288-amー 3

28S・am13
VEGF刺激血管内皮細胞膜團分のプロテオーム解析
豪辮囎働齢症モデ，，マウスの腎機能解析
○刀坂 泰史L3，浅井 知浩1・3内藤 博敬2・3，大橋 典男2・3，奥 直人L3（工静岡県
○滝上 裕一工，横尾 卓也1，木村 真規1，細山田 真1，柴崎 敏昭1（葦共立薬大）
大院薬，2静岡県大険生活健康13COE2i〉
戯的1
腫瘍血管新生はがんの成長・転移に必須の事象である。腫瘍内の血管内皮細胞
は正常のそれとは増殖能、運動能などが大きく異なり、様々な分子の発現が異な
っている。このような分子は有効な治療標的となりうることから、我々は、この
分子の違いをタンパク質レベルで解析するため、2D−DエGB法を用いたプロテオー
ム解析を行った。
【圏的】家族性若年性高尿酸血症性腎症（F田N）は、若年から排泄低下型高尿
酸血症や慢性腎不全を呈する遺伝性疾患であり、Uromodulin（UMOD）遺伝子の突
然変異が原國であることが報告されている。慢性腎不全は20歳代で発症するこ
とが多く、血液透析療法が必要となる症例も多い。そこで、本研究はヒト変異
UMOD遺伝子トランスジェニックマウスの疾患モデルとしての適性を検討する
ため、腎臓におけるヒト変異UMODの蓄積と腎機能低下との関係を明らかにす
ることを墜的として行った。
［方法1
ヒト1濟帯静脈ぜ硬管内皮細胞（HUVEC）を血管萩生に最も重要な因子である壷管
内皮増殖因子（V昆GF）で刺激し、細胞質、細胞膜・オルガネラ画分に分醐したタ
ンパク質溶液を調製した。またCo瞭dとして未処理のサンプルを調製し、2D−DIGE
法、MALDI−TOF・MSを用いたプロテオーム解析を行った。
［結果・考察］
VEGF刺激した琶UV狂Cのプロテオーム解析の結果、細胞質画分、細胞膜画分に
おいてそれぞれU、36個のタンパク質を岡定した。問定されたタンパク質の中に
は分子シャペロン、解糖系、脂質代謝に関わる酵素、細胞骨格に関連する分子が
同定された。
中でも最も発現が穴進していたBiPproteinに着目し、続いてRNAiを用いて血管
新生との関連性について検討を行った。結果、BiPproteinを㎞ockdownしたHUV狂C
では、VBGFによる増殖効果の抑制がみられ、さらにVEGFで誘導されるBRKi／2
活性化も抑制された。これらの結果から、BiP proteinはVEGFシグナルに重要であ
り、血管新生において重要な役割を担っていることが示唆された。
【方法】突然変異（Cl48W）を含むヒトUMOD遺伝子を導入したトランスジェ
ニックマウス（Tg）と野生型マウス（WT）を被験動物とした。警組織の蛍光免
疫染色法と腎臓膜分函のウェスタンブロット法（WB）により、腎臓へのヒト
UMOD蓄積を確認した。また、尿のWBにより、UMODの尿中排泄量を比較し
た。さらに、HPLCを溺いてクレアチニンクリアランス（Ccr）を算出し、腎機
能の解析を行った。
【結果】腎組織の蛍光免疫染色法と腎臓膜分画のWBの結果より、WTと比較し
てTgの腎臓にヒトUMODが発現していることが確認された。また、尿のWB
の結果より、尿中に排泄されるUMOD量に有意差がないことが確認された。さ
らに、HPLCの結果より、WTと比較してTgでCcrの低下傾向が認められた。
【考察】蛍光免疫染色法とWBの結果より、Tgの腎臓へのヒト変異UMOD蓄積
や尿中ヘヒトUMODが携泄されないことなど、FJgN患者と同様の病態を示す可
能性が示唆された。また、TgにおいてCcrが低下傾向にあったこともFJHN患者
に類似する。今後はCcr低下のメカニズムについて検討していく。
28S−am魔4
前立腺癌の分子標的治療創薬に覇けたPCA4の機能解析
28S−pmO2
メカニカルマッサージによる腎臓選択蛉遺伝子導入
○小池 和央｝，北恵 郁緒婁1新川 愛奈1・有、馬 宏1，鈴木 崇史1・岩尾 睦美工，
辻雄 穣丈圭，由元 弘王（工阪矢院薬〉
○向井 英史｝，川上 茂1，出下 富義工，橋田 充｝（工京大院薬）
【目的】当研究室では前立腺癌術後検体を周いたディファレンシャル・ディスプ
レイ解析により，前立腺慈部において姦発現する遺伝子としてPα一1（Prostate
CancerAlltigen−1）をクローニングした．抗peA−1抗体を用いた免疫組織化学的解
析により，前立腺癌病理組織標本の90％以上でPCA−1陽性と判断されたが，良性
腫瘍である前立腺肥大や正常前立腺においては陽’1生例が認められなかった．これ
らの結果は，PCA−1を分子標的とする前立腺癌治療創薬への展開可能牲を示すも
のである．そこで本媛究では，前立腺掘細胞においてPCA4の発現レベルを変化
させることによる細胞増殖と癌化との関連性について検討した．
【方法・結果】3種類のPCA・1siRNAを念成し，前立腺癌細胞株DUエ45にトラン
【目的】 糖尿病性腎症、糸球休腎炎、急性および慢性腎不全踏の腎疾患は、現
在、有効な治療法を欠いており、遺伝子治療はこれらの疾患に対する画期的な治
療法の提供を期待されている。腎臓への簡便で、安全かつ高効率な遺伝子導入法
は、腎疾患に対する遺伝子治療の実現に海けて最も重要葱技術の重つである。本
研究では、プラスミドを尾静脈投与後、瞥臓をマッサージすることで、腎臓選択
的に高効率な遺伝子導入が可能であることを見出し、その蒋効姓を検討した。
〔方法〕 1CRマウスにモデル遺伝子としてルシフェラーゼ発現プラスミド
（pCMV−Luc）100μgを尾静脈投与後、右腎をマッサージした。6時糊後、右腎、左
腎、群臓、肺、心臓、稗臓を摘出し、ルシフェラーゼアッセイにより各臓器の遺
伝子発現レベルを評価した。また、本遺伝子導入法により引き起こされ得る腎機
スフェクションした．その結果，いずれのPCA4s1R層Aにおいても80％以上の
PCA−1mRNAならびに蛋白質の発現低下が確認された、またこれらのPCA−1ノッ
クダウン細胞の増殖は顕著に掬lllllされ，さらに細胞死が誘導された．AnnexinVと
prop1dium iodidcを用いて，slRNA導入縮胞を染色しフローサイトメトリー解析を
行った結果，PCA−1ノックダウン細胞ではアポトーシスの誘導を認めた、一方，
PCA4発現ベクターのトランスフェクションにより一過性にPCA−1を高発現させ
たDU145細胞を用いて，コ獄二一形成率を測定した．その結果，コントロールベ
クターをトランスフェクションした細胞に比べてPCA−1トランスフェクタントに
おいては，形成コロニー数の増加が認められた・これらの結果から，前立腺癌に
おけるPCA一エの高発現は，細胞増殖の捉進とアポトーシス抑制を介して癌腫形成
に関与していることが示唆された．現在，PCA−l siRNAによる前立腺癌細胞増殖
能障害の程度を、血清申の尿素窒素（BCN）、クレアチニン値を指標として検討した。
〔結果・考察】 プラスミドを尾静脈投与後、后腎をマッサージすると、遺伝子
産物であるルシフェラーゼは右腎選択的に発現し、左腎や他の臓器で発現は見ら
れなかった。右腎におけるルシフェラーゼ発現レベルは、腎臓実質細胞への直接
漣入と比較し高く、本方法が効率的な遺伝子導入法であることが分かった。また、
血清中のBCN、クレアチニン値は共に正常値の範囲であり、顕著な腎機能障害を
引き起こさない安全な方法であることが示唆された。本方法は、瞥臓へ簡便かつ
高効率に遺伝子導入可能であることから、様々な腎疾患に癖する遺伝子治療に有
効なツールであると考えられる。
抑鰯分子メカニズムの解明を進めている．
28S・am15
織欄囎一ブの開発毒こ勘、カ，んの特異自勺蛍ラ旨動，、加イメージング
㈱耀鰭襯、尋桝繊綴蝋欝騰徹郁緒鰍
○浅沼 大祐1，浦野 泰照！・2，長野 哲雄 ，浜 幸寛4．小出 佳成4，小林 久隆4
（1舞こ大1院薬，2JST PRESTO，3JST CREST，埋NI王｛／NC⇔
［麟釣］当研究繁では前立腺癌で商発環する遺伝子としてPCん1（Prost＆te C3ucer
Antigen−1〉をクローニングした。データベース解析により、PCA−1はメチル化
DNA・RNA脱メチル化酵素活性を有する大腸菌蛋臼質AlkBと高い相1司性を有す
臓的】医療において、CTやMR王、PETをはじめとするイメージング技術はがん
の診断や発晃、治療経過を観察する上で不可欠な手段となっている。蛍光イメー
ジング法は、他の手法に比べて蔦感度・蕩時空闘分解能を脊する簡便な手法であ
るものの、∫’Mvoにおいてauorescenceim旧gingagentの体内動態を制御することは
ることが明らかとなった。また最近、i’13’1漉oの解析によりPCA−1は少なくても
他の6遺伝子とともにヒトA！kB homo！og（ABH）ファミリーを構成することが報告
され、われわれはそれら6種のAB｝1ファミリー分子の発環を確認した。本研究で
は、新たなヒトABHファミリー分子の隅定と機能解明を目指し研究を進めた。
［方法と結果］新規ヒトA3Hファミリー分子として、膵臓cD畝よりA騒8をクロー
ニングした。AB｝i8の塩基配列から推定される全664アミノ酸醗列のモチーフ・ド
メイン検索によりAlkBho粗010gousdo粗ainとともに、R酷一recognit沁皿modf、
methyltraηsferase domainが認められた．このことはABH8が岡一分子で核酸のメ
チル化と脱メチル化を撫い、また姻Aがその基質となる群能性を推測させた。抗
A擁8ペプチド抗体を作成し、ヒト癌病理組織標本を用いて免疫組織化学解析を行
難しく、非縛異的結舎などに由来する高いバックグラウンド蛍光などの問題によ
り、現状では汎用されるに至っていない。そこで本研究では、ターゲット集積性
分子と蛍光のo田on制御を施した蛍光プローブを組み含わせ、それぞれの利点を活
かした新たな∫，Mvoイメージング手法を開発し、標的部位を腐いSIN比で可視化
することを1ヨ的とする。
［方法】Humanepide㎜田growth￡actorreceptor2（HER2）は、乳がん愚者の20−25％
なった結果、乳癌でA騒81場性率90％以上（26／28）という高い発現が認められた。
で過剰発現している受容体であり、冊R2陽性患者に対してこの受容体に対する抗
体であるHerceptlnが治療に用いられている。撫rceptinは、受容体の二量体化を促
進し、エンドサイトーシス経路で細胞内に取り込まれ、後期エンドソームやリソ
ソームといった酸性オルガネラヘと輸送される。そこで、酸性環境で蛍光が”on”
ヒト置常組織におけるABH8mR甑の発現をreal−ti聡PCRで解析した結果、検討
したすべての組織においてABH8mR猷の発現を確認したが、糖巣において特に発
となるBODIPY骨格のpRプローブをデザイン・余成し、これを掬rceptinにラベ
ル化し、肥R2を過蜷発現しているNlmT3服ER2細胞およびその播種モデルマウ
現が海いことが分かった。A8H8の機能解析を行うためABH8si酬Aを合成し、前立
腺癌細胞株D慧145にトランスフェクションしてそのノックダウン効果を調べた結
果、約70％以上のA3H8mR甑減少が確認できた。さらにABH8ノックダウン細胞で
は細胞死が誘導された。現在、職癌におけるABH8の機能解析ならびにABH8を分
子標的とする乳癌治療創薬への応用を検討中である。
スに適絹し、加v∫鱒および加卿oでのイメージングを行った。
〔結果】光誘起電子移動を蛍光o卿on制御原理とした論理的設認こより、pK、の異
なる一連のpHプローブを開発した。pHプ1コーブーHcrceptin複合体がノ”v∫fmにお
いて細胞内に取り込まれて初めて強蛍光性となることを確認し、ノη吻oにおいて高
いSIN比でがんのイメージングに成功した。
一98一