neuron

Shinichi Kohsaka
化学物質の神経系への有害性評価のあり方
Brain
Information Processing
by neuronal network
Requirements for Hazard Assessment of
Chemical Substances and the Nervous System
高坂 新一 (国立精神・神経センター神経研究所)
Shinichi Kohsaka
(National Institute of Neuroscience)
Neuron
neuron
Na+
Na+
stimuli
axon
K+
Cl-
synapse
dendrite
K+
action potential
cell body
0
resting membrane potential: -70 mV
10 msec
action potential
Neuron
axon terminal
Na+
neurotransmitter
Na channel
synaptic vesicle
receptor
K channel
Ca channel
synapse
receptors
K channel
Neurotransmitter;
glutamate, GABA, dopamine etc.
K+
1
Shinichi Kohsaka
Brain
Information Processing
by neuronal network
neuron
myelin
oligodendrocyte
neuron
neuron
astrocyte
blood-brain barrier
vessel
brain surface
ヒト脳の発達
synapse and network formation
neuron
glia
migration
migration
neuronal progenitor cell
glial progenitor cell
neural stem cell
ventricule
試験ガイドライ
ン
胎生期
日齢
生後
出生
ラット E8 E10 E12 E14 E16 E18 E20
PO
P2
P4
P6
P8
P10
マウス E6
PO
P2
P4
P6
P8
P10
E8 E10 E12 E14 E16 E18
出生
胎生期
週齢
ヒト
2w
3w
4w
6w
10w
ヒトと齧歯類の脳の発達
18W
28W
＊東北大学大学院医学系研究科
生後
38w
供試動物
検査項目
試験の目的
急性神経毒性試験
11農産第6283号
OECD 424
US OPPTS
870.6200
ラット
一般症状、機能検査、病理組織
学的検査
急性中毒のﾘｽｸ評価
（誤飲、誤食、暴露事故等）
反復経口投与
神経毒性試験
11農産第6283号
OECD 424
US OPPTS
870.6200
ラット
一般症状、機能検査、眼科学的
検査、病理組織学的検査
食品、飲料水からの長期的暴露
によるﾘｽｸ評価
Developmental
Neurotoxicity
study
US OPPTS
870.6300
ラット
一般症状、機能検査、病理組織
学的検査
妊娠中から授乳期間中の胎児/小
児における暴露のﾘｽｸ評価
急性遅発性
神経毒性試験
11農産第6283号
OECD 418
US OPPTS
870.6100
ニワトリ
一般症状、生化学的検査、病理
組織学的検査
急性中毒のﾘｽｸ評価
（誤飲、誤食、暴露事故等）
28日間反復経口投
与
遅発性神経毒性試
験
11農産第6283号
OECD 419
US OPPTS
870.6100
ニワトリ
一般症状、機能検査、病理組織
学的検査
食品、飲料水からの長期的暴露
によるﾘｽｸ評価
大隈典子教授より提供
2
Shinichi Kohsaka
培養細胞を用いた有害性評価の利点
神経細胞や神経回路網の機能評価
１）神経幹細胞の分裂、移動の観察
１） げっ歯類の脳神経系の発達の諸過程は遺伝プログラムも含めヒトのそ
れと極めて類似している。
２）神経細胞、グリア細胞の成熟程度の判定
２） 神経細胞、グリア細胞それぞれの細胞について培養技術が既に確立さ
れている。
３）神経伝達物質の放出量の測定
３） 培養細胞やスライスを用いることにより、ヒトの胎児期での脳神経系の
初期発生における発達のみならず、可塑性を含む出生後の発達までを
観察することが可能である。
４）神経伝達物質受容体の定量
４） 細胞の生死は当然のこととして、神経細胞の機能や神経回路網での情
報処理までを比較的簡便かつ迅速に判定可能である。
６）神経細胞の電気的興奮の画像によるイメージング
５） 評価に要する時間が短縮されることから、ある程度多数の検体を扱うこ
とが可能である。
５）シナプス関連蛋白の定量
７）神経回路網の発達の画像よるイメージング
８）神経の可塑性（長期増強、抑圧）の観察
６） 化学物質の影響を鋭敏に検出できる。
neuron
MAP-2
Preparation of neural primary cells
Neuronal cells
embryos
Glial cells
dissection
and
trimming
mince
pipetting
culture
37℃
10％CO2
astrocyte
GFAP
oligodendrocyte
O4
new born
Propidium iodide assay
3
Shinichi Kohsaka
神経細胞や神経回路網の機能評価
Effect of substance Y on response to neurotransmitters
in neurons
acetylcholine
neuron / glia
１）神経幹細胞の分裂、移動の観察
glutamate
ratio
1.0
２）神経細胞、グリア細胞の成熟程度の判定
0.8
Control
0.6
３）神経伝達物質の放出量の測定
0.4
４）神経伝達物質受容体の定量
0.2
５）シナプス関連蛋白の定量
neuron / glia
６）神経細胞の電気的興奮の画像によるイメージング
10
20
Time (min)
10
20
Time (min)
ratio
1.0
0.8
７）神経回路網の発達の画像よるイメージング
Substance Y
0.6
８）神経の可塑性（長期増強、抑圧）の観察
0.4
0.2
Primary cells prepeared from E15 mouse embryos
for 7 days cultured after substance Y-treatment.
Effect of substance Y on response to neurotransmitter
in glial cells
acetylcholine
neuron / glia
Control
神経細胞や神経回路網の機能評価
１）神経幹細胞の分裂、移動の観察
ratio
0.6
２）神経細胞、グリア細胞の成熟程度の判定
0.4
３）神経伝達物質の放出量の測定
４）神経伝達物質受容体の定量
0.2
neuron / glia
5
10
Time (min)
ratio
６）神経細胞の電気的興奮の画像によるイメージング
0.6
Substance Y
５）シナプス関連蛋白の定量
７）神経回路網の発達の画像よるイメージング
0.4
８）神経の可塑性（長期増強、抑圧）の観察
0.2
Primary cells prepeared from new born rat
for 6 days cultured after substance Y-treatment.
5
10
Time (min)
Preparation of cortical slices
Synaptic activities in cultured neuronal cells
embryos
New born
dissection
and
cutting
trimming
cortical slice
culture
37℃
10％CO2
cortical plate
50 µm
Detected by Ca2+ imaging on furafura-2 loaded hippocampal cells
ventricular zone
4
Shinichi Kohsaka
神経細胞や神経回路網の機能評価
Effect of substance X on proliferation of neural stem cells
Incorporation of bromo-deoxyuridine
１）神経幹細胞の分裂、移動の観察
control
２）神経細胞、グリア細胞の成熟程度の判定
substance X
CP
３）神経伝達物質の放出量の測定
CP
CP
４）神経伝達物質受容体の定量
2 hr
５）シナプス関連蛋白の定量
VZ
VZ
６）神経細胞の電気的興奮の画像によるイメージング
CP
７）神経回路網の発達の画像よるイメージング
CP
ventricule
3 day
８）神経の可塑性（長期増強、抑圧）の観察
VZ
VZ
神経細胞や神経回路網の機能評価
E16 (day 1)
Migration of the GFP-positive cells
１）神経幹細胞の分裂、移動の観察
２）神経細胞、グリア細胞の成熟程度の判定
E16 (day 1)
３）神経伝達物質の放出量の測定
E18 (day 3)
E19 (day 4)
CP
P0 (day 5)
CP
CP
CP
４）神経伝達物質受容体の定量
５）シナプス関連蛋白の定量
VZ
VZ
６）神経細胞の電気的興奮の画像によるイメージング
７）神経回路網の発達の画像よるイメージング
VZ
VZ
GFP/Nestin
８）神経の可塑性（長期増強、抑圧）の観察
Effect of substance X on migration of immature neurons
Effect of substance X on migration of immature neurons
control
substance X-treatment
substance X-treatment
control
CP
CP
VZ
VZ
E19 (day 4)
E17 (2 day): time-laps analysis for 10 hr
5
Shinichi Kohsaka
培養細胞を用いた有害性評価の利点
結論 −Conclusionー
１） げっ歯類の脳神経系の発達の諸過程は遺伝プログラムも含めヒトのそ
れと極めて類似している。
化学物質の神経系への有害性の評価に関しては、すべ
ての化学物質を従来行われている評価法へ持ち込むこと
は不可能なことから、その前段階、即ち１次スクリーニン
グ的評価として、神経系の培養細胞を用いた評価が有用
と考えられる。
２） 神経細胞、グリア細胞それぞれの細胞について培養技術が既に確立さ
れている。
３） 培養細胞やスライスを用いることにより、ヒトの胎児期での脳神経系の
初期発生における発達のみならず、可塑性を含む出生後の発達までを
観察することが可能である。
４） 細胞の生死は当然のこととして、神経細胞の機能や神経回路網での情
報処理までを比較的簡便かつ迅速に判定可能である。
５） 評価に要する時間が短縮されることから、ある程度多数の検体を扱うこ
とが可能である。
６） 化学物質の影響を鋭敏に検出できる。
It is impossible to examine all chemical substances
with the currently available methods for assessing
hazards to the nervous system. It is, therefore, more
effective to employ a method using cultured neural
cells as the first phase screening assessment.
ご清聴 ありがとうございました
Thank you for your attention.
国立精神・神経センター
National Institute of Neuroscience
http://www.ncnp.go.jp
6