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ウサギ及びヒ卜関節軟骨細胞が産生する
インスリン様成長因子結合蛋白質について
大学院医学研究科生理系専攻(生化学 3)
大川得太郎
授
ι
x
a隼
介
宏
原
市
e
当
担び導
目よ指
科お究
主研
ウサギ及びヒ卜関節軟骨細胞が産生する
インスリン様成長因子結合蛋白質について
大学院医学研究科生理系専攻(生化学 3)
大川得太郎
市︹又
X
ん
4字
介
宏
原
市
当
担び
目よ指
科お究
主研
【要旨】
生体内において軟骨の成長と代謝は、全身性因子と軟骨細胞自身が産生する
局所性因子の両者により制御されている。全身性因子としては、成長ホルモン、
インスリン様成長因子 (
i
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth factor ;I
G
F
)、副甲状腺ホルモ
ン、甲状腺ホルモンなどがある。局所性因子としては、塩基性線維芽細胞成長
i
b
r
o
b
l
a
s
t growth factor ;bFGF)、 トランスフォーミング成長
因子 (basic f
因子ー β(transforming growth factor-β;TGF-β)、さらに I
G
Fが重要であ
G
Fはインスリンに類似した惰造を持った成長因子であり、 I
GF
Iと I
G
F
I
I
る
。 I
の 2種類が報告されている。 I
G
Fは、軟骨細胞の増殖と分化の両者を促進する成
G円ま、局所環境において重要な働きを
長因子であり、軟骨細胞自身が産生する I
担っている事が示唆されている。
ところで、最近、各種の細胞自身が IGF結合蛋白質 (IGF-binding protein ;
G
F作用を修飾している事が示唆されている。しかし、
IGFBP)を産生し、局所の I
軟骨細胞自身が産生する IGFBPについての報告は数少なく、特にヒ卜軟骨細胞
についての報告は見られない。そこで、今回著者は、ウサギ及びヒト関節軟骨
細胞を用い、 IGFBPの産生について検討を行った。軟骨材料として、生後 4週
歯紡ウサギ膝関節軟骨と、人工関節置換術時に採取したヒト関節軟骨を用いた。
i
n
t
e
r
l
e
u
k
i
n
-1β;
これらより軟骨細胞を分離培養し、各種サイトカイン (
G
F
I、 I
G
F
I
I
)
I
L
l
β 、 tumor necrosis factor-α;TNF-α 、インスリン、 I
及びデキサメサソ、ン (
D
e
x
.
)添加時のプ口テオグリカン (PG)合成、細胞層への PG
の蓄積量及び培養上清中の I
GF
I量を測定した。また、培養上清中の IGFBPは
CI
]1
GF
Iによるウエスタン・リガンドプロット法と、抗ヒ卜 IGFBP-3抗 体 に
2S
よるウエスタン・イムノプロット法により検討し、以下の結果を得た。
，
1、ウサギ軟骨細胞が、主に 30kDaの IGFBPを産生しており、この IGFBPは
糖鎖の結合しない型であることが判明した。
2、ウサギ関節軟骨細胞に、 I
L
ls、T
N
F
α 、D
e
x
.を添加すると、 PG産生が
G
F
I量は、増加することが判明
減少し、これに反して 30kDaIGFBP及び、 I
した。また、インスリン、 I
GF
I、 I
G
F
I
Iを添加すると、 PG産生が増加し、
その際の IGFBPの挙動を調べると、 I
G
F
I、I
G
F
I
I添加により 30 kDa IGFBP
が減少した。また、インスリン添加時は、新たに 25kDaIGFBPが出現し
G
F
I量の額著な変化は認められなかった。以上より、 I
G
F
I及
た。しかし、 I
びIGFBPが局所の PG産生の調節に関与することが示唆された。
3、正常ヒ卜関節軟骨細胞が 23、29、35kDa の IGFBP 及び~IGFBP-3 の数種の
IGFBPを産生することを、初めて見い出した。また、 I
G
F
I
(1OOng/ml)を添
加すると 23、29kDaの IGFBPが激減し、 IGFBP-3産生が増加することが判
OA)患者由来の関節軟骨細胞では、正常ヒト関節軟骨
明した。変形性関節症 (
GFBP-3産生が増加しており、 OA
の変形が高度になるほど、その
細胞よりも I
傾向が強いことが判明した。
の研究を進めることにより、関節
今後さらに、軟骨細胞が産生する IGFBP
疾患の病態の解明など、臨床への応用が期待できるものと考える。
-2-
【緒言】
生体内において軟骨の成長と代謝は、全身性因子と軟骨細胞自身が産生する
局所性因子の両者により制御されている。全身性因子としては、成長ホルモ
ン、インスリン様成長因子 (
i
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth f
a
c
t
o
r ;I
G
F
)
l
)、副甲状腺
ホルモン2)、甲状腺ホルモン 3)，
4)などがある。局所性因子としては、塩基性線維
b
a
s
i
cf
i
b
r
o
b
l
a
s
t growth f
a
c
t
o
r ;b
F
G
F
)
5
)州、トランスフ
芽細胞成長因子 (
transforming growth f
a
c
t
o
r
-s ;TGF-s，
)
/8)、さ
ォーミング成長因子-s(
らに I
G
Fが重要である9
)
。l
G
Fはインスリンに類似した構造を持った成長因子で
G
F
Iと I
G
F
I
Iの 2種類が報告されている 1
0
)
川) I
G
Fは、軟骨細胞の増殖
あり、 I
0
と分化の両者を促進する成長因子であり 1
2)ー1
6
)、軟骨細胞培養系において、
I
G
F
Iのみの添加により牛胎仔血清 (
F
B
S
)添加時と同程度の軟骨基質維持作用が
5
)。軟骨細胞自身が産生する I
G
Fは、オートクリン
あることが、報告されている 1
的あるいはパラクリン的に作用を発現し、関節軟骨では特に基質の維持に重要
5
)1
9
)。
な役割を担っていることが、示唆されている 1
ー
ところで、以前より血清中のI
GFは そ の 大 部 分 が IGF結 合 蛋 白 質
(
I
G
F
b
i
n
d
i
n
gp
r
o
t
e
i
n ;IGFBP)と結合し、 IGFBPは I
G
Fのキャリアーとして機
0)。しかし最近、各種の細胞自身が IGFBPを産生
能していると考えられていた2
1)
2
8
)、また IGFBPに I
G
F作用を修飾する機能が存在する事が報告されている
し2
2
9)
3
4
)。以上より、
IGFBPは I
G
Fと共に、細胞の局所環境を制御している事が示
5
)，
3
6
)。 iGFBPは現在までに 6種類が報告されているが
唆されている 3
(
T
a
b
l
e 1)
37)刻、軟骨細胞自身が産生する IGFBPについての報告は数少ない
お)，判)。特にヒト軟骨についての報告は見られない。そこで、今回著者は、ウサ
GFBPの産生について検討を行った。
ギ及びヒト関節軟骨細胞を用い、 I
-3-
【実験材料及び方法】
1、試薬類
n
t
e
r
l
e
u
k
i
n
-1β(1
し1β)は大塚製薬(株)(大阪)、
ヒト・リコンビナント i
ヒト・リコンビナント I
G
F
Iは藤沢薬品(株)(大阪)及び、ヒト・リコンビナント
IGF-川ま湧永製薬(株)(東京)より供与された。デキサメサソ、ン (
D
e
x
.
)は、和光
純薬より購入した。ヒト・リコンビナント tumorn
ecrosis f
a
c
t
o
r
α
C1
]I
GF
I及 び [
3
5S
]硫 酸
25
(TNF-α)、ヒト・リコンビナン卜インスリン、
(carrier-free)は Amersham社(東京)より購入した。ウサギ抗ヒ卜 IGFBP-3
抗体は岡山大学医学部小児科、清野佳紀教授より供与された。その他の試薬は
市販の特級品、あるいはそれに準ずるものを用いた。
2、ウサギ軟骨細胞の分離・培養 (
F
i
g
.1
)
ウサギ肋軟骨及び膝関節軟骨細胞は、生後 4週齢の雄性ニュージーランド白
ウサギ(体重 400g) より鈴木、下村ら 41)の方法に準じて分離した。すなわち、
肋軟骨成長板及び静止軟骨部より、成長軟骨と静止軟骨を分離し、また、大腿
骨遠位膝関節軟骨を分離した。それぞれの分離軟骨をメスで細切した後に、
0
.
1% EDTAを含む 0.15%トリプシン (
D
i
f
c
o社)により 1時間、 37Cでインキュ
0
ペートし、次いで 0.15%コラゲナーゼ (Worthington社)存在下で 2時間 30分
、
37"Cでインキュベー卜した後、 120μmナイロンフィルター (NBC工業)を通過
した細胞を回収した。分離した細胞は、
1ω'
O FBS (
C
e
l
l Culture
)
、 60μg/mlの力ナマイシン(明治製薬)を含むダルベッコ変
Technologies社
法 イ ー グ ル 最 少 必 須 培 地 (DMEM培地;日水製薬)に混和し、 24穴 プ レ ー ト
4
(Corning社)に 1穴当たり 4 x10個播種して、 37C、 5%C02気相下で培養し
0
-4-
，
た。なお、培地は 2日毎に新鮮培地に交換した。
3、ウサギ血清の採取
軟骨材料を採取した直後のウサギより、心臓穿刺により全血を採取した。そ
の全血を室温で 1時間放置し、 1，
100rpm、10分間遠心した後、血清成分を採
取し実験に用いた。
4、ヒト関節軟骨細胞の分離・培養 (
F
i
g
.2
)
ヒト関節軟骨は人工関節置換術が必要な患者(大腿骨頚部内側骨折及び変形性
関節症 (
O
A
)
)より手術時に採取した。その内、肉眼的に磨耗等の変化を認めない
患者由
ものを正常関節軟骨とした。それ以外で肉眼的に変形を認めるものを OA
来の関節軟骨とし、肉眼的な変形の程度により 3種(+)、(++)、(+++)に分け
て検討した。(+)は表層の磨耗のみを認めたものを、 (
11
)は、軟骨の変色、脱
落、骨縁増殖を認めるが、軟骨下骨の露出がないものを、(+++)は軟骨下骨の露
出を認めるものとした (
T
a
b
l
e2) 。なお、血液検査にてリウマチ等の異常を
認めないものとした。
軟骨細胞は鈴木、下村ら 41)の方法を一部改変した方法で分離した。すなわ
ち、それぞれの軟骨材料より軟骨のみを分離し、メスで細切した後に、 0.25%
0
プ口ナーゼ(科研製薬)により 1時間、 37Cでインキュベートした。次いで
0
0.15%コラゲナーゼ存在下で2時間 30分
、 37Cでインキュベー卜した後、 120
μ mナイロンフィルターを通過する細胞を回収した。分離した細胞は、 10%
FBS、60μg/mlのカナマイシンを含む DMEM培地に混和し、 24穴プレートに
1穴当たり 10x10個播種して、 37C、5%CO
2気相下で培養した。なお、培
4
0
ー
5-
地は 2日毎に新鮮培地に交換した。
5、プロテオグリカン産生の測定
プロテオグリカン (PG) 産生は、以下に述べた [35S
]硫酸の 17時間パルスラベ
ルによる PG合成と、細胞層中の PG蓄積量の両者で判定した。
1) PG合成の測定
細胞がコンフルエン卜になった際に無血清培地A(フェノールレッドを含まな
い MEM培地、 5mM HEPES、 5μg/ml t
r
ansfer
r
in、 5ng/ml selenious
a
c
i
d(pH7
.
4
)
)に交換し、さらに培養を続けた。 24時間後に再度、無血清培地
35
AI
こ交換し、最終濃度 2μCi/mlの[ S
]硫酸と各種サイトカイン及び‘ Dex.を添加
後
、 17時間培養を行いパルスラベルした。 PGの合成はセチルピリジウムク口ラ
イドにより沈澱する物質中への [35S
]硫酸の取り込みを測定することにより行っ
た42)。なお、ウサギ関節軟骨細胞を上記無血清培地Aで 72時間培養した際の生
存細胞率が 95%
以上であることは、 トリパンブルー染色により確認した。
2
)細胞層への PG蓄積量の測定
こ交換し、さらに培養を続
細胞がコンフルエントになった際に無血清培地 AI
けた。 24時間後に再度、無血清培地 AI
こ交換し、各種サイトカイン及び Dex.を
添加後、 72時間培養を行った。その後、細胞層をパパイン (300μg/ml)1こより
1時間、 65Cで消化し、 1，
9-dimethyl-methylene blue (
A
l
d
r
i
c
h社)を添加
0
して発色させ、 530nmの吸光度より PG蓄積量を測定した43)。なお、標準とし
ては、コンド口イチン硫酸(和光純薬社)を用いた。
-6-
，
6、培養上清 (
c
o
n
d
i
t
i
o
n
e
dmedium;CM)の回収
IGFBPの検出及び I
GF
I定量に使用した CMは以下の方法により回収した。す
なわち、培養軟骨細胞がコンフルエン卜になった際に、細胞層を phosphate
buffered s
a
l
i
n
e(
P
B
5
)
(カルシウム・マグネシウムを含まない)により 2回洗
浄し、無血清培地 A
Iこ交換後 4時間培養して、血清の影響を完全に除いた。そ
こ交換し、各種サイトカイン及び‘ D
e
x
.を添加して 48
の後に新鮮な無血清培地 AI
時間培養を行った。その CMを回収し、 1，
SOOrpm、 10分間遠心して浮遊細胞
を除去し、 48時間 CMとした 27)。
7、 IGFBP
検出用試料の調製
1)48時間 CMの調製
48時間 CMを凍結乾燥で濃縮し、標準液としてウシ血清アルブミン (B5A;
45
)
の色素結合法により蛋白量を測定した。蛋白
Sigma社)を用いて、 Bradford
として 10μgの試料を I
GFBP検出に用いた。
2
)ウサギ関節軟骨細胞層の調製
48時 間 CM回 収 後 、 細 胞 層 を PBSで 2 回洗浄し、 3%sodium dodecyl
s
u
l
f
a
t
e(
5
0
S
;和光純薬)、 5%グリセロールを含む 10mM卜リス緩衝液 (pH6.8)
により可溶化した。その可溶化試料の内、蛋白量として 10μgの48時間 CMを産
生した細胞に相当する量を I
GFBP検出に用いた。
3
)ウサギ血清の調製
ウサギ血清 2μ￨をIGFBP
検出に用いた。
-7-
，
4)EndoglycosidaseF(EndoF
)処理
濃縮 48時間 CM試料(蛋白量 10μg)またはウサギ血清 (2μ1)を酸性条件下にお
) IGFBP検出に
いて 、 250mUEndo F(Sigma社)により 37Cで 3時間処理し 39、
0
用いた。
8，
IGFBP検 出
IGFBPの検出は、ウエスタン・リガンドプロット法と、ウエスタン・イムノ
F
i
g
.3)。
プロット法により行った (
1)ウエスタン・リガンドプロッ卜法(以下リガンドプロッ卜と略す)
Hossenloppら例)の方法に準じて行った。つまり、 IGFBP検出用試料を非還
元状態で、
12.5%均 一 ゲ ル の SDS-ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動
(SDS-PAGE)により分離し、ニトロセルロースメンプレン (
N
i
t
r
oP
l
u
s
; MSI社)
に転写した。そのメンブレンを 3% Nonidet P-40を含む PBSで 30分 間 洗 浄
.
1% Tween20
し
、 1%BSAを含む PBSで 2時間コーテイングした。その後、 0
25
を含む PBSで 10分間洗浄し、 400，
000cpm/mIC 1
]I
G
F
Iと共に 24時間、 4
℃でインキュペー卜した。その後、 Tween20を含む PBSで洗浄し、 KodackX
ray f
i
l
mでオートラジオグラフィーを行い検出した。
2
)ウエスタン・イムノプロット法(以下イムノプロットと略す)
25
]I
G
F
Iに代えて、抗 IGFBP抗体を一次抗体として反応
上記のリガンドの C 1
させた。二次抗体はヤギ抗ウサギ I
gG(H+し)(Vector
社)とし、染色は、ビオチ
ンーアビジンシステムを用いた Vectastain ABC kit(Vector
社)によって行っ
た
。
-8-
9，
I
G
F
1の定
48時間 CMI
こ1N H
C
Iを添加して酸性条件とし、 IGFBPとの結合を断ち、遊
IGF1のみとし、 SepPackC18(Waters社)により I
GF
Iを分離した46)。その
IGF1量を I
G
F
I radioimmuno assay (
R
I
A
)k
i
t (Amersham社)により定
した。なお、標準としてはヒ卜・リコンビナント I
G
F
Iを用いた。
【結果】
1、ウサギ軟骨細胞 CM及びウサギ血清中の IGFBP
ウサギ軟骨細胞CM
及びウサギ血清中の I
GFBPの検出のために、まず
C I]IGF-1を用いてリガンドプロットを行った (Fig.4)0 Fig. 4-A，
s，
C，
Dはそれ
2S
ぞれウサギ関節軟骨細胞CM、ウサギ肋軟骨成長軟骨細胞CM、 ウサギ肋軟骨静
止軟骨細胞 CM、ウサギ血清の結果を示している。全てにおいて、主に分子
30kDaの IGFBPが検出できた。次に、この 30kDaIGFBPの型を知る目的で、ウ
サギ関節軟骨細胞 CM
及びウサギ血清を EndoF
処理を行った後にリガンドプロッ
トを行った。その結果、両者とも EndoF
で分解されず、糖鎖の結合しない蛋白
質であることが判明した (
F
i
g
.5
)。しかし、これらのウサギの IGFBPはヒ卜
IGFBP1から 5に対する抗体では認識されなかった(データ省略)。
2、ウサギ関節軟骨細胞に対する、各種サイトカイン及び‘ D
e
x
.の効果
1)
I
L
1
β 、TNF-α 、 Dex.の効果
F
i
g
. 6-Aは、ウサギ関節軟骨細胞に I
L
1s、TNF-α 、D
e
x
.を添加した際の
PG合成を、 F
i
g
. 6-Bは細胞層の PG蓄積量を、それぞれが示している。 PG合 成
は3者ともほぼ濃度依存性に減少し、 PG蓄積量もほぼ同様の傾向を示した。
-9
目
，
F
i
g
.7は、その際の CM及び細胞層中の IGFBPの変動を、リガンドプロットで調
べた結果である。￨し 1
β 、 TNF-α 、 D
e
x
.の添加により、 CM中の 30kDa
IGFBPがほぼ濃度依存性に増加した。しかし、細胞層には、全てにおいてバン
ドが検出されず、産生された 30kDaIGFBPは、ほとんどがCM中に放出されて
いることが明らかになった。すなわち、￨し 1
β 、TNF-α 、D
e
x
.の添加により
30kDaIGFBPの総量が増加することが判明した。 F
i
g
.8は
、 CM中の I
G
F
I量の
L
1s、TNF-α 、D
e
x
.の添加によ
動きを RIAで測定した結果を示している。 I
G
F
I量が対照レベルよりも増加した。
り
、 I
2)インスリン、 I
G
F
I、 I
G
F
I
Iの効果
F
i
g
. 9-Aは、ウサギ関節軟骨細胞にインスリン、 I
GF
I、 I
G
F
I
Iを添加した
i
g
. 9-Bは細胞層の PG蓄積量を示している。 PG合成は 3者によ
際の PG合成、 F
i
g
. 10
りほぼ濃度依存性に増加し、 PG蓄積量もほぼ同様の傾向を示した。 F
は、その際の CM及び細胞層中の IGFBPの変動を、リガンドプロットで調べた結
果を示している。 I
GF
I及び I
G
F
I
Iの添加により、対照レベルよりも 30kDa
G
Fとは異なり、新たに 2SkDaIGFBPが出
IGFBPが減少した。インスリンでは I
G
F
I
現した。細胞層では全てにおいてバンドが検出できなかった。これより、 I
及び I
G
F
I
Iの添加により 30kDa IGFBPの総量が減少し、インスリンの添加によ
i
g
.1
1は
、 CM中の I
G下 l
り新たに 2SkDaIGFBPが出現する事が判明した。 F
の動きを RIAで調べた結果を示している。なお、 I
G
F
I添加時は正確な定量が困
ため、インスリン及び I
G
F
I
I添加時においてのみ定量した。両者とも、低
濃度では対照レベルよりも軽度に増加したが、高濃度では対照レベルとほぼ同
程度であり、顕著な変化を示さなかった。
10-
3、正常ヒト関節軟骨細胞の PG合成に対する各種サイトカインの効果
大腿骨頚部内側骨折患者より得られた正常ヒト関節軟骨細胞に、各種サイト
合成を、 F
i
g.12に示す。 I
L
1
β 、TNF-α の添加によ
カインを添加した際の PG
合成は、対照レベルよりも減少した。一方、インスリン、 I
GF
Iの添加
り
、 PG
により PG合成は、対照レベルより増加した。 I
G
F
I
Iにおいては、ほぽ対照レベ
ルであった。
4、正常ヒト関節軟骨細胞が産生する IGFBPの検出
F
i
g
.
13は、大腿骨頚部内側骨折患者由来の正常ヒト関節軟骨細胞の CMを
、 リ
ガンドプロットで検出した結果を示している。 4例とも非刺激下においては、主
GFBPを多量に、また 35及び 38から 41kDaの分子
に23、 29kDaの分子量の I
G
F
I (100ng/ml)を添加すると、
の IGFBPを少量、それぞれ産生していた。 I
4例全てにおいて、 23、29kDaの IGFBPが激減し、 38から 41kDaの IGFBPが
i
g
.14-Aはリガンドプロットの結果を示し、 F
i
g
.14-Bは同じ試料
増加した。 F
を、抗ヒ卜 IGFBP-3抗体によるイムノプロットを行った結果を示している。
38-41kDaの IGFBPは、抗ヒ卜 IGFBP-3抗体により認識され、 IGFBP-3である
が判明した。
5、 OA
患者由来の関節軟骨細胞が産生する I
GFBPの検討
Fig.15-Aは正常ヒト関節軟骨細胞 CM、 F
i
g
. 15-B、C、Dは OA
患者由来の
関節軟骨細胞CMのそれぞれのリガンドプロットの結果を示している。 OA
変形
の程度により(+)、(++)、(+++)の 3種に分けている。非刺激下の比較では、 OA
患者由来の関節軟骨細胞 CMは正常ヒト関節軟骨細胞 CMI
こ比べて 35から 41kDa
-11-
の分子量の IGFBPが増加しており、 23及び 29kDaの分子量の IGFBPが減少し
の変形が強いものほど、その傾向が強い事が判明した。 OA
ていた。また、 OA
患者由来の関節軟骨細胞に I
G
F
I
(1OOng/ml)を添加すると 、正常ヒト関節軟骨
がさらに増加した。 F
i
g
. 16-A
細胞と同様に、 35から 41kDaの分子量の IGFBP
はリガンドプロットの結果を示し、 F
i
g
. 16-Bは閉じ試料を、抗ヒト IGFBP-3
抗体によるイムノプロットを行った結果を示している。 3Sから 41kDaの分子
GFBP-3抗体により認識され、 IGFBP-3である事が判明し
の IGFBPは、抗ヒ卜 I
た
。
【考察】
軟骨細胞自身が産生する I
G
Fは、成長軟骨の内軟骨性骨化、関節軟骨の基質の
16)。また、骨折の治癒過
維持などにおいて、非常に重要な役割を担っている 15)，
W7)や関節破壊の抑制にも作用している事が示唆されている 48)。一方、
IGFBP
はI
G
Fの作用を、促進的にあるいは抑制的に修飾することが報告されている
2
9)
3
4
)。従って、今日では軟骨における
I
G
Fの作用を検討するには、軟骨細胞自
身が産生する IGFBPを考慮することが、不可欠と考えられる。しかし、軟骨細
胞自身が産生する IGFBP
及び、 IGFBP
産生に対する各種サイトカイン等の影響
，
判)。そこで、今回著者はウサギ及びヒト関節
に関する研究は、非常に少ない 39)
e
x
.による、
軟骨細胞を用いて、 PG産生に影響する各種サイトカイン及び D
IGFBP
産生の挙動について検討した。
1、ウサギ軟骨細胞が産生する IGFBPの検討
F
i
g
.4に示したように、ウサギ軟骨細胞は、肋軟骨成長軟骨細胞、肋軟骨静
GFBPを産生して
止軟骨細胞及び関節軟骨細胞の 3者において、主!こ 30kDaの I
ー
12-
いた。また、ウサギ血清においても、 30kDaの IGFBPが最も多量に存在してい
た。この 30kDaIGFBPは F
i
g
.5の結果より、糖鎖の結合しない型であることが
判明した。現在までに報告されているとト IGFBPは
、 1から 6の6種類がある
め 38)。T
able1は、それぞれの特徴を簡単にまとめたものである 49，)50)。ウサギ
軟骨細胞が産生する IGFBPは、分子量が 30kDaであり、糖鎖が結合しない特徴
G
F
B
P
1 、2、5のいずれかに類似した型と恩われる。しか
を持つことから、 I
し、ヒトの IGFBPべから 5の抗体では認識されず、その型は未だ判明していな
GFBPの型が大きく異なる可能性も考えられる。
い。ウサギとヒ卜では I
2、ウサギ関節軟骨細胞における、 PG産生と IGFBPの検討
F
i
g
. 6に示したように、 I
L
1
β 、TNF-α 、D
e
x
.の添加により PG産生は対照
レベルよりも、ほぽ濃度依存性に減少した。しかし CM中の 30kDa IGFBP
及び
，
1
GF
I量は逆に増加する傾向にあった (
F
i
g
.78
)。一方、
F
i
g
. 9に示したよう
GF
I、 I
G
F
I
Iの添加により PG産生は対照レベルよりも、ほ
に、インスリン、 I
i
g
.10に示したように、 I
G
F
I、 Hの添加により CM
ぽ濃度依存性に増加した。 F
中の 30kDaIGFBPは減少し、インスリン添加により新たに 25kDaの
の
IGFBPが出現した。この 25kDaIGFBPはその分子量から IGFBP-4と恩われ
る
。 IGFBP-4は軟骨細胞において、 I
G
Fの作用を抑制することが報告されてい
G
F
I量は I
G
F
I
I、インスリンを添加しても、顕著な変化
る34)。また、 CM中の I
F
i
g
.11)。以上より、 IGFBPがウサギ関節軟骨細胞の PG
産生の
を示さなかった (
調節に関与すること、特に、 IGFBPは局所の PG産生の恒常性の維持 i
こ、重要な
働きを担っている事が示唆される。 F
i
g
. 17は、以上のことをまとめた図であ
る
。
13
-
•
Fig.17-Aの様に、￨し 1
β 、TNF-α 、 D
e
x
.の添加により PG産生が減少する
と、それ以上の減少を抑制するために I
G
F
I産生増加と、 I
G
Fの作用を増強させ
i
g
. 17-Bの様!こ、
ると考えられる 30kDaIGFBP量の増加が起こる。一方、 F
I
GF
I、 I
G
F
I
Iの添加により PG産生が増加すると、過剰の PG産生を抑制する
ために、 30kDa IGFBP量の低下が起こるものと思われる。
、I
GFBP分解
酵素の存在が報告されている。また、この酵素は IGF/IGFBP結合体により誘導
され、 EDTAにより作用が抑制されることが報告されている 51，)52)。著者も、
I
G
F
I
(1OOng/ml)と2mM EDTAを同時に添加すると 30kDaIGFBPの減少が抑
制されることを見い出している(データ省略)。これより、ウサギ関節軟骨細
G
Fの添加により IGFBP分解酵素が誘導され、その結果 30kDa
胞においても、 I
IGFBPが分解され、減少する可能性も考えられる。インスリンは IGFBPと結合
できず49)、このため新たに I
G
F作用を抑制する IGFBP-4が、誘導されるものと
恩われる。
3、ヒト関節軟骨細胞が産生する IGFBPの検討
ヒト軟骨より軟骨細胞を分離培養する事は困難であるため、ヒト軟骨細胞の
研究は数少ない。今回著者は、手術時に採取したヒト関節軟骨より、 F
i
g
.12に
示すような、各種サイトカインに対して、ウサギ関節軟骨細胞とほぼ同様の PG
合成の反応性を持った軟骨細胞の分離培養に成功した。 I
G
F
I
Iによる PG合成促
進作用は弱いが、これは I
G
F
I
Iは胎生期で主に作用を発現すると示唆されてお
り11)、加齢による反応性の低下と恩われる。また、ヒ卜関節軟骨細胞が IGFBP
を産生するをことを本研究により初めて明らかにした。 F
i
g
.13は正常ヒト関節
軟骨細胞が産生する IGFBPパターンを示したものである。 4例全てにおいて、
14-
主に 23、 29kDaの分子量の IGFBPを多量に産生し、 IGFBP-3も少量ながら産
生する傾向が見られた。また、 I
G
F
I
(1OOng/ml)の添加により、 23、29kDa
の分子量の IGFBP
が激減し、 IGFBP-3産生が増加することが明らかになった。
F
i
g
. 15は
、 OAJ
患者由来の関節軟骨細胞が産生する IGFBPパターンを示してい
る。正常ヒ卜関節軟骨細胞と異なり、 IGFBP-3の産生が増加し、 23、29kDa
の分子量の IGFBPの産生が減少していた。また、 I
G
F
I
(1OOng/ml)の添加によ
り
、 IGFBP-3産生の増加が、正常軟骨細胞の場合と同様に認められた。その傾
向は OA
の変形が進行するほど、強くなることが示唆された。以上のように、正
常ヒ卜関節軟骨細胞と OA患者由来の関節軟骨細胞では、 IGFBPの産生パターン
患者由来の関節軟骨細胞は、正常ヒト関節軟骨細
に明らかな差異を認めた。 OA
G
F
I産生及び I
G
F
I受容体数が増加している事が報告されている
胞と比べて、 I
5
3，5
) 4)。しかし、
OA患者由来の関節軟骨細胞の I
G
F田￨に対する反応性は低下して
おり、 PG産生は減少している 55)。この矛盾が生じる理由の 1つは、今回見い出
GFBP-3産生が増加するためと恩われる。
した、 OA患者由来の関節軟骨細胞で I
GF作 用 を 抑 制 す る 事 が 報 告 さ れ て お り
すなわち、 IGFBP-3は 一 般 に I
5
6
)
(
T
a
b
l
e1
)、このため OA患者由来の関節軟骨細胞で I
G
F
I産生及び I
G
F
I受
32)
，
G
F
Iによる PG産生の増
容体数が増加しても、多量の IGFBP-3の存在により、 I
加作用が抑制されるものと、推察される。
以上のように、軟骨細胞が産生する IGFBPの研究をさらに進めることによ
り、関節疾患の病態の解明、軟骨細胞の加齢変化の理解、関節疾患に対する薬
効の判定など、臨床への応用が期待できるものと考える。
-15
-
【結語】
1、ウサギ軟骨細胞が、主に 30kDaの IGFBPを産生しており、この IGFBP
は糖鎖の結合しない型のものであることが判明した。
2、ウサギ関節軟骨細胞に、 I
L
1
β 、TNF-α 、 D
e
x
.を添加すると、 PG産 生
GFBP及び、 I
G
F
I量が増加することが判明し
が減少し、これに反して 30kDaI
た。また、インスリン、 I
G
F1、 I
G
F
I
Iを添加すると、 PG産生が増加した。そ
G
F
I量は顕著な変化を示さなかったが、 I
G
F
I、 I
G
F
I
Iの添加により、
の際、 I
30kDaIGFBP
量が減少した。インスリン添加時に、新たに 25kDaI
GFBPが出
現した。
3、正常ヒト関節軟骨細胞が 23、29、 35及 び IGFBP-3の数種の IGFBPを産
生することを、初めて見い出した。また、 I
G
F
I
(1OOng/ml)を添加すると
23、 29の分子量の IGFBPが激減し、 IGFBP-3産生が増加していることが判明
患者由来の関節軟骨細胞は、正常ヒ卜関節軟骨細胞よりも I
GFBP-3産
した。 OA
生が増加しており、 OA
の変形が高度になるほど、その傾向が強いことが判明し
た
。
なお、本論文の要旨の一部は第 12回日本骨代謝学会及び第 9回日本整形外科
学会基礎学術集会において発表した。
ー
16-
【謝辞】
稿を終えるに当たり、御指導ならびに御校閲を賜りました、大阪市立大学医
学研究科生化学 3教 室
市原宏介教授ならびに岡山大学歯学部口腔生化学教室
滝川正春教授に深甚なる謝意を表します。また、御協力を頂きました大阪大学
学部生化学教室
鈴木不二男教授ならびに大阪大学歯学部中央研究室
浅田
彬講師に深謝いたします。さらに、種々の御援助を頂いた大阪市立大学医学部
整形外科教室
山野慶樹教授ならびに油谷安孝講師を始め教室の皆様に厚くお
礼申し上げます。
，
- 7-
•
ι
一一
t
【参考文献】
1
. Salmon，
W.D.，
Jr
.& Daughaday，W.H.:Ahormonallycontrolledserum
factor which stimulated s
u
l
f
a
t
ei
n
c
o
r
p
o
r
a
t
i
o
n by c
a
r
t
i
l
a
g
ei
nv
i
t
r
o
.
J
.Lab.C
l
i
n
.Med. 1957;49:825-835.
.，Yoneda，T
.，Shimomura，Y
.:
C
a
l
c
i
t
o
n
i
nandp
a
r
a
t
h
y
r
o
i
d
2
. Suzuki，F
hormone s
t
i
m
u
l
a
t
i
o
no
fa
c
i
d mucopolysaccharide synthesis i
nc
u
l
t
u
r
e
d
chondrocytes i
s
o
l
a
t
e
d from growth c
a
r
t
i
l
a
g
e
. FEBSL
e
t
t
. 1976;70:
155-158.
.
B
.:
T
h
y
r
o
i
d
a
li
n
f
l
u
e
n
c
eonbodygrowth. JExptZoo.
l1984;232:
3
. King，D
453-460.
.
E
.:
T
r
i
i
o
d
o
t
h
y
r
o
n
i
n
e stimulates maturationo
f
4
. Burch，W.M.，Lebovitz，H
.C
l
i
n
.I
n
v
e
s
t
. 1982;70:
porcine growth-plate c
a
r
t
i
l
a
g
ei
nv
i
t
r
o
. J
496-504.
くa
to，Y
. andGospodarowicz，D
.:
S
u
l
f
a
t
e
dproteoglycans
y
n
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h
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5
. I
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i
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o
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t
a
l chondrocytesgrowth i
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e
l
lB
i
o.
l 1985; 100:
presence o
ff
i
b
r
o
b
l
a
s
t growth f
a
c
t
o
r
. J
477-485.
.
S
.:
P
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i
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6
. Lobb，R
e
n
d
o
t
h
e
l
i
a
lc
e
l
l growth f
a
c
t
o
r
s
.J
.B
i
o
.
lChem. 1986;261: 1924-1928.
7
. H
i
r
a
k
i，
Y
.，I
n
o
u
e，H
.，H
i
r
a
i，R
.，I
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.:
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e
. B
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.A
c
t
a
. 1988;969:91-99.
.，Kato，
Y
.，Iwamoto，M
.，H
i
r
a
k
i，
Y
.，
Sakuda，
M.andSuzuki，F
.
8
. Inoue，H
:Stimulation o
fc
a
r
t
i
l
a
g
e
m
a
t
r
i
x proteoglycan synthesis by
morphologically transformed chondrocytes grown i
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t
o
r and transforming growth f
a
c
t
o
r
b
e
t
a
.
J
.C
e
l
l
. Physio.
l 1989; 138: 329-337.
9
. I
くa
to，Y
.，Nasu，N
.，
Takase，
T
.，Daikuhara，
Y
. andSuzuki，F
. :A serum-free
medium supplemented with m
u
l
t
i
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l
i
c
a
t
i
o
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r
e
n
t
i
a
t
i
o
no
f chondrocytes
i
n primary c
u
l
t
u
r
e
. Exp.C
e
l
lR
e
s
. 1980; 125: 167-174.
. & Humbel，
R
.
E
. :The amino a
c
i
d sequence o
fi
n
s
u
l
i
n
1
0
.Rinderknecht，E
l
i
k
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t
u
r
a
l homology with p
r
o
i
n
s
u
l
i
n
.
J
.B
i
o
.
lChem. 1978;253 :2769-2779.
. & Humbel，R
.
E
. :Primary structure o
f human i
n
s
u
l
i
n
11.Rinderknecht，E
l
i
k
e growth factor 1
1
. FEBSL
e
t
t
. 1978;89:283-288.
12.Guenther，H
.，
.
L Guenther，H.E.，Froesch，E.R.et a.
l:Effectof i
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e
growth factor on collagen and glycosaminoglycan synthesis by r
a
b
b
i
t
a
r
t
i
c
u
l
a
r chondrocytes i
n culture. E
x
p
e
r
i
e
n
t
i
a
. 1982; 38: 979-981.
.
J
.，Handley，C
.
J
.，Cambell，M.A.et a.
l:Stimulation of
13.McQuillan，D
proteoglycan biosynthesis by serum and i
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth f
a
c
t
o
r
I
i
n cultured bovine a
r
t
i
c
u
l
a
rc
a
r
t
i
l
a
g
e
. BiochemJ
. 1986;240:423-30.
.，Dumontier，M
.
F
.，Tsagris，L
.et a.
l:
I
nv
i
t
r
oi
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e
14.Demarquay，D
growth factor Iinteraction with c
a
r
t
i
l
a
g
ec
e
l
l
s derived from
postnatal animals. Horm R
e
s
. 1990; 33: 111-4.
15.Luyten，F
.
P
.，H
a
s
c
a
l
l，V.C.，N
i
s
s
l
e
y，S
.
P
.
e
t a.
l:
I
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth
factors maintain steady-state metabolism of proteoglycans i
n bovine
a
r
t
i
c
u
l
a
rc
a
r
t
i
l
a
g
e explants. Arch Biochem Biophys. 1988; 267:
416-25.
.:
I
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth factor Ican decrease degradation and
1
6
.Tyler，J
promote synthesis of proteoglycan i
nc
a
r
t
i
l
a
g
e exposed to cytokines.
BiochemJ
. 1989; 260: 543-8.
17.T
r
i
p
p
e
l，S
.
B
.，Hung，H
.
H
.，andManl
くi
n，H
.
J
. :Synthesiso
fsomatomedin-C
by growth p
l
a
t
e chondrocytes. Orthopaedic Transactions. 1987; 1
1
:
422.
•
18
.H
i
l
l，D
.
J
. and Logan，A
.:
P
e
p
t
i
d
egrowthf
a
c
t
o
r
sandt
h
e
i
ri
n
t
e
r
a
c
t
i
o
n
s
d
u
r
i
n
g chondrogenesis. ProgGrowthFactorR
e
s
. 1992;4
:45-68.
1
9
.大川得太郎，木下昭弘，滝川正春:ヒト軟骨細胞様細胞株 (HCS-2/8)における
オートクリン分化因子としての I
G
F
Iおよび 1の作用機構.
日本骨代謝学会雑誌 10(抄録号) 1990:210.
2
0
.Guler，H
.
P
.，Zapf，J
.，Froesch，E
.
R
.eta
.
l:Short-term metaboliceffects
o
f recombinant human i
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth f
a
c
t
o
r 1i
n healthy a
d
u
l
t
s
.
N
.Eng.
lJ
.Med.1987;317:137.
21.Conover，C
.
A
.，P
o
w
e
l
l，F
.
D
.，Rosenfeld，R
.
G
.
e
t a.
l:
I
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth
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e
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i
b
r
o
b
l
a
s
t
s
.J
.C
l
i
n
.
I
n
v
e
s
t
. 1989; 83:852859.
国
2
2
.Lamson，G
.，Oh，Y
.，Pham，H
.
e
ta
.
l:Expressiono
ftwoi
n
s
u
l
i
n
l
i
k
egrowth
f
a
c
t
o
r
b
i
n
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i
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n
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n a human endometrial cancer c
e
l
ll
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n
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t
r
u
c
t
u
r
a
l，
immunological，
and genetic c
h
a
r
a
c
t
e
r
i
z
a
t
i
o
n
.
JC
l
i
nE
n
d
o
c
r
i
n
o
lMetab. 1989; 6
9
: 852-859.
2
3
.M
a
r
t
i
n，
J
.L
. and B
axter，R
.
C
.:
P
r
o
d
u
c
t
i
o
no
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n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth
factor (
I
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F
)i
n
d
u
c
i
b
l
eI
G
F
b
i
n
d
i
n
gp
r
o
t
e
i
n by human s
k
i
nf
i
b
r
o
b
l
a
s
t
s
.
Endocrinology. 1990; 127:781-788.
2
4
.T
h
r
a
i
l
k
i
l
l，K
.
M
.，Clemmons，D
.
R
.，Busby，J
r
.W. H
.andhandwerger，S
.
:
D
i
f
f
e
r
e
n
t
i
a
lr
e
g
u
l
a
t
i
o
no
f i
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth f
a
c
t
o
rb
i
n
d
i
n
gp
r
o
t
e
i
n
s
e
c
r
e
t
i
o
n from human d
e
c
i
d
u
a
lc
e
l
l
s by I
G
F
I，
i
n
s
u
l
i
n，
and r
e
l
a
x
i
n
.
J
.
C
l
i
n
.I
n
v
e
s
t
. 1990;8
6
:878-883.
25.Andress，D
.L
.
， Birnbaum，R
.
S
.:
An
o
v
e
l humani
n
s
u
l
i
n
l
i
k
e growth f
a
c
t
o
r
b
i
n
d
i
n
gp
r
o
t
e
i
n secreted by o
s
t
e
o
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1858-1866.
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. 1993; 8
: 391-396.
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. 1989;1
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. 1991; 5
: 19-28.
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. 199;251:440-447.
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: 253-263.
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. 1993: 409-433.
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. 1990; 127: 2795-2803.
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.
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により 1時間、 37Cで消化
0
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0
.
1
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2時間 30分
、
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により細胞を分散
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120μm)を
、
通過した細胞のみを回収
細胞を 10%F
B
S添加 DMEM培地で 3回洗浄
分離細胞を 1
0% F
B
S添加 DMEM培地に混和
4
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、 2
4穴プレートに 1
穴当たり 4X1
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気相下で培養
を播種して、 37C、 5%C0
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0
(新鮮培地との交換は 2日毎に行った。)
F
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. ウサギ軟骨細胞の分離・培養法
人工関節置換術時に、関節軟骨を無菌的に
採取し、軟骨のみを分
骨をメスで細切
0
.
2
5%プ口ナーゼにより 1時間、 37C
0
で消化
P
B
Sで 3回洗浄
0.15%コラゲナーゼにより 2時間 30分
、 3
7C
0
で消化
~ピペッティング
により細胞を分散
ナイロンフィルター (120μm)を
、
通過した細胞のみを回収
細胞を 10%F
B
S添加 DMEM培地で 3回洗浄
分離細胞を 10%F
B
S添加 DMEM培地に混和
4
し
、 2
4穴プレートに 1
穴当たり 1
0X10個
を播種して、
37C、 5%C02気相下で培養
0
(新鮮培地との交換は 2日毎に行った。)
F
i
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. ヒト関節軟骨細胞の分離・培養法
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IGFBP検出用試料を終濃度が 1% SDS，
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12.5%均一ゲルにより
SDS-PAGEを行う。
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に 10分以上浸す。
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によりニトロセルロースメンブレンヘ
エレクト口プロットする。
メンブレンを 3% N
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30分間洗浄す:る。
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メンブレンを 10分間洗浄
1%BSA，
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.
1% Tween20、
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と共にインキュベー卜する。
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)
0
メンブレンを 0
.
1% Tween20-PBS
ウエスタン・
イムノプロッ卜法
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.
5% Tween20-PBSで
メンブレンを 10分間洗浄
0
.
1% BSA-PBSで300倍希釈
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、 30
分間
インキュベァ卜する。(室温)
0.5%Tween20-PBSでメンブレン
で 2回
、 PBSで 2回洗浄する。
を3回洗浄する。
メンブレンを、￨くodackXr
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mに
500倍希釈ビオチン化 2次抗体で
30分間インキュベー卜する。(室温)
露光させてオートラジオグラフィー
を行う。 (
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