HILIC カラムを用いた N-結合型グリカンの高速分析

HILIC カラムを用いた
N-結合型グリカンの高速分析
アプリケーションノート
生物医薬品・バイオシミラー
著者
はじめに
James Martosella, Oscar Potter,
組み換えモノクローナル抗体 (mAb) 治療薬は、治療用タンパク質のなかでも最大のグ
ループとなっています。この種の治療薬の効能は、mAb のグリコシル化パターンが適切
Danny Mancheno, and Jia Liu
かどうかに大きく左右されます。また、これまでに認可されている治療用 mAb は、す
Agilent Technologies, Inc.
べて免疫グロブリン G (IgG) です [1]。ヒト IgG には、各重鎖に 1 つの N-結合型グリコシ
ル化部位があります [2]。N-結合型グリコシル化はきわめて重要かつ複雑な翻訳後修飾
で、糖タンパク質薬剤の開発や処理、製造のあらゆる段階において、管理やモニタリン
グ、および解析が求められます [3]。治療用タンパク質の安全性、効能、血中半減期な
どの特性は、グリコシル化パターンの違いによる影響を受けます。そのため、グリカン
パターンの分析は、治療用糖タンパク質、とりわけ mAb の特性分析におけるきわめて
重要な要素となります。
グリカン分析については、さまざまな手法が適用されています。しかし、大部分のメ
ソッドは、酵素による mAb からのグリカンタンパク質遊離と、その後の 2-アミノベン
ズアミド (2-AB) などの標識試薬を用いた誘導体化をベースにしています [4]。グリカン
には発色団がないため、2-AB (中性) タグで標識化すれば、蛍光検出が可能になります。
標識化されたグリカンは親水性がきわめて高い構造で、分離テクニックとしては親水性
相互作用クロマトグラフィー (HILIC) が適しています。HILIC と蛍光検出を用いた分離は、
グリカン分析に適した堅牢なメソッドです。また、HILIC/LC とマススペクトロメトリー
を組み合わせれば、重要な質量情報や構造情報が得られます。
結果と考察
このアプリケーションノートでは、ハイスループットグリコシル
化分析に AdvanceBio グリカンマッピングカラムを導入していま
高速分離
す。AdvanceBio グリカンマッピングカラムは、新しい HILIC ア
ミドケミストリを備えたサブ-2 µm HPLC カラムです。このカラ
1.8 µm 粒子の AdvanceBio グリカンマッピング HILIC カラムを使
えば、10 分未満の超高速グリカン分析が実現します (図 2 および
表 1)。表 2 に、ピーク番号と IgG の主要グリカン構造を示して
ムおよびメソッドを用いれば、グリカンの高分離能を得ると同時
に、現在提供されている HPLC カラム技術よりも溶出時間を
40 % 短縮することができます。AdvanceBio グリカンマッピング
カラムの有効性を示すために、2-AB 標識ヒト IgG N-結合型グリ
います。
カンサンプルを分析しました。
9
4
15 16 17
14
7.382
7.819
7.991
3
6.167
3.923
2
13
10 11 12
6.480
2.992
0.2
8
1.965
2.093
1
2.840
0.345
0.363
3
5.214
2-AB
0.6 labelling
reagent
0.4
3.460
3.770
5 7
5.680
0.8
高速分離の評価にも同じ条件を使用しましたが、グラジエント
6
4.411
Agilent AdvanceBio グリカンマッピング、
2.1 × 150 mm、1.8 µm (p/n 859700-913)
グリカンライブラリ :Agilent 2-AB 標識ヒト IgG N-結合型グリカン、
200 pmol (p/n 5190-6996)
溶離液 :
A) 100 mM NH4 ギ酸、pH 4.5
B) ACN
注入量 :
70:30 ACN: 水中で 2 µL
4.636
1
カラム :
3.304
条件、超高分離能
4
3.624
LU
2.476
2
材料とメソッド
0
0
は異なるものを使用しました。
1
5
6
7
8
9
分
図 2. 条件
ワークフローを図 1 に示しています。
グラジエント:
時間 (分)
0
12
12.15
12.5
12.9
13.05
15
%B
75
60
40
40
75
75
75
流量 (mL/min)
1.0
1.0
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
図 2. Agilent AdvanceBio グリカンマッピングカラムを使えば、2-
AB 標識ヒト IgG N-結合型グリカンの 10 分未満での高速分離が
可能です。
図 1. Agilent AdvanceBio グリカンマッピング HILIC カラムと蛍
光検出を用いた 2-AB-標識ヒト IgG グリカン分析の全体のワーク
フローソリューション
表 1. 2-AB 標識ヒト IgG N-結合型グリカンの高速分離で得られた分離性能結果
カラム
平均
RT (分)
RS 2,1
RS 3,2
RS 4,3
RS 6,5
平均
Bp (bar)、 ピーク
PW (分) 20 % B
キャパシティ
グリカンマッピングカラム
3.93
1.63
1.70
3.05
2.09
0.059
2
298
135
表 2. ピーク番号と IgG の主要グリカン構造
ピーク
グリカン
G0
10
G2FB
フルクトース
2
G0F
11
G1FS1
マンノース
3
G0FB
12
A1
4
G1F
13
A1F
5
G1F’
14
A1FB
6
G1FB
15
A2
7
G1FB
Man6
16
A2F
8
G2
17
A2FB
9
G2F
ピーク
グリカン
1
構造
構造
ガラクトース
N-アセチルグルコサミン
N-アセチルノイラミン酸
超高分離能分離
1.8 µm 粒子の AdvanceBio グリカンマッピング HILIC カラムでは、
高速分離の代わりに、わずかに長いランタイムでの超高分離能
分離を行うことも可能です (図 3 および表 3)。この分離では、2-
AB 標識ヒト IgG N-結合型グリカンがきわめて良好に分離され、
きわめて高い感度が得られます。
9.612
2
4
図 3. 条件
11.669
12.348
LU
カラム温度 :
6
7
0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
10 11
19.721
14 15
12
15.0
17.5
検出 :
17
19.023
8
16
13
14.369
15.423
16.242
17.077
17.580
10.535
1
8.474
0.2
0.677
0.718
0.913
0.4
3
12.986
標識試薬
0.6
12.018
12.665
5
0.8 2-AB
19.986
1.0
グラジエント :
9
13.964
1.2
20.0
使用機器 :
55 °C
時間 (分)
0
25
26
27
30
%B
流量 (mL/min)
80
0.5
60
0.5
0
0.5
80
0.5
80
0.5
蛍光、励起 260 nm、発光 430 nm
Agilent 1290 Infinity LC システムおよび
Agilent 1260 Infinity 蛍光検出器
分
図 3. Agilent 1.8 µm AdvanceBio グリカンマッピング HILIC カラムを用いた超高分離能分離における 2-AB 標識ヒト IgG N-結合型グリカ
ンの分離
表 3. 2-AB 標識ヒト IgG N-結合型グリカンの高分離能分離結果
カラム
平均
RT (分)
グリカンマッピングカラム 12.7
平均
RS 2,1
RS 3,2
RS 4,3
RS 6,5
PW (分)
Bp (bar)、 ピーク
20 % B
キャパシティ
2.60
2.90
5.43
2.81
0.0741
298
3
221
性能比較
AdvanceBio グリカンマッピングカラムでは、2.1 × 150 mm 構成
の他社製カラムに比べて、同じクロマトグラフィー条件で優れた
分離能と狭帯域が得られます。また、ピークキャパシティも向上
17.005
0.6
0.4
0.2
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
B
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
17.5
20.0
22.5
分
20.0
22.5
分
17.076
0
LU
9.612
10.535
11.169
11.668
12.017
12.348
12.984
13.390
13.966
14.373
0
23.661
0.8
18.926
19.550
18.567
1.0
20.587
A
LU
1.2
18.240
16.006
し、分離時間は 40 % 短くなります (図 4 および表 4)。
17.5
図 4. Agilent AdvanceBio グリカンマッピングカラム (B) では、同じ寸法および同じ分離
条件の他社製カラムに比べて、優れた分離能、狭いピーク幅、高いピークキャパシティ
が得られ、分離時間が 40 % 短くなります。
表 4.スピード面の利点を示す Agilent AdvanceBio グリカンマッピングカラムと他社製カラムとの比較
カラム
平均
RT (分)
平均
RS 2,1
RS 3,2
RS 4,3
RS 6,5
PW (分)
Bp (bar)、 ピーク
20 % B
キャパシティ
他社製グリカンカラム (A)
20.2
1.77
1.94
3.39
2.10
0.1085
349
214
Agilent AdvanceBio グリカンマッピングカラム (B)
12.7
2.60
2.90
5.43
2.81
0.0741
298
221
4
別の比較では、両方のカラムに超高速分離を適用しました。使
用した条件 (5 % B によりグラジエントオフセットを調整) はどち
らのカラムも同じです。AdvanceBioグリカンマッピングカラムで
は、2.1 × 150 mm 構成の他社製カラムに比べて、優れた分離能、
狭帯域、高いピークキャパシティが得られました (図 5 および表
5)。
グラジエント A
% B mL/min
時間
2.916
0
1
2
3
6
7
4
5
6
70
47.5
30
30
70
70
70
1.0
1.0
0.50
0.50
0.50
1.0
1.0
オフセット
+min
5% B
9
8
グラジエント B
時間
% B mL/min
0
18
18.15
18.5
18.9
19.05
22.50
6.167
3.460
3.624
3.923
2.093
0
2.840
0.6
0.2
6.422
5
0.8
0.4
4.792
3.879
4
4.411
1.0
5.011
3
4.636
2
B
0
18
18.15
18.5
18.9
19.05
22.50
3.304
1
0
LU
4.060
4.311
2.510
3.290
3.746
A
2.476
LU
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
7
75
52.5
40
40
75
75
75
8
1.0
0.5
0.50
0.50
0.50
1.0
1.0
9
分
図 5. 超高速分離の比較: 同じ分離時間を用いる場合、AdvanceBio グリカンマッピングカラム (B)
では、同じ構成の他社製カラムに比べて優れた分離能、狭帯域、高いピークキャパシティが得
られます。
表 5. 分離能における利点を示す Agilent AdvanceBio グリカンマッピングカラムと他社製カラムとの比較
カラム
平均
RT (分)
平均
RS 2,1
RS 3,2
RS 4,3
RS 6,5
PW (分)
Bp (bar)、 ピーク
20 % B
キャパシティ
他社製グリカンカラム (A)
4.32
1.02
1.39
1.92
1.59
0.078
375
101
Agilent AdvanceBio グリカンマッピングカラム (B) 3.93
1.63
1.70
3.05
2.09
0.059
298
135
5
化学的安定性
AdvanceBio グリカンマッピングカラムでは、高温条件での優れ
た寿命安定性も示されています。図 6 は、60 °C で 5000 回注入
したあとの安定した分離性能を示しています。この比較では、繰り
返し注入後にもピーク形状、保持力、感度が維持されています。
結論
HILIC ベースの Agilent AdvanceBio グリカンマッピングカラムを
使えば、他の HPLC カラムよりも優れた分離能および効率でグリ
カンを分離することができます。溶出時間も 40 % 短縮されます。
また、5000 回以上の注入後にも優れた化学的安定性が保たれます。
LU
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
寿命テスト後
0.5
謝辞
この研究は、第 41 回高性能液相分離および関連技術に関する国
際シンポジウム (HPLC 2014) のポスターセッションで発表された
ものです(2014 年 5 月 11–15 日、ニューオーリンズ)。
参考文献
寿命テスト前
0
0
5
10
図 6. Agilent AdvanceBio グリカンマッピングカラムの寿命テス
ト前後のグリカン分離結果の重ね表示 (HILIC QC 条件 : 10:90 100
mM pH 4.4 ギ酸アンモニウム : ACN、0.2 mL/min、4 分、60 °C、
シトシン)
1. R. Jefferis, Biotechnol.Prog. 21, 11 (2005).
2. J. N. Arnold, L. Royle, R. A. Dwek, P. M. Rudd, R. B. Sim,
Adv.Exp.Med.Biol. 564, 27 (2005).
3. R. Abès, J. L. Teillaud, Pharmaceut. 3, 146 (2010).
4. L. R. Ruhaak, G. Zauner, C. Huhn, C. Bruggink, A. M. Deelder,
M. Wuhrer, Anal.Bioanal.Chem. 397, 3457 (2009).
詳細
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アジレント・テクノロジー株式会社
© Agilent Technologies, Inc., 2014
Printed in Japan
June 30, 2014
5991-4886JAJP