(57)【要約】 【課題】 P450モノオキシゲナーゼ遺伝子

JP 2005-278637 A 2005.10.13
(57)【 要 約 】
【 課 題 】 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 大 腸 菌 等 の 微 生 物 宿 主 内 で 安 定 的 に 機 能 発 現
させる方法を提供する。
【 解 決 手 段 】 シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と 古 細 菌 由 来 の PPIaseの 両 者 を 生 産 可
能 な 微 生 物 、 又 は シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の N末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIaseを
付加した融合タンパク質を生産可能な微生物を培養し、培養物又は菌体からシトクローム
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を 採 取 す る こ と を 特 徴 と す る シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー
ゼの生産方法。
【選択図】 なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と 古 細 菌 由 来 の PPIaseの 両 者 を 生 産 可 能 な 微 生 物 を
培 養 し 、 培 養 物 又 は 菌 体 か ら シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を 採 取 す る こ と を 特 徴 と
す る シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 。
【請求項２】
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 細 菌 由 来 の シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ
で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 １ に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方
法。
【請求項３】
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シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト ク ロ
ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 、 又 は そ の 一 部 を 改 変 し た シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ
で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 １ に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方
法。
【請求項４】
バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 一 部 を 改 変
し た シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト ク
ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 87番 目 の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン を バ リ ン に 置 換 し た シ ト ク ロ ム
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 ３ に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ
オキシゲナーゼの生産方法。
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【請求項５】
微 生 物 が 、 大 腸 菌 で あ る 請 求 項 １ 乃 至 ４ の い ず れ か 一 項 に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ
オキシゲナーゼの生産方法。
【請求項６】
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の N末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIaseを 付 加 し た 融 合 タ
ン パ ク 質 を 生 産 可 能 な 微 生 物 を 培 養 し 、 培 養 物 又 は 菌 体 か ら 、 活 性 の あ る シ ト ク ロ ー ム P4
50モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を 含 む 融 合 タ ン パ ク 質 を 採 取 す る こ と を 特 徴 と す る シ ト ク ロ ー ム P4
50モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 。
【請求項７】
融 合 タ ン パ ク 質 が 、 シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と 古 細 菌 由 来 の PPIaseと の 間 に
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切 断 部 位 を 含 む 融 合 タ ン パ ク 質 で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 ６ に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P4
50モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 。
【請求項８】
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 細 菌 由 来 の シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ
で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 ６ 又 は ７ に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の
生産方法。
【請求項９】
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト ク ロ
ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 、 又 は そ の 一 部 を 改 変 し た シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ
で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 ６ 又 は ７ に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の
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生産方法。
【請求項１０】
バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 一 部 を 改 変
し た シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト ク
ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 87番 目 の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン を バ リ ン に 置 換 し た シ ト ク ロ ム
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 ９ に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ
オキシゲナーゼの生産方法。
【請求項１１】
微 生 物 が 、 大 腸 菌 で あ る 請 求 項 ６ 乃 至 １ ０ の い ず れ か 一 項 に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ
ノオキシゲナーゼの生産方法。
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【請求項１２】
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と 古 細 菌 由 来 の PPIaseの 両 者 を 生 産 可 能 な 微 生 物 。
【請求項１３】
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の N末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIaseを 付 加 し た 融 合 タ
ンパク質を生産可能な微生物。
【請求項１４】
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の N末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIaseを 付 加 し た 融 合 タ
ンパク質。
【請求項１５】
請 求 項 １ ４ に 記 載 の 融 合 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNA。
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生触媒工学、すなわち生変換反応による有用物質合成領域に属するものである
。より具体的には、本発明は、産業上有用な有機化合物の合成に使われている酵素である
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ （ 以 下 、 単 に 「 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 」 と い う 場 合
がある。）を、機能を損なわない形で安定的に生産する方法を提供する。元来不安定な酵
素 で あ る P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を コ ー ド す る 遺 伝 子 を 安 定 的 に 微 生 物 内 で 機 能 発 現 す る
ことにより、種々の有用な生変換反応を効率的に行うことができる。
【背景技術】
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【０００２】
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 、 細 菌 か ら 植 物 や 哺 乳 動 物 に 至 る 広 範 囲 の 生 物 種 に 分 布 し て
い る 酸 素 添 加 酵 素 で あ り 、 酸 素 分 子 を 還 元 し て 1分 子 の 水 を 作 る と 共 に 、 残 り の 酸 素 原 子
を 様 々 な 有 機 化 合 物 (基 質 )に 導 入 し て 、 酸 化 生 成 物 に 変 換 す る 反 応 （ 一 原 子 酸 素 添 加 反 応
） を 触 媒 す る 鉄 ・ イ オ ウ 酵 素 で あ る 。 哺 乳 動 物 に お け る P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 非 常 に
よく研究されており、生体内に取り込まれた薬物や環境汚染毒物を酸化し水溶性を高め、
体外への排出を促進する生体防御の役割を担う鍵酵素であり、また、生体内の二次代謝産
物 の 生 合 成 に お い て 水 酸 化 反 応 等 を 担 う 鍵 酵 素 で も あ る 。 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 、 シ
ト ク ロ ム P450本 体 タ ン パ ク 質 （ CYP） 以 外 に 電 子 伝 達 タ ン パ ク 質 を 必 要 と す る 複 合 酵 素 で
あ る 。 す な わ ち 、 P450が 活 性 を 発 揮 す る に は 、 NAD(P)Hか ら 電 子 を 伝 達 し て く る タ ン パ ク
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質として、細菌や真核生物のミトコンドリアでは フェレドキシンレダクターゼとフェレ
ド キ シ ン の 介 在 を 必 要 と し 、 哺 乳 動 物 の 肝 臓 ミ ク ロ ソ ー ム で は NADPH-P450レ ダ ク タ ー ゼ
の 介 在 を 必 要 と す る 。 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 部 分 的 な 構 造 の 変 化 に よ り 多 彩 な 化 合 物
の代謝に多様化された酵素で、バイオテクノロジーの分野において既存の方法では難しい
と思われている化合物の酸化処理が可能になると考えられている。したがって、本酵素は
、 新 し い 有 機 （ 低 分 子 ） 化 合 物 （ た と え ば ， 位 置 /立 体 特 異 的 に 導 入 さ れ た 水 酸 化 物 な ど
）の合成や、分解処理が難しい環境負荷物質の処理への応用に期待されている。
【０００３】
細 菌 を は じ め と す る 微 生 物 の P450研 究 は 哺 乳 動 物 に 比 べ る と 遅 れ て い た が 、 細 菌 の ゲ ノ
ム 解 析 の 進 展 と 相 ま っ て 、 細 菌 の P450研 究 が 今 日 、 盛 ん に な っ て き て い る 。 細 菌 で 最 も よ
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く 研 究 さ れ て い る P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 、 シ ュ ー ド モ ナ ス ・ プ チ ダ 由 来 の P450camで
、 本 酵 素 は 、 樟 脳 （ camphor） を 基 質 と し て 、 5位 に 水 酸 基 を 導 入 す る 反 応 を 触 媒 す る こ と
が 明 ら か に さ れ て お り 、 P450cam遺 伝 子 を 導 入 ・ 発 現 し た 組 換 え 細 菌 を 用 い た 解 析 も 広 く
実 施 さ れ て い る （ Poulos, T.L., Finzel, B.C., and Howard, A,J., High-resolution cr
ystal structure of cytochrome P450cam.
J . M o l . B i o l . , 1 9 5 , 6 8 7 - 7 0 0 ( 1 9 8 7 )） 。 ま
た 、 高 脂 血 症 薬 プ ラ バ ス タ チ ン （ pravastatin;三 共 株 式 会 社 商 品 名 メ バ ロ チ ン ） は 、 コ
ン パ ク チ ン （ compactin） カ ル ボ ン 酸 の 立 体 特 異 的 な 水 酸 化 反 応 に よ り 合 成 さ れ る が 、 こ
の 反 応 を 担 う 酵 素 は 、 土 壌 細 菌 ス ト レ プ ト マ イ セ ス ・ カ ル ボ フ ィ ラ ス （ Streptmyces carb
ophilus） 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ で あ る （ Matsuoka, T., Miyakoshi, S., Tanzaw
a, K., Nakahara, K., Hosobuchi, M., and Serizawa, N., Eur. J. Biochem., 184, 707
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-713, 1989） 。
【０００４】
P450酵 素 は 、 肝 ミ ク ロ ソ ー ム 画 分 の も の に 関 し て は 広 く 研 究 が 行 わ れ 、 試 験 用 酵 素 も 売
り 出 さ れ て い る 。 ま た 、 放 線 菌 ス ト レ プ ト マ イ セ ス ・ セ リ カ ラ ー （ Streptomyces coelico
lor） の ゲ ノ ム 配 列 が す で に 決 定 さ れ 、 本 細 菌 が 18個 の P450配 列 を 持 っ て い る こ と が 明 ら
か に な っ た こ と も あ り （ D. C. Lamb et al, The cytochrome P450 complement (CYPome)
of Streptomyces coelicolor A3 (2), J. Biol. Chem. 277, 24000-24005, 2002） 、 放 線
菌 や 他 の 細 菌 の P450を 用 い た 研 究 も 最 近 、 盛 ん に な り つ つ あ る 。 シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ
シゲナーゼ遺伝子は、植物や動物由来のものと比べて、細菌（放線菌も細菌）由来のもの
は、大腸菌内で機能発現しやすいことがわかっていた。真核生物由来のもの（前者）が膜
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酵素であるのに対して、原核生物由来のもの（後者）が細胞質内の可溶性酵素ということ
が 、 そ の 最 大 の 理 由 で あ る と 考 え ら れ る 。 細 菌 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム （ Bacillus megat
erium） や ミ ク ロ テ ト ラ ス ポ ラ （ Microtetraspora） 属 放 線 菌 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー
ゼ遺伝子が大腸菌内で機能発現し、基質となる有機低分子化合物が水酸化されることが報
告 さ れ て い る （ 小 川 順 ら , Bacillus megaterium由 来 の シ ト ク ロ ム P450 BM-3変 異 型 酵 素
を 用 い る パ ラ ヒ ド ロ キ ノ ン 類 の 酵 素 合 成 , 日 本 農 芸 化 学 会 2003年 大 会 講 演 要 旨 , p. 38, 2
003、 及 び 、 有 澤 章 ら , 放 線 菌 シ ト ク ロ ム P450お よ び 電 子 伝 達 タ ン パ ク 質 を 共 発 現 さ せ た
大 腸 菌 に よ る 微 生 物 変 換 系 , 日 本 農 芸 化 学 会 2003年 大 会 講 演 要 旨 , p. 38, 2003） 。 し か
し、細菌由来の同酵素でさえ、組換え大腸菌内で かなりの部分が正常に機能していない
だ け で な く 、 正 常 に 機 能 し て い た 酵 素 も し だ い に 失 活 し て い く こ と が 観 察 さ れ た 。 P450モ
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ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 酵 素 そ の も の が 不 安 定 酵 素 で あ る と 考 え ら れ て い る （ H. Joo, Z. Lin,
and F. H. Arnold, Laboratory evolution of peroxide-mediated cytochrome P450 hydr
oxylation. Nature 399, 670-673, 1999） 。
【０００５】
発 明 者 が 所 属 す る 研 究 機 関 で あ る (株 )海 洋 バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー 研 究 所 で は 、 積 水 化 学 工
業 (株 )と の 共 同 研 究 に よ り 、 免 疫 抑 制 剤 FK506と 結 合 す る タ ン パ ク 質 で あ る PPIase（ ペ プ
チ ジ ル プ ロ リ ル cis-transイ ソ メ ラ ー ゼ ） 遺 伝 子 を 好 熱 性 古 細 菌 ピ ロ コ ッ カ ス ・ ホ リ コ シ
（ Pyrococcus horikoshii） 等 よ り 単 離 し た 。 本 PPIaseは 、 古 細 菌 の 不 安 定 な 酵 素 で あ る
ロ ダ ネ ー ゼ （ rhodanese） や 、 不 溶 化 し や す い 鶏 卵 の リ ゾ チ ー ム 抗 体 の Fab断 片 等 を 、 本 来
の 立 体 構 造 に 巻 き 戻 し 可 溶 化 さ せ る こ と が で き た （ 特 開 平 10-91号 公 報 ） 。 し か も 、 ロ ダ
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ネ ー ゼ は 本 PPIase共 存 下 で 100℃ ま で 安 定 で あ っ た 。 し た が っ て 、 本 PPIaseは 高 温 で も 安
定な分子シャペロンであることがわかった。また、安定的に機能発現させたいタンパク質
の N末 に 、 前 記 PPIaseま た は 大 腸 菌 の シ ャ ペ ロ ニ ン GroELを 融 合 さ せ る こ と に よ り 、 そ の タ
ンパク質が本来の立体構造に巻き戻されることがわかった。この融合タンパク質系を用い
て 、 毒 性 の 強 い B型 肝 炎 ウ ィ ル ス 表 面 抗 原 や 不 溶 性 の ヒ ト IgGの 重 鎖 等 を コ ー ド す る 遺 伝 子
が、安定的に組換え大腸菌内で機能発現されることがわかった（特許文献１、特許文献２
） 。 最 近 、 三 井 化 学 も PPIaseの シ ャ ペ ロ ン 活 性 に 着 目 し 、 大 腸 菌 の PPIaseを 利 用 す る こ と
により、大腸菌で生産が難しかったヒトのミッドカインや組織プラスミノーゲン活性化因
子 （ TPA） の 生 産 量 の 増 強 に 成 功 し た と 発 表 し て い る （ 日 経 バ イ オ テ ク 、 2003年 5月 21日 ）
。
40
【０００６】
細 菌 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム （ Bacillus megaterium） BM-3株 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ
ナ ー ゼ （ P450 BM-3） は 、 P450ド メ イ ン と NADPH-P450レ ダ ク タ ー ゼ ド メ イ ン が 結 合 し た 、
大 変 珍 し い 構 造 を 有 す る 酵 素 で あ る 。 本 酵 素 の 塩 基 配 列 は 、 DDBJ Accession No. J04832
に 登 録 さ れ て い る 。 本 酵 素 は 元 々 、 C12∼ C20の 飽 和 脂 肪 酸 の ω 末 端 （ メ チ ル 基 側 ） の 1位
、 2位 ま た は 3位 を 水 酸 化 す る 酵 素 で あ っ た が 、 87番 目 の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン が バ リ ン に 変 異
し た も の （ 以 下 、 こ の 変 異 酵 素 を 「 F87V」 と い う 場 合 が あ る 。 ） は 、 ナ フ タ レ ン や 2-ブ ロ
モフェノール等の芳香族化合物を広く基質として認識し 水酸基を導入することができた
（ 小 川 順 ら , Bacillus megaterium由 来 の シ ト ク ロ ム P450(BM-3)変 異 型 酵 素 を 用 い る パ ラ
ヒ ド ロ キ ノ ン 類 の 酵 素 合 成 , 日 本 農 芸 化 学 会 2003年 大 会 講 演 要 旨 , p. 38, 2003、 及 び 、 Q
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. -W. Li, U. Schwaneberg, P. Fischer, and R. D. Schmid, Directed evolution of th
e fatty-acid hydoroxylase P450 BM-3 into an indole-hydroxylating catalyst.
Chem
. Eur. J. 6, 1531-1536, 2000） 。
【０００７】
【 特 許 文 献 １ 】 特 開 平 2004-24102号 公 報
【 特 許 文 献 ２ 】 国 際 公 開 第 02/052029号 パ ン フ レ ッ ト
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 、 そ の 構 造 だ け で な く 、 基 質 特 異 性 や 反 応 特 異 性 に 関 し て も
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非常に多様であるので、生変換反応による有用物質合成領域への応用、すなわち、産業利
用可能な様々な有機低分子化合物の合成に利用されることが期待されている酵素である。
ま た 実 際 に 、 高 脂 血 症 薬 プ ラ バ ス タ チ ン （ pravastatin； 三 共 株 式 会 社 商 品 名 メ バ ロ チ ン
） の 製 造 に 、 放 線 菌 が 有 す る P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 機 能 が 利 用 さ れ て い る 。 一 方 で 、
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 、 失 活 し や す く タ ー ン オ ー バ ー が 悪 い 不 安 定 酵 素 と し て 有 名 で
、異種宿主中で安定的に生産する方法は知られていなかった。そのため、外来遺伝子とし
て P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 導 入 ・ 発 現 し た 組 換 え 微 生 物 を 利 用 し て 、 有 用 な 有 機
化合物の実際の工業生産を行った例はほとんど存在しないと思われる。本発明では、実際
の 工 業 生 産 を 可 能 に す る た め 、 外 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 安 定 的 に 機 能 発 現
する方法を開発することを課題としている。
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【課題を解決するための手段】
【０００９】
分 子 シ ャ ペ ロ ン と し て は 、 GroEL等 の シ ャ ペ ロ ニ ン や PPIase（ ペ プ チ ジ ル プ ロ リ ル cis-t
ransイ ソ メ ラ ー ゼ ） 等 多 く の も の が 知 ら れ て い る が 、 発 明 者 ら は 好 熱 性 の 古 細 菌 由 来 の PP
Iaseに 着 目 し た 。 そ の 理 由 は 、 古 細 菌 由 来 の PPIaseは 、 失 活 し に く く 、 構 造 的 に も 真 正 細
菌 由 来 の PPIaseと 異 な っ て い る こ と 、 さ ら に は 、 ロ ダ ネ ー ゼ 遺 伝 子 等 の 大 腸 菌 で の 機 能 発
現 に 実 績 が あ る か ら で あ る 。 シ ャ ペ ロ ニ ン ま た は PPIaseを 利 用 し た タ ン パ ク 質 の 安 定 的 生
産 の 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ て き た こ と は 「 背 景 技 術 」 で 述 べ た と お り で あ る 。 一 方 、 P450モ
ノオキシゲナーゼに関する研究はきわめて盛んであることは言うまでもない。試しに、「
PPIase」 及 び 「 P450」 を キ ー ワ ー ド と し て 、 米 国 NCBI（ National Center for Biotechnol
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ogy Information） の Entrez-PubMedで 検 索 す る と 、 そ れ ぞ れ 、 2,364件 、 及 び 、 16,433件
ヒ ッ ト し た 。 と こ ろ が 、 「 PPIase & P450」 で 同 デ ー タ ベ ー ス を 検 索 す る と 、 2件 し か ヒ ッ
ト が な く 、 し か も こ の 2件 は 、 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 安 定 化 に は 全 く 関 係 の な い 文 献
で あ っ た 。 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 安 定 化 は 、 ニ ー ズ が 多 い は ず に も か か わ ら ず 、 今 ま
で PPIaseを 利 用 し た 方 法 が 存 在 し な か っ た の は 、 こ の 方 法 の 開 発 が 困 難 で あ る こ と を 物 語
っ て い る 。 本 発 明 者 ら は 、 古 細 菌 の PPIaseを 利 用 す る だ け で な く 、 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー
ゼ の 中 で は 例 外 的 に 、 １ つ の ペ プ チ ド が P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の ホ ロ 酵 素 で あ る 真 正 細
菌 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ に 着 目 し て こ れ を P450モ ノ オ キ
シゲナーゼのモデルとして利用することにより、本発明を完成するに至った。
【００１０】
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すなわち、本発明は以下の（１）∼（１５）を提供するものである。
【００１１】
（ １ ） シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と 古 細 菌 由 来 の PPIaseの 両 者 を 生 産 可 能 な 微 生
物 を 培 養 し 、 培 養 物 又 は 菌 体 か ら シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を 採 取 す る こ と を 特
徴 と す る シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 。
【００１２】
（ ２ ） シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 細 菌 由 来 の シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ
ー ゼ で あ る こ と を 特 徴 と す る （ １ ） に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産
方法。
【００１３】
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（ ３ ） シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト
ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 、 又 は そ の 一 部 を 改 変 し た シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ
ー ゼ で あ る こ と を 特 徴 と す る （ １ ） に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産
方法。
【００１４】
（ ４ ） バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 一 部 を
改 変 し た シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ
ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 87番 目 の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン を バ リ ン に 置 換 し た シ ト ク
ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ で あ る こ と を 特 徴 と す る （ ３ ） に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ
ノオキシゲナーゼの生産方法。
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【００１５】
（ ５ ） 微 生 物 が 、 大 腸 菌 で あ る （ １ ） 乃 至 （ ４ ） の い ず れ か 一 項 に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P4
50モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 。
【００１６】
（ ６ ） シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の N末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIaseを 付 加 し た 融
合タンパク質を生産可能な微生物を培養し、培養物又は菌体から、活性のあるシトクロー
ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を 含 む 融 合 タ ン パ ク 質 を 採 取 す る こ と を 特 徴 と す る シ ト ク ロ ー
ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 。
【００１７】
（ ７ ） 融 合 タ ン パ ク 質 が 、 シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と 古 細 菌 由 来 の PPIaseと の
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間に切断部位を含む融合タンパク質であることを特徴とする（６）に記載のシトクローム
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 。
【００１８】
（ ８ ） シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 細 菌 由 来 の シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ
ー ゼ で あ る こ と を 特 徴 と す る （ ６ ） 又 は （ ７ ） に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ
ーゼの生産方法。
【００１９】
（ ９ ） シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト
ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 、 又 は そ の 一 部 を 改 変 し た シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ
ー ゼ で あ る こ と を 特 徴 と す る （ ６ ） 又 は （ ７ ） に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ
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ーゼの生産方法。
【００２０】
（ １ ０ ） バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 一 部
を 改 変 し た シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の
シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 87番 目 の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン を バ リ ン に 置 換 し た シ ト
ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ で あ る こ と を 特 徴 と す る （ ９ ） に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P450
モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００２１】
（ １ １ ） 微 生 物 が 、 大 腸 菌 で あ る （ ６ ） 乃 至 （ １ ０ ） の い ず れ か に 記 載 の シ ト ク ロ ー ム P4
50モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 。
40
【００２２】
（ １ ２ ） シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と 古 細 菌 由 来 の PPIaseの 両 者 を 生 産 可 能 な 微
生物。
【００２３】
（ １ ３ ） シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の N末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIaseを 付 加 し た
融合タンパク質を生産可能な微生物。
【００２４】
（ １ ４ ） シ ト ク ロ ム P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の N末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIaseを 付 加 し た
融合タンパク質。
【００２５】
50
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（ １ ５ ） （ １ ４ ） に 記 載 の 融 合 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNA。
【発明の効果】
【００２６】
本 発 明 は 、 古 細 菌 由 来 の PPIaseを 利 用 す る こ と に よ り P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を
大腸菌等の微生物宿主内で安定的に機能発現させる方法を提供する。そのような組換え微
生物を用いて、生変換反応による産業上有用な有機（低分子）化合物の合成が可能になる
。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
10
【００２８】
最 初 に P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と PPIaseに つ い て 説 明 す る 。
【００２９】
１ ． P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 、 細 菌 か ら 植 物 や 哺 乳 動 物 に 至 る 広 範 囲 の 生 物 種 に 分 布 し て
い る 酸 素 添 加 酵 素 で あ り 、 酸 素 分 子 を 還 元 し て 1分 子 の 水 を 作 る と 共 に 、 残 り の 酸 素 原 子
を 様 々 な 脂 溶 性 の 有 機 （ 低 分 子 ） 化 合 物 (基 質 )に 導 入 し て 、 酸 化 生 成 物 に 変 換 す る 反 応 （
一 原 子 酸 素 添 加 反 応 ） を 触 媒 す る 鉄 ・ イ オ ウ 酵 素 で あ る 。 哺 乳 動 物 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ
ーゼは非常によく研究されており、本酵素は、生体内に取り込まれた薬物や環境汚染毒物
を酸化し水溶性を高め、体外への排出を促進する生体防御の役割を担う鍵酵素（肝臓ミク
20
ロ ソ ー ム 型 P450） で あ り 、 ま た 、 生 体 内 の 二 次 代 謝 産 物 の 生 合 成 に お い て 水 酸 化 反 応 等 を
担 う 鍵 酵 素 （ ミ ト コ ン ド リ ア 型 P450） で も あ る 。 ゲ ノ ム 配 列 の 解 析 か ら P450は 、 ヒ ト で は
約 57種 類 、 細 菌 で は 、 ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム ・ ツ メ フ ァ シ エ ン ス （ Agrobacterium tumefaci
ens） が 5種 類 、 放 線 菌 ス ト レ プ ト マ イ セ ス ・ セ リ カ ラ ー （ Streptomyces coelicolor） が 1
8種 類 、 ス ト レ プ ト マ イ セ ス ・ エ バ ー ミ チ リ ス （ S. avermitilis） が 33種 類 、 マ イ コ バ ク
テ リ ウ ム ・ ツ ベ ル ク ロ シ ス が 20種 類 あ る こ と が 知 ら れ て い る 。 な お 、 大 腸 菌 は P450を 有 し
ていない。
【００３０】
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 、 シ ト ク ロ ム P450本 体 タ ン パ ク 質 （ CYP） 以 外 に 電 子 伝 達 タ
ン パ ク 質 を 必 要 と す る 複 合 酵 素 で あ る 。 す な わ ち 、 P450が 活 性 を 発 揮 す る に は 、 NAD(P)H
30
から電子を伝達してくるタンパク質として、細菌や真核生物のミトコンドリアでは フェ
レドキシンレダクターゼとフェレドキシンの介在を必要とし、哺乳動物の肝臓ミクロソー
ム で は NADPH-P450レ ダ ク タ ー ゼ の 介 在 を 必 要 と す る 。 ま た 、 CYPそ の も の も き わ め て 多
様 で あ る 。 す な わ ち 、 CYPフ ァ ミ リ ー 間 の ア ミ ノ 酸 配 列 の 相 同 性 は 40％ 以 下 で あ り 、 共 通
部 分 は 、 ヘ ム 鉄 と 結 合 す る シ ス テ イ ン 残 基 部 分 と 両 末 端 の 共 通 配 列 部 分 で あ る 。 P450モ ノ
オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が diversozymeと 言 わ れ る 所 以 で あ る 。 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 部 分 的
な構造の変化により多彩な化合物の代謝に多様化された酵素で、先端の生物工学（バイオ
テクノロジー）を活用することにより、既存の方法では難しいと思われている化合物の酸
化処理が可能になると期待されている。したがって、本酵素は、新しい有機（低分子）化
合 物 （ た と え ば ， 位 置 /立 体 特 異 的 に 導 入 さ れ た 水 酸 化 物 な ど ） の 合 成 や 、 分 解 処 理 が 難
40
し い 環 境 負 荷 物 質 の 処 理 へ の 応 用 に 期 待 さ れ て い る 。 ま た 、 作 物 植 物 に 新 た な P450モ ノ オ
キシゲナーゼを導入して残留農薬の分解を促すことなども期待されている。
【００３１】
細 菌 を は じ め と す る 微 生 物 の P450研 究 は 哺 乳 動 物 に 比 べ る と 遅 れ て い た が 、 細 菌 の ゲ ノ
ム 解 析 の 進 展 と 相 ま っ て 、 細 菌 の P450研 究 が 今 日 、 盛 ん に な っ て き た 。 細 菌 で 最 も よ く 研
究 さ れ て い る P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 、 シ ュ ー ド モ ナ ス ・ プ チ ダ 由 来 の P450camで 、 本
酵 素 は 、 樟 脳 （ camphor） を 基 質 と し て 、 5位 に 水 酸 基 を 導 入 す る 反 応 を 触 媒 す る こ と が 明
ら か に さ れ て お り 、 P450cam遺 伝 子 を 導 入 ・ 発 現 し た 組 換 え 細 菌 を 用 い た 解 析 も 広 く 実 施
さ れ て い る （ Poulos, T.L., Finzel, B.C., and Howard, A,J., High-resolution crysta
l structure of cytochrome P450cam.
J. Mol. Biol., 195, 687-700 (1987)） 。 ま た 、
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高 脂 血 症 薬 プ ラ バ ス タ チ ン （ pravastatin;三 共 株 式 会 社 商 品 名 メ バ ロ チ ン ） は 、 コ ン パ
ク チ ン （ compactin） カ ル ボ ン 酸 の 立 体 特 異 的 な 水 酸 化 反 応 に よ り 合 成 さ れ る が 、 こ の 反
応 を 担 う 酵 素 は 、 土 壌 細 菌 ス ト レ プ ト マ イ セ ス ・ カ ル ボ フ ィ ラ ス （ Streptmyces carbophi
lus） 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ で あ る （ Matsuoka, T., Miyakoshi, S., Tanzawa, K
., Nakahara, K., Hosobuchi, M., and Serizawa, N., Purification and characterizat
ion of cytochrome P-450sca from Streptomyces carbophilus. ML-236B (compactin) in
duces a cytochrome P-450sca in Streptomyces carbophilus that hydroxylates ML-236
B to pravastatin sodium (CS-514), a tissue-selective inhibitor of 3-hydroxy-3-me
thylglutaryl-coenzyme-A reductase. Eur. J. Biochem., 184, 707-713, 1989） 。 最 近
、 ロ ド コ ッ カ ス 属 （ Rhodococcus sp.） NCIMB 9784由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ （ P450R
10
hF） の 構 造 が 、 P450本 体 タ ン パ ク 質 、 及 び フ ェ レ ド キ シ ン レ ダ ク タ ー ゼ と フ ェ レ ド キ シ ン
部分（電子伝達タンパク質）がすべて繋がった１つのポリペプチドであることが発見され
た 。 こ の 酵 素 の 遺 伝 子 を 発 現 し た 大 腸 菌 は 、 7-エ ト キ シ ク マ リ ン （ 7-ethoxycoumarin） の
O-脱 ア ル キ ル 化 反 応 を 触 媒 す る こ と が 報 告 さ れ て い る （ Roberts, G.A., Grogan, G., Gre
ter, A., Flitsch, S.L., and Turner, N.J., Identification of a new class of cytoc
hrome P450 from a Rhodococcus sp.
J. Bacteriol., 184, 3898-3908 (2002)） 。
【００３２】
細 菌 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は 、 P450ド メ イ ン と
NADPH-P450レ ダ ク タ ー ゼ ド メ イ ン が 結 合 し た 、 大 変 珍 し い 構 造 を 有 す る 酵 素 で あ る 。 本 酵
素 の 塩 基 配 列 は 、 DDBJ Accession No. J04832に 登 録 さ れ て い る 。 本 酵 素 は 元 々 、 C12∼ C2
20
0の 飽 和 脂 肪 酸 の ω 末 端 （ メ チ ル 基 側 ） の 1位 、 2位 ま た は 3位 を 水 酸 化 す る 酵 素 で あ っ た が
、 87番 目 の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン が バ リ ン に 変 異 し た も の （ F87V） は 、 ナ フ タ レ ン や 2-ブ ロ モ
フェノール等の芳香族化合物を広く基質として認識し 水酸基を導入することができた（
小 川 順 ら , Bacillus megaterium由 来 の シ ト ク ロ ム P450(BM-3)変 異 型 酵 素 を 用 い る パ ラ ヒ
ド ロ キ ノ ン 類 の 酵 素 合 成 , 日 本 農 芸 化 学 会 2003年 大 会 講 演 要 旨 , p. 38, 2003、 及 び 、 Q.
-W. Li, U. Schwaneberg, P. Fischer, and R. D. Schmid, Directed evolution of the
fatty-acid hydoroxylase P450 BM-3 into an indole-hydroxylating catalyst.
Chem.
Eur. J. 6, 1531-1536, 2000） 。
【００３３】
２ ． PPIase
30
PPIase（ ペ プ チ ジ ル プ ロ リ ル cis-transイ ソ メ ラ ー ゼ ） は 、 ペ プ チ ド 中 の プ ロ リ ン イ ミ
ド結合の回転を速めてタンパク質の折り畳みを促進する酵素で、免疫抑制剤のシクロスポ
リ ン Aと 結 合 す る シ ク ロ フ ィ リ ン 、 FK506と 結 合 す る FKBP、 こ れ ら と 結 合 し な い パ ー ブ リ ン
の 3種 類 が あ る 。 超 好 熱 古 細 菌 の ゲ ノ ム は PPIaseと し て FKBP遺 伝 子 し か 有 し て い な い 。 超
好 熱 古 細 菌 の PPIaseは 他 の 生 物 種 の PPIaseに は な い 、 変 性 タ ン パ ク 質 の 凝 集 を 阻 止 し て 折
り た た む シ ャ ペ ロ ン 活 性 を 有 す る （ A. Ideno, T. Yoshida, T IIDA, M. Furutani, and T
. Maruyama. FK506-binding protein of the hyperthermophilic archaeum, Thermococcu
s sp. KS-1, a cold-shock-inducible peptidyl-prolyl cis-trans isomerase with acti
vities to trap and refold denatured proteins. Biochem J. 357(Pt 2):465-71, 2001
） 。 ま た タ ン パ ク 質 が 熱 凝 集 す る こ と を 抑 制 す る 凝 集 抑 制 活 性 も 有 し て い る （ A. Ideno,
40
M. Furutani, Y. Iba, Y. Kurosawa, and T. Maruyama. FK506 binding protein from th
e hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii suppresses the aggregation of
proteins in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. Feb;68(2):464-469, 2002.
）。これらの性質はその高い熱安定性と併せて、変性しやすいタンパク質の安定化やタン
パク質生産の際生じる不活性型タンパク質の再活性化など産業分野への応用が期待されて
いるものである。
【００３４】
発 明 者 が 所 属 す る 研 究 機 関 で あ る (株 )海 洋 バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー 研 究 所 で は 、 積 水 化 学 工
業 (株 )と の 共 同 研 究 に よ り 、 免 疫 抑 制 剤 FK506と 結 合 す る タ ン パ ク 質 で あ る PPIase遺 伝 子
を 好 熱 性 古 細 菌 ピ ロ コ ッ カ ス ・ ホ リ コ シ （ Pyrococcus horikoshii） 等 よ り 単 離 し た 。 本 P
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PIaseは 、 古 細 菌 の 不 安 定 な 酵 素 で あ る ロ ダ ネ ー ゼ （ rhodanese） や 、 不 溶 化 し や す い 鶏 卵
の リ ゾ チ ー ム 抗 体 の Fab断 片 等 を 、 本 来 の 立 体 構 造 に 巻 き 戻 し 可 溶 化 さ せ る こ と が で き た
（ 特 開 平 10-91号 公 報 ） 。 し か も 、 ロ ダ ネ ー ゼ は 本 PPIase共 存 下 で 100℃ ま で 安 定 で あ っ た
。 し た が っ て 、 本 PPIaseは 高 温 で も 安 定 な 分 子 シ ャ ペ ロ ン で あ る こ と が わ か っ た 。 ま た 、
安 定 的 に 機 能 発 現 さ せ た い タ ン パ ク 質 の N末 に 、 前 記 PPIaseま た は 大 腸 菌 の シ ャ ペ ロ ニ ン G
roELを 融 合 さ せ る こ と に よ り 、 そ の タ ン パ ク 質 が 本 来 の 立 体 構 造 に 巻 き 戻 さ れ る こ と が わ
か っ た 。 こ の 融 合 タ ン パ ク 質 系 を 用 い て 、 毒 性 の 強 い B型 肝 炎 ウ ィ ル ス 表 面 抗 原 や 不 溶 性
の ヒ ト IgGの 重 鎖 等 を コ ー ド す る 遺 伝 子 が 、 安 定 的 に 組 換 え 大 腸 菌 内 で 機 能 発 現 さ れ る こ
と が わ か っ た （ 特 許 文 献 １ 、 特 許 文 献 ２ ） 。 最 近 、 三 井 化 学 も PPIaseの シ ャ ペ ロ ン 活 性 に
着 目 し 、 大 腸 菌 の PPIaseを 利 用 す る こ と に よ り 、 大 腸 菌 で 生 産 が 難 し か っ た ヒ ト の ミ ッ ド
10
カ イ ン や 組 織 プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン 活 性 化 因 子 （ TPA） の 生 産 量 の 増 強 に 成 功 し た と 発 表 し て
い る （ 日 経 バ イ オ テ ク 、 2003年 5月 21日 ） 。
【００３５】
次 に 、 本 発 明 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 に つ い て 説 明 す る 。
【００３６】
本 発 明 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 生 産 方 法 は 、 古 細 菌 由 来 の PPIaseの シ ャ ペ ロ ン 活 性
を 利 用 す る こ と に よ り 、 機 能 の あ る P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を 安 定 的 に 生 産 す る こ と が で
き る 。 古 細 菌 由 来 の PPIaseの シ ャ ペ ロ ン 活 性 を 利 用 す る 方 法 と し て は 、 以 下 の 二 通 り の 方
法がある。
【００３７】
20
第 一 の 方 法 は 、 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と 古 細 菌 由 来 の PPIaseの 両 者 を 生 産 可 能 な 微 生
物 を 培 養 し 、 培 養 物 又 は 菌 体 か ら P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を 採 取 す る こ と を 特 徴 と す る も
のである。
【００３８】
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と 古 細 菌 由 来 の PPIaseの 両 者 を 生 産 可 能 な 微 生 物 は 、 P450モ ノ
オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 発 現 す る ベ ク タ ー と 古 細 菌 由 来 の PPIase遺 伝 子 を 発 現 す る ベ ク タ
ーを作製し、これらを同一の宿主に導入することにより作製できる。
【００３９】
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 酵 素 活 性 を 発 揮 す る た め に は 、 酵 素 本 体 の 他 に 電 子 伝 達 タ ン
パク質も必要であり、また、酵素本体と電子伝達タンパク質は通常別々のタンパク質とし
30
て 生 産 さ れ る 。 従 っ て 、 ベ ク タ ー 作 製 の 際 に は 、 通 常 、 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 だ
けではなく、電子伝達タンパク質をコードする遺伝子も挿入しておく必要がある。
【００４０】
使 用 す る P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 は 、 植 物 や 動 物 な ど の 真 核 生 物 由 来 の も の で あ
っ て も よ い が 、 細 菌 由 来 の も の で あ る こ と が 好 ま し い 。 細 菌 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー
ゼ 遺 伝 子 は 特 に 限 定 さ れ な い が 、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の 遺 伝 子 （ DDBJ Acc
ession No. J04832） 、 ロ ド コ ッ カ ス 属 NCIMB9784由 来 の 遺 伝 子 （ GenBank Accession No.
AF459424） 、 シ ュ ー ド モ ナ ス ・ プ チ ダ 由 来 の 遺 伝 子 （ P450cam、 DDBJ Accession No. M12
546） な ど を 使 用 す る の が 好 ま し い 。 ま た 、 天 然 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の 配 列
を一部改変した遺伝子を使用してもよい。このような配列の一部改変した遺伝子としては
40
、 バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 87番 目 の フ ェ ニ ル ア ラ
ニ ン を バ リ ン に 置 換 し た 酵 素 を コ ー ド す る 遺 伝 子 （ DDBJ Accession No. J04832の 塩 基 配
列 に お い て 、 261番 目 の ア デ ニ ン が グ ア ニ ン に （ ア ミ ノ 酸 に は 影 響 し な い ） 、 262番 目 の チ
ミ ン が グ ア ニ ン に 置 き 換 わ り 、 そ の 結 果 、 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 87番 目 の フ ェ ニ ル ア
ラニンがバリンに置き換わる。）を挙げることができる。
【００４１】
使 用 す る PPIaseを コ ー ド す る 遺 伝 子 は 、 古 細 菌 由 来 の も の で あ れ ば 特 に 限 定 さ れ ず 、 例
え ば 、 ピ ロ コ ッ カ ス ・ ホ リ コ シ （ Pyrococcus horikoshii） 由 来 の 遺 伝 子 [遺 伝 子 番 号 PH1
399; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]、 メ タ ノ バ ク テ リ ウ ム ・ サ ー モ オ ー ト ト ロ フ ィ カ ム
（ Methanobacterium thermoautotrophicum） 由 来 の 遺 伝 子 [遺 伝 子 番 号 MTH1125; http://
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www.ncbi.nlm.nih.gov/]な ど を 使 用 す る こ と が で き る 。
【００４２】
宿主とする微生物は、両方の遺伝子を発現させることのできる微生物であれば特に限定
されないが、大腸菌であることが好ましい。
【００４３】
大腸菌等の微生物内における上記の二つの遺伝子の発現は、遺伝子工学実験の常法に基
づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝
子 の 導 入 ・ 発 現 法 は 、 多 く の 実 験 書 に 記 載 さ れ て い る の で （ た と え ば 、 Sambrook, J., Ru
ssel,D. W., Molecular Cloning
A Laboratory Manual, 3
r d
Edition, CSHL Press, 200
1; Hopwood, D. A., Bibb, M. J., Chater, K. F., Bruton, C. J., Kieser, H. M., Lyd
iate, D. J., Smith, C. P., Ward, J. M., Schrempf, H.
10
Genetic manipulation of St
reptomyces: A laboratory manual, The John Innes Institute, Norwich, UK, 1985） 、
それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００４４】
微生物の培養及び菌体等からの酵素の採取は、常法に従って行うことができる。
【００４５】
第 二 の 方 法 は 、 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の N末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIaseを 付 加 し た 融
合 タ ン パ ク 質 を 生 産 可 能 な 微 生 物 を 培 養 し 、 培 養 物 又 は 菌 体 か ら 、 活 性 の あ る P450モ ノ オ
キシゲナーゼを含む融合タンパク質を採取することを特徴とするものである。必要に応じ
て 、 こ の 融 合 タ ン パ ク 質 か ら P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を 遊 離 さ せ 、 採 取 す る こ と も で き る
20
。
【００４６】
P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の N末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIaseを 付 加 し た 融 合 タ ン パ ク 質 を
生 産 可 能 な 微 生 物 は 、 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の 5'末 端 側 に 古 細 菌 由 来 の PPIase遺
伝子を付加した融合遺伝子を発現するベクターを作製し、それを宿主微生物に導入するこ
とにより作製できる。
【００４７】
使 用 す る P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 及 び 古 細 菌 由 来 の PPIase遺 伝 子 は 、 第 一 の 方 法
と同様のものでよい。
【００４８】
30
上 述 し た よ う に 、 P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 発 現 す る ベ タ ク ー に は 通 常 電 子 伝 達
タ ン パ ク 質 遺 伝 子 も 挿 入 し て お く 必 要 が あ る の で 、 融 合 遺 伝 子 を 発 現 す る ベ ク タ ー は 、 P4
50モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 、 電 子 伝 達 タ ン パ ク 質 遺 伝 子 、 及 び 古 細 菌 由 来 の PPIase遺 伝
子の三者を含むことになる。このようなベクターの作製には、図１に示すプラスミドを使
用するのが好ましい。
【００４９】
具 体 的 に は 、 古 細 菌 由 来 の PPIase遺 伝 子 の 後 に 適 当 な 長 さ の リ ン カ ー を 介 し て 、 電 子 伝
達 タ ン パ ク 質 遺 伝 子 を 繋 ぐ 。 リ ン カ ー 部 分 に λ フ ァ ー ジ の att配 列 を 加 え て お け ば 、 λ フ
ァ ー ジ の 部 位 特 異 的 組 換 え 系 （ attB x attP ま た は attL x attR） を 利 用 し て 、 対 応 す る
att配 列 に 囲 ま れ た P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 容 易 に 挿 入 す る こ と が で き る 。 こ の
40
部 位 特 異 的 組 換 え 実 験 に は 、 イ ン ビ ト ロ ジ ェ ン 社 の Gateway Technologyキ ッ ト を 用 い る こ
とができる。電子伝達タンパク質は種々のものを用いることができるが、たとえば、ロド
コ ッ カ ス 属 NCIMB 9784由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ （ P450− フ ェ レ ド キ シ ン レ ダ ク タ ー
ゼ−フェレドキシンの融合タンパク質のような構造をしている）におけるフェレドキシン
レダクターゼ−フェレドキシン部分を用いればよい。
【００５０】
ま た 、 融 合 タ ン パ ク 質 中 の 古 細 菌 由 来 の PPIaseと P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 間 に は 、 酵
素などによって切断される部位が挿入されていることが好ましい。このような切断部位と
しては、実施例で構築したトロンビン切断部位を例示できるが、これに限定されるわけで
は な い 。 融 合 タ ン パ ク 質 か ら P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を 遊 離 さ せ る 方 法 は 特 に 限 定 さ れ な
50
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いが、切断部位を挿入した場合には、その切断部位を切断する酵素等を作用させればよい
。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。
【００５２】
〔実施例１〕 共発現系用プラスミドの構築
バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ （ monooxygenase） （ DDB
J Accession No. J04832） の 変 異 酵 素 で あ る F87V（ 87番 目 の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン を バ リ ン に
10
置 換 し た も の ） は 、 そ の 構 造 遺 伝 子 を PCRに よ り 増 幅 し 、 ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ド pUC18の EcoR
I− BamHI部 位 に ク ロ ー ニ ン グ し た 。 以 後 、 こ の プ ラ ス ミ ド を pUC18-F87Vと 呼 ぶ 。 PCRに
よる増幅の条件は以下の通りである。
【００５３】
PCR増 幅 に 用 い た プ ラ イ マ ー
Primer1 (36mer)
5'- gTgAAAgAggAATTCCATgACAATTAAAgAAATgCC -3'（ 配 列 番 号 １ ）
Primer2 (42mer)
5'- CgggATTCTTAATgATgATgATgATgATgCCCAgCCCACACg -3'（ 配 列 番 号 ２ ）
下 線 部 は EcoRIサ イ ト （ Primer1） 、 BamHIサ イ ト （ Primer2） を そ れ ぞ れ 示 し て い る 。
20
【００５４】
PCR増 幅 条 件
９４℃ ２分処理後、９４℃ １５秒、６１℃ ３０秒、６８℃ ４分を２５サイクル行っ
た 。 KOD Plus DNA polymerase (TOYOBO)を 用 い た 。
【００５５】
ピ ロ コ ッ カ ス ・ ホ リ コ シ （ Pyrococcus horikoshii） 由 来 の PPIase遺 伝 子 は PCRに よ り 増
幅 し 、 ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ド pET21aベ ク タ ー の NdeI-HindIII部 位 に ク ロ ー ニ ン グ し た 後 、 PP
Iase遺 伝 子 と こ れ に 隣 接 す る T7プ ロ モ ー タ ー を SphI− SalIで 切 り 出 し 、 pACYC184の 同 部 位
に ク ロ ー ニ ン グ し 、 PPIase発 現 プ ラ ス ミ ド を 作 製 し た 。 以 後 、 こ の プ ラ ス ミ ド を pACPhFK１ と 呼 ぶ （ Ideno, A., Furutani, M., Iba, Y., Kurosawa, Y., and Maruyama, T., FK50
30
6 binding protein from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii supp
resses the aggregation of proteins in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol.
68(2):464-469 (2002)） 。
【００５６】
大 腸 菌 JM109(DE3)株 を は じ め に pACPhFK-１ で 形 質 転 換 し た 。 得 ら れ た 大 腸 菌 を 用 い て コ
ン ピ テ ン ト セ ル を 作 製 し 、 更 に pUC18-F87Vで 形 質 転 換 し た 。 こ の 操 作 に よ り 、 pACPhFK-１
と pUC18-F87Vの ２ つ を 有 し た 大 腸 菌 JM109(DE3)/ pACPhFK-１ / pUC18-F87Vが 得 ら れ た 。
【００５７】
ま た 比 較 の 対 象 と し て PPIase遺 伝 子 を 持 た な い 大 腸 菌 も 作 製 し た 。 こ れ は PPIase遺 伝 子 が
入 っ て い な い ベ ク タ ー で あ る pACYC184と pUC18-F87Vの ２ プ ラ ス ミ ド を 有 す る JM109(DE3)/
40
pACYC184/ pUC18-F87Vで あ る 。
【００５８】
〔実施例２〕 共発現系による化合物の生変換能力の解析
構 築 し た 共 発 現 系 JM109(DE3)/ pACPhFK-１ / pUC18-F87V及 び P450単 独 発 現 系 JM109(DE3)
/ pACYC184/ pUC18-F87Vは 各 々 LB培 地 （ ア ン ピ シ リ ン 100 μ g/ml及 び ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー
ル 25 μ g/mlを 含 む ） 4 mLで 16時 間 、 30℃ で 培 養 し た 。 こ の 前 培 養 液 全 量 を M9＋ グ ル コ ー
ス 培 地 （ ア ン ピ シ リ ン 100 μ g/ml及 び ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル 25 μ g/mlを 含 む ） 100 mLに
全 量 植 菌 し 、 4時 間 培 養 し た 。 こ の 培 養 液 に 誘 導 物 質 と し て IPTGを 1 mMに な る よ う 加 え 、
更 に 30℃ で 16時 間 培 養 し た 。 そ の 後 集 菌 し 、 10 mMト リ ス バ ッ フ ァ ー （ ｐ H＝ 7.5） 40 mLに
懸 濁 、 基 質 と し て イ ン ド ー ル を 1 mM、 ま た は 5 mMに な る よ う 添 加 し た 。 30℃ で 16時 間 振 盪
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培 養 し 基 質 と の 反 応 を 行 わ せ た 後 、 細 胞 懸 濁 液 と 等 量 、 す な わ ち 40 mLの メ タ ノ ー ル を 入
れ 、 30分 間 攪 拌 し た 。 次 に 8,000回 転 で 5分 間 遠 心 を 行 い 、 上 清 80 μ lを HPLCで の 解 析 に 用
いた。
【００５９】
イ ン ド ー ル は P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ (F87V)に よ り 水 酸 化 反 応 を 触 媒 さ れ 、 イ ン デ ィ ゴ
に 変 換 さ れ る 。 共 発 現 系 、 及 び P450単 独 発 現 系 で の イ ン デ ィ ゴ 生 成 を HPLCで 検 出 、 比 較 し
た結果を表１に示す。実験は３回行い、その平均値が示してある。なお、インドール及び
イ ン デ ィ ゴ に お け る HPLCで の 保 持 時 間 は そ れ ぞ れ 、 ９ .５ 分 、 及 び 、 ４ .８ 分 で あ っ た 。
【００６０】
【表１】
10
【００６１】
表 １ に 示 す よ う に 、 PPIaseと の 共 発 現 系 は P450単 独 発 現 系 と 比 較 し 、 １ ｍ Mイ ン ド ー ル
20
を 基 質 と し た 場 合 で 約 １ ． ７ 倍 、 ５ ｍ Mイ ン ド ー ル で 約 ３ ． ３ 倍 の 変 換 効 率 を 示 し た 。
【００６２】
〔実施例３〕 融合タンパク質作製用発現プラスミドの構築
バ チ ル ス ・ メ ガ テ リ ウ ム BM-3株 由 来 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 変 異 酵 素 で あ る F87V
は 、 そ の 構 造 遺 伝 子 1.3 kbを PCRに よ り 増 幅 し た 。 用 い た プ ラ イ マ ー の 配 列 を 以 下 に 示 す
。
【００６３】
Primer1 (30mer)
5'- GGAGCTCACAATTAAAGAAATGCCTCAGCC-3'（ 配 列 番 号 ３ ）
Primer2 (36mer)
30
5'- CGCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCCCAGC -3'（ 配 列 番 号 ４ ）
下 線 部 は SacIサ イ ト （ Primer1） 、 XhoIサ イ ト （ Primer2） を そ れ ぞ れ 示 し て い る 。
【００６４】
PCR増 幅 条 件
９４℃ ２分処理後、９４℃ １５秒、６１℃ ３０秒、６８℃ ４分を２５サイクル行っ
た 。 KOD Plus DNA polymerase (TOYOBO)を 用 い た 。
【００６５】
サ ー モ コ ッ カ ス 属 （ Thermococcus sp.） KS-1由 来 の PPIase遺 伝 子 18 kbは PCRに よ り 増
幅した。用いたプライマーの配列を以下に示す。
【００６６】
40
Primer3 (28mer)
5'- GGCCATGGGAAAAGTTGAAGCTGGTGAT -3'（ 配 列 番 号 ５ ）
Primer4 (26mer)
5'- CCACTAGTAGCTTCTGAGTCCTCCTC -3'（ 配 列 番 号 ６ ）
下 線 部 は NcoIサ イ ト （ Primer3） 、 SpeIサ イ ト （ Primer4） を そ れ ぞ れ 示 し て い る 。
【００６７】
PPIase遺 伝 子 と P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の 間 に ト ロ ン ビ ン 切 断 部 位 を 構 築 す る た
め 、 相 互 に 相 補 的 な 次 の 配 列 を 持 つ 2本 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド (Throm-F、 Throm-R)を 合 成
し ハ イ ブ リ ダ イ ズ さ せ 2本 鎖 DNA断 片 を 作 製 し た 。 以 下 こ の 2本 鎖 DNA断 片 を Throm断 片 と 呼
ぶ。
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【００６８】
Throm-F
5'- GGACTAGTCTGGTTCGGCGTGGATCC CATATG GAATTCGG -3'（ 配 列 番 号 ７ ）
Throm-R
5'- CCGAATTC CATATG GGATCCACGCCGAACCAGACTAGTCC -3'（ 配 列 番 号 ８ ）
こ の 断 片 は SpeI（ ACTAGT） 、 BamHI(GGATCC)、 NdeI(CATATG)、 EcoRI(GAATTC)の 制 限 酵 素
サ イ ト を 含 ん で い る 。 上 記 Throm-F及 び Throm-Rの 配 列 に お い て こ れ ら の サ イ ト は 下 線 で
示している。
【００６９】
上 述 の 方 法 で 増 幅 し た PPIase遺 伝 子 は NcoI及 び SpeI、 Throm断 片 は SpeIと EcoRIで 各 々
10
処 理 し 、 ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ド pET21dの NcoI-EcoRIサ イ ト へ タ ン デ ム に 挿 入 し た 。 得 ら れ た
発 現 プ ラ ス ミ ド の SacI− XhoIサ イ ト へ 更 に P450遺 伝 子 を ク ロ ー ニ ン グ し 、 PPIaseと P450の
融 合 タ ン パ ク 質 遺 伝 子 発 現 系 を 構 築 し た 。 以 下 、 こ の プ ラ ス ミ ド を pFusionP450と 呼 ぶ 。 p
FusionP450の マ ッ プ は 図 ２ に 示 さ れ て い る 。 な お 、 プ ラ ス ミ ド pFusionP450に よ り 作 ら れ
る FKBPと P450の 分 子 間 に は リ ン カ ー ペ プ チ ド が あ り （ ア ミ ノ 酸 配 列 TSLVPRGSHMEFEL） ト
ロンビン切断部位（下線部）を有している。
【００７０】
比 較 対 象 と し て 、 P450遺 伝 子 の み を pET21dの SacI− XhoI部 位 へ ク ロ ー ニ ン グ し た プ ラ ス
ミ ド pETP450も 作 製 し た 。
【００７１】
20
〔 実 施 例 ４ 〕 融 合 タ ン パ ク 質 法 に よ る F87Vの 安 定 発 現
大 腸 菌 BL21 (DE3)株 を pFusionP450ま た は pETP450で 形 質 転 換 し 、 各 々 LB培 地 （ ア ン ピ シ
リ ン 100 μ g/mlを 含 む ） 3 mLで 4時 間 、 30℃ で 培 養 し た 。 こ の 前 培 養 液 全 量 を LB培 地 （ ア
ン ピ シ リ ン 100 μ g/ml含 む ） 40 mLに 全 量 植 菌 し 、 3時 間 培 養 し た 。 こ の 培 養 液 に 誘 導 物 質
と し て IPTGを 0.5 ｍ Mに な る よ う 加 え 、 更 に 30℃ で 16時 間 培 養 し た 。 そ の 後 集 菌 し 、 10 ｍ
Mリ ン 酸 ナ ト リ ウ ム バ ッ フ ァ ー （ ｐ H＝ 8.0） 2 ｍ Lに 懸 濁 、 氷 上 で 超 音 波 破 砕 を 行 い 32,000
回 転 で 30分 間 超 遠 心 を 行 い 、 得 ら れ た 上 清 を 無 細 胞 抽 出 液 と し た 。 BL21(DE3)/pFusionP45
0ま た は /pETP450よ り 調 製 し た 無 細 胞 抽 出 液 の タ ン パ ク 質 濃 度 を 測 定 し 、 約 6 μ gを SDS/PA
GEゲ ル （ 7.5-15％ ） で 泳 動 し た 。 得 ら れ た バ ン ド を 解 析 し た と こ ろ 、 pFusionP450を 用 い
た 系 は pETP450の 系 と 比 較 し て 約 2.7倍 量 の P450が 発 現 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。
30
【００７２】
次 に 、 P450単 独 発 現 系 及 び PPIase-P450融 合 タ ン パ ク 質 の 無 細 胞 抽 出 液 に つ い て 、 P450
の 熱 安 定 性 を 検 討 し た 。 実 際 に は 、 前 も っ て 、 各 無 細 胞 抽 出 液 の P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ
活 性 を 測 定 し 、 60℃ 、 20分 の 処 理 を 行 っ た 後 に 、 残 存 活 性 を 測 定 し た 。 活 性 の 測 定 は 、 0.
1 Mリ ン 酸 ナ ト リ ウ ム バ ッ フ ァ ー (pH8.0)に 無 細 胞 抽 出 液 （ タ ン パ ク 量 200∼ 400μ g） 及 び
基 質 と し て ラ ウ リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム を 最 終 濃 度 0.5 ｍ Mに な る よ う 加 え 、 NADPH（ 終 濃 度 0.2
μ M） を 添 加 後 素 早 く 混 合 し 、 分 光 光 度 計 で 340 nmに 示 さ れ る NADPHの 吸 光 度 の 減 少 を 追 う
ことによって行った。各々の無細胞抽出液の活性を熱処理前と後で比較した結果、表２に
示 す よ う に 、 PPIaseと の 融 合 タ ン パ ク 質 化 し た P450BM-3モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ F87V[大 腸 菌 (
pFusionP450)の 無 細 胞 抽 出 液 ]の 方 が 、 単 独 の P450BM-3モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ F87V[大 腸 菌 (p
40
ETP450)の 無 細 胞 抽 出 液 ]よ り も 熱 安 定 性 に 優 れ て い る こ と が 判 明 し た 。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
〔 実 施 例 ５ 〕 融 合 タ ン パ ク 質 法 に よ る P450camの 安 定 発 現
シ ュ ー ド モ ナ ス ・ プ チ ダ 由 来 の P450cam（ DDBJ Accession No. M12546） は 、 そ の 構 造 遺
伝 子 1.3 kbを PCRに よ り 増 幅 し た 。 用 い た プ ラ イ マ ー の 配 列 を 以 下 に 示 す 。
【００７５】
Primer1 (30mer)
5'- GGACTAGTATGACGACTGAAACCATACAAA-3'（ 配 列 番 号 ９ ）
Primer2 (30mer)
5'- CATATGTTATACCGCTTTGGTAGTCGCCGG -3'（ 配 列 番 号 １ ０ ）
下 線 部 は SpeIサ イ ト （ Primer1） 、 NdeIサ イ ト （ Primer2） を そ れ ぞ れ 示 し て い る 。
10
【００７６】
PCR増 幅 条 件
９４℃ ２分処理後、９４℃ １５秒、６１℃ ３０秒、６８℃ ４分を２５サイクル行っ
た 。 KOD Plus DNA polymerase (TOYOBO)を 用 い た 。 〔 実 施 例 ３ 〕 で 構 築 し た 発 現 プ ラ ス ミ
ド の SpeI− NdeIサ イ ト に こ の 断 片 を ク ロ ー ニ ン グ し 、 融 合 プ ラ ス ミ ド pFusionP450camを 作
製 し た 。 ま た 比 較 対 象 と し て P450cam遺 伝 子 を pET21aに ク ロ ー ニ ン グ し た pETP450camプ ラ
ス ミ ド も 作 製 し た 。 大 腸 菌 BL21 (DE3)株 を pFusionP450camま た は pETP450camで 形 質 転 換 し
、実施例４と同様の手法で培養、無細胞抽出液を調製した。各無細胞抽出液のタンパク質
濃 度 を 測 定 し 、 約 6 μ gを SDS/PAGEゲ ル （ 7.5-15％ ） で 泳 動 し 得 ら れ た バ ン ド を 解 析 し た
と こ ろ 、 pFusionP450camを 用 い た 系 は pETP450の 系 と 比 較 し て 約 2.１ 倍 量 の P450camが 発 現
していることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【 図 １ 】 PPIase− P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ − 電 子 伝 達 タ ン パ ク 質 の 融 合 タ ン パ ク 質 生 産 用
プラスミドの構造を示す図である。
【 図 ２ 】 PPIase-P450モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の 融 合 タ ン パ ク 質 生 産 用 プ ラ ス ミ ド pFusionP450
の構造を示す図である。
20
(15)
【図１】
【図２】
【配列表】
2005278637000001.app
JP 2005-278637 A 2005.10.13
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JP 2005-278637 A 2005.10.13
フロントページの続き
7
(51)Int.Cl.
Ｃ１２Ｎ
ＦＩ
9/90
Ｃ１２Ｎ
テーマコード（参考）
9/90
(72)発明者 井手野 晃
岩手県釜石市平田第３地割７５番１ 株式会社海洋バイオテクノロジー研究所内
(72)発明者 小川 順
京都府京都市北区上賀茂榊田町２８ メルベーユ３４６ ３０１号室
(72)発明者 清水 昌
京都府京都市右京区常盤山下町６−９
Ｆターム(参考) 4B024 AA03 BA07 BA08 CA02 CA07 DA06 EA04
4B050 CC03 CC04 CC05 DD02 LL05
4B065 AA01Y AA17Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA27 CA28 CA60