで生物への負荷量を減じてでさえも、感染を制御するための宿主自身の防御が許容 されるかもしれない。加えて、初期の殺菌／静菌効果を増大させることが、長期間の殺菌 30 ／静菌効果よりも重要でありうる。これらの初期の成果によって、宿主の防御機構を活性 化する時間が与えられるので、このような初期成果は重要であり、治療の成功に決定的な 部分である。殺菌の速度を増大させることは、髄膜炎、骨または関節の感染などの感染症 に ［ Stratton、 Antibiotics in Laboratory Medicine、 第 ３ 版 （ Lorian， V.編 ） 、 849∼ 8 79頁 、 Williams and Wilkins、 Baltimore MD（ 1991） ］ 、 あ る い は 、 抗 生 物 質 に 対 す る 感 受性が低下しているのかもしれない、生育の遅い生物に関わる感染症にも特に重要である かもしれない。 本 明 細 書 に お い て 用 い ら れ る 「 BPIタ ン パ ク 質 産 物 」 に は 、 天 然 に て 及 び 組 換 え に よ り 製 造 さ れ る BPIタ ン パ ク 質 ； 天 然 、 合 成 、 及 び 組 換 え の 、 BPIタ ン パ ク 質 の 生 物 学 的 に 活 性 を 有 す る ポ リ ペ プ チ ド 断 片 ； ハ イ ブ リ ッ ド 融 合 タ ン パ ク 質 及 び ダ イ マ ー を 含 む 、 BPIタ ン パ 40 ク質またはその断片の生物学的に活性を有するポリペプチド変異体；システインで置換さ れ た 類 似 体 を 含 む 、 BPIタ ン パ ク 質 ま た は そ の 断 片 ま た は 変 異 体 の 、 生 物 学 的 に 活 性 を 有 す る ポ リ ペ プ チ ド 類 似 体 ； な ら び に BPI由 来 ペ プ チ ド が 包 含 さ れ る 。 本 発 明 に 従 っ て 投 与 さ れ る BPIタ ン パ ク 質 産 物 は 、 当 該 技 術 分 野 に お い て 知 ら れ て い る い か な る 手 段 に よ っ て 生産及び／または単離してもよい。引用することによりその開示が本明細書に含まれるも の で あ る 、 米 国 特 許 第 5,198,541号 に rBPI 5 0 と 称 さ れ る 組 換 え BPIホ ロ タ ン パ ク 質 及 び BPI の 組 換 え 断 片 を 包 含 す る BPIタ ン パ ク 質 を コ ー ド す る 組 換 え 遺 伝 子 、 及 び そ の 発 現 の た め の 方 法 が 開 示 さ れ て い る 。 共 有 で あ り 係 属 中 の 米 国 特 許 出 願 第 07/885,501号 及 び そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 1993年 5月 19日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/072,063号 そ し て 1993年 5月 19日 に 出 願 さ れ た 、 対 応 の PCT出 願 No． 93/04752は 、 す べ て 引 用 す る こ と に よ り そ の 開 示 50 (10) JP 3922723 B2 2007.5.30 が本明細書に含まれるものであるが、遺伝的に形質転換した培養中の哺乳動物宿主細胞に お い て 発 現 し 、 且 つ そ の 細 胞 か ら 分 泌 さ れ る 組 換 え BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 精 製 の た め の 新 規な方法を開示しており、また、安定で均質な医薬調剤に配合するのに好適な、大量の組 換 え BPI産 物 を ど の よ う に 製 造 す る か を 開 示 し て い る 。 BPIの 生 物 学 的 に 活 性 を 有 す る 断 片 （ BPI断 片 ） に は 、 そ の 断 片 分 子 が 、 ホ ロ タ ン パ ク 質 の アミノ末端アミノ酸、内部アミノ酸、及び／またはカルボキシ末端アミノ酸を欠くことを 除 い て は 、 天 然 の ヒ ト BPIホ ロ タ ン パ ク 質 と 同 じ か ま た は 類 似 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る 、 生 物 学 的 に 活 性 を 有 す る 分 子 が 包 含 さ れ る 。 こ の よ う な 断 片 の 例 に 、 Ooiら 、 J.Exp.Med. 、 174巻 、 649頁 （ 1991） に 記 載 さ れ る お よ そ 25kDの 天 然 ヒ ト BPIの Ｎ -末 端 断 片 、 及 び Gazz ano-Santoroら 、 Infect.Immun． 60巻 、 4754∼ 4761頁 （ 1992） に 記 載 さ れ 、 rBPI 2 3 と 称 さ 10 れ て い る 天 然 ヒ ト BPIの 第 １ 位 よ り お よ そ 第 193ま た は 199位 ま で の Ｎ -末 端 ア ミ ノ 酸 を コ ー ド す る DNAの 組 換 え 発 現 産 物 が 包 含 さ れ る が 、 こ れ ら に 限 定 さ れ る も の で は な い 。 か か る 出 版 物 に お い て 、 Grayら 、 前 出 の 図 １ に 示 さ れ る ご と き 、 31残 基 の シ グ ナ ル 配 列 及 び 成 熟 ヒ ト BPIの Ｎ -末 端 の 最 初 の 199ア ミ ノ 酸 を 有 す る 組 換 え 発 現 産 物 （ rBPI 2 3 ） を コ ー ド す る D NA（ 第 151位 の バ リ ン が Ｇ Ｔ Ｃ で な く Ｇ Ｔ Ｇ で 特 定 さ れ 、 第 185位 の 残 基 が リ ジ ン （ Ａ Ａ Ｇ で特定される）でなくグルタミン酸（ＧＡＧで特定される）であるという例外を含む）の 供 給 源 と し て 、 発 現 ベ ク タ ー が 用 い ら れ た 。 Grayら 、 前 出 の 図 １ に 示 さ れ る 配 列 （ 配 列 番 号 ： １ 及 び ２ 、 rBPI 2 3 に つ い て 注 解 し た 例 外 及 び 第 417位 の 残 基 が バ リ ン （ Ｇ Ｔ Ｔ で 特 定 される）でなくアラニン（ＧＣＴで特定される）であるという点は異なる）を有する組換 え ホ ロ タ ン パ ク 質 （ rBPI） も 製 造 さ れ て い る 。 他 の 例 に は 、 共 有 で あ り 係 属 中 の 、 1994年 20 3月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/212,132号 及 び 対 応 す る PCT出 願 No． PCT/US95/031 25号 （ 引 用 す る こ と に よ り そ れ ら の 開 示 が 本 明 細 書 に 含 ま れ る も の で あ る ） に 記 載 さ れ る ご と き 、 BPI断 片 の ダ イ マ ー 型 が 包 含 さ れ る 。 好 ま し い ダ イ マ ー 産 物 に は 、 モ ノ マ ー が 、 B PIホ ロ タ ン パ ク 質 の お よ そ 第 1∼ 175か ら 、 お よ そ 第 1∼ 199ま で の Ｎ -末 端 残 基 を 有 す る ア ミ ノ 末 端 BPI断 片 で あ る 、 ダ イ マ ー BPIタ ン パ ク 質 産 物 が 包 含 さ れ る 。 特 に 好 ま し い ダ イ マ ー 産 物 は 、 rBPI 4 2 ダ イ マ ー と 名 付 け ら れ た 、 Ｎ -末 端 残 基 第 1か ら 193ま で を 有 す る BPI断 片 のダイマー型である。 BPIの 生 物 学 的 に 活 性 を 有 す る 変 異 体 （ BPI変 異 体 ） に は 、 BPIホ ロ タ ン パ ク 質 ま た は そ の 生物学的に活性を有する断片及び少なくとも一つの他のポリペプチドの少なくとも一部を 含 む 組 換 え ハ イ ブ リ ッ ド 融 合 タ ン パ ク 質 、 な ら び に BPI変 異 体 の ダ イ マ ー 型 が 包 含 さ れ る 30 が、これらに限定されない。このようなハイブリッド融合タンパク質及びダイマー型の例 は 、 共 有 で あ り 係 属 中 の 米 国 特 許 出 願 第 07/885,911号 （ Theofanら に よ る ） 及 び そ の 一 部 継 続 出 願 で あ る 1993年 5月 19日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/064,693号 及 び 対 応 す る 199 3年 5月 19日 に 出 願 さ れ た PCT出 願 第 No． US93/04754号 （ す べ て 引 用 す る こ と に よ り そ の 開 示 が 本 明 細 書 に 含 ま れ る も の で あ る ） に 記 載 さ れ て お り ア ミ ノ 末 端 端 部 で BPIタ ン パ ク 質 またはその生物学的活性を有する断片、及びカルボキシ末端端部で少なくとも１つの免疫 グロブリン重鎖の定常ドメインまたはその対立変異体を含む、ハイブリッド融合タンパク 質 を 包 含 す る 。 同 様 に 形 成 し た 、 リ ポ 多 糖 結 合 タ ン パ ク 質 （ LBP） の 一 部 ま た は す べ て を 包含するハイブリッド融合タンパク質もまた、本発明における使用に企図されている。 BPIの 生 物 学 的 に 活 性 を 有 す る 類 似 体 （ BPI類 似 体 ） に は 、 １ 以 上 の ア ミ ノ 酸 残 基 が 異 な る 40 ア ミ ノ 酸 に 置 換 さ れ て い る BPIタ ン パ ク 質 産 物 が 包 含 さ れ る が 、 こ れ ら に 限 定 さ れ な い 。 例 え ば 、 共 有 で あ り 係 属 中 の 1993年 2月 2日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/013,801号 及 び 対 応 す る 1994年 2月 2日 に 出 願 さ れ た PCT出 願 No． US94/01235号 （ す べ て 引 用 す る こ と に よ りその開示が本明細書に含まれるものである）に、システイン残基が異なるアミノ酸で置 換 さ れ た BPI及 び BPI断 片 の ポ リ ペ プ チ ド 類 似 体 が 開 示 さ れ て い る 。 こ の 出 願 に 記 載 さ れ た 好 ま し い BPIタ ン パ ク 質 産 物 は 、 BPIホ ロ タ ン パ ク 質 の Ｎ -末 端 ア ミ ノ 酸 の 第 1ア ミ ノ 酸 か ら お よ そ 第 193ま た は 199ま で の ア ミ ノ 酸 を コ ー ド す る DNAの 発 現 産 物 （ 但 し 、 第 132番 目 の 残 基 の シ ス テ イ ン が ア ラ ニ ン で 置 換 さ れ て お り 、 rBPI 2 1 Δ cysま た は rBPI 2 1 と 名 付 け ら れ て い る ） で あ る 。 他 の 例 と し て は 、 BPI類 似 体 の ダ イ マ ー 型 が 包 含 さ れ る 。 例 え ば 、 共 有 で あ り 係 属 中 の 1994年 3月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/212,132号 及 び 対 応 す る PCT出 50 (11) JP 3922723 B2 2007.5.30 願 No． PCT/US95/03125（ 引 用 す る こ と に よ り そ の 開 示 が 本 明 細 書 に 含 ま れ る も の で あ る ） 。 本 発 明 の 方 法 に 有 用 な 他 の BPIタ ン パ ク 質 産 物 は 、 共 有 で 係 属 中 の 、 1995年 7月 20日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/504,841号 、 及 び 1994年 9月 15日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/ 306,473号 に 対 応 す る 、 共 有 で あ り 係 属 中 の 1994年 9月 15日 に 出 願 さ れ た PCT出 願 第 US94/01 0427号 、 及 び 、 1993年 3月 12日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/030,644号 の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1993年 7月 15日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/093,202号 （ こ れ に 対 応 す る 国 際 出 願 は 、 1994年 3月 11日 に 出 願 さ れ た PCT出 願 第 US94/02401号 で あ る ） の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 1994年 1月 14日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/183,222号 の 一 部 継 続 出 願 で あ る 、 199 4年 3月 11日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/209,762号 に 対 応 す る 、 1994年 3月 11日 に 出 願 10 さ れ た PCT出 願 第 US94/02465号 （ こ れ ら は す べ て 引 用 す る こ と に よ り そ の 開 示 が 本 明 細 書 に含まれるものである）に記載されるものなどの、組換えまたは合成手段により生産され る BPI由 来 の ま た は そ れ ら BPIに 基 づ く ペ プ チ ド （ BPI由 来 ペ プ チ ド ） で あ る 。 現 在 の と こ ろ 好 ま し い BPIタ ン パ ク 質 産 物 に は 、 組 換 え に よ っ て 生 産 さ れ た BPIの Ｎ -末 端 断 片 、 特 に rBPI 2 3 ま た は rBPI 2 1 な ど の 、 お よ そ 21か ら 25kDの あ い だ の 分 子 量 を 有 す る も の 、 も し く は 、 こ れ ら Ｎ -末 端 断 片 の ダ イ マ ー 型 （ 例 え ば rBPI 4 2 ダ イ マ ー ） が 包 含 さ れ る 。 加 う る に 、 好 ま し い BPIタ ン パ ク 質 産 物 に は 、 rBPI 5 0 及 び BPI由 来 ペ プ チ ド が 包 含 さ れ る 。 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 投 与 は 、 好 ま し く は BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 医 薬 的 に 容 認 さ れ う る 希 釈 剤 、 佐 剤 ま た は 担 体 を 含 む 、 医 薬 組 成 物 を 用 い て 成 し 遂 げ ら れ る 。 BPIタ ン パ ク 質 産 物 は、既知の界面活性剤、他の化学療法剤または付加的な既知の抗微生物剤と併用してまた 20 は 併 用 せ ず に 投 与 す る こ と が で き る 。 BPIタ ン パ ク 質 産 物 （ 例 え ば 、 rBPI 5 0 、 rBPI 2 3 ） を 含 有 す る 医 薬 組 成 物 の 一 つ は 、 0.1重 量 ％ の ポ ロ キ サ マ ー 188（ Pluronic F-68、 BASF Wyan dotte、 Parsippany、 ニ ュ ー ジ ャ ー ジ ー 州 ） 及 び 0.002重 量 ％ の ポ リ ソ ル ベ ー ト 80（ Tween 80、 ICI Americans Inc.、 Wilmington、 デ ラ ウ ェ ア 州 ） を 含 む ク エ ン 酸 緩 衝 性 生 理 食 塩 水 （ 5ま た は 20mMク エ ン 酸 塩 、 150mM NaCl、 pH5.0） 中 に 、 1mg/mlの 濃 度 で BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 含 む も の で あ る 。 BPIタ ン パ ク 質 産 物 （ 例 え ば rBPI 2 1 ） を 含 有 す る 他 の 医 薬 組 成 物 は 、 5mMク エ ン 酸 塩 、 150mM NaCl、 0.2％ ポ ロ キ サ マ ー 188及 び 0.002％ ポ リ ソ ル ベ ー ト 80中 に 2mg/mlの 濃 度 で BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 含 む も の で あ る 。 こ の よ う な 組 合 せ が 、 1994年 2月 2 日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/190,896号 及 び 1993年 2月 2日 に 出 願 さ れ た 米 国 特 許 出 願 第 08/012,360号 に 対 応 す る 、 共 有 で 係 属 中 の 、 1994年 2月 2日 に 出 願 さ れ た PCT出 願 第 US94/ 30 01239号 に 記 載 さ れ て お り 、 こ れ ら は す べ て 引 用 す る こ と に よ り そ の 開 示 が 本 明 細 書 に 含 まれるものである。 本発明の他の特徴及び利点は、以下の例示的な実施例を考慮すれば明らかになるであろう 。 実 施 例 １ に は 、 S． aureus（ ス タ フ ィ ロ コ ッ カ ス ・ ア ウ レ ウ ス ） ま た は A． baumannii（ ア シ ネ ト バ ク タ ー ・ バ ウ マ ニ ー 、 旧 称 は A． anitratus（ エ ー ・ ア ニ ト ラ タ ス ） ） に 対 す る 、 水 中 で の BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 殺 菌 活 性 へ の ポ ロ キ サ マ ー 403ま た は ポ ロ キ サ マ ー 334の 効 果 を 述 べ る 。 実 施 例 ２ に は 、 A． baumannii、 S． aureus、 N． meningiditis（ ナ イ セ リ ア ・ メ ニ ン ギ デ ィ テ ィ ス ） ま た は P． aeruginosa（ シ ュ ー ド モ ナ ス ・ ア エ ル ギ ノ ー サ ） に 対 す る 、 血 清 、 ブ ロ ス ま た は 水 中 で の 非 製 剤 化 ま た は 製 剤 化 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 殺 菌 活 性 へ の ポ ロ キ サ マ ー 333ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403の 効 果 を 表 す 。 実 施 例 ３ は 、 S． pneumoniae 40 （ ス ト レ プ ト コ ッ カ ス ・ ニ ュ ー モ ニ エ ） 、 S． aureus、 E． faecium（ イ ー ・ フ ァ エ シ ウ ム ） ま た は A． baumanniiに 対 す る 水 中 で の BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 殺 菌 活 性 へ の ポ ロ キ サ マ ー 3 33ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403の 効 果 を 表 す 。 実 施 例 ４ は 、 他 の ポ ロ キ サ マ ー の 使 用 に 関 す る 。 実 施 例 ５ に は 、 A． baumannii、 S． aureus、 S． pneumoniae、 E． faecium、 ま た は P． aer uginosaに 対 す る 、 血 清 、 Mueller-Hintonブ ロ ス 、 ト リ プ シ ン ・ ダ イ ズ ・ ブ ロ ス 、 ま た は 水 の 中 に お け る BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 殺 菌 活 性 へ の ポ ロ キ サ マ ー 188、 333、 334、 335、 ま た は 403（ EDTAを 添 加 ま た は 添 加 せ ず ） の 効 果 を 表 す 。 実 施 例 ６ に は 、 抗 生 物 質 に 対 す る 様 々 な 生 物 の 感 受 性 へ の 、 EDTAの 存 在 下 ま た は 非 存 在 下 に お け る BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 188、 333、 334、 335、 ま た は 403を 含 有 す る 組 成 物 の 効 果 を 表 す 。 実 施 例 ７ に は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 抗 細 菌 活 性 増 強 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 有 す る 組 成 物 50 (12) JP 3922723 B2 2007.5.30 の 、 角 膜 損 傷 及 び 潰 瘍 形 成 の ウ サ ギ モ デ ル に お け る 効 果 を 表 す 。 実 施 例 ８ に は 、 EDTAの 存 在 下 ま た は 非 存 在 下 で の 、 様 々 な 細 菌 及 び 真 菌 の 生 育 に 対 す る 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 188ま た は 403を 含 有 す る 組 成 物 の 効 果 を 表 す 。 実施例１ S． aureusま た は A． baumanniiに 対 す る 、 水 中 で の BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 40 3ま た は ポ ロ キ サ マ ー 334を 含 有 す る 組 成 物 の 殺 菌 活 性 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 、 ポ ロ キ サ マ ー 403（ PLURONIC P123、 BASF Wyandotte Corp.、 Parsi ppany、 ニ ュ ー ジ ャ ー ジ ー 州 ） 、 熱 処 理 し た PLURONIC 123、 ま た は 熱 処 理 し た ポ ロ キ サ マ ー 334（ PLURONIC P104、 BASF Wyandotte Corp.） の う ち の い ず れ か と を 含 む 治 療 用 組 成 物 の 殺 菌 活 性 を 、 Microscan（ 登 録 商 標 ） ラ イ ブ ラ リ ー （ Dade Microscan、 West Sacramento 10 、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） か ら の 細 菌 の 臨 床 分 離 株 に 対 し て 評 価 し た 。 1mg/mLの rBPI 2 1 及 び 0. 1％ （ 重 量 ／ 容 量 ） の PLURONIC P123ま た は 熱 処 理 し た PLURONIC P123を 含 む 治 療 用 組 成 物 を 、 「 非 製 剤 化 」 rBPI 2 1 の 2mg/mL溶 液 （ 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 及 び 150mM NaClを 含 み 、 全 く 界 面 活 性 剤 を 含 ま な い の 緩 衝 液 中 ） を 、 PLURONIC P123の 0.2％ 溶 液 と 1:2の 割 合 で 希 釈 す る こ と に よ り 製 剤 化 し た 。 2mg/mLの rBPI 2 1 及 び 0.1％ （ 重 量 ／ 容 量 ） の 熱 処 理 し た PLU RONIC P104を 含 む 治 療 用 組 成 物 を 調 製 し た 。 0.1％ の PLURONIC P123ま た は 0.1％ の 熱 処 理 し た PLURONIC P123の み を 含 有 し 、 rBPI 2 1 を 含 ま な い ポ ロ キ サ マ ー 対 照 溶 液 も 調 製 し た 。 1.0％ PLURONIC P123の 滅 菌 保 存 溶 液 は 、 PLURONIC P123を 脱 イ オ ン 水 中 で 溶 解 す る ま で 攪 拌 し 、 そ の 溶 液 を 0.22μ m Nalgeneフ ィ ル タ ー ユ ニ ッ ト （ Nalgene Co.、 Rochester、 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 ） を 通 し て 濾 過 す る こ と に よ り 調 製 し た 。 熱 処 理 し た PLURONIC P123の 滅 菌 保 20 存 溶 液 は 、 以 下 の 方 法 を 使 用 し て 調 製 し た 。 す な わ ち 、 （ １ ） 脱 イ オ ン 水 で 、 PLURONIC P 123の 1.0％ （ 重 量 ／ 容 量 ） 溶 液 を つ く り 、 （ ２ ） 沸 騰 す る ま で そ の 溶 液 を 加 熱 し 、 （ ３ ） 溶 液 を 熱 源 か ら 離 し 、 （ ４ ） 室 温 に ま で 冷 却 さ せ 、 （ ５ ） PLURONIC P123が 完 全 に 可 溶 化 す る ま で 攪 拌 し 、 そ し て （ ６ ） 滅 菌 の た め に 、 溶 液 を 0.22μ m Nalgeneフ ィ ル タ ー ユ ニ ッ トに通して濾過した。あるいは、保存溶液を滅菌するためにオートクレーブにかけてもよ い 。 熱 処 理 し た PLURONIC P104は 、 同 様 に 調 製 し た 。 ア ッ セ イ に お い て 使 用 さ れ る べ き 細 菌 、 す な わ ち 、 S． aureus（ Microscan（ 登 録 商 標 ） 、 ID番 号 052-106） 及 び A． baumannii（ Microscan（ 登 録 商 標 ） 、 ID番 号 12291） は 、 ト リ プ シ ン ・ ダ イ ズ 寒 天 （ TSA） プ レ ー ト （ Remel、 カ タ ロ グ #01-920、 Lenexa、 KN） で ２ ４ 時 間 4 生 育 し た 。 約 4か ら 7x10 細 胞 /mLの 細 菌 保 存 懸 濁 液 は 、 注 射 用 滅 菌 水 （ Kendall McGaw Lab 30 oratory、 Irvine、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） 中 の 細 菌 コ ロ ニ ー を 、 0.5 McFarland標 準 液 に 懸 濁 し て 、 さ ら に 水 で 1： 10に 希 釈 す る こ と に よ り 調 製 し た 。 ア ッ セ イ は 、 944μ Lの 注 射 用 滅 菌 水 を 4.5mLの ポ リ プ ロ ピ レ ン チ ュ ー ブ （ Nalgene Cryovial、 Nalge Co.、 Rochester、 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 ） に 添 加 し 、 次 い で 40μ Lの 細 菌 懸 濁 液 、 続 い て 16μ Lの 1mg/mL rBPI 2 1 /0.1 ％ PLURONIC P123治 療 用 組 成 物 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 対 照 溶 液 （ ま た は 8μ Lの 2mg/mL rBPI 2 1 /0.1％ PLURONIC P104治 療 用 組 成 物 ） を 添 加 す る こ と に よ っ て 行 っ た 。 チ ュ ー ブ を 反 転 さ せ て 混 合 し 、 そ し て 37℃ に て ３ ０ 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン の 後 、 各 々 の チ ュ ー ブ か ら の 10μ Lを TSAプ レ ー ト に 播 種 し て 10 -2 の希釈率にて、及び各々のチュ ー ブ か ら の 10μ Lを TSAプ レ ー ト に 1： 100の 希 釈 率 で 播 種 す る こ と に よ り 10 -4 の希釈率にて 残 存 す る コ ロ ニ ー 形 成 単 位 （ CFU） を 計 数 し た 。 TSAプ レ ー ト は 、 37℃ に て １ ８ 時 間 イ ン キ ュベートし、細菌コロニーの数を目視下に計数した。結果を以下の表１及び２に示す。 40 (13) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 実施例２ S． AUREUS及 び A． BAUMANNIIに 対 す る 血 清 、 ブ ロ ス 及 び 水 中 に お け る 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 333を 含 有 す る 組 成 物 の 殺 菌 活 性 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と 、 ポ ロ キ サ マ ー 333（ PLURONIC P103、 BASF Wyandotte Corp.） ま た 30 は 熱 処 理 し た PLURONIC P103の い ず れ か と を 含 む 治 療 用 組 成 物 の 殺 菌 活 性 を 、 実 施 例 １ の 臨 床 分 離 株 に 対 し て 評 価 し た 。 160μ g/mLの rBPI 2 1 と 、 様 々 な 濃 度 の PLURONIC P103ま た は 熱 処 理 し た PLURONIC P103の い ず れ か を 含 む 治 療 用 組 成 物 は 、 「 非 製 剤 化 」 rBPI 2 1 の 2mg/m L溶 液 （ 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 及 び 150mM NaClを 含 み 、 界 面 活 性 剤 を 全 く 含 ま な い 緩 衝 液 中 ） を 、 適 量 の PLURONIC P103ま た は 熱 処 理 し た PLURONIC P103溶 液 で 共 に 希 釈 す る こ と に よ っ て 製 剤 化 し た 。 2mg/mLの rBPI 2 1 、 0.2％ ポ ロ キ サ マ ー 188（ PLURONIC F68、 BASF Wyand otte Corp.） 、 0.002％ TWEEN 80（ ポ リ ソ ル ベ ー ト 80、 ICI Americas、 Wilmington、 デ ラ ウ ェ ア 州 ） 、 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 及 び 150mM NaClを 含 有 す る 「 製 剤 化 し た 」 rBPI 2 1 溶 液 も 、 比 較 用 に 試 験 し た 。 0.1％ PLURONIC P103ま た は 0.1％ の 熱 処 理 し た PLURONIC P103 を 含 有 し 、 rBPI 2 1 を 含 ま な い ポ ロ キ サ マ ー 対 照 溶 液 も 調 製 し た 。 40 PLURONIC P103の 0.1％ （ 重 量 ／ 容 量 ） 溶 液 は 、 脱 イ オ ン 水 中 で PLURONIC P103が 溶 解 す る ま で 攪 拌 し 、 そ し て 、 そ の 溶 液 を 0.22μ mセ ル ロ ー ス ア セ テ ー ト ポ リ ス チ レ ン フ ィ ル タ ー ユ ニ ッ ト （ Corning Inc.、 Corning、 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 ） を 通 し て 濾 過 す る こ と に よ り 調 製 し た 。 熱 処 理 し た PLURONIC P103の 滅 菌 保 存 溶 液 は 、 以 下 の 方 法 を 使 用 し て 調 製 し た 。 す な わ ち 、 （ １ ） 脱 イ オ ン 水 で 、 PLURONIC P103の 0.1％ （ 重 量 ／ 容 量 ） 溶 液 を つ く り 、 （ ２ ） そ の 溶 液 を ３ ０ 分 間 沸 騰 さ せ 、 （ ３ ） 室 温 に ま で 冷 却 さ せ 、 （ ４ ） PLURONIC P103が 完 全 に 可 溶 化 す る ま で 攪 拌 し 、 そ し て （ ５ ） 滅 菌 の た め に 溶 液 を 0.22μ m Acrodiscフ ィ ル タ ー ユ ニ ッ ト （ Gelman Sciences、 Ann Arbor、 ミ シ ガ ン 州 ） に 通 し て 濾 過 し た 。 ア ッ セ イ に お い て 使 用 さ れ る べ き 細 菌 は 、 ト リ プ シ ン ・ ダ イ ズ 寒 天 （ TSA） プ レ ー ト （ Rem el、 カ タ ロ グ #01-920、 Lenexa、 KN） で ２ ４ 時 間 生 育 し た 。 S． aureusは 、 Fildes富 化 培 地 50 (14) JP 3922723 B2 2007.5.30 中 で さ ら に ２ 時 間 生 育 し た 。 細 菌 の 保 存 懸 濁 液 は 、 滅 菌 脱 イ オ ン 水 中 に 、 Microscan（ 登 録 商 標 ） Turbidity Meter（ Dade Microscan、 West Sacramento、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） に よ 8 っ て 測 定 し て 、 お よ そ 2.2か ら 3.8x10 コ ロ ニ ー 形 成 単 位 （ CFU） /mLに な る よ う に 懸 濁 さ せ 、 さ ら に 水 で 1： 10に 希 釈 す る こ と に よ り 調 製 し た 。 ア ッ セ イ は 、 96ウ ェ ル 平 底 ミ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト （ Corning、 カ タ ロ グ #25860-96） に て 、 各 ウ ェ ル に 170μ Lの 血 清 （ Sigma #S1764、 St． Louis、 ミ ズ ー リ 州 ） 、 ト リ プ シ ン ・ ダ イ ズ ・ ブ ロ ス （ TSB、 Remel、 カ タ ロ グ #08-942、 Lenexa、 KN） ま た は 注 射 用 滅 菌 水 （ Kendall McGaw） ； 10μ Lの 細 菌 懸 濁 液 （ ま た は 対 照 と し て 水 ） ； 20μ Lの 示 さ れ た 通 り の 160μ g/mLの rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 治 療 用 組成物（または対照としてポロキサマー対照溶液または水単独）を添加することによって 5 行 っ た 。 各 ウ ェ ル 中 の 細 菌 の 最 終 濃 度 は 、 約 4か ら 7x10 CFU/mLで あ っ た 。 ウ ェ ル の 中 身 を 混 合 し 、 プ レ ー ト を 37℃ に て ４ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン に 続 い て 、 各 ウ ェ ル に 残 存 す る コ ロ ニ ー 形 成 単 位 （ CFU） を 、 各 々 の ウ ェ ル か ら の 10μ Lを TSAプ レ ー ト に 播 種 し て 10 -2 の 希 釈 率 に て 計 数 し た 。 TSAプ レ ー ト は 、 37℃ に て ２ ４ 時 間 イ ン キ ュ ベ ートし、細菌コロニーの数を目視下に計数した。結果を以下の表３に示す。対照ウェルに ついてのコロニー計数は、以下の表４及び５に示す。 10 (15) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (16) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (17) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 追 加 の 実 験 を 行 っ て 、 熱 処 理 し た PLURONIC P104溶 液 を 用 い た 様 々 な 製 剤 化 さ れ た BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 希 釈 す る こ と に よ り 調 製 し 、 そ し て 血 清 で 連 続 的 に ２ 倍 に 希 釈 し た A． bauma nniiに 対 す る 試 験 を し た 治 療 用 組 成 物 を 調 べ た 。 こ れ ら の 実 験 に お い て 、 低 血 清 濃 度 に て ある程度の殺菌活性が観察されることが認められた（血清濃度を連続的に２倍に低減する こ と に 呼 応 し た 、 CFUの 連 続 的 な 50％ の 減 少 で 実 証 さ れ る ） 。 rBPI 2 3 に つ い て は 、 血 清 濃 度 12.5％ 以 下 で 殺 菌 活 性 が 観 察 さ れ た 。 rBPI 2 1 に つ い て は 、 血 清 濃 度 6.25％ 以 下 で 殺 菌 活 性 が 観 察 さ れ た 。 rBPI 4 2 ダ イ マ ー 及 び rBPI 5 0 に つ い て は 、 1.6％ 以 下 の 希 釈 率 に て 殺 菌 活 性が観察された。 40 Microscan（ 登 録 商 標 ） Pluronic Inoculum Water（ Dade Microscan、 West Sacramento、 カリフォルニア州）を用いて同様に行った別の実験では、この産物は殺菌活性を増強する 効 果 を 呈 し た 。 ポ ロ キ サ マ ー 335（ PLURONIC P105、 BASF Wyendotte Corp.） を 用 い て 同 様 に実施した予備実験において、このポロキサマーもまた、ある程度の殺菌活性増強効果を 有することが観察された。 さ ら な る 実 験 で 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 む 治 療 用 組 成 物 の 殺 菌 活 性 を 、 Neisseria meningiditis（ Ｃ 型 ） （ Microscan（ 登 録 商 標 ） ID番 号 410-001） 、 Pseudomonas aeruginosa（ 12.4.4株 、 S.M． Opal、 Brown University、 Providence、 Rho de Islandよ り 提 供 ； Ammonsら 、 J． Infect． Diseases、 170:1473∼ 82頁 （ 1994） に 参 照 さ れ て い る ） 、 及 び Acinetobacter baumannii（ Microscan（ 登 録 商 標 ） ID番 号 12300） の 臨 50 (18) JP 3922723 B2 2007.5.30 床 分 離 株 に 対 し て 評 価 し た 。 以 下 の 治 療 用 組 成 物 を 調 製 し た 。 す な わ ち 、 2mg/mL rBPI 2 1 ； （ a） ポ ロ キ サ マ ー 188（ PLURONIC F68） 、 （ b） ポ ロ キ サ マ ー 333（ PLURONIC P103） 、 （ c） ポ ロ キ サ マ ー 334（ PLURONIC P104） 、 （ d） ポ ロ キ サ マ ー 335（ PLURONIC P105） ま た は （ e） ポ ロ キ サ マ ー 403（ PLURONIC P123） の い ず れ か 0.2％ ； 0.002％ ポ リ ソ ル ベ ー ト 80 （ TWEEN 80） ； 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム ； 及 び 150mM NaClを 含 む 治 療 用 組 成 物 を 調 製 し た 。 0.2％ PLURONIC P123、 P103ま た は F68の み を 含 有 し 、 rBPI 2 1 を 含 ま な い ポ ロ キ サ マ ー の 対照溶液も調製した。 こ れ ら の さ ら な る ア ッ セ イ に お い て 使 用 す べ き 細 菌 は 、 P． aeruginosaま た は A． baumanni iつ い て は ト リ プ シ ン ・ ダ イ ズ 寒 天 （ TSA） プ レ ー ト （ Remel、 カ タ ロ グ #01-920、 Lenexa、 KN） そ レ て N． meningiditisに つ い て は チ ョ コ レ ー ト 寒 天 プ レ ー ト （ Remel、 カ タ ロ グ #01- 10 301、 Lenexa、 KN） で お よ そ ２ ４ 時 間 生 育 し た 。 細 菌 保 存 懸 濁 液 は 、 滅 菌 生 理 食 塩 水 （ 0.9 ％ 塩 化 ナ ト リ ウ ム 潅 注 水 、 Kendall McGaw Laboratory、 Irvine、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） 中 に 、 Microscan（ 登 録 商 標 ） Turbidity Meter（ Dade Microscan、 West Sacramento、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） に よ っ て 測 定 し て 、 0.5 McFarland標 準 液 と 同 等 に ま で 細 菌 コ ロ ニ ー を 懸 濁 さ せ 、 さ ら に 生 理 食 塩 水 で 1： 10に 希 釈 す る こ と に よ っ て 調 製 し た 。 ア ッ セ イ は 、 4.5mLの ポ リ プ ロ ピ レ ン チ ュ ー ブ （ Nalgene Cryovial、 Nalge Co.、 Rochester、 ニ ュ ー ヨ ー ク ） に 、 最 終 容 量 1mLに て 、 N． meningitidisに つ い て は 2％ Fildes Enrichment（ Remel、 カ タ ロ グ #06-1496、 Lenexa、 KN） を 含 む Mueller-Hinton Broth、 ま た は 、 P． aeruginosaに つ い て は Mueller-Hinton Brothプ ラ ス Cations（ CSMHB、 Remel） の 982μ Lま た は 974μ L、 次 い で 、 10μ Lの 細 菌 懸 濁 液 （ ま た は 対 照 と し て ブ ロ ス 培 地 ） ； そ し て 8ま た は 16μ Lの 、 2mg/m 20 L rBPI 2 1 ／ ポ ロ キ サ マ ー 治 療 用 組 成 物 を 添 加 し て 行 っ た 。 チ ュ ー ブ を 渦 流 形 成 （ ボ ル テ ッ ク ス ） に よ っ て 混 合 し 、 37℃ に て ８ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン に 続 い て 、 残 存 す る コ ロ ニ ー 形 成 単 位 （ CFU） を 、 適 切 な 希 釈 液 の 10μ Lま た は 100μ Lを チ ョ コ レ ー ト 寒 天 ま た は TSAプ レ ー ト に 播 種 し て 、 様 々 な 希 釈 率 （ 10 -2 か ら 10 -7 ）にて計数した。 チ ョ コ レ ー ト 寒 天 ま た は TSAプ レ ー ト は 、 37℃ に て お よ そ ２ ４ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト （ N． me ningitidisの プ レ ー ト に つ い て は 、 5％ Ｃ Ｏ 2 で ） し 、 そ し て 細 菌 コ ロ ニ ー の 数 を 目 視 下 に 計数した。結果を以下の表６及び７に示す。 30 40 (19) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 実施例３ 水 中 に お け る 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 333ま た は ポ ロ キ サ マ ー 334を 含 有 す る組成物の様々な細菌に対する殺菌活性 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 熱 処 理 し た PLURONIC P103ま た は 熱 処 理 し た PLURONIC P104を 含 む 治 療 用 組 成 物 の 殺 菌 活 性 を 、 実 施 例 １ の S． aureus及 び A． baumannii臨 床 分 離 株 な ら び に さ ら な る 生 物 で あ る S． pneumoniae（ Microscan（ 登 録 商 標 ） ID番 号 145） 及 び E． faecium （ Microscan（ 登 録 商 標 ） ID番 号 15773） に 対 し て 評 価 し た 。 0.075％ （ 重 量 ／ 容 量 ） 濃 度 の 熱 処 理 し た PLURONIC P103ま た は 熱 処 理 し た PLURONIC P104の い ず れ か の 中 に 、 500μ g/m Lの rBPI 2 1 を 含 む 治 療 用 組 成 物 は 、 適 量 の 0.1％ 熱 処 理 PLUROMCP 103ま た は 熱 処 理 PLURONIC 40 P104溶 液 を 用 い て 「 非 製 剤 化 」 rBPI 2 1 ま た は 「 製 剤 化 」 rBPI 2 1 の 2mg/mL溶 液 を 希 釈 す る こ と に よ っ て 製 剤 化 し た 。 水 の み （ ポ ロ キ サ マ ー を ま っ た く 含 ま な い ） で の 500μ g/mLの 非 製 剤 化 rBPI 2 1 を 含 む 組 成 物 、 及 び 0.1％ の 熱 処 理 P103ま た は 熱 処 理 P104の み を 含 有 す る （ 且 つ rBPI 2 1 を 含 ま な い ） ポ ロ キ サ マ ー 対 照 溶 液 も 調 製 し た 。 1mg/mL rBPI 2 3 、 0.1％ PLU RONIC F68及 び 0.002％ TWEEN 80を 含 有 す る 「 製 剤 化 し た 」 rBPI 2 3 の 治 療 用 組 成 物 も 、 比 較のために試験した。 熱 処 理 し た PLURONIC P103ま た は 熱 処 理 し た PLURONIC P104の 滅 菌 保 存 溶 液 は 、 以 下 の 方 法 を 用 い て 調 製 し た 。 す な わ ち 、 （ １ ） 脱 イ オ ン 水 で 、 ポ ロ キ サ マ ー の 0.1％ （ 重 量 ／ 容 量 ）溶液をつくり、（２）その溶液を沸騰するまで加熱し、（３）室温にまで冷却させ、（ ４ ） PLURONIC P103が 完 全 に 可 溶 化 す る ま で 攪 拌 し 、 そ し て （ ５ ） 滅 菌 の た め に 、 溶 液 を 0 50 (20) JP 3922723 B2 2007.5.30 .22μ m Nalgeneフ ィ ル タ ー に 通 し て 濾 過 す る 。 S． aureus、 E． faesium及 び A． baumannii細 菌 は 、 TSAプ レ ー ト （ Remel、 カ タ ロ グ #01-920 、 Lenexa、 KN） で 、 S． pneumoniaeは 、 5％ ヒ ツ ジ 血 液 寒 天 プ レ ー ト （ Remel、 カ タ ロ グ #01 -200、 Lenexa、 KN） で 、 ２ ４ 時 間 生 育 し た 。 細 菌 保 存 懸 濁 液 は 、 滅 菌 脱 イ オ ン 水 に て 、 Mi 8 croscan（ 登 録 商 標 ） Turbidity Meterに よ っ て 測 定 し て 、 お よ そ 2.2か ら 3.8x10 CFU/mLに な る よ う に 懸 濁 さ せ 、 さ ら に 水 で 1： 10に 希 釈 す る こ と に よ り 調 製 し た 。 rBPI 2 1 治 療 用 組 成 物 に 対 す る ア ッ セ イ は 、 96ウ ェ ル 平 底 ミ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト （ Corning、 カ タ ロ グ #25 860-96） に て 、 各 ウ ェ ル に 185μ Lの TSB（ Rembl、 カ タ ロ グ #08-942、 Lenexa、 KN） ま た は 注 射 用 滅 菌 水 （ Kendall McGaw） ； 8μ Lの 細 菌 懸 濁 液 ； 6.3μ Lの 示 さ れ た 通 り の 500μ g/mL の rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 治 療 用 組 成 物 （ ま た は ポ ロ キ サ マ ー 対 照 溶 液 ま た は 水 単 独 ） を 添 10 5 加 し て 行 っ た 。 各 ウ ェ ル 中 の 細 菌 の 最 終 濃 度 は 、 約 4か ら 7x10 CFU/mLで あ っ た 。 rBPI 2 3 治 療 用 組 成 物 に 対 す る ア ッ セ イ は 、 178μ Lの ブ ロ ス ま た は 水 及 び 13μ Lの 500μ g/mLの rBPI 2 3 組 成 物 を 添 加 し た こ と を 除 い て 、 同 様 に 行 っ た 。 ウ ェ ル の 中 身 を 混 合 し 、 プ レ ー ト を 37℃ に て イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 後 ３ ０ 分 及 び ３ 時 間 に 、 各 ウ ェ ル 中 の CFU を 、 10 -2 及 び 10 -4 の希釈率にて計数した。３０分及び３時間における結果を、それぞれ表 ８及び９に示す。 rBPI 2 1 及 び 熱 処 理 し た PLURONIC P104を 含 有 す る 医 療 用 組 成 物 を 使 用 し た 予 備 実 験 に お い て、細菌を添加する前、希釈（例えば水で）直後に治療用組成物を添加すると、細菌を添 加 し た 後 に 同 じ 治 療 用 組 成 物 を 添 加 し た 場 合 に 比 較 し て よ り 一 層 、 rBPI 2 1 の 殺 菌 活 性 の 増 強 が な さ れ る こ と が 認 め ら れ た 。 同 じ グ ラ ム 陽 性 及 び グ ラ ム 陰 性 生 物 を 使 用 し て 、 PLURON IC P103及 び PLURONIC P104溶 液 で 非 製 剤 化 rBPI 2 1 を 希 釈 す る こ と に よ り 調 製 し た 治 療 用 組 成 物 で 実 施 し た 別 の 予 備 実 験 に お い て 、 ブ ロ ス 中 で rBPI 2 1 治 療 用 組 成 物 が 64μ g/mLの 濃 度 までで、グラム陽性生物に対する殺菌活性は観察されなかった。 20 (21) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (22) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (23) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (24) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (25) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (26) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (27) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 実施例４ BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び 他 の ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 有 す る 組 成 物 の 殺 菌 活 性 ポ ロ キ サ マ ー 101、 ポ ロ キ サ マ ー 105、 ポ ロ キ サ マ ー 108、 ポ ロ キ サ マ ー 122、 ポ ロ キ サ マ ー 123、 ポ ロ キ サ マ ー 124、 ポ ロ キ サ マ ー 181、 ポ ロ キ サ マ ー 182、 ポ ロ キ サ マ ー 183、 ポ ロ キ サ マ ー 184、 ポ ロ キ サ マ ー 185、 ポ ロ キ サ マ ー 188、 ポ ロ キ サ マ ー 212、 ポ ロ キ サ マ ー 215、 ポ ロ キ サ マ ー 217、 ポ ロ キ サ マ ー 231、 ポ ロ キ サ マ ー 234、 ポ ロ キ サ マ ー 235、 ポ ロ キ サ マ ー 237、 ポ ロ キ サ マ ー 238、 ポ ロ キ サ マ ー 282、 ポ ロ キ サ マ ー 284、 ポ ロ キ サ マ ー 288、 ポ ロ キ 50 (28) JP 3922723 B2 2007.5.30 サ マ ー 331、 ポ ロ キ サ マ ー 333、 ポ ロ キ サ マ ー 334、 ポ ロ キ サ マ ー 335、 ポ ロ キ サ マ ー 338、 ポ ロ キ サ マ ー 401、 ポ ロ キ サ マ ー 402、 ポ ロ キ サ マ ー 403、 ま た は ポ ロ キ サ マ ー 407［ 例 え ば 、 CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary、 Cosmetic, Toiletry and Frag rance Association、 Inc.、 Washington、 DC（ 1991） を 参 照 さ れ た い ］ 、 特 に 、 447∼ 451 頁 ］ を 包 含 す る 他 の ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 と BPIタ ン パ ク 質 産 物 と を 含 む 治 療 用 組 成 物 を 調 製 し 、 実 施 例 １ 、 ２ 及 び ３ に 前 記 し た 通 り に BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 殺 菌 活 性 を 増 強 す る能力について試験する。 実施例５ 血 清 、 MUELLER-HINTONブ ロ ス 、 ト リ プ シ ン ・ ダ イ ズ ・ ブ ロ ス ま た は 水 中 で の 、 EDTAを 含 む か ま た は 含 ま な い 、 ポ ロ キ サ マ ー で 製 剤 化 し た BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 含 有 す る 組 成 物 の 殺 10 菌活性 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び PLURONIC F68、 P103、 P104、 P105ま た は P123を 含 む 治 療 用 組 成 物 の 殺 菌 活 性 を 、 実 施 例 １ の S． aureus及 び A． baumannii生 物 、 実 施 例 ３ の S． pneumoniae生 物 、 E． faecium生 物 （ Microscan（ 登 録 商 標 ） ID番 号 16866） 、 及 び American Type Cultur e Collectionか ら の P． aeruginosaの 株 （ ATCC受 託 番 号 19660） に 対 し て 評 価 し た 。 治 療 用 組 成 物 は 、 所 望 の 0.2％ （ 重 量 ／ 容 量 ） ポ ロ キ サ マ ー 濃 度 と な る よ う に 、 2.2mg/mLの rBPI 2 1 保 存 溶 液 （ ポ ロ キ サ マ ー を 含 ま な い 、 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 、 150mM NaCl） に 、 適 量 の ポロキサマーを添加し、次いで濾過滅菌することによって調製した。製剤化した産物は、 ６ カ 月 を 上 限 と し て 、 2∼ 8℃ に て 保 存 し た 。 ポ ロ キ サ マ ー の 滅 菌 保 存 溶 液 は 、 ポ ロ キ サ マ ー ぺ ー ス ト を 、 室 温 に て 1∼ 5％ の 濃 度 （ 重 量 ／ 容 量 ） に 混 合 し て 注 射 用 滅 菌 水 （ WFI、 Ken dall-McGaw） に 溶 解 さ せ 、 次 い で 濾 過 滅 菌 す る こ と に よ り 作 製 し た 。 ア ッ セ イ は 、 生 育 培 地 と し て WFI、 ト リ プ シ ン ・ ダ イ ズ ・ ブ ロ ス （ TSB、 Remel、 Lenexa、 KN） 、 Mueller-Hinto n Brothプ ラ ス Cations（ CSMHB、 Remel） 、 ま た は CSMHBに プ ー ル し た 40％ ヒ ト 血 清 （ Sigma 、 St． Louis、 ミ ズ ー リ 州 ） を 用 い 、 96ウ ェ ル の ミ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト で 、 実 施 例 ２ 及 び３に前記した一般的な方法に従って行った。結果（２４時間のインキュベーション後の コ ロ ニ ー 形 成 単 位 で 示 す ） を 、 以 下 の 表 １ ０ に 表 す が 、 ポ ロ キ サ マ ー が BPIタ ン パ ク 質 産 物の殺菌活性を増強できることが確認される。 20 (29) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (30) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 追 加 の 実 験 で 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 と ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 み 、 さ ら に 様 々 な 濃 度 の EDTAを 含 む 治 療 用 組 成 物 の 殺 菌 活 性 を 、 P． aeruginosa（ ATCC 19660） に 対 し て 評 価 し た 。 前 記 の ご と く 治 療 用 組 成 物 を 製 剤 化 し て 、 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 、 150mM NaCl及 び 0 .002％ ポ リ ソ ル ベ ー ト 80の 緩 衝 液 中 、 所 望 の 濃 度 の ポ ロ キ サ マ ー 及 び rBPI 2 1 と し た 。 ア ッ セ イ は 、 P． aeruginosa及 び A． baumanniiに つ い て 実 施 例 ２ に 前 記 し た と 概 し て 同 様 に 実 施した。およそ２４時間インキュベートした後のコロニー形成単位の結果を、以下の表１ １ に 表 す が 、 EDTAの 添 加 に よ っ て 、 PLURONIC P123で 製 剤 化 し た BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 殺 菌 活性がさらに増強できることが示されている。 40 (31) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 実施例６ EDTAの 存 在 下 ま た は 非 存 在 下 で の 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー を 含 有 す る 組 成 物による、様々な生物の抗生物質に対する感受性への効果 EDTAを 含 む か ま た は 含 ま な い 、 ポ ロ キ サ マ ー で 製 剤 化 し た rBPI 2 1 の 治 療 用 組 成 物 を 、 複 数 の 薬 剤 に 耐 性 な 、 実 施 例 ５ の A． baumannii、 S． pneumoniae、 E． faecium及 び P． aerugino 30 saの 生 物 の 抗 生 物 質 へ の 感 受 性 に つ い て 評 価 し た 。 医 療 用 組 成 物 は 、 0.2％ （ 重 量 ／ 容 量 ） の 濃 度 の PLURONIC F68、 P103、 P104、 P105ま た は P123と 共 に 2mg/mLの rBPI 2 1 （ 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 、 150mM NaCl） を 含 有 す る も の を 調 製 し た 。 抗 生 物 質 へ の 生 物 の 感 受 性 に 対 す る 効 果 は 、 Mueller-Hinton Brothプ ラ ス Cations（ CSMHB、 Remel） 、 ま た は CSMHBに プ ー ル し た 40％ ヒ ト 血 清 （ Sigma、 St． Louis、 ミ ズ ー リ 州 ） に お い て 、 以 下 の 通 り に 判 定 し た。 一 晩 の 培 養 物 か ら 単 離 し た 生 物 の コ ロ ニ ー を 、 Microscan（ 登 録 商 標 ） 濁 度 計 を 使 用 し て 8 測 定 し て 0.5 McFarland標 準 液 （ お よ そ 1x10 CFU/ml） と 同 等 の 濃 度 に ま で 、 Microscan（ 登 録 商 標 ） Inoculum Water中 に 懸 濁 し た 。 ア リ コ ー ト を 、 CSMHBま た は CSMHBに プ ー ル し た 40％ ヒ ト 血 清 の い ず れ か に 移 し た 。 各 チ ュ ー ブ に は 、 最 終 濃 度 16μ g/mLの rBPI 2 1 ま た は 等 40 容量の対照緩衝液のいずれかが含まれていた。試験した各抗生物質に対する最小阻害濃度 （ MIC） 、 す な わ ち 、 目 視 可 能 な 生 育 を 阻 害 す る 抗 生 物 質 の 最 低 濃 度 は 、 グ ラ ム 陰 性 （ MB 及 び MC） な ら び に グ ラ ム 陽 性 （ MA） Sensititre Trays（ Radiometer America、 Westlake、 オハイオ州）を使用して測定した。これによって、広範囲にわたる標準抗生物質の迅速な 、 そ し て 同 時 の 調 査 が 許 容 さ れ る 。 Microscan（ 登 録 商 標 ） （ Dade Microscan、 Sacrament o、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） 、 Pasco（ DIFCO、 Detroit、 ミ シ ガ ン 州 ） 及 び Alamar（ Alamar、 Sa cramento、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） シ ス テ ム な ど の 、 当 該 技 術 分 野 に お い て 知 ら れ た 他 の い か なる抗微生物パネルシステムを、抗生物質感受性についてアッセイするために選択的に使 用してもよい。 以 下 の 表 １ ２ ∼ １ ５ に 、 示 さ れ た と お り の rBPI 2 1 治 療 用 組 成 物 の 存 在 下 に 調 べ た 抗 生 物 質 50 (32) JP 3922723 B2 2007.5.30 の MICと し て 、 各 株 の 検 査 に つ い て 報 告 し た 、 抗 生 物 質 ス ク リ ー ニ ン グ パ ネ ル の 結 果 の 要 約 を 表 す 。 試 験 し た 生 物 に 適 用 可 能 な 抗 生 物 質 感 受 性 の 基 準 （ NCCLSの 基 準 に 従 っ て 、 臨 床 的 に 耐 性 （ Ｒ ） 、 中 間 （ Ｉ ） ま た は 感 受 性 （ Ｓ ） と し て MICが 解 釈 さ れ る ） を 、 MICの 次 の 肩 付 き 文 字 で 表 す 。 こ れ ら の 結 果 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 の 添 加 に よ っ て 認 め ら れ る 抗 生 物質の治療的有効性の改良が、様々なポロキサマー製剤によってさらに一層増強されうる ことが示唆される。 10 20 30 40 (33) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 (34) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 (35) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 さ ら な る 実 験 で 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 で あ る rBPI 2 1 を 、 抗 微 生 物 活 性 を 増 強 す る ポ ロ キ サ マ ー 、 特 に PLURONIC P123を 用 い て 、 様 々 な 濃 度 の EDTAと 共 に 製 剤 化 し 、 そ し て Pseudomon 40 as aeruginosa（ ATCC 19660） の 抗 生 物 質 感 受 性 に 対 す る 効 果 に つ い て 評 価 し た 。 抗 生 物 質 感 受 性 は 、 数 多 く の 異 な る 抗 生 物 質 に つ い て 最 小 阻 害 濃 度 の 同 時 測 定 が 可 能 で あ る 、 Mi croscan（ 登 録 商 標 ） パ ネ ル プ レ ー ト （ Dade Microscan、 West Sacramento、 カ リ フ ォ ル ニ ア州）を使用して測定した。 Microscan（ 登 録 商 標 ） パ ネ ル プ レ ー ト で 実 施 し た 抗 微 生 物 感 受 性 試 験 は 、 ブ ロ ス 希 釈 感 受 性 試 験 を 小 型 簡 略 化 し た も の で あ る 。 抗 微 生 物 薬 剤 は 、 Mueller-Hintonブ ロ ス （ カ ル シ ウム及びマグネシウムを、またはオキサシリン用には塩化ナトリウムを、またはトリメト プリム、スルファメトキサゾール及びトリメトプリム／スルファメトキサゾール用にはチ ミジンホスフォリラーゼを補充）にて、その濃度を臨床的に興味ある範囲になるように、 連 続 的 に 希 釈 す る 。 96ウ ェ ル の Microscan（ 登 録 商 標 ） プ レ ー ト の １ つ の ウ ェ ル は 、 脱 水 50 (36) JP 3922723 B2 2007.5.30 したブロスのみを含む生育対照のウェルである。残りのウェルは、脱水したブロス及び抗 生物質（またはブロス及び生化学試薬の指示薬）を含み、これは、試験生物の標準化した 懸濁液を接種することにより所望の濃度にまで再水和される。色素生産性である生化学試 薬の指示薬は、ｐＨ変化及び基質利用の検出に基づいて細菌の種を同定及び特徴付けする ために使用される。一晩インキュベートした後、試験生物に対する抗生物質の最小阻害濃 度 （ MIC） が 、 生 育 の 阻 害 を 示 す ウ ェ ル で 抗 生 物 質 の 最 低 濃 度 を 有 す る も の を 観 察 す る こ と に よ っ て 決 定 さ れ る 。 グ ラ ム 陰 性 及 び グ ラ ム 陽 性 生 物 を 、 Microscan（ 登 録 商 標 ） パ ネ ル プ レ ー ト （ Microscan（ 登 録 商 標 ） 、 Dade Microscan、 West Sacramento、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） の い ず れ の も の を 使 用 し て 試 験 し て も よ い 。 P． aeruginosaに つ い て の こ れ ら の 実 験 で は 、 MIC Plus Type 2パ ネ ル プ レ ー ト を 使 用 し た 。 こ の パ ネ ル プ レ ー ト に て 調 べ た 抗 生物質の濃度を、以下の表１６に示す。各パネルプレートにて試験されうるグラム陰性生 物 に 適 用 可 能 な 抗 生 物 質 感 受 性 の 基 準 （ Microscan（ 登 録 商 標 ） の NCCLSに 由 来 す る 基 準 に 従 う 、 耐 性 、 中 間 ま た は 感 受 性 と し て の MICの 解 釈 ） を 、 以 下 の 表 １ ６ Ａ に 表 す 。 10 (37) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 (38) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (39) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 P． aeruginosaに 用 い た こ れ ら の 実 験 の た め に 、 以 下 の 方 法 を 実 施 し た 。 生 物 を TSAプ レ ー ト （ Remel、 Lenexa、 KN） に 塗 布 し 、 そ し て 一 晩 、 １ ８ ∼ ２ ４ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 プ レ ー ト か ら 、 よ く 単 離 さ れ た コ ロ ニ ー を 、 最 終 濁 度 が 0.5 McFarland硫 酸 バ リ ウ ム 標 準 液 と 同 等 に な る よ う に 、 3mlの 滅 菌 Inoculum Water（ カ タ ロ グ 番 号 B1015-2、 MicroScan（ 登 録 商 標 ） シ ス テ ム 、 Dade Microscan、 West Sacramento、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） に 懸 濁 し た 。 こ の 細 胞 懸 濁 液 は 、 ２ か ら ３ 秒 間 渦 流 形 成 し 、 そ の 100μ Lを 、 Pluronic-Dを 含 む 25ml の Inoculum Water（ カ タ ロ グ 番 号 B015-7、 MicroScan（ 登 録 商 標 ） シ ス テ ム 、 Dade Micros can、 West Sacramento、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） （ 以 下 、 「 Pluronic Inoculum Water」 と 称 す る ） 、 ま た は 、 0.2％ PLURONIC P123、 0.002％ TWEEN 80、 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 、 15 20 0mM NaClの rBPI 2 1 （ 「 rBPI 2 1 /P123」 ） が 64μ g/mlの rBPI 2 1 に 希 釈 さ れ て い た 25mlの Pluro nic Inoculum Waterを 含 有 す る ガ ラ ス チ ュ ー ブ に 移 し た 。 rBPI 2 1 を 含 有 す る こ の 接 種 物 25mlを 反 転 す る こ と に よ っ て 混 合 し 、 ト レ ー に 注 加 し た 。 接 種 物 は 、 Microscan（ 登 録 商 標 ） パ ネ ル プ レ ー ト シ ス テ ム で の 使 用 の た め に 設 計 さ れ た 手 動 式 96ウ ェ ル ピ ペ ッ テ ィ ン グ シ ス テ ム （ RENOK（ 登 録 商 標 ） 再 水 和 − 接 種 シ ス テ ム 、 Dade Microscan、 West Sacramento、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） に 吸 い 上 げ 、 そ し て 接 種 物 の う ち 110 μ lを 、 Microscan（ 登 録 商 標 ） MIC Plus Type 2パ ネ ル プ レ ー ト の 各 々 の ウ ェ ル に 入 れ た 5 5 。 ウ ェ ル に 添 加 す る と 、 こ の 接 種 物 に よ っ て 4x10 か ら 7x10 CFU/mlの 最 終 細 菌 濃 度 が 得 ら れ た 。 パ ネ ル プ レ ー ト を 、 次 い で 35℃ に て １ ５ ∼ ２ ４ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 そ し て 細 胞 の生育について目視的に読み取った。 30 ウェル内がわずかに白いか、またはブロスが透明である場合、生育なしと規定した。生育 は、ウェル全体の白濁、ウェル中央の白い粒、またはウェル全体の微細顆粒の生育の形状 をとりうる、濁りとして現れた。すべてのウェルを、黒色の間接的に照明した背景を背に して読み取った。生化学的反応の目視下の結果を、細菌同定用データベースに読み取らせ た 。 試 験 し た 各 抗 生 物 質 に 対 す る MICは 、 目 視 可 能 な 生 育 を 阻 害 す る 抗 生 物 質 の 最 低 濃 度 を同定することによって決定した。 以 下 の 表 １ ７ に 、 抗 生 物 質 ス ク リ ー ニ ン グ パ ネ ル の 結 果 を 要 約 す る 。 Microscan（ 登 録 商 標 ） の NCCLSに 由 来 す る 基 準 に 従 う 、 耐 性 、 中 間 ま た は 感 受 性 と し て の MICの 解 釈 で あ る 、 抗生物質感受性基準は、表１６において、肩付き文字のＲ、Ｉ及びＳでそれぞれ示されて い る 。 こ れ ら の デ ー タ か ら 、 試 験 し た P． aeruginosa株 の セ フ ォ ニ シ ド 、 セ フ ォ テ タ ン 、 セファマンドール、クロラムフェニコール、アンピシリン／スルバクタム、及びアモキシ シ リ ン ／ kク ラ ブ ラ ネ ー ト へ の 耐 性 を 反 転 さ せ る こ と こ と に よ っ て 、 ま た 、 試 験 し た P． ae ruginosa株 の セ フ チ ゾ キ シ ム 、 セ フ ォ タ キ シ ム 、 セ フ ト リ ア キ ソ ン 、 及 び ア ズ ト レ オ ナ ム へ の 感 受 性 を 高 め る こ と に よ っ て 、 rBPI 2 1 /P123製 剤 の 抗 細 菌 活 性 を EDTAが さ ら に 増 強 さ せることが示される。 40 (40) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 (41) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 (42) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 実施例７ BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 188ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403を 含 有 す る 組 成 物 の 、 ウ サ ギ 角 膜 潰 瘍 形 成 モ デ ル に お け る PSEUDOMONAS感 染 に 対 す る 抗 細 菌 活 性 40 ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 と 共 に BPIタ ン パ ク 質 産 物 を 含 む 治 療 用 組 成 物 の 抗 細 菌 活 性 を 、 角 膜 感 染 ／ 潰 瘍 形 成 ウ サ ギ モ デ ル に お け る Pseudomonas感 染 の 感 染 前 及 び 感 染 後 の 双 方 で の投与情況において評価した。 こ れ ら の 実 験 用 に は 、 感 染 性 生 物 に 、 American Type Culture Collection（ ATCC、 Rockvi lle、 メ リ ー ラ ン ド 州 ） か ら 入 手 し た Pseudomonas aeruginosa 19660の 株 を 用 い た 。 凍 結 乾 燥 し た 生 物 を 、 普 通 （ nutrient） ブ ロ ス （ Difco、 Detroit、 ミ シ ガ ン 州 ） に 再 懸 濁 し 、 そ し て １ ８ 時 間 振 盪 し な が ら 37℃ に て 生 育 し た 。 培 養 物 は 、 ペ レ ッ ト を 採 集 し 洗 浄 す る た めに、インキュベーション後に遠心した。洗浄した生物を、培養物の純度を確認するため に グ ラ ム 染 色 し た 。 前 記 と 同 様 の 技 術 を 用 い て 、 第 2世 代 を 培 養 し た 。 第 2世 代 の 細 胞 懸 濁 9 液 は 、 普 通 ブ ロ ス に て 希 釈 し 、 600nmで の 吸 光 度 が 1.524と な る よ う （ お よ そ 6.55X10 CFU/ 50 (43) JP 3922723 B2 2007.5.30 6 mlの 濃 度 ） に 調 整 し た 。 最 終 的 に 普 通 ブ ロ ス で 1.3X10 倍 希 釈 す る と 、 5000CFU/mLす な わ 2 ち 1.0X10 CFU/0.02mLと な っ た 。 CFU測 定 の た め の プ レ ー ト 計 数 は 、 普 通 寒 天 プ レ ー ト に 10 0μ Lの 希 釈 細 胞 懸 濁 液 を 付 し 、 そ し て そ れ ら を 37℃ に て ２ ４ ∼ ４ ８ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す ることによって行った。 使 用 し た 動 物 は 、 ニ ュ ー ジ ー ラ ン ド 白 色 ウ サ ギ で あ り 、 SERI指 針 及 び 研 究 に お け る 動 物 の 使 用 上 の ARVO決 議 の 双 方 に 厳 密 に 従 っ て 飼 育 し た 。 眼 の 健 康 を 確 か め る た め に 、 す べ て の 眼の基礎実験を注射に先駆けて行った。すべての眼が、正常のウサギの眼に特徴的に認め られる、穏やかな拡散性の蛍光染色を呈した。すべての眼の健康状態は、正常の限度内に あ っ た 。 2.5か ら 3.Okgの 間 の 体 重 の ウ サ ギ に 、 0.5∼ 0.7mL/kgの 齧 歯 類 カ ク テ ル （ rodent cocktail： 100mg/mLケ タ ミ ン 、 20mg/mLキ シ ラ ジ ン 、 及 び 10mg/mLア セ プ ロ マ ジ ン ） を 筋 肉 10 内 注 射 す る こ と に よ っ て 麻 酔 を か け た 。 注 射 の 前 に 、 １ 滴 の プ ロ パ ラ カ イ ン 塩 酸 塩 （ 0.5 ％ Ophthaine、 Bristol-Myers Squibb） を 眼 に 適 用 し た 。 前 記 の ご と く に 調 製 し た 20μ L 2 の 細 菌 懸 濁 液 （ 1X10 CFU） を 、 無 作 為 に 指 定 し た 眼 の 中 央 角 膜 基 質 に 注 射 し 、 一 方 、 別 の 眼 は 未 処 置 の ま ま に し た 。 注 射 、 角 膜 上 皮 の 模 擬 穿 孔 は 、 30ゲ ー ジ 、 1/2イ ン チ の 針 及 び 1 00μ Lシ リ ン ジ を 使 用 し て 実 施 し た 。 最 初 の 実 験 系 列 に つ い て は 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 （ 試 験 薬 物 ） の ５ 日 間 の 投 与 規 制 は 以 下 の 通 り で あ っ た 。 す な わ ち 、 検 査 第 ０ 日 に は 、 基 質 内 へ の 細 菌 注 射 （ 0時 ） の ２ 時 間 前 （ 2） 及 び １ 時 間 前 （ -1） に 、 40μ Lの 試 験 薬 物 ま た は 媒 体 対 照 を 試 験 す る 眼 に 入 れ 、 次 い で 、 注 射 後 そ れ ぞ れ １ ０ 時 間 ご と に （ 0か ら +9時 間 ） 合 計 12回 投 与 （ 40μ L/投 与 ） す な わ ち 、 試 験 の １ ∼ ４ 日 の 各 日 に 、 試 験 す る 眼 に そ れ ぞ れ 10時 間 ご と に 40μ Lの 試 験 薬 物 ま た は 20 媒体を入れた（例えば、午前８時から午後５時までというように、毎日同じ時間に与えた ） 。 こ れ ら の 実 験 に つ い て 、 ポ ロ キ サ マ ー 188含 有 治 療 用 組 成 物 を 試 験 す る た め に 、 ５ 羽 の 動 物 を 、 rBPI 2 1 （ 5mMク エ ン 酸 塩 、 150mM NaCl、 0.2％ ポ ロ キ サ マ ー 188、 0.002％ ポ リ ソ ル ベ ー ト 80中 、 2mg/mL） を 用 い て 処 置 し 、 そ し て ５ 羽 を 緩 衝 性 媒 体 で 処 置 し 、 ま た ポ ロ キ サ マ ー 103含 有 治 療 用 組 成 物 を 試 験 す る た め に 、 ５ 羽 の 動 物 を 、 rBPI 2 1 （ 5mMク エ ン 酸 塩 、 150mM NaCl、 0.2％ ポ ロ キ サ マ ー 403、 0.002％ ポ リ ソ ル ベ ー ト 80中 、 2mg/mL） を 用 い て 処 置 し 、 そ し て ５ 羽 を 偽 薬 （ 5mMク エ ン 酸 塩 、 150mM NaCl、 0.2％ ポ ロ キ サ マ ー 403、 0.002％ ポ リ ソ ル ベ ー ト 80） で 処 置 し た 。 臨床的徴候を認知すべく、各々５日の試験期間中、毎日２回スリットランプ生物顕微鏡を 介して眼の実験を行った。結膜充血、結膜水腫及び催涙、粘液分泌を採点した。充血に対 30 す る 採 点 の 尺 度 は 、 0（ な し ） ； 1（ 軽 度 ） ； 2（ 中 度 ） ； 及 び 3（ 重 度 ） で あ っ た 。 結 膜 水 腫 を 採 点 す る た め の 尺 度 は 、 0（ な し ） ； 1（ ス リ ッ ト ラ ン プ で 目 視 可 能 ） ； 2（ 軽 度 の 分 離 ） ； 及 び 3（ 重 度 の 膨 張 ） で あ っ た 。 粘 液 分 泌 を 採 点 す る た め の 尺 度 は 、 0（ な し ） ； 1 （ わ ず か な 蓄 積 ） ； 2（ 肥 厚 分 泌 ） ； 及 び 3（ 離 散 し た ス ト ラ ン ド ） で あ っ た 。 羞 明 は 、 そ の有無にて記録した。催涙は、その有無にて記録した。角膜の潰瘍が存在する場合、高さ （ mm） 、 幅 （ mm） 、 及 び 深 さ （ 角 膜 の 厚 み の ％ ） に つ い て 評 価 し た 。 新 血 管 新 生 は 、 冒 さ れた角膜経線について図示した。フォトドキュメンテーションは、実験手順全体にわたっ て進行する症候として毎日実施した。 ５日間の検査期間終了時に、すべてのウサギを致死量のフェノバルビタールナトリウム（ 6グ ラ ム /mL） を 用 い て 屠 殺 し た 。 角 膜 を 採 集 し 、 ２ 分 の １ 強 度 の Karnovskyの 固 定 液 中 で 固定した。角膜は、微生物の存在をアッセイするためにグラム染色を用いて、また細胞浸 潤についてアッセイするためにヘマトキシリン及びエオシンを使用して、光学顕微鏡用に 処理した。 実 験 は 、 Pseudomonasを 注 射 し た 後 、 4、 24、 28、 48、 52、 72、 76、 及 び 96時 間 に 行 っ た 。 こ れ ら の 実 験 の 結 果 を 、 最 も 強 力 な 効 果 が 提 供 さ れ た ポ ロ キ サ マ ー 403と 共 に rBPI 2 1 を 含 む治療用組成物について、表１８に示す。 40 (44) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 表 １ ８ に 示 さ れ る 結 果 か ら 、 眼 に 穿 孔 に よ る 損 傷 を 与 え 、 そ し て Pseudomonasの 注 射 を 行 う前後に処置を行うことによって、充血、結膜浮腫、及び粘液形成の減少、さらには角膜 潰瘍の発生率及び重症度の軽減に伴う新血管新生の発生の減少における、実質的な利点が 提供されることが明らかである。 Pseudomonasを 注 射 し て ４ 時 間 後 に 、 処 置 及 び 対 照 の 双 方 の 動 物 に 角 膜 の 蛍 光 染 色 を 行 う と、注射（穿孔）による損傷に一致して小さな領域で染色されることが明らかになった。 注 射 後 ２ ８ 時 間 で 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403で 処 置 し た 眼 は 、 清 澄 な 眼 球 表 面 を 呈 し 、 そ 40 して典型的に、充血、結膜浮腫及び粘液分泌の証明となるものはなく、一方媒体で処置し た眼は、角膜水腫及び白血球の浸潤に起因する眼球表面の曇りを示した。注射後２８時間 で、媒体で処置した眼に虹彩炎が顕著に認められ、そして蛍光染色剤を適用すると、活力 喪失した上皮の領域が典型的に明示され、重度の充血及び中度から重度の結膜浮腫及び粘 液 分 泌 が さ ら に 認 め ら れ た 。 注 射 後 ４ ８ 時 間 で 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403処 置 し た 眼 で 時 折 軽 度 の 充 血 が 認 め ら れ た が 、 粘 液 分 泌 及 び 結 膜 浮 腫 は な か っ た 。 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 4 03処 置 し た 角 膜 は 、 他 の 点 で は 典 型 的 に 清 澄 で 健 常 な 様 子 で あ り 、 こ れ は 蛍 光 染 色 剤 の 適 用によって立証されるものであった。媒体で処置した眼は注射後４８時間で、重度の充血 、結膜浮腫及び粘液分泌を呈し、角膜のあるものは、水腫、細胞浸潤及びフィブリン沈積 の 結 果 曇 り が 生 じ た 潰 瘍 形 成 領 域 と 共 に 、 角 膜 の 溶 解 及 び 細 薄 化 （ thinning） を 呈 し た 。 50 (45) JP 3922723 B2 2007.5.30 注 射 後 ５ ２ 時 間 で 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403処 置 し た 眼 は 、 蛍 光 を 用 い た 染 色 に 耐 性 を 有 する、清澄で健常な角膜を呈しており、製剤が安全で角膜上皮に対して無毒であることを 示唆していた。媒体で処置した眼は注射後５２時間で、角膜上皮の痂皮形成が顕著であり 、一方結膜浮腫は減少して充血が重篤であった。これらの実験において、媒体で処置した いくつかの眼は、新血管新生を呈しており、血管が角膜中心に向かって内側に成長してい た 。 か か る 明 示 は 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403で 処 置 し た 眼 の い ず れ に も 認 め ら れ な か っ た 。 ヘ マ ト キ シ リ ン 及 び エ オ シ ン で 染 色 し た 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403で 処 置 し た 角 膜 の 病 理 組織学的評価によって、健常な、無傷の上皮及び基質であることが明らかになり、組織に 白血球の浸潤はなかった。これと対照的に、媒体で処置した角膜の評価によって、上皮の 10 欠如及び角膜基質内への白血球の広範囲にわたる浸潤が明らかになった。 ト ル イ ジ ン ブ ル ー で 染 色 し た 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403で 処 置 し た 角 膜 の さ ら な る 病 理 組 織学的評価によって、やはり、健常で無傷の上皮及び基質であることが明らかになり、さ ら に 、 角 膜 組 織 に Pseudomonas生 物 が 存 在 し な い こ と も 明 ら か に な っ た 。 対 照 的 に 、 媒 体 で 処 置 し た 角 膜 の 評 価 に よ っ て 、 こ の 組 織 に 桿 状 の Pseudomonas生 物 が 認 め ら れ 、 当 該 組 織内の生物に向かって進んでいる白血球細胞の存在が明らかになった。これらの結果から 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403の 有 効 な 角 膜 透 過 、 及 び 新 血 管 新 生 を 伴 わ ず に 組 織 の 有 効 な 滅 菌がなされることが示唆される。 こ れ ら の 実 験 に お い て 試 験 さ れ た rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403治 療 用 組 成 物 は 、 こ の 重 度 の Ps eudomonasに よ る 損 傷 ／ 感 染 の ウ サ ギ モ デ ル に て 試 験 し た rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 188治 療 用 20 組 成 物 の 効 果 に 比 較 し て 、 最 も 劇 的 で 有 益 な 抗 微 生 物 及 び 抗 血 管 形 成 効 果 を 達 成 し た 。 rB PI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 188組 成 物 を 用 い た 処 置 に つ い て は 、 新 血 管 新 生 の 抑 制 と い う 点 で の 利 点は認められたものの、充血、結膜浮腫、粘液形成及び催涙の低減においては、有意な効 果 が 認 め ら れ な か っ た 。 こ れ ら の 実 験 で 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403組 成 物 の 有 効 性 と 、 そ れ よ り 劣 る rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 188組 成 物 の 有 効 性 と の 対 比 に よ っ て 、 製 剤 の 成 分 、 投 与 量及び投与規則のすべてが、本発明の方法にかかる有益な効果を至適化するうえで重要な 役割を果たすかもしれないことが示唆された。 実施例８ EDTAの 存 在 下 ま た は 非 存 在 下 で の 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 188ま た は 403を 含有する組成物の細菌及び真菌生育阻害活性 30 Escherichia coli（ 大 腸 菌 、 ATCC受 託 番 号 8739） 、 Pseudomonas aeruginosa（ ATCC受 託 番 号 9027） 、 Staphylococcus aureus（ ATCC受 託 番 号 6538） 、 Candida albicans（ カ ン ジ ダ ・ ア ル ビ カ ン ス 、 ATCC受 託 番 号 10231） 及 び Aspergillus niger（ ア ス ペ ル ギ ル ス ・ ニ ガ ー 、 ATCC受 託 番 号 16404） の 、 標 準 細 菌 及 び 真 菌 の 試 験 微 生 物 に 対 し て 、 U.S． Pharmacopeia （ USP） 微 生 物 試 験 プ ロ ト コ ル （ USP 23、 ［ 51］ Antimicrobial Preservatives-Effective ness、 1681頁 ） に 従 っ て 、 BPIタ ン パ ク 質 産 物 及 び ポ ロ キ サ マ ー 界 面 活 性 剤 を 含 む 治 療 用 組成物の抗微生物保存的効果を評価した。 こ れ ら の 実 験 の た め に 、 USPプ ロ ト コ ル に 従 っ て 調 製 し た ５ 種 の 試 験 微 生 物 の 各 々 か ら の 少 量 の 培 養 液 を 、 2mg/ml rBPI 2 1 、 0.2％ ポ ロ キ サ マ ー 188（ PLURONIC F68） ま た は ポ ロ キ サ マ ー 403（ PLURONIC P123） 、 0.002％ TWEEN 80、 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 及 び 150mM塩 化 40 ナトリウムの溶液を入れた滅菌容器に添加した。ある実験では、これらの溶液にさらに様 々 な 濃 度 の EDTAを 含 有 さ せ た 。 微 生 物 を 接 種 し た 後 様 々 な 時 点 で （ す な わ ち 、 ７ 、 １ ４ 、 ２１及び２８日）、試験溶液のアリコートを容器から取り出し、５種の各微生物のコロニ ー 形 成 単 位 （ CFU） を 測 定 す る た め に 播 種 し た 。 USPの 標 準 に 従 う と 、 （ a） １ ４ 日 目 ま で に 初 期 濃 度 の 0.1％ 以 下 ま で 、 生 存 能 力 の あ る 細 菌 の 濃 度 が 低 下 し て い る ； （ b） 最 初 の １ ４ 日 の 間 に 、 生 存 能 力 の あ る 真 菌 の 濃 度 が 初 期 濃 度 以 下 に な っ て い る ； な ら び に （ c） 残 り２８日の試験期間の間に各試験微生物の濃度が、これらの指示値以下のままになってい るのであれば、産物の有効性が示される。 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 188及 び rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403組 成 物 の 最 初 の 試 験 の 結 果 を 、 以 下 の表１９Ａ∼１９Ｂに示す。 50 (46) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 前 記 の よ う に 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403の さ ら な る 組 成 物 を 0.01％ 、 0.05％ 及 び 0.1％ の 濃 度 の EDTAを 配 合 し て 調 製 し 、 そ し て 前 記 表 １ ９ Ｂ に 示 す 実 験 に お け る と 同 様 に 試 験 す る と、得られた結果はすべての生物について、表１９Ｂに示される結果に匹敵するものであ った。 さ ら な る 実 験 に お い て 、 0.05％ EDTAを 含 む か ま た は 含 ま な い 、 2mg/mL rBPI 2 1 、 0.2％ PLU RONIC P123、 0.002％ TWEEN 80、 5mMク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 、 150mM塩 化 ナ ト リ ウ ム を 含 有 す る他の組成物を、前記のごとき有効性について評価した。結果を以下の表２０に示す。こ れ ら の 実 験 で 、 0.05％ の EDTAに よ り 、 rBPI 2 1 /ポ ロ キ サ マ ー 403組 成 物 の 抗 微 生 物 の 有 効 性 がさらに増強されていた。 30 (47) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 前記発明の数多くの修飾及び変更が、当業者に想起されることが予想される。従って、本 発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。 50 (48) JP 3922723 B2 2007.5.30 配列表 （ 1） 一 般 情 報 ： （ i） 出 願 人 ： ラ ン バ ー ト 、 ル イ ス エ イ チ .、 ジ ュ ニ ア （ ii） 発 明 の 名 称 ： 殺 菌 性 ／ 透 過 性 増 強 （ Ｂ Ｐ Ｉ ） タ ン パ ク 質 産 物 を 含 む 、 改 良 さ れ た 治療用組成物 （ iii） 配 列 の 数 ： ２ （ iv） 連 絡 先 住 所 ： （ A） 宛 名 ： マ ー シ ャ ル 、 オ ト ゥ ー ル 、 ジ ェ ー ス テ ィ ン 、 マ レ ー ア ン ド ボ ー ラ ン （ B） 番 地 ： 6300 シ ア ー ズ タ ワ ー 、 233 サ ウ ス ワ ッ カ ー ド ラ イ ブ （ C） 都 市 名 ： シ カ ゴ 10 （ D） 州 名 ： イ リ ノ イ （ E） 国 名 ： 米 国 （ F） 郵 便 番 号 ： 60606-6402 （ V） コ ン ピ ュ ー タ ー 読 取 形 式 ： （ A） 媒 体 ： フ ロ ッ ピ ー デ ィ ス ク （ B） コ ン ピ ュ ー タ ー ： IBM PC互 換 機 （ C） 操 作 シ ス テ ム ： PC-DOS/MS-DOS （ D） ソ フ ト ウ ェ ア ： パ テ ン ト イ ン リ リ ー ス #1.0、 バ ー ジ ョ ン #1.25 （ vi） 現 出 願 デ ー タ ： （ A） 出 願 番 号 ： 20 （ B） 出 願 日 ： （ C） 分 類 ： （ vii） 先 行 出 願 デ ー タ ： （ A） 出 願 番 号 ： US 08/372,104 （ B） 出 願 日 ： 1995年 1月 13日 （ C） 分 類 ： （ viii） 弁 護 士 ／ 弁 理 士 情 報 ： （ A） 氏 名 ： シ ャ ー プ 、 ジ ェ フ リ ー 、 エ ス . （ B） 登 録 番 号 ： 31,879 （ C） 参 照 ／ 事 件 番 号 ： 27129/33071 30 （ ix） 通 信 情 報 ： （ A） 電 話 ： 312/474-6300 （ B） フ ァ ッ ク ス ： 312/474-0448 （ C） テ レ ッ ク ス ： 25-3856 （ 2） 配 列 番 号 ： １ の 情 報 ： （ i） 配 列 特 徴 ： （ A） 配 列 の 長 さ ： 1813塩 基 対 （ B） 配 列 の 型 ： 核 酸 （ C） 鎖 の 数 ： 一 本 鎖 （ D） ト ポ ロ ジ ー ： 直 鎖 状 40 （ ii） 配 列 の 種 類 ： cDNA （ ix） 配 列 の 特 徴 ： （ A） 配 列 を 表 す 記 号 ： CDS （ B） 存 在 位 置 ： 31..1491 （ ix） 配 列 の 特 徴 ： （ A） 配 列 を 表 す 記 号 ： mat_peptide （ B） 存 在 位 置 ： 124..1491 （ ix） 配 列 の 特 徴 ： （ A） 配 列 を 表 す 記 号 ： misc_feature （ D） 他 の 情 報 ： 「 rBPI」 50 (49) JP 3922723 B2 2007.5.30 （ xi） 配 列 ： 配 列 番 号 ： １ ： 10 (50) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (51) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (52) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 （ 2） 配 列 番 号 ： ２ の 情 報 ： （ i） 配 列 特 徴 ： （ A） 配 列 の 長 さ ： 487ア ミ ノ 酸 （ B） 配 列 の 型 ： ア ミ ノ 酸 （ D） ト ポ ロ ジ ー ： 直 鎖 状 （ ii） 配 列 の 種 類 ： タ ン パ ク 質 （ xi） 配 列 ： 配 列 番 号 ： ２ ： 40 (53) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (54) JP 3922723 B2 2007.5.30 10 20 30 40 (55) JP 3922723 B2 2007.5.30 フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ Ａ６１Ｐ 31/10 (2006.01) Ａ６１Ｐ 31/10 (56)参考文献 国際公開第９４／０１７８１９（ＷＯ，Ａ１） B. P. CHEW et al, J Dairy Sci, １９８５年，68, p.3037-3046 (58)調査した分野(Int.Cl.，ＤＢ名) A61K 38/00 ZNA A61K 47/18 A61K 47/34 BIOSIS(STN) CAplus(STN) EMBASE(STN) MEDLINE(STN) REGISTRY(STN)