修士論文 酵母2ハイブリット法による 枯草菌必須タンパク質間の相互

NAIST-IS-MT0251138
修士論文
酵母２ハイブリット法による
枯草菌必須タンパク質間の相互作用解析
海堂 剛央
2003 年 2 月 6 日
奈良先端科学技術大学院大学
情報科学研究科 情報生命科学学専攻
本論文は奈良先端科学技術大学院大学情報科学研究科に
修 士 (理 学 ) 授 与 の 要 件 と し て 提 出 し た 修 士 論 文 で あ る 。
海堂剛央
審査委員：小笠原直毅
箱嶋敏雄
川端猛
教授
教授
助教授
酵母２ハイブリット法による
枯草菌必須タンパク質間の相互作用解析
海堂剛央
内容梗概
枯草菌はゲノム配列の解析によりタンパク質をコードする4100の遺伝子の存在が明らかになっている。
個々の遺伝子を破壊した変異株作製プロジェクトが行われ、その結果271遺伝子が必須であることが示さ
れた。しかし、染色体複製、タンパク質合成、細胞分裂など細胞増殖に必須なプロセスを繋げるタンパ
ク質ネットワークはその存在が予想されているにもかかわらず、未だに不明である。本論文では、その
ネットワークを解明するために、271の必須遺伝子を含む295遺伝子の産物間の相互作用を、酵母２ハイ
ブリット法により網羅的に解析した。大規模な酵母２ハイブリット法は系統的なタンパク質間相互作用
地図の作成のために広く用いられているアプローチであるが、かならずしも全ての相互作用を検出でき
ず、一方、生物学的な意味のない偽陽性を検出するという問題点を抱えている。この問題を改善するた
め、正しい立体構造がとれるように全長のタンパク質をコードするように全ての遺伝子をクローン化し、
PCRによるエラーを除去するために配列を確認した。さらに、実験上の精度を上げるため全てのクローン
の組み合わせ(295×295)について一対一の酵母２ハイブリット解析を行った。また、ポジティブクロー
ンの一次スクリーニングの後、その再現性も確認した。
その結果、必須タンパク質間で196の相互作用を検出した。この結果を評価するために本研究で検出さ
れた相互作用を、文献情報の検索によって得られた、実験的に確認されている相互作用と比較したとこ
ろ、41が既知であり、155が新規の相互作用であった。複製、細胞分裂、DNA修復、脂質代謝など異なる
細胞プロセスに属するタンパク質間の相互作用も同定されており、本研究で作製した必須タンパク質間
の相互作用地図は様々な細胞増殖の基本プロセスを繋げるネットワークを明らかにするための手がかり
を供給するだろう。
キーワード
枯草菌
必須タンパク質
酵母２ハイブリット法
ネットワーク
タンパク質間相互作用
*奈 良 先 端 科 学 技 術 大 学 院 大 学 情 報 科 学 研 究 科 情 報 シ ス テ ム 学 専 攻 修 士 論 文 ,
NAIST-ISMT0251138, 2003 年 2 月 6日 .
i
Comprehensive Analysis of Interactions between
Essential Bacillus subtilis Proteins by using Yeast Two
Hybrid system
Takeo Kaido
Abstract
Bacillus subtilis genome sequence revealed existence of 4100 protein coding genes. To estimate minimal gene
set that sustains bacterial life, systematic inactivation of protein coding genes has been carried out and 271
genes were found to be essential for cell growth. The essential genes are involved in several essential cellular
processes, such as chromosome replication, protein synthesis, cell division, energy production, etc. In living
cells, these essential processes are orchestrated to work cooperatively to support cellular life. However,
molecular mechanisms for the orchestration are still unclear. To elucidate the protein-protein interaction
network of essential B. subtilis proteins, I have carried out a comprehensive yeast two-hybrid analysis. It has
been pointed out that “false” interactions are often detected in the yeast two-hybrid analysis. In addition, not
all interaction has been detected. To overcome these problems, I cloned 295 genes including 271 essential
genes in full-length to guarantee correct folding of the gene products and the clones were sequenced to
eliminate any PCR error. In addition, I performed the yeast two-hybrid analysis in one-on-one relationship for
all combinations (295 x 295) to increase experimental accuracy. Thus I identified 196 interactions between
essential proteins. I compared the interactions detected in this study and interactions identified
experimentally and reported in literatures, and found that among 196 interactions, 41 interactions have been
reported and the remaining 155 are new. Interestingly, among newly found interactions, interactions between
proteins, which belong to different cellular processes such as replication, cell division, DNA repair and lipid
metabolism, are identified. The interaction map between essential B. subtilis proteins obtained in this study
would provide important information for further understanding of protein network underlying cellular life.
Keywords:
Bacillus subtilis, essential protein, yeast two hybrid analysis, network, protein-protein interaction
.*Master’s Thesis, Department of Information Systems, Graduate School of Information
Science, Nara Institute of Science and Technology, NAIST-IS-MT123456, February 6, 2003.
ii
目次
1. 序論_5
1.1 背景_5
1.2 本研究の目的_6
2. 方法と材料_10
2.1 菌株_10
2.2 Gateway system を用いた必須遺伝子のクローニング_11
2.2.1 プラスミドの構築_12
2.2.2 Gateway system を用いた Entry clone の作製_13
2.2.3 酵母２ハイブリット用 vector(Expression clone)の作製_15
2.2.4 プラスミドの抽出法_15
2.3 酵母２ハイブリット法による必須タンパク質間相互作用の
スクリーニングと再現性の確認_17
2.3.1 酵母への形質転換_17
2.3.2 酵母の接合_19
2.3.3 タンパク質間相互作用のスクリーニング_22
2.3.4 再現性の確認_24
2.4 蛍光顕微鏡による YFP 融合タンパク質の局在観察_25
2.4.1 YFP 融合タンパク質発現 vector(pAPNC213-yfp-GW)の構築_25
2.4.2 YFP 融合発現制御株の作製_26
2.4.3 蛍光顕微鏡による YFP 融合タンパク質の局在観察_28
3
3. 結果と考察_29
3.1 Gateway system を用いたクローニング_29
3.2 相互作用のスクリーニングと再現性の確認_30
3.3 検出された相互作用の評価_34
3.4 新たなタンパク質相互作用ネットワークの可能性_37
3.4.1 染色体の複製に関与するタンパク質のネットワーク_37
3.4.2 XseA が介するネットワーク_39
3.4.3 YerQ の機能とそのネットワーク_40
3.4.4 その他の興味深い相互作用_41
3.5 蛍光顕微鏡による YFP 融合タンパク質の局在観察_42
3.6 今後の展望_45
4. 参考文献_46
5. 謝辞_59
4
１． 序論
1.1 背景
枯草菌はバクテリアの研究に最適な生物の１つであり、低 GC 含量のグラム陽性菌の
モデル生物である。ゲノム配列の解析終了により、枯草菌には約 4100 のタンパク質を
コードする遺伝子が存在することが明らかにされた（Kunst F et al., 1997）
。さらに、
バクテリアの生命維持に必要な最小の遺伝子セットを調べるために、4100 遺伝子の系
統的な破壊株の作成 (Kobayashi.K et al., 2002)が、世界の研究室で使われている標準
的な株である 168 株について行われた。その結果、4100 遺伝子の中で 192 が枯草菌に
不可欠であることが明らかにされ、79 が必須であると予測された。計 271 の必須遺伝
子は Table 1 のように分類された。72 種の生物
（http://mbgd.genome.ad.jp/）の遺伝子との相
同性を解析した結果、枯草菌必須遺伝子はバク
テリアで良く保存されており、4 分の１が全て
のバクテリアに存在し、4 分の３が少なくとも
75％のバクテリアに存在していた。さらに、枯
草菌必須遺伝子の 20%が、解析した 18 種の真
核生物と古細菌の全てに存在していた。意外に
も、解糖系の経路に関わるほとんどの遺伝子が
必須であった。また、機能未知の必須遺伝子は
必須遺伝子のうち 4%であった。機能未知必須遺
伝子や予想外の必須遺伝子の同定はバクテリア
の生命を維持するプロセスをより理解するため
に新たなる道を開くと考えられている。
5
Table.1 B.subtilis essential genes
DNA metabolism
Basic replication machinery
Packaging and segregation
Methylation
RNA metabolism
Basic transcription machinery
RNA modification
Regulation
Protein synthesis
Ribosomal proteins
Aminoacyl-tRNA synthetases
Translation factors
Protein folding and modification
Protein translocation
Cell envelope
Membrane lipids
Cell wall
Cell shape and division
Glycolysis
Respiratory pathways
Isoprenoids
Menaquinone
Cytochrome biogenesis
Thioredoxin
Nucletides
Cofactors
CoA
Folate
NAD
s -Adenosylmethionine
Iron-sulfur cluster
Other
Unknown
Total
27
16
9
2
14
4
6
4
95
52
24
10
3
6
44
16
28
10
8
22
8
8
3
3
10
15
1
3
4
1
6
15
11
271
1.2 本研究の目的
枯草菌には必須遺伝子が 271 個存在していることが明らかになったが、染色体複製・
タンパク質合成・細胞分裂など細胞増殖に必須な各プロセス間の協調がどのようになさ
れているか、その分子機構は未だに不明である。このネットワークの解明を目指し、本
研究では酵母２ハイブッリド法（Fig.1）を用いて必須タンパク質間の相互作用ネット
ワーク解析をおこなった。また、その結果は機能未知遺伝子の機能解明にも役立つと考
えられる。
DNA binding domain
(BD)
Activation domain
(AD)
gene
gene
酵母に形質転換
接合
酵母細胞内でAD融合タンパク質と
BD融合タンパク質が発現
ＡＤ
２つの蛋白質が相互作用しない
2つの蛋白質が相互作用する
ＢＤ
ＡＤ
ＡＤ
レポーター遺伝子
ＢＤ
オペレータープロモーター
RNAポリメラーゼによる転写
ＢＤ
レポーター遺伝子
オペレータープロモーター
His3
-His培地で生育できない
His3
-His培地で生育できる。
ネガティブクローン
ポジティブクローン
ＳＤ（-His)培地でコロニーが生育
Fig.1 酵母２ハイブリッド法の原理
6
酵母２ハイブリット法の最大の利点は、タンパク質を直接用いた in vitro での実験と
比較して取り扱いが容易な遺伝子を操作するだけで相互作用を解析出来ることである。
さらに、相互作用部位のマッピングや相互作用を阻害する変異の同定にも応用可能であ
る。また、酵母２ハイブリット解析は大規模で系統的な相互作用地図作成のために、現
時点では適切なアプローチであるとされている。系統的な相互作用地図の作成は様々な
ネットワークの仮説を提供し、そこには生物学的に興味深いものや予想外の相互作用が
存在するため、細胞全体像の解明に役立つだろうと考えられている（Pandey A & Mann
M., 2000)。本研究においても枯草菌必須タンパク質間のネットワークを得ることで、
バクテリアの生命維持に必要な新たな分子機構の解明が進むことを期待した。
酵母２ハイブリット法は以上のような利点がある反面で、擬陽性が高い、膜タンパク
質には向かない、翻訳後修飾を必要とするものは検出できない、一対一の相互作用しか
検出できないなどの欠点がある。さらに、大規模な酵母２ハイブリット解析の問題点も
明らかになっている。出芽酵母の 6000 遺伝子について２つのグループ（金沢大学・伊
藤グループと Cura Gen 社・Uetz グループ）がゲノムワイドな酵母 2 ハイブリット解
析を行い、そこで検出されたそれぞれの相互作用データを比較している（Ito T et al.,
2002 ; Ito T et al., 2001 )。両者とも、まず出芽酵母の約 6000 遺伝子の全長を PCR に
より増幅し、それぞれを BD（DNA binding domain）融合タンパク質および AD
（Activation domain）融合タンパク質として発現するクローンを作成した。次に、そ
れらを 100 個ずつ含むプールを作り、BD 融合タンパク質と AD 融合タンパク質のプー
ル間の可能な全ての組み合わせについて接合を行い、その結果検出されたポジティブク
ローンについて sequencing を行うことで相互作用するペアの同定を行った。その結果、
伊藤グループが 841 種類の相互作用を同定したのに対し、Uetz グループは 691 種類の
相互作用を得た。その 80%以上が新規の相互作用で占められていたが、両者の相互作
用の重複は 141 種類であり、全ての相互作用のうち 10%と予想外に少ないものであっ
7
た。ここに大規模な酵母２ハイブリット解析における問題点が見られる。２つのチーム
が行った酵母２ハイブリット解析のデータに違いが生じる原因として、Ito らによって
以下のような可能性が指摘されている（Ito T et al., 2001）
。
① PCR が原因で、クローニングされた遺伝子に変異が入り、それが結果に影響した。
② それぞれ異なるプラスミドを用いており、Activation domain あるいは DNA
binding domain との融合によりタンパク質のフォールディングに与える影響が異
なっている。
③ ポジティブクローンの選択における戦略と方法により結果が異なる。Ito らが３つ
のレポーター遺伝子とマルチコピーのプラスミドを用いたのに対し、Uetz らは１つ
のレポーター遺伝子とシングルコピーのプラスミドを用いていた。
④ 一定数のポジティブクローンの sequencing を行ったが、その数が不足しており、
全てのポジティブクローンがピックアップされていなかった。
⑤ 偶発的なレポーター遺伝子の活性化により間違った相互作用が検出された。
本研究ではこうした酵母２ハイブリット解析の問題点を踏まえて、より信頼性の高い
相互作用データを取得するための工夫を行うことにした。まず、全てのクローンについ
て sequencing により配列の確認を行うことで、①で述べた PCR による変異の可能性
を排除した。さらに、単独のクローンをそれぞれ酵母に形質転換し一対一で解析したた
め、③で述べたポジティブクローンの検出漏れを起こす可能性も排除した。さらに、本
研究室の石川が 11 種の Rap phoshatase について、枯草菌のランダムライブラリーを
用いた酵母２ハイブリット法を行ったところ、非常に短い ORF（数∼数十アミノ酸）
が偽陽性として多数出現するという問題点があったので、正しい立体構造がとれるよう
にタンパク質の全長を用いることにした。こうしたストラテジーの工夫を行った上で、
271 の必須遺伝子を含む 295 の遺伝子について、全ての組み合わせ（295×295）につい
8
て１対１酵母２ハイブリット法を行うことにした。
こうして完成した相互作用ネットワークには、196 の相互作用が存在した。染色体複
製装置、染色体分配に関わる Smc 複合体、細胞分裂装置など、多くの既知および予想
された相互作用が検出された。また、細胞膜合成に関係するタンパク質と染色体複製に
関係するタンパク質との相互作用、修復酵素に関係するタンパク質と細胞周期に関与す
るタンパク質との相互作用が検出されるなど、異なるプロセスに関与するタンパク質の
間での相互作用も見出され、細胞増殖の基本プロセス間の協調ネットワーク解明のため
の手がかりが示唆された。
9
２．材料と方法
2.1 菌株
本研究で使用した菌株を Table 2 に示した。ジャイレースを不活性化する ccdB 遺伝
子を持つプラスミドを大腸菌に導入した場合、この大腸菌は生育することが出来ない。
そのため、ccdB 遺伝子を持つ pDONR201、pADGW、pBDGW(Fig.3)の増幅には ccdB
耐性である大腸菌 DB3.1 を用いた。大腸菌の形質転換は DH5αを用いる時には、ヒー
トショックで、DB3.1 を用いるときにはエレクトロポレーションで行った。
Table 2 本研究で使用した菌株
菌株
遺伝子型
由来
大腸菌 DH5a
supE44, Δ lacU169( φ 80lacZ Δ M15),
hsdR17,recA1,gylA96,thi-l,recA1.
研究室
大腸菌 DB3.1
F-,gyrA462,ebdA1 Δ (sr1-recA),mcrB,mrr,hsd,S20(rB-mB-),
supE44,ara-14,galK2,lacy1,proA2,rpsL20(Smr),xyl-5?-,leu.
Invitrogen
酵母
PJ69-4a MATa,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4 Δ ,Gal80? ,
LYS2::GAL1-His3,GAL2-ADE2,met2::GAL7-lacZ.
Clontech
酵母
PJ69-4a MATa,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4 Δ ,Gal80? ,
LYS2::GAL1-His3,GAL2-ADE2,met2::GAL7-lacZ.
Clontech
枯草菌 168
Pasteur lab. stock
trpC2
10
2.2
Gateway system を用いた必須遺伝子のクローニング
Gateway system はλファージの部位特異的な組み換え酵素を利用して in vitro で組
み換えを行うシステムである（Landy A., 1989）。この方法によりあらかじめ Entry
clone を作成しておけば、酵母２ハイブリット法をはじめ、様々な実験に用いる
Expression clone を簡便に作成することができる（Fig. 2）
。本研究ではこの Gateway
coloning system を用いて枯草菌の 271 の必須遺伝子を含む 295 の遺伝子（付録 1）に
ついて Entry clone を作成し、それを用いて酵母 2 ハイブリット用 clone を作製した。
attB1
attB2
gene
+
ccdB
attB-flanked
PCR product
gene
BP Clonase
attL1
+
Entry
clone
+
Entry
clone
attR2
attR1
attL2
gene
Donor
vector
attL2
attL1
attP2
attP1
ccdB
LR Clonase
Destination
vector
attR2
ccdB
By-product
attB2
attB1
attR1
gene
Expression
clone
+
attP2
attP1
ccdB
By-product
Fig.2 Gateway system を用いたクローニング
Donor vector は pDONR201 を示す。
Entry clone は pDONR201-EG を示す。
Destination vector は pADGW もしくは pBDGW を示す。
Expression clone は pGAD424-EG もしくは pGBT9-EG を示す
EG は essential gene を現している。
2.2.1 プラスミドの構築
Donor vector の pDONR201 (Clontech)は Entry clone の作製に、Destination vector
の pADGW 及び pBDGW は Expression clone の作製に用いた。pBDGW と pADGW
は、市販の酵母 2 ハイブリド用の BD 融合タンパク質あるいは AD 融合タンパク質を発
11
現する、pGBT9 (Invitrogen)と pGAD424 (Invitrogen)を EcoRⅠと BamHⅠで消化し
た後、T4 DNA polymerase (Takara Bio Inc)を用いて平滑化したものに、Gateway
syatem によるクローニングのための rfA (reading frame) cassette (Gateway Vector
Conversion System; Invitrogen)を挿入することにより構築した(Fig.3)。
attP1 ccdB CmR attP2
GAL4 AD
PADH1
T1 T2
2u ori
TADH1
pGBT9
pGAD424
pDONR201
(5500bp)
(6600bp)
(4470bp)
bla
Col E1 ori
kan
Col E1 ori
rfA cassette
rfA cassette
attR1 ccdB CmR attR2
PADH1 GAL4 BD
PADH1GAL4 AD
2u ori
2u ori
TADH1
TADH1
pBDGW
pADGW
TRP1
bla
Col E1 ori
MCS
kan
bla
T1
T2
attP1
attP2
ccdB
cat
attR1
attR2
TRP1
LEU2
PADH1
TADH1
GAL4 BD
GAL4 AD
2µ ori
Col E1 ori
TRP1
bla
LEU2
attR1 ccdB CmR attR2
bla
MCS
2u ori
TADH1
ori
PADH1 GAL4 BD
MCS
Col E1 ori
LEU2
マルチクローニングサイト
大腸菌におけるKanamycin耐性遺伝子
大腸菌におけるAmpicillin耐性遺伝子
大腸菌rrnB 由来のターミネーター
大腸菌rrnB 由来のターミネーター
BP clonaseの組み換え反応に必要な配列
BP clonaseの組み換え反応に必要な配列
大腸菌においてDNAジャイレースを不活性化する遺伝子
chloramphenicol耐性遺伝子
LR clonaseの組み換え反応に必要な配列
LR clonaseの組み換え反応に必要な配列
トリプトファン合成遺伝子
ロイシン合成遺伝子
ADH1プロモーター
ADH1ターミネーター
GAL4 DNA Binding Domain
GAL4 Activator Domain
酵母の複製起点
大腸菌の複製起点
Fig.3 酵母２ハイブリット用 vector (Expression clone)の構築に用いたプラスミド
12
2.2.2 Gateway system を用いた Entry clone の作製
まず、Gateway の組み換え配列である attB1 配列 25bp のうち 3’末端側の 14bp、ま
た attB2 配列 25bp のうち 3’末端側の 13bp を付加した、目的遺伝子に特異的なプライ
マーをデザインした。PCR による増幅は開始コドンから終止コドンを含む領域までと
した(付録２)。これらのプライマーを用いて枯草菌 168 株のゲノム DNA を鋳型とし、
目的遺伝子を PCR によって増幅した（1st PCR）
。1stPCR の反応条件は 94℃で２分間
加熱した後、94℃で 15 秒、58℃で 30 秒間、68℃で 40 秒間∼2 分 50 秒間（1kb 毎に
1 分間）を 3 サイクル、次に 94℃で 15 秒間、68℃で 40 秒間∼2 分 50 秒間を 3 サイク
ルである。
次に、1st PCR 反応液を鋳型として attB1 プライマー及び attB2 プライマー(Table 3)
を用いて PCR を行った(2nd PCR)。2ndPCR の反応条件は 94℃で２分間加熱した後、
94℃で 15 秒間、58℃で 30 秒間、68℃で 40 秒間∼2 分 50 秒間（1kb 毎に 1 分）を 3
サイクル、次に 94℃で 15 秒間、68℃で 40 秒間∼2 分 50 秒間を 25 サイクルである。
PCR による変異の可能性を減らすために 1st PCR、
2nd PCR 共に、
強い Proofreading
活性を持った KOD-Plus DNA polymerase (TOYOBO)を用い、Table 4 に示すバッフ
ァーを用いて PCR を行った。こうして目的遺伝子の両端に Gateway の組み換えに必
要な attB 配列が付加した DNA 断片を増幅した。
Table 3 Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
attB1
attB2
pDONR-F
pDONR-R
配列 (5'→3')
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCG
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC
TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC
GTGTCTCAAAATCTCTGATGTTAC
13
Table 4 1st PCR 及び 2nd PCR の反応系
1st PCR
2nd PCR
MgSO4濃度
1.6mM
1.4mM*
鋳型DNA濃度
1ng/µl
1st PCR 反応液を1/10量
プライマー濃度
200nM
800nM
*1st PCR productの持ち込みを加えると1.6mMになる
2nd PCR により増幅した必須遺伝子を BP clonase enzyme mix (Invitrogen) を用い
て pDONR201 vector に組み換え、Entry colne を得た。BP clonase による組み換え反
応は 25℃で 2 時間行い、プロティナーゼ K (Invitrogen) により酵素を失活させた。次
に、BP clonase 反応液を用いて大腸菌 DH5αを形質転換し、LB 寒天培地 (50µg/µl
kanamycin)、37℃で一晩培養し、形質転換体を選択した。
Entry clone 内の必須遺伝子は PCR による変異が入っている可能性があるため、全
ての塩基配列を sequencing により確認した。sequencing の鋳型はプラスミドの組み換
え領域の外側にアニーリングする pDONR-F 及び pDONR-R プライマー (Table 3) を
用いて PCR により増幅した産物を用いた。sequencing には、基本的にこれら２つのプ
ライマーを用いたが、1365bp 以上の遺伝子については、遺伝子配列の内部にアニーリ
ングする sequencing 用プライマー(付録 2)も合わせて用いることで、全長の塩基配列を
確認した。塩基配列はデータベース（http://bacillus.genome.ad.jp/）と照合したが、も
し間違いがあればそれが PCR による変異なのか、それともデータベースの間違いなの
かを確かめる必要がある。その場合には対象となる遺伝子に関して、ゲノムＤＮＡを鋳
型として、増幅した 2nd PCR product を sequencing の鋳型に用いることにより確認し
た。
14
2.2.3 酵母２ハイブリット用プラスミド (Expression clone) の作製
Entry clone の 必 須 遺 伝 子 を LR clonase enzyme mix (Invitrogen) に よ っ て
Destination vector (pBDGW 及び pADGW)に組み換え、Expression colne を得た。LR
clonase による組み換え反応は 25℃で 2 時間行い、
反応停止後、
大腸菌を形質転換した。
Expression clone を導入した形質転換体は LB 培地 (100 µg /ml Ampicillin)で選択した。
そして、形質転換からプラスミドを抽出後、目的遺伝子に特異的なプライマー (付録 2)
を用い、PCR によりインサートのサイズの確認を行った。PCR は 1st PCR と同じ反応
条件で行った (2.2.2)。
こうして、それぞれ GAL4 の activation domain、GAL4 の DNA binding domain と
翻訳レベルで目的の遺伝子が融合している Expression clone を取得し、 pGAD424 由
来の pADGW に目的遺伝子を挿入したプラスミドを pGAD424-EG(essential gene)、
pGBT9 由来の pBDGW に目的遺伝子を挿入したプラスミドを pGBT9-EG(essential
gene）と命名した。
大腸菌で Entry clone をクローニングすることができなかった遺伝子については、
BP
reaction 液を EtOH 沈殿後、直接 LR reaction を行った。そして、その反応液を直接
酵母の形質転換に用いた。また、Expression clone をクローニングすることが出来なか
った Entry clone については、LR reaction の反応液を直接酵母の形質転換に用いた。
2.2.4
プラスミドの抽出方法
大腸菌からのプラスミドの抽出は、多量のプラスミドを同時に抽出するために、96
well のプレートを用いて行った。原理はアルカリ法によるプラスミド抽出の後、DNA
のガラス Fiber への吸着を利用したものである。形質転換体を 96 well Deep well プレ
ート (BMBio BM6017) を用いて、750µl の LB 液体培地 (50 µg / µl kanamycin を含
む)、 37℃で一晩培養した後、テーブルトップ多本架遠心機（QIAGEN 4-15C）を用
15
いて、3000rpm で５分間遠心し、集菌した。ペレットの菌体に 80 µl の solution Ⅰ
（50mM グルコース, 25mM EDTA, pH8.0）を加えて懸濁後、80 µl の solution Ⅱ
（0.2N NaOH, 1% SDS）を加えて細胞を溶解した。さらに、80 µl の solution Ⅲ（5M
CH3COOK,pH5.2）を加えて中和した後、Multi Screen Nucleic A プレート (Millipore)
のカラムに移し、テーブルトップ多本架遠心機を用いて 50g で５分間、室温で遠心し、
不溶化した染色体、タンパク質等を取り除いた。遠心によりカラムの下に落ちた溶液を
150 µl の Binding buffer
（6.1M ＫＩ）
が入った Multi Screen-FB プレート (Millipore)
のカラムに移し、ピペッティングによりよく混合した。混合液を、テーブルトップ多本
架遠心機を用いて 20g で 5 分間、室温で遠心することにより、プレートのガラス Fiber
に DNA を吸着させた。さらに 200 µl の 80%エタノールをカラムに加え、テーブルト
ップ多本架遠心機を用いて 500g で 5 分間、室温で遠心し洗浄した。80%エタノールに
よるカラムの洗浄を２回行った後、そのまま 1000g で 10 分間、室温で遠心することに
よりカラムを乾燥した。乾燥したカラムに 70 µl の TE を加え 5 分間室温に置いた後、
テーブルトップ多本架遠心機を用いて 1000g で 5 分間、室温で遠心し、プラスミドを
カラムより溶出、回収した。
16
2.3 酵母２ハイブリット法による必須タンパク質間相互作用のスクリーニング
と再現性の確認
本研究で使用した Expression clone は組み込まれた遺伝子産物がそれぞれ GAL4
activation domain 及び GAL4 DNA binding domain との融合タンパク質として発現す
るように設計されている。これら２つの domain は元々同一のタンパク質を構成してお
り、特異的なオペレーター配列を認識し、転写を活性化する。これらの domain と融合
している遺伝子産物同士が相互作用すれば、各 domain 間の距離が極めて近くなり転写
活性能が回復する。そうすると、レポーター遺伝子 HIS3 が発現し、酵母は Histidine
を合成できるようになるため、Histidine を含まない培地で生育できるようになる。一
方、各 domain と融合している遺伝子産物同士が相互作用しなければ、転写活性能は回
復しない。よって、この酵母は Histidine を合成することが出来ず、Histidine を含ま
ない培地で生育することが出来ない。このようにＳＤ(-His,-Leu,-Trp) 寒天培地におけ
るコロニーの生育状況を観察することで相互作用を検出した(Fig.1)。
2.3.1 酵母への形質転換
Expression clone (pGAD424-EG, pGBT9-EG) の酵母への形質転換は、CLONTECH
の Yeast protocols handbook に従い行った。pGAD424-EG は酵母 PJ69-4α株に、
pGBT9-EG は酵母 PJ69-4a 株にそれぞれ導入した。
まず、PJ69-4αと PJ69-4a を YPDA 寒天培地(Table 5)で 1 日培養し、それらのコロ
ニーをそれぞれ 60ml の YPDA 液体培地に O.D.600=0.3 となるよう植菌した後、30℃
で 3 時間培養した。これを 1500rpm で５分間、室温で遠心して集菌し、7ml の LiAc
溶液 (Table 6) を用いて菌体を 2 回洗浄し、コンピテントセルとした。次に、7ml の
LiAc 溶液に懸濁した酵母のコンピテントセルに、1.4mg の Carrier DNA (CLONTECH)
を加え vortex により混和した。これを 15 µl ずつ 1.5ml チューブに分注し、200ng の
17
プラスミドを加え voltex により混和した。次に、PEG/LiAc 溶液 (Table6) を 90 µl ず
つ加え voltex により混和した。これを 30℃で 30 分間、42℃で 20 分間インキュベート
し、氷上で２分間放置した後、テーブルトップ多本架遠心機を用いて 910g で５秒間、
４℃で遠心した。チューブの底に沈んだ菌液 5 µl を 96 well plate の形と重なるように
SD 寒天培地 (Table5) にスポットし、30℃で 2 日間培養した。その際、Drop out
solution (Table6) を用いて、特定のアミノ酸を除いた寒天培地で、形質転換体を選択
し た 。 pGAD424-EG プ ラ ス ミ ド を 導 入 し た 酵 母 PJ64 α は SD(-Leu) 培 地 で 、
pGBT9-EG プラスミドを導入した酵母 PJ69-4a は SD(-Trp) 培地で培養することでそ
れぞれ選択した。
Table 5 酵母の培養に用いた培地
酵母を培養する時は下記に示した培地を用いて 30℃で行った。
また、Bio shaker を用いた場合は 1200rpm/min で震盪培養した
YPDA培 地
2 0 g /L
D ifco peptone(D ifco)
1 0 g /L
Yeast extract(D ifco)
5 0 m l/L 4 0 % glucose(W /V)(W a k o )
2 0 m g /L L-adenine(W a k o )
SD培地
6.7g/L Yeast nitrogen base without amino acids(Difco)
50ml/L 40% glucose(W/V)(Wako)
100ml/L 10×DO solution
18
Table.5 続き
10×DO(drop out) solution*
300mg/L L-Isoleusine
1500mg/L L-Valine
440mg/ L L-Adenine hemisulfate salt
200mg/L L-Arginine HCl
200mg/L L-Histidine HCl monohydrate
1000mg/L L-Leusine
300mg/L L-Lysine HCl
200mg/L L-Methionine
500mg/L L-Phenylalanine
2000mg/L L-Threonine
200mg/L L-Tryptophan
300mg/L L-Tyrosine
200mg/L L-Uracil
*１０×DO solution は必要に応じて特定のアミノ酸を除いて使用
した。アミノ酸は全てWako製である。
Table6 酵母の形質転換に用いた試薬
いずれの試薬も用事調整して形質転換に用いた。
LiAc溶液
TE buffer
LiAc
10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.5
100mM LiAc
PEG/LiAc溶液
PEG3350
40%
TE buffer
10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.5
LiAc
100mM LiAc
2.3.2 酵母の接合
相 互 作 用 を 観 察 す る 、 そ れ ぞ れ の Expression clone を 持 つ 酵 母 PJ69-4 α
(pGAD424-EG) と PJ69-4a (pGBD9-EG) の接合は、CLONTECH の Yeast protocols
handbook に従い行った (Fig.4)。まず、PJ69-4α (pGAD424-EG) を、コピープレー
ト (トッケン TK-CP96) を用いて 96 well Deep well プレート (BMBio BM6017) 中
の SD(-Leu) 液体培地 600 µl に移し、Bio shaker (TAITEC) を用い 1 日培養した。一
方、PJ69-4a (pGBD9-EG) は SD(-Trp) 寒天培地に塗布し、30℃で 1 日間培養した。
酵母の接合を行う当日、PJ69-4α(pGAD424-EG) の培養液を、テーブルトップ多本
19
架遠心機を用いて 3000rpm で５分間、室温で遠心して培地を除いた後、YPDA 培地
を 500 µl 加えて Bio shaker を用い 1 時間培養した。一方、PJ69-4a (pGBD9-EG) は
コロニーをかきとって L 字型試験管中の YPDA 培地 7.5ml (192 種の PJ64α
(pGAD424-EG)と接合を行う時) もしくは 5ml (103 種の PJ69-4α (pGAD424-EG)
と接合を行う時) に移し 30℃で 1 時間培養した。接合をするために YPDA 培地で 1
時間培養したそれぞれの酵母を 96 well マイクロタイター プレート（BM Bio 平底
BM6001）に 25 µl ずつ移して混合し、接合を 6 時間∼一晩、Bio shaker を用いて行
った。接合した酵母は SD (-Leu,-Trp) 寒天培地に 2.5 µl ずつスポットし、30℃で 2
日間培養することで選択した。
20
PJ69-4α(pGAD424-EG)の形質転換体
PJ69-4a(pGBT9-EG)の形質転換体
SD(-Leu)寒天培地
SD(-Trp)寒天培地
30℃、1日培養
30℃、1日培養
コピープレート
SD(-Leu)液体培地
600ul
96 well
Deep well plate
30℃、1日培養
3000rpm,５分
Remove
supernatant
YPDA液体培地
7.5mlor5ml
+YPDA液体培地
500ul
30℃、1時間培養
30℃、1時間培養
25ulずつ分注
25ulずつ分注
96穴
マイクロタイターplate
30℃、6時間∼一晩培養
2.5ulずつスポット
SD(-Leu,-Trp)寒天培地
30℃、2日間培養
PJ69-4α/a(pGAD424-EG,pGBT9-EG)を選択
レプリカ
384 well
マイクロタイターplate
SD(-Leu,-Trp)液体培地 15ul
30℃、1日間培養
レプリカ
レプリケーター
SD(-His,-Leu,-Trp)寒天培地
30℃培養
2日目・
4日目・6日目に酵母の生育を観察
Fig.4
酵母の接合及びハイスループット一対一酵母２ハイブリット法
21
2.3.3 タンパク質間相互作用のスクリーニング
PJ69-4α(pGAD424-EG) と PJ69-4a(pGBT9-EG) を接合して、SD(-Leu,-Trp) 寒
天培地で選択した２倍体の酵母を、384 well マイクロタイタープレート (GENETIX
X7007) 中の SD(-Leu,-Trp) 液体培地 15 µl に、コピープレートを用いて移し、Bio
shaker を用いて１日培養した。この培養液を SD(-His,-Leu,-Trp) 寒天培地にレプリケ
ーター (GENETIX X5053) を用いてレプリカし、2 日後、4 日後、6 日後に酵母の生育
を観察することで相互作用の有無を判定した (Fig.4)。前述したように、酵母内で BD
融合タンパク質と AD 融合タンパク質が相互作用すれば、レポーター遺伝子 HIS3 が発
現し、Histidine を合成できるようになるため、2 倍体酵母が Histidine を含まない培
地で生育できるようになる。
相 互 作 用 の 判 別 方 法 を Fig.5 の プ レ ー ト 写 真 を 例 に し て 説 明 す る 。
SD(-His,-Leu,-Trp) 寒天培地にレプリカ後 2 日目 (Fig.5,a) では、赤丸をつけた接合体
の増殖が観察され、DnaA 同士、DnaB 同士、DnaC 同士、DnaD 同士、DnaD と DnaA、
DnaC と DnaI、DnaG と DnaI の相互作用が検出された。また、4 日目(Fig.5,b) には
DnaB と DnaD の相互作用、DnaC と DnaA の相互作用（青丸）が、さらに検出され
た。しかし、6 日目(Fig.5,c) では、コントロールにおいた pGAD424 や pGBT9 との組
み合わせでコロニーの生育が見られる(緑丸)。よって、SD(-His,-Leu,-Trp) 寒天培地に
レプリカ後、4 日目までに増殖が観察された接合体をポジティブクローンとした。
また、pGBT9-Ssb, YpuH, FtsW, Csd では、コントロールを含む全てにコロニーの生
育が見られた (Fig.5,d 赤線)。このような現象は pGAD424-EG との組み合わせでは存
在しなかった。pGBT9-EG にクローニングされている遺伝子産物が、RNA ポリメラー
ゼの転写を直接的に活性化してしまったためと考えられる。このような
Auto-activation を示すものはポジティブクローンとして扱わなかった。
22
pGAD424
pGAD424-dnaA
pGAD424-dnaB
pGAD424-dnaD
pGAD424-dnaC
pGAD424-dnaE
pGAD424-dnaG
pGAD424-dnaN
pGBT9
pGBT9
pGBT9-dnaA
pGBT9-dnaA
pGBT9-dnaB
pGBT9-dnaB
pGBT9-dnaC
pGBT9-dnaC
pGBT9-dnaD
pGBT9-dnaD
pGBT9-dnaE
pGBT9-dnaE
pGBT9-dnaG
pGBT9-dnaG
pGAD424
pGAD424-dnaA
pGAD424-dnaC
pGAD424-dnaB
pGAD424-dnaD
pGAD424-dnaE
pGAD424-dnaG
pGAD424-dnaI
pGAD424-dnaN
pGAD424
pGAD424-dnaB
pGAD424-dnaA
pGAD424-dnaC
pGAD424-dnaD
pGAD424-dnaE
pGAD424-dnaG
(d)
pGAD424-dnaI
(c)
pGAD424-dnaN
pGAD424-dnaI
pGAD424
pGAD424-dnaA
pGAD424-dnaB
pGAD424-dnaC
pGAD424-dnaD
pGAD424-dnaG
pGAD424-dnaE
pGAD424-dnaN
(b)
pGAD424-dnaI
(a)
pGBT9-ypuG
pGBT9
pGBT9-ypuH
pGBT9-dnaA
pGBT9-ydiB
pGBT9-dnaB
pGBT9-dnaC
pGBT9-dnaD
pGBT9-dnaE
pGBT9-dnaG
Fig.5 タンパク質間相互作用の判定方法
PJ69-4α(pGAD424-EG)と PJ69-4a(pGBT9-EG)を接合した酵母 2 倍体を SD(-Leu,-Trp)液体培
地で 1 日培養した後、レプリケーターを用いて、
(a)SD(-His,-Leu,-Trp)寒天培地にレプリカ後、30℃で 2 日間培養したプレート写真。
(b)SD(-His,-Leu,-Trp)寒天培地にレプリカ後、30℃で 4 日間培養したプレート写真。
(c)SD(-His,-Leu,-Trp)寒天培地にレプリカ後、30℃で 6 日間培養したプレート写真。
(d)SD(-His,-Leu,-Trp)寒天培地にレプリカ後、30℃で 2 日間培養したプレート写真。
23
2.3.4 再現性の確認
スクリーニング実験により検出された相互作用について、その再現性を確認すること
で、より信頼性の高い相互作用データの取得を目指した。再現性実験はスクリーニング
実験で、２日目と４日目に相互作用が示されたタンパク質の組み合わせについて行った。
また、Activation domain と DNA binding domain を入れ替えた組み合わせについても
相互作用を調べた。
接合は、スクリーニング実験と比べ相互作用の有無を調べる組み合わせが少ないため、
前培養と YPDA 培地での培養方法を変えた。PJ69-4α（pGAD424-EG）はコピープレ
ートを用いて 96 well マイクロタイタープレート中の SD(-Trp) 液体培地 150 µl に移し
て 1 日培養した。一方、PJ69-4a(pGBT9-EG) もコピープレートを用いて 96 well マ
イクロタイタープレート中の SD(-Trp) 液体培地 150 µl に移して 1 日培養した。接合を
行う当日、PJ69-4α(pGAD424-EG) と PJ69-4a(pGBT9-EG) の培養液を、テーブルト
ップ多本架遠心機を用いて 3000rpm５分間、室温で遠心して集菌し、YPDA 培地を
150 µl 加えて 1 時間培養した。酵母の接合と SD(-His,-Leu,-Trp) へのレプリカは 2.2.3
と同様に行った。
再現性の確認実験では、スクリーニング実験に比べてコロニーの生育が遅かったため、
４日目までに生育したコロニーをポジティブクローンにすれば、多くの偽陰性を生じる
ことが予想された。そこで 2 回目の再現性確認実験を行い、この実験では２日目と４日
目に生育したコロニーに加えて６日目に生じたコロニーもポジティブクローンとして
扱うことにした。また、1 回目の再現性確認実験では、スクリーニング実験の時から長
期間に渡って植え継いでいた形質転換体を用いていたことから、酵母や Expression
clone に変異が起こったため酵母の生育が遅れたという可能性が危惧された。そこで、
2 回目の再現性実験は、再度 Expression clone を酵母に形質転換して行った。しかし、
1 回目の再現性確認実験と比べ、コロニーの生育速度はほとんど変わらなかった。
24
2.4 蛍光顕微鏡による YFP 融合タンパク質の枯草菌内での局在観察
酵母２ハイブリット解析により検出された相互作用が、実際に枯草菌細胞内で反映さ
れているかどうかを調べるため、目的タンパク質を YFP 融合タンパク質として枯草菌
内で発現させ、蛍光顕微鏡によりその局在を観察した。
YFP 融合発現制御株の作製には pAPNC213-yfp-GW を用いた。このプラスミドは、
yfp、rfA cassette、lacI リプレッサー遺伝子とその産物によって制御される spac プロ
モーター (Pspac)、さらに枯草菌形質転換体の選択マーカーとしての spectinomycin 耐
性遺伝子が、枯草菌 aprE 遺伝子の内部に挿入された配列を持っている (Fig.6)。これ
に目的遺伝子を導入したプラスミド(pAPNC213-yfp-EG) で、枯草菌を形質転換し、染
色体に導入すれば、培地中に IPTG を添加することにより、spac プロモーターの下流
に置いた遺伝子が YFP 融合タンパク質として発現し、その局在を観察することができ
る。
2.4.1 YFP 融合タンパク質発現 vector (pAPNC213-yfp-GW)の構築
まず、pSM5072 (Imai Y et al., 2000) の gfp の 203 番目のトレオニンをチロシンに置
換したプラスミド（本研究室の桑野が作製）を鋳型として、fp-HBg-F プライマーと
fp-rfA-R プライマー (Table 7) を用いて、yfp を PCR により増幅した。この PCR 産物
の 3’末端と rfA cassette の 5’末端は相同であるので、PCR 産物と rfAcassette を鋳型と
して、fp-HBg-F プライマーと attR2-EVBg-R プライマー (Table 7) を用いた PCR を
行うことにより、yfp と rfA cassette を結合した (yfp-GW)。次に、pUC19 を BamHⅠ
で消化して、Mung Bean Nuclease (Takara Bio Inc) によって末端を平滑化した後、
上記の PCR 産物を挿入することによって pUC19-yfp-GW を作製した。そして、
pUC19-yfp-GW の yfp と rfA cassette 領域を、fp-SD-HBg-F プライマー (Table 7) と
25
attR2-EVBg-R プライマーを用いて PCR により増幅し、この PCR 産物を BglⅡと
EcoRV により消化した後、pAPNC213 を SmaI と BamHⅠで消化したものに挿入する
ことにより pAPNC213-yfp-GW を構築した (Fig.6)。
Table 7 プラスミドの構築に使用したプライマー
プライマー
fp-HBg-F
fp-rfA-R
attR2-EVBg-R
fp-SD-HBg-F
配列 (5'→3')
GGCCAGATCTAAGCTTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC
GCTTTTTTGTACAAACTTGTTTTGTATAGTTCATCCATGC
GCGCAGATCTGATATCACCACTTTGTACAAGAAAGC
GGCCAGATCTAAGCTTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC
2.4.2 YFP 融合発現制御株の作製
Entry clone 中の目的遺伝子を、LR reaction (2.2.3)により、pAPNC213-yfp-GW に導
入 し た (pAPNC213-yfp-EG) 。 こ の プ ラ ス ミ ド を Anagonostopoulos ら の 方 法
(Anagonostopoulos and Spizien.,1961)を用いて枯草菌内に形質転換し、aprE 遺伝子
上流部と下流部の配列での相同組み換えにより、枯草菌 168 株染色体上に導入した。
枯草菌の形質転換体は LB (100 µg /ml spectinomycin を含む) 寒天培地により選択し
た。得られた形質転換体より染色体 DNA を抽出し、attB2 out プライマーと aprE
back プライマー及び spc5’out プライマーと aprE front プライマー (Table 8) を用い
た PCR を行うことにより、枯草菌染色体に yfp を融合した目的遺伝子が組み込まれ
ていることを確認した。
こうして完成した YFP 融合発現制御株では、培地中に IPTG を添加することによ
り、spac プロモーターの下流に置いた遺伝子の発現を人為的に制御することが出来る。
26
fp-rfA-F
相同性を持つ領域
yfp
BamHⅠ
rfA cassette
yfp PCR product
attR1 ccdB cat
pUC19
2686bp
Recombinant PCR
ori
attR2-EVg-R
attR1 ccdB cat
yfp
lacZ
attR2
attR2
bla
yfp-GW
Mung Bean Nucleaseによる平滑化
BamHⅠ
Fp-SD-HBg-F
yfp
attR1 ccdB cat
attR2-EVBg-R
attR2
lacZ
BamHⅠ SmaⅠ
pUC19-yfp-GW
ter
Pspac
aprE back
LacI
ori
bla
pAPNC213
7729bp
PCR
BglⅡ
SpcR
EcoRV
aprE front
yfp
attR1 ccdB
bla
cat attR2
yfp
Ter
attR1 ccdB cat
Pspac
aprE back
LacI
Pspac
aprE front
aprE back
SpcR
yfp
bla
ccdB
cat
attR1
attR2
lacI
spacプロモーター
pAPNC213-yfp-GW
aprE 遺伝子の上流配列
aprE 遺伝子の下流配列
SpcR
spectinomycin耐性遺伝子
変異蛍光タンパク質
bla
aprE front
大腸菌におけるAmpicillin耐性遺伝子
大腸菌においてDNAジャイレースを不活性化する遺伝子
chloramphenicol耐性遺伝子
LR clonaseの組み換え反応に必要な配列
LR clonaseの組み換え反応に必要な配列
Lacリプレッサー遺伝子
Fig.6 YFP 融合タンパク質発現 vector の構築
27
attR2
Table 8 枯草菌染色体への目的遺伝子の組み換えを確認するプライマー
プライマー
attR2-EVBg-R
spc5'out
aprE front
aprE back
配列 (5'→3')
GCGCAGATCTGATATCACCACTTTGTACAAGAAAGC
CTATAGAAACTTCTCTCAATTAGGC
GGCTACACAGGCTCTAAC
TCCAGCTATATTGGCCGC
2.4.3 蛍光顕微鏡による YFP 融合タンパク質の局在観察
作製した枯草菌の YFP 融合発現制御株を、LB 培地を用いて 30℃で一晩前培養した。
前培養した菌株を LB 液体培地(0.5mM IPTG,100 µg/ml spectinomycin を含む)に
O.D.600=0.01 となるように加え、37℃で培養し、対数増殖期の O.D.600=0.2∼0.5 の
細胞を、13500rpm、室温で数秒間遠心した後、上清を取り除いて濃縮した。濃縮し
た培養液 5 µl をアガロースコートしたスライドガラスに添加し、DAPI 水溶液
(1mg/ml) 3 µl と 混 合 し 、 ピ ペ ッ ト を 用 い て 穏 や か に 混 合 し た 。 蛍 光 顕 微 鏡
(DMRE-HC; Leica) を用いて、位相差による細胞形体の観察と、蛍光による YFP 融
合タンパク質の局在及び DAPI 染色された核様体の形態の観察を行った。コンピュー
ターへの画像の取り込みは CCD カメラ(1300Y; Roper Scientific)を使用し、画像処理
は METAMORPH(Universal Imaging)を用いた。
28
3.結果と考察
3.1
Gateway system を用いたクローニング
PCR により増幅した 297 遺伝子を、BP reaction により pDONR201 に組み換えて、
大腸菌に形質転換した結果、295 個の形質転換体を得ることが出来た。しかし、map
と topA については形質転換体を得ることが出来なかった。また、295 個の Entry clone
を、LR reaction により pADGW 及び pBDGW にそれぞれ組み換えて、大腸菌に形質
転換した結果、293 遺伝子の Expression clone を得た。ここでは、leuS, pheT と ydiP
(pGBT9-ydiP のみ) について、形質転換体を得ることが出来なかった。大腸菌への形質
転換が出来なかったこれら 5 つの遺伝子は、2.3.2 で述べたように、組み換え反応終了
後、直接酵母に形質転換を試みた結果、map, topA, ydiP については形質転換体を得る
ことが出来たが、leuS, pheT については得ることが出来なかった。
結果として、目標とした 297 遺伝子中、295 遺伝子のクローニングに成功した。Entry
clone を構築するために用いた pDONR201 には、大腸菌に有毒な遺伝子であってもク
ローニングすることが出来るように遺伝子の挿入領域の上流にターミネーターが２つ
存在している (Fig.3)。実際に、大腸菌で発現プラスミドを構築できないことが分かっ
ている dnaA (Fukuoka T et al.,1990)が Entry clone 及び Expression clone として構築
されたことから、組み込まれた遺伝子の大腸菌内での発現が良く抑えられていることが
確認できた。このように本研究では様々な遺伝子をクローニングするのに適したプラス
ミドを構築することが出来た。
29
3.2
相互作用のスクリーニングと再現性の確認
本研究では 1 回のスクリーニング実験とその結果に基づいた２回の再現性確認実験
を行ったが、それぞれにおいて検出された相互作用の数は大きく異なった。スクリーニ
ング実験と 1 回目の再現性確認実験では、SD(-His,-Leu,-Trp) 寒天培地に接合した酵
母をレプリカ後、２日目と４日目に生育したコロニーをポジティブクローンとした。1
回目の再現性確認実験ではスクリーニング実験に比べてコロニーの生育が遅く、４日目
までの相互作用データでは多くの偽陰性が生じていることが予想されたこと、スクリー
ニング実験と同じ形質転換体のコロニーを長期間に渡って植え継いで用いたことから、
再度 Expression clone を酵母に形質転換して、2 回目の再現性確認実験を行った。2 回
目の再現性実験では２日目、４日目に加え６日目に生じたコロニーもポジティブクロー
ンとして扱うことにした。しかし、2 回目の再現性確認実験でも 1 回目の再現性確認実
験と同じくスクリーニング実験に比べてコロニーの生育が遅かった。これらの 3 回の実
験により観察された相互作用の数は１回目では 423 種類（付録 3）
、２回目では 114 種
類、３回目では 185 種類（４日目までは 127 種類）であった。後述するように、スク
リーニング実験で得られた相互作用で既知のものは 44 種であり、残りは新規のもので
あった。また、2 回行った再現性実験の相互作用データのうち、そのどちらか一方でも
相互作用が検出されれば、それをポジティブクローンとした。こうして得られた相互作
用は計 196 種類存在し(Table.9)、後述するように既知のものは 42 種だった。
Table.9
スクリーニング実験と 2 回の再現性実験で得られた相互作用
既知の相互作用
新規の相互作用
計
スクリーニング 再現性実験（1回目）再現性実験（2回目） いずれかの再現性実験で検出
44
34
40
42
379
80
140
154
423
114
185
196
30
さらに、得られた相互作用をから、大きなタンパク質の相互作用ネットワークを書く
ことができた。それを、Fig. 7 に模式的に示した。また、大きなタンパク質の相互作用
ネットワークに含まれない単独（オリゴマー形成）及び 2 タンパク質間の相互作用を、
Fig. 8 に示した。
スクリーニング実験で検出されたが 2 回行った再現性確認実験で共に検出すること
が出来なかった相互作用は 227 種類あり、そのうち既知の相互作用はわずか 2 種類
(NadE 同士、TrxB 同士)であった。再現性実験は相互作用データの信頼性を高めるため
の有効な手段だったと評価している。
しかし、同じコンストラクトで解析しているのにも関わらず、これだけ結果にばらつ
きが生じていることから、やはり酵母２ハイブリット解析は実験上の微妙な条件の違い
によって結果が左右されると言える。このように、常に偽陰性と偽陽性の問題が付きま
とう酵母２ハイブリット解析の結果を考察するにあたって、その相互作用データがどれ
ほど信頼できるのかということを、別の方法で検討することが重要である。
31
SMC複合体
SMC複合体
operon
Rnc
Smc
YpuH
operon
YpuG
RplL
YurX
YurY
operon
YurU
YqeJ
Ffh
RpsH
RplC
SigA
FtsA
ValS
AccD
operon
DnaA
YerQ
GcaD
operon
DnaB
Ssb
PriA
XseB
operon
DnaE
YpfD
AcpA
SecE
複製の
複合体
YueK
FabF
ResC
HepS
AcpS
RplR
NrdF
YnbA
RpmA
GlyQ
RplO
GatB
operon
NrdE
PheS
YlaN
YqjK
TopA
DnaX
PolC
RplP
RplT
ThdF
OdhB
ParE
MrpC
PrfB
Asd
Map
RplB
YdiB
operon
ParC
RpsQ
YdiC
295×295 の一対一酵母２ハイブリット法により検出された相互作用について、
YkzG
operon
operon
MrpA
トポイソメラーゼ
IV
再現性実験でも検出された相互作用のうち、ネットワークを形成する相互作用を示した。
矢印の方向は pGBT9-EG から pGAD424-EG への相互作用の方向を示している。矢印の色は
Eno
再現性実験の 2 回目（再現性実験の 1 回目のみの場合は 1 回目）で、SD(-His,-Leu,-Trp)培地に
接合した酵母をレプリカした後、赤色が 2 日目、青色が 4 日目、緑色が 6 日目にそれぞれコロニーの
生育が観察され、相互作用を検出したことを示している。２回行った再現性実験のうち１回だけ検出した
相互作用を点線で、２回とも検出した相互作用を実線で示した。紫色の枠内には既知及び予想されていた異なる
タンパク質同士の相互作用を示している。タンパク質の機能の分類も色で表した（赤色,DNA metabolism; 群青色,RNA metabolism;
黒色,Protein synthesis; 緑色,Cell envelope; 黄緑色,Cell shape and division; 黄色,Glycolysis; 青色,Respiratory Pathways; 橙色,Nucletide;
紫色,Cofactor;水色,GTP binding protein; 灰色,Other; 白色,Unknown）
。 赤色文字は non-essential gene を表している。
矢印の方向は pGBT9-EG から pGAD424-EG への相互作用の方向を表す。
32
RplN
GlyS
YkqC
YlaG
HolB
RpmD
GuaB
Fig.7 枯草菌必須タンパク質間のネットワークを形成する相互作用の地図
DnaI
HolA
YneS
YphC
DnaC 1
RpsC
RpmA
DnaG
FolD
ProS
YmfL
YyaF
RplU
RelA
RplD
GatC
operon
Dxr
YtiA
RpsL
DapB
GatB
HepT
GyrB
DnaD
DapA
Exonuclease Ⅶ
FabG
BirA
MrpB
TrxA
GatA
operon
operon
GyrA
YtaG
YacN
operon
XseA
FabD
AccA
TrmU
tRNA
methyltransferase
DNA gyrase
分裂
operon
operon
BirA
DnaC
RpsD
RpsO
Rpm
GA
AccB
YrvO
AccB
operon
InfC
AccC
AccC
RplX
SecE
脂肪酸合成
RplJ
RpsD
RplP
RnpA
FtsZ
Div
IB
MrpB
RpsB
RplM
CspR
TrmD
MreB
CdsA
Div
IB
PgsA
MurB
operon
YqfP
翻訳因子
RpsR
TufA
YqeH
RpmI
HisS
TagH
Gmk
Prs
RplQ
Ddl
operon
RpsF
Tsf
RpsD
DapF
TagG
RpmF
DapD
MenB
MenC
operon
MenD
PyrG
HprT
Tmk
Gro
ES
RplS
MetK
PpnK
RacE
MurE
FbaA
Mbl
YacM
Div
IC
GrpE
YqfY
Era
ResA
Fig.8 枯草菌必須タンパク質間の独立した相互作用の地図
295×295 の一対一酵母２ハイブリット法により検出された相互作用のうち、再現性実
験で検出された相互作用のうち独立した相互作用を示した。Figure の説明文は Fig.7
と同じである。
33
3.3
検出された相互作用の評価
本研究の相互作用データの精度について検討するため、既知の相互作用情報を文献よ
り調べた。枯草菌で実証されている相互作用に加え、枯草菌以外のバクテリアで実証さ
れている相互作用についても調べ、検出された相互作用データと比較した(付録４)。な
お、リボソームタンパク質における既知の相互作用は、リボソーム RNA が結合した結
晶構造由来のものであり、タンパク質単独での相互作用を検出するという酵母２ハイブ
リット法の観点から、相互作用の評価に加えるにはふさわしくないと考え、比較対象か
らはずした。
その結果、本研究で調べたタンパク質間の相互作用（ダイマー等の自己会合を含む）
が 126 種報告されていることを見出したが、その 33%が本実験で検出されていた。ま
た、異なるタンパク質間の相互作用に限れば、既知 53 相互作用の内、24(44%) を検出
できており、個々のタンパク質の特性に合わせて条件設定をすることなく、同一の方法
でシステマチックに相互作用をスクリーニングしたことを考えると、有意の結果を得る
ことができたと評価できると思う。
Table 10 既知の相互作用の検出率
既知の相互作用のうち、本研究の酵母２ハイブリット解析により検出された相互作用の
検出率。カテゴリーによって異なる検出率を示した。
相互作用の種類
同じタンパク質同士
異なるタンパク質間
tRNA合成酵素
RNAポリメラーゼ
膜の脂質合成
複製系
総数
既知の相互作用 検出された相互作用
73
18
54
24
16
2
10
0
12
7
19
13
127
42
34
検出率
25%
44%
13%
0%
58%
68%
33%
本研究において検出されなかった相互作用（偽陰性）にはいくつかの点で傾向が見ら
れた (Table 10)。異なるタンパク質間の相互作用では検出率が 43%だったのに対し、
同じタンパク質同士では検出率が 25%であり、本研究の酵母２ハイブリット法では同
じタンパク質同士の相互作用は検出されにくいという傾向があった。
また、タンパク質のカテゴリーによって検出率が大きく異なった。顕著な例を挙げる
と、複製タンパク質や膜の脂質合成に関係するタンパク質では高い検出率であったが、
tRNA 合成酵素や RNA ポリメラーゼ複合体の検出率は極めて低かった。
また、特定のタンパク質の相互作用が全てもしくはほとんど検出されない例もある。
DnaN で予想されている４つの相互作用、翻訳開始因子間の相互作用、グルタミン
tRNA アミドトランスフェラーゼの複合体など既知の相互作用が全て検出されていな
い。
既知のタンパク質の相互作用を検出することが出来ない理由として、
①導入したタンパク質が酵母にとって有害になり、そのためにコロニーの生育が遅れた
②タンパク質の全長を用いた場合に相互作用が弱くなった
③相互作用していたとしても、相互作用部位との立体構造により AD ドメインが RNA
ポリメラーゼと相互作用することができない
⑤ タンパク質間の相互作用が元々弱いあるいは短時間しか相互作用しないためにレポ
ーター遺伝子の発現量が少なくない
など、そのタンパク質固有の原因があると考えられる。
その他の偽陰性の要因を挙げると、まず Auto-activation したタンパク質(Ssb,YpuH,
FtsW, Csd) はポジティブクローンとして扱っていないので、これらのタンパク質を
DNA binding domain との融合タンパク質としてスクリーニングした場合、偽陰性とな
る。また、膜タンパク質の場合、疎水性の膜結合ドメインの存在によりミスフォールデ
ィングが起こり、相互作用しないことがある。実際、膜タンパク質の SecA, SecE, SecY
35
に関しては、再現性良く検出された相互作用が無かった。しかし、今回は検出されなか
ったが、FtsL と DivIC のように疎水性領域を削らずに全長の配列を用いたことで初め
て相互作用が検出されることもあり (Sievers J and Erington J.,2000)、膜タンパク質
の相互作用が必ずしも検出されないとは言い切れない。また、本研究が Histidine 合成
遺伝子の活性の検出によりポジティブクローンを選択しているのに対して、Sievers と
Erington はβ-galactosidase 遺伝子の活性の検出によりポジティブクローンを選択し
ており、この違いが原因になっている可能性もある。選択の厳密さやプラスミドの構築
法など実験の条件により酵母２ハイブリット法の結果が異なることがあると考えられ
る。
36
3.4
新たなタンパク質間相互作用ネットワークの可能性
本研究の目的は必須タンパク質間の相互作用地図を作成することによって、細胞増殖
に必須なプロセス間のネットワークの解明を行うことである。細胞周期と厳密に同調し
ているプロセスとして染色体複製、染色体凝縮、細胞分裂がある。
バクテリアの染色体複製は複製起点当たりの細胞質量が一定の値（開始質量）に達し
たときに始まり、しかもその複製開始は２回以上連続して起きないように制御されてい
る。しかし、開始質量が複製開始を制御する機構は不明である(小椋 博士論文)。さら
に、染色体複製は、そのプロセスがほとんどあるいは完全に終了するまで細胞分裂の初
期に行われる Z-ring の形成が阻害されていることから、染色体複製と細胞分裂を同調
させる機構の存在が示唆されている (Harry EJ., 2000)。
また、
複製された染色体は Smc
複合体により凝縮されると考えられているが、その Smc 複合体の局在は複製装置に似
た動きをしている (Lindow JC.,2002)。この様に染色体複製、凝縮、細胞分裂は細胞周
期と厳密に同調しており、これらが協調して働く機構があり、その一担をタンパク質間
相互作用によるネットワークの関与が担っていると考えられる。
本研究の相互作用解析により検出された相互作用のうち、新規の相互作用は 158 種
類あり、全体の 78%を占めた。この新規の相互作用の中に染色体複製を中心とするプ
ロセス間のネットワークを制御する手がかりがあると考えられるが、本研究においても
いくつかの可能性が見出された。
3.4.1 染色体の複製に関与するタンパク質のネットワーク
複製系のタンパク質では、計 19 種類の既知の相互作用のうち、13 種類の相互作用が
確認された（Fig. 9）。本実験で見出されなかった 6 種の相互作用のうち、4 種は DnaN
が関与するものである。複製開始時に順に集合する複製開始因子（DnaA, PriA, DnaD,
37
DnaB）、DNA ヘリカーゼ（DnaC, DnaI）
、DNA プライマーゼ（DnaG）
、DNA ポリ
メラーゼ（PolC, DnaX, HolA, HolB）の各複合体とその間の相互作用が検出されてお
り、これらは過去の実験結果と一致する（Fig. 10）
。なお、枯草菌の HolA と HolB は、
大腸菌タンパク質との配列の類似性と枯草菌の増殖への必須性から同定されていたも
のであり、本研究の結果は、それをさらに裏付けるものである。さらに新規の相互作用
として、SssB と PriA・DnaB、DnaC と PolC、DnaX と DnaG が検出された。現在提
唱されている複製装置の各タンパク質の空間的配置のモデルを考えると(O’Donnell
Met al ,2001)、DnaC と PolC、DnaX と DnaG の相互作用は有り得る事であり、プラ
イモソームと DNA ポリメラーゼが 3 箇所で結合している可能性を示している。
Fig.9 染色体複製タンパク質の相互作用地図
Ssb
DnaA
PriA
既知及び予想された相互作用で本研究でも検出された相互
DnaD
作用を赤色、既知及び予想された相互作用であるが本研究で
は検出されなかった相互作用を黒色、新規の相互作用が青色
DnaB
で示している。
DnaG
DnaC
DnaI
DnaX
PolC
HolA
HolB
DnaN
38
(a)
(b)
(c)
ヘリカーゼ
（DnaC)
PriA
プライマーゼ
(DnaG)
PolⅢα
(PolC)
DnaA
PolⅢτ
(DnaX)
DnaD
DnaD
βクランプ
(DnaN)
DnaB
DnaB
PolⅢ δ’
（HolB)
PolⅢγ
(DnaX)
Ssb
PolⅢ δ
（HolA)
DnaC-DnaI
DnaC-DnaI
Fig. 10 染色体複製開始と伸長装置に関するモデル
(a) PriA から始まる複製開始因子の集合 (Marsin S et al.,2001)
(b) DnaA から始まる複製開始因子の集合 (Lemon K et al.,2002)
(c) 染色体複製の伸長 (O’Donnell M et al.,2001)
3.4.2 XseA が介するネットワーク
大腸菌において一本鎖 DNA を分解し、除去修復としての機能を持っている XseA
(Chase J.Q et al.,1977,1979) について、FtsA, YpuG, DnaC, RplC, SigA, GatA, GatC
との相互作用が検出された (Fig.7)。このタンパク質は大腸菌では必須でなく、なぜ、
修復酵素が枯草菌の増殖に必須に近いのか、その原因は不明である。したがって、XseA
が染色体複製に必須なヘリカーゼである DnaC、細胞分裂に必須な分裂環形成に関わる
FtsA (Wang X et al.,1997)、染色体凝縮を行う Smc 複合体のサブユニットである YpuG
(Mascarenhas J., 2002) に直接相互作用することは、この 3 つのプロセス間の同調機
構に XseA が関与している可能性を示しており、とても興味深い結果である。
39
3.4.3 YerQ のネットワークとその機能
脂質の合成に関与しているとされている YerQ について、DnaC と XseA との相互作
用が検出され、YerQ が複製機構に関係することが考えられ、この相互作用の意味をさ
らに詳しく考察した。
YerQ の機能を正確に推測するために BLAST により相同性検索を行った結果、YerQ
のホモログは広くバクテリアに保存されていたが、高い相同性を示すホモログの中に機
能がわかっているものは見出されなかった。しかし、真核生物では Sphingosine をリ
ン酸化する酵素である Human Sphingosine Kinase 1(hSK1) の N 末端側の領域で相同
性が見られ、さらに YerQ と hSK1 では LCB5 というモチーフが見出された (Fig.11)。
その他にも YerQ は真核生物の Diacylglycerol kinase (Dgk)や Lipid kinase との相同性
が見られた。また、hSK1 の YerQ と相同性が見られる N 末端領域にはリン酸化に必要
な ATP binding site が存在していた(Pitson SM et al.,2002)。以上のことから、
確かに、
YerQ は ATP によりリン酸化する lipid kinase としての役割をもっていることが推測さ
れた。
一方、枯草菌において Ca2+依存性 protein kinase (PKC)の inhibitor として働く
Sphingosine が DNA 複製の開始を阻害し、PKC の activator である 12-tetradecanoyl
13-phorbol acetate (TPA)が、その阻害を部分的に抑制すると報告されている(Sandler
N et al.,1992)、また、複製開始時にタンパク質のリン酸化が観察され、Shingosin、TPA
がそのリン酸化に影響を与えていることも報告されている(Sandler N et al.,1992)。
以上のことから、相同性検索で推測した様に YerQ が Sphingosine kinase の機能を
有するとすれば、YerQ は DNA 複製を阻害する sphingosine をリン酸化することで染
色体複製開始を促す機能があることが示唆された。
40
C末端
N末端
0
100
300amino acid
200
ATP binding domain
hSK1
25%のIdentity
YerQ
DAGKc
全体で相同性が見られる
LCB5 motif
Fig.11 YerQ の相同性検索
DAGKc は diacylglycerol kinase C の相同性検索から、その活性中心であると予想されている
motif であり、LCB5 は COGS(Clusters of Orthologus Groups of Proteins,NCBI)により同定
された motif で、真核生物の Sphingosine kinase と acylglycerol kinase に関係のある motif
であると考えられている。
3.4.4 その他の興味深い相互作用
その他の興味深い相互作用として、様々なリボソームタンパク質と各種のカテゴリー
に属するタンパク質との特異的な相互作用が多数見出された。リボソーム複合体あるい
は単独のリボソームタンパク質が、各種の酵素活性を調整する可能性を示しているのか
もしれない。
また、枯草菌に 8 種存在する機能未知の GTP 結合タンパク質についても、6 種のも
のについて相互作用が検出された（YphC, YnbA, YyaF, ThdF, YqeH, Era）
。また、そ
の他の機能未知必須遺伝子、YlaN, YneS, YdiB, YdiC, YkzG, YkqC と種々の機能既知
タンパク質の相互作用も見出した。
これらの相互作用は他の解析方法を用いて検証する必要があるが、これらのタンパク
質についてそれぞれ発現・精製した後、in vitro での酵素活性の測定を行って、酵素活
性に機能未知タンパク質がどのような影響を及ぼすかを解析すれば、機能の解明に役立
つことが期待される。
41
3.5 蛍光顕微鏡による YFP 融合タンパク質の局在観察
本研究で、酵母２ハイブリット解析により作成された相互作用ネットワーク地図の
中から、染色体複製を中心として細胞増殖に必須なプロセスを繋げる新たな相互作用
の可能性がいくつか見出された。このネットワークの解析をさらに進めるため、複製
タンパク質を中心にネットワークを形成しているタンパク質 (Table 11)に焦点を絞り、
YFP 融合タンパク質として枯草菌内で発現させて蛍光顕微鏡によりその局在を観察
することにした。
Table 11 YFP 融合タンパク質として局在を観察したタンパク質
DnaA
DnaB
DnaC
DnaD
DnaE
DnaG
DnaI
DnaX
PolC
PriA
Ssb
HolA
HolB
YerQ
Smc
YpuG
YpuH
SigA
Rnc
CspR
RnpA
DapA
DapB
SecE
XseA
XseB
GlyS
YlaG
ThdF YdiB
GcaD YkqC
OdhB FtsA
YpfD
TrxA
TrmD
YtaG
Gateway system を用いて、新たに構築したベクターを使って、spac プロモーター
により、目的タンパク質を YFP との融合タンパク質として発現できるプラスミドを作
製し、相同組み換えにより、枯草菌 168 株染色体の aprE 領域上に導入した。こうし
て作製した YFP 融合タンパク質発現制御株に、IPTG を添加することにより、spac
プロモーターの下流に置いた遺伝子を人為的に発現させ、蛍光顕微鏡を用いて YFP 融
合タンパク質の局在観察を行った。局在が見えたものに関しては、DAPI の添加によ
り、核様体の観察も行った。
計 38 のタンパク質の局在を観察して、18 のタンパク質について局在が観察された。
局在にはいくつかのパターンが見られたが、(a) 染色体上に foci として局在するもの、
42
(b) 染色体上の一面に分布するもの、(c) 染色体を避けるように分布するもの、 (d)分裂
隔壁に局在するもの、4 つに分類することができた(Table 12、付録 5)。
Table 12 4 つに分類されたタンパク質の局在とその機能
SubtiList
DnaA
DnaE
DnaG
DnaX
Ssb
PriA
HolA
HolB
PolC
YpuG
YpuH
Smc
染色体上の一面に分布
SigA
染色体を避けるように分布 OdhB
YkqC
YerQ
YpfD
分裂隔壁に局在
FtsA
局在
染色体上にfociとして局在
function
Category
DNA replication
initiation of chromosome replication
DNA replication
DNA polymerase III (alpha subunit)
DNA replication
DNA primase
DNA replication
DNA polymerase III (gamma and tau subunits)
DNA replication
single-strand DNA-binding protein
DNA replication
primosomal replication factor Y
DNA replication
DNA polymerase III (delta subunit)
DNA replication
DNA polymerase III (delta' subunit)
DNA replication
DNA polymerase III (alpha subunit)
DNA packaging
SMC interacting protein
DNA packaging
SMC interacting protein
DNA packaging
chromosome condensation and segregation SMC
transcription
RNA polymerase major sigma factor
unknown
2-oxoglutarate dehydrogenase
unknown
similar to unknown proteins
phospholipids biosynthesis putative kinase related to diacylglycerol kinase
similar to ribosomal protein S1 homolog
unknown
cell division
cell-division protein (septum formation)
DnaA 以外の染色体複製開始タンパク質、染色体複製装置、Smc 複合体は、細胞周期
の進行にしたがって、核様体内の特定の位置に局在することが知られている。そうした
タンパク質については、今回の解析でも、多くの場合、DAPI で染色された領域に、foci
が観察された。その中には、従来解析されていなかった、DnaG, HolA, HolB, PriA も
含まれる。また、分裂隔壁に局在することが知られている FtsA についても、DAPI で
染色された領域を挟んだ箇所に局在が観察された。今回、多くのタンパク質について効
率的に解析を進めるために、野生型遺伝子の存在下で、YFP 融合タンパク質を異所的
に発現させ、その局在を解析したが、多くの場合、正しい局在を観察できたと言える。
一方、DnaA は細胞質に一様に分布すること、一方、DnaC, DnaB は核様体に局在する
ことが報告されており、今回の結果は異なっていた。
SigA については、転写が活発な細胞では、核様体に foci として観察されることが知
られており、今回の結果はそれと一致する。また、可溶性の酵素と考えられる、OdhB、
43
YkqC（metallo-beta-lactamase ファミリー）
、YpfD（大腸菌等の S1 リボゾームタンパ
ク質のホモログ）
、YerQ（脂質合成タンパク質）は、核様体以外の部分に存在した。
今回の実験では、酵母２ハイブリット解析での結果を検証するような局在を観察でき
ることを期待したが、残念ながら、YerQ と複製装置の相互作用や XseA と複製装置、
Smc 複合体、細胞分裂装置の相互作用を示すような結果を得ることはできなかった。
YerQ や XseA の一部のみが相互作用をしていることも考えられ、今回の結果は複製装
置との相互作用を否定するものではない。
今後、今回構築した系を用いて、より多数のタンパク質の細胞内局在を解析していけ
ば、興味深い結果が得られることが期待される。
44
3.6 今後の展望
本研究では細胞増殖に必須な各プロセス間の協調を行う分子機構を解明するために、
枯草菌必須タンパク質間の相互作用を酵母２ハイブリット法によって解析し、仮説のネ
ットワークを提供した。酵母２ハイブリットから得られる相互作用データには様々な要
因により偽陰性や偽陽性が生じるため、これを減らすコンストラクトの確立と検出され
た相互作用の検討が不可欠であった。本研究で構築したコンストラクトでの酵母２ハイ
ブリット解析では計 196 の相互作用が検出され、
そのうち 41 が既知の相互作用であり、
既知の相互作用の検出率は 33%であった。新規の相互作用の中には染色体複製や染色
体凝縮、細胞分裂などのプロセス間の協調を行う可能性を持った相互作用を見出すこと
ができた。さらに、YFP 融合発現制御株によるタンパク質の局在の観察では、プロセ
ス間の協調を行う相互作用を支持するような結果を得ることは出来なかった。
しかし、3.5 で述べたような方法でタンパク質の局在を観察した場合には、タンパク
質の発現量、本来の機能を保持しているか等の要素を考慮して、局在が不明であったも
のも含めてより詳細に解析していく必要がある。また、酵母２ハイブリット法は分子機
構の解明を目指したスクリーニングの最初の手段に過ぎない。3.1 で述べたように酵母
２ハイブリット法により検出された相互作用には偽陽性と偽陰性を含む可能性がある。
さらに解析を進めるためには in vivo での複合体解析、FRET などより直接的な手法
を用いて、枯草菌の細胞内で実際に意味のある相互作用を同定することが必須である。
もし、そのような相互作用が決定出来れば、酵母２ハイブリット法を用いた相互作用領
域の同定や相互作用しない mutant の選出、枯草菌内でのその mutant の影響などの応
用も考えられネットワークの意味がより明確になることが期待される。
45
4.参考文献
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58
５
謝辞
本研究を遂行するにあたり、小笠原直毅教授には適切な御指導を頂き、また素晴らしい
環境の下で研究させて頂いたことに感謝致します。
石川周助手には終始、あらゆる面で御指導、御助力を頂き深く感謝致します。
システム細胞学講座の皆さんの日頃からの励ましやサポートにより、充実した研究生活
を送れたことを感謝致します。ここまで支援してくれた両親に感謝します。
59
付録 1 本研究で用いた枯草菌必須遺伝子を含む遺伝子
必須遺伝子
SubtiList
Category
dnaA
DNA metabolism
function
DNA replication
dnaB
DNA replication
dnaC
dnaD
dnaE
dnaG
dnaI
dnaN
dnaX
holA
holB
ligA
pcrA
polC
priA
ssb
gyrA
gyrB
hbs
parC
parE
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
smc
DNA packaging
topA
ypuG
ypuH
ydiO
ydiP
rpoA
rpoB
rpoC
sigA
cca
cspR
rnc
rnpA
trmD
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DNA methylation
DNA methylation
transcription
transcription
transcription
transcription
RNA modification
RNA modification
RNA modification
RNA modification
RNA modification
RNA metabolism
trmU
RNA modification
yycF
yycG
yhdL
nusA
rplA
rplB
rplC
rplD
rplE
rplF
rplI
rplJ
rplL
rplM
rplN
rplO
rplP
rplQ
rplR
rplS
transcription
transcription
transcription
transcription
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
Protein synthesis
initiation of chromosome replication
initiation of chromosome replication / membrane
attachment protein
replicative DNA helicase
initiation of chromosome replication
DNA polymerase III (alpha subunit)
DNA primase
primosome component (helicase loader)
DNA polymerase III (beta subunit)
DNA polymerase III (gamma and tau subunits)
DNA polymerase III (delta subunit)
DNA polymerase III (delta' subunit)
DNA ligase (NAD-dependent)
ATP-dependent DNA helicase
DNA polymerase III (alpha subunit)
primosomal replication factor Y
single-strand DNA-binding protein
DNA gyrase (subunit A)
DNA gyrase (subunit B)
non-specific DNA-binding protein HBsu
subunit of DNA topoisomerase IV
subunit of DNA topoisomerase IV
chromosome condensation and
segregation SMC protein
DNA topoisomerase I
SMC interacting protein
SMC interacting protein
DNA-methyltransferase (cytosine-specific)
DNA-methyltransferase (cytosine-specific)
RNA polymerase (alpha subunit)
RNA polymerase (beta subunit)
RNA polymerase (beta' subunit)
RNA polymerase major sigma factor
tRNA nucleotidyltransferase
pobable rRNA methylase
ribonuclease III
protein component of ribonuclease P (RNase P)
probable tRNA (Guanine-N(1)-)probable tRNA (5-methylaminomethyl-2thiouridylate) methyltransferase
two-component response regulator
two-component sensor histidine kinase
possible anti-SigM protein
transcription translation coupling
ribosomal protein L1 (BL1)
ribosomal protein L2 (BL2)
ribosomal protein L3 (BL3)
ribosomal protein L4
ribosomal protein L5 (BL6)
ribosomal protein L6 (BL8)
ribosomal protein L9
ribosomal protein L10 (BL5)
ribosomal protein L12 (BL9)
ribosomal protein L13
ribosomal protein L14
ribosomal protein L15
ribosomal protein L16
ribosomal protein L17 (BL15)
ribosomal protein L18
ribosomal protein L19
1
付録 1 本研究で用いた枯草菌必須遺伝子を含む遺伝子
SubtiList
function
Category
rplT
rplU
rplV
rplW
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
rplX
ribosoma lprotein
rpmA
rpmB
rpmC
rpmD
rpmE
rpmF
rpmGA
rpmGB
rpmH
rpmI
rpmJ
rpsB
rpsC
rpsD
rpsE
rpsF
rpsG
rpsH
rpsI
rpsJ
rpsK
rpsL
rpsM
rpsN
rpsO
rpsP
rpsQ
rpsR
rpsS
rpsT
rpsU
alaS
argS
asnS
aspS
cysS
gltX
glyQ
glyS
hisS
ileS
leuS
lysS
metS
pheS
pheT
proS
serS
trpS
tyrS
valS
gatA
gatB
gatC
frr
fusA
infA
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
translation
translation
translation
ribosomal protein L20
ribosomal protein L21 (BL20)
ribosomal protein L22 (BL17)
ribosomal protein L23
ribosomal protein L24 (BL23)
(histone-like protein HPB12)
ribosomal protein L27 (BL24)
ribosomal protein L28
ribosomal protein L29
ribosomal protein L30 (BL27)
ribosomal protein L31
ribosomal protein L32
possible ribosomal protein L33
ribosomal protein L33
ribosomal protein L34
ribosomal protein L35
ribosomal protein L36 (ribosomal protein B)
ribosomal protein S2
ribosomal protein S3 (BS3)
ribosomal protein S4 (BS4)
ribosomal protein S5
ribosomal protein S6 (BS9)
ribosomal protein S7 (BS7)
ribosomal protein S8 (BS8)
ribosomal protein S9
ribosomal protein S10 (BS13)
ribosomal protein S11 (BS11)
ribosomal protein S12 (BS12)
ribosomal protein S13
ribosomal protein S14
ribosomal protein S15 (BS18)
ribosomal protein S16 (BS17)
ribosomal protein S17 (BS16)
ribosomal protein S18
ribosomal protein S19 (BS19)
ribosomal protein S20 (BS20)
ribosomal protein S21
alanyl-tRNA synthetase
arginyl-tRNA synthetase
asparaginyl-tRNA synthetase
aspartyl-tRNA synthetase
cysteinyl-tRNA synthetase
glutamyl-tRNA synthetase
glycyl-tRNA synthetase (alpha subunit)
glycyl-tRNA synthetase (beta subunit)
histidyl-tRNA synthetase
isoleucyl-tRNA synthetase
leucyl-tRNA synthetase
lysyl-tRNA synthetase
methionyl-tRNA synthetase
phenylalanyl-tRNA synthetase (alpha subunit)
phenylalanyl-tRNA synthetase (beta subunit)
prolyl-tRNA synthetase
seryl-tRNA synthetase
tryptophanyl-tRNA synthetase
tyrosyl-tRNA synthetase (major)
valyl-tRNA synthetase
glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase (subunit
glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase (subunit
glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase (subunit
ribosome recycling factor
elongation factor G
initiation factor IF-1
2
付録 1 本研究で用いた枯草菌必須遺伝子を含む遺伝子
SubtiList
infB
infC
prfA
prfB
tsf
tufA
spoVC
groEL
groES
map
ffh
ftsY
translation
translation
translation
translation
translation
translation
RNA modification
protein folding
protein folding
protein modification
secretion
secretion
prsA
secA
secE
secY
accA
accB
accC
accD
acpA
acpS
birA
fabD
fabF
fabG
cdsA
gpsA
pgsA
yhdO
yerQ
plsX
gcaD
glmS
ybbT
yvyH
asd
dapA
dapB
dapF
ykuQ
ykuR
alr
ddl
racE
mraY
murAA
murB
murC
murD
murE
murF
function
Category
Cell envelope
initiation factor IF-2
initiation factor IF-3
peptide chain release factor 1
peptide chain release factor 2
elongation factor Ts
elongation factor Tu
peptidyl-tRNA hydrolase
class I heat-shock protein (chaperonin)
class I heat-shock protein (chaperonin)
methionine aminopeptidase
signal recognition particle-like (SRP) component
signal recognition particle
protein secretion (post-translocation molecular
secretion
chaperone)
secretion
preprotein translocase subunit (ATPase)
secretion
preprotein translocase subunit
secretion
preprotein translocase subunit
fatty acid biosynthesis
acetyl-CoA carboxylase (alpha subunit)
acetyl-CoA carboxylase (biotin carboxyl carrier
fatty acid biosynthesis
subunit)
fatty acid biosynthesis
acetyl-CoA carboxylase (biotin carboxylase
fatty acid biosynthesis
acetyl-CoA carboxylase (beta subunit)
fatty acid biosynthesis
acyl carrier protein
fatty acid biosynthesis
holo-acyl carrier protein synthase
transcriptional repressor of the biotin operon /
fatty acid biosynthesis
biotin acetyl-CoA-carboxylase synthetase
fatty acid biosynthesis
malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase
fatty acid biosynthesis
beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase II
fatty acid biosynthesis
beta-ketoacyl-acyl carrier protein reductase
phospholipids biosynthesis phosphatidate cytidylyltransferase
NAD(P)H-dependent glycerol-3-phosphate
phospholipids biosynthesis
dehydrogenase
phospholipids biosynthesis phosphatidylglycerophosphate synthase
phospholipids biosynthesis 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase
phospholipids biosynthesis putative kinase related to diacylglycerol kinase
fatty acid biosynthesis
involved in fatty acid/phospholipid synthesis
aminosugar metabolism
UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase
L-glutamine-D-fructose-6-phosphate
aminosugar metabolism
amidotransferase
aminosugar metabolism
phosphoglucomutase (gluconeogenesis)
aminosugar metabolism
UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase
diaminopimelate biosynthesis
aspartate-semialdehyde dehydrogenase
diaminopimelate biosynthesis
dihydrodipicolinate synthase
diaminopimelate biosynthesis
dihydrodipicolinate reductase
diaminopimelate biosynthesis
diaminopimelate epimerase
diaminopimelate biosynthesis
tetrahydrodipicolinate succinylase
diaminopimelate biosynthesis
similar to deacetylases
peptidoglycan biosynthesis D-alanine racemase
peptidoglycan biosynthesis D-alanyl-D-alanine ligase A
peptidoglycan biosynthesis glutamate racemase
phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide
peptidoglycan biosynthesis
transferase
UDP-N-acetylglucosamine 1peptidoglycan biosynthesis
carboxyvinyltransferase
peptidoglycan biosynthesis UDP-N-acetylenolpyruvoylglucosamine reductase
peptidoglycan biosynthesis UDP-N-acetylmuramate-alanine ligase
peptidoglycan biosynthesis UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamate
UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamate-2,6peptidoglycan biosynthesis
diaminopimelate ligase
UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6peptidoglycan biosynthesis
diaminopimelate-D-alanyl-D-alanine ligase
3
付録 1 本研究で用いた枯草菌必須遺伝子を含む遺伝子
SubtiList
murG
tagA
tagB
tagD
tagF
tagG
tagH
tagO
divIB
divIC
ftsA
ftsL
ftsW
ftsZ
pbpB
rodA
mreB
mreC
eno
fbaA
pfkA
pgk
pgm
prs
tkt
tpiA
dxr
dxs
ispE
yacM
yacN
yqfP
yqfY
yqiD
hepS
hepT
menA
menB
menC
menD
menE
menH
resA
resB
resC
trxA
trxB
yumC
adk
gmk
guaB
hprT
function
Category
UDP-N-acetylglucosamine-N-acetylmuramylpeptidoglycan biosynthesis (pentapeptide)pyrophosphoryl-undecaprenol Nacetylglucosamine transferase
involved in polyglycerol phosphate teichoic acid
teichoic acid biosynthesis
biosynthesis
involved in polyglycerol phosphate teichoic acid
teichoic acid biosynthesis
biosynthesis
teichoic acid biosynthesis glycerol-3-phosphate cytidylyltransferase
CDP-glycerol:polyglycerol phosphate glyceroteichoic acid biosynthesis
phosphotransferase
teichoic acid biosynthesis teichoic acid translocation (permease)
teichoic acid biosynthesis teichoic acid translocation (ATP-binding protein)
teichoic acid biosynthesis teichoic acid linkage unit synthesis
Cell shape and division cell division
cell-division initiation protein (septum formation)
cell division
cell-division initiation protein (septum formation)
cell division
cell-division protein (septum formation)
cell division
cell-division protein (septum formation)
cell division
cell-division protein
cell division
cell-division initiation protein (septum formation)
cell division
penicillin-binding protein 2B (cell-division
cell division
control of cell shape and elongation
cell shape
cell-shape determining protein
cell shape
cell-shape determining protein
Glycolysis
glycolysis
enolase
glycolysis
fructose-1,6-bisphosphate aldolase
glycolysis
6-phosphofructokinase
glycolysis
phosphoglycerate kinase
glycolysis
phosphoglycerate mutase
glycolysis
phosphoribosylpyrophosphate synthetase
glycolysis
transketolase
glycolysis
triose phosphate isomerase
Respiratory pathways isoprenoid biosynthesis
1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate
isoprenoid biosynthesis
1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase
isoprenoid biosynthesis
4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol
2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate
isoprenoid biosynthesis
cytidylyltransferase
2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate
isoprenoid biosynthesis
synthase
isoprenoid biosynthesis
isopentenyl diphosphate biosynthesis
1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate
isoprenoid biosynthesis
synthase
isoprenoid biosynthesis
geranyltranstransferase
menaquinone biosynthesis heptaprenyl diphosphate synthase component I
menaquinone biosynthesis heptaprenyl diphosphate synthase component II
menaquinone biosynthesis 1,4-dihydroxy-2-naphthoate
menaquinone biosynthesis dihydroxynapthoic acid synthetase
menaquinone biosynthesis O-succinylbenzoate-CoA synthase
2-succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1menaquinone biosynthesis
carboxylate synthase / 2-oxoglutarate
menaquinone biosynthesis O-succinylbenzoic acid-CoA ligase
menaquinone biosynthesis menaquinone biosynthesis methyltransferase
cytochrome c synthesis
cytochrome c biogenesis protein
cytochrome c synthesis
cytochrome c biogenesis protein
cytochrome c synthesis
cytochrome c biogenesis protein
thioredoxin
thioredoxin
thioredoxin
thioredoxin reductase
unknown
similar to thioredoxin reductase
Nucleic acid bases
purine biosynthesis
adenylate kinase
purine biosynthesis
guanylate kinase
purine biosynthesis
inosine-monophosphate dehydrogenase
purine biosynthesis
hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
4
付録 1 本研究で用いた枯草菌必須遺伝子を含む遺伝子
SubtiList
nrdE
nrdF
ymaA
cmk
pyrG
tmk
ytaG
dfrA
Cofactors
folD
glyA
fmt
nadE
ppnK
yqeJ
yueK
metK
csd
yurU
yurV
yurX
yurY
yrvO
mrpA
Other
mrpB
mrpC
mrpD
mrpF
ppaC
era
obg
ylqF
yphC
yqeH
ysxC
gcp
odhB
pdhA
ydiC
yneS
ymdA
yloQ
ywlC
yacA
ydiB
ykzG
ylaN
yqjK
yqeI
function
Category
Unknown
ribonucleoside-diphosphate reductase (major
purine/pyrimidine biosynthesis
subunit)
ribonucleoside-diphosphate reductase (minor
purine/pyrimidine biosynthesis
subunit)
purine/pyrimidine biosynthesis
ribonucleoside-diphosphate reductase subunit
pyrimidine biosynthesis
cytidylate kinase
pyrimidine biosynthesis
CTP synthetase
pyrimidine biosynthesis
thymidylate kinase
CoA biosynthesis
desphospho-CoenzymeA kinase
folate
dihydrofolate reductase
methylenetetrahydrofolate dehydrogenase /
folate
methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase
folate
serine hydroxymethyltransferase
folate
methionyl-tRNA formyltransferase
NAD biosynthesis
NH3-dependent NAD+ synthetase
NAD biosynthesis
inorganic polyphosphate/ATP-NAD kinase
NAD biosynthesis
nicotinate-nucleotide adenylyltransferase
NAD biosynthesis
nicotinate phosphoribosyltransferase
SAM
S-adenosylmethionine synthetase
Fe-sulfate cluster
cysteine desulfurase - NifS homolog
Fe-sulfate cluster
Synthesis of iron sulfur clusters - NifZ homolog
Fe-sulfate cluster
Synthesis of iron sulfur clusters - NifU homolog
Fe-sulfate cluster
Synthesis of iron sulfur clusters - NifZ homolog
Synthesis of iron sulfur clusters - ABC
Fe-sulfate cluster
transporter (ATP-binding protein)
unknown
NifS protein homolog
multiple resistance and pH homeostasis (Na+/H+
Na/H transporter
antiporter)
Na/H transporter
multiple resistance and pH homeostasis
Na/H transporter
multiple resistance and pH homeostasis
Na/H transporter
multiple resistance and pH homeostasis
Na/H transporter
multiple resistance and pH homeostasis
unknown
inorganic pyrophosphatase
GTP-binding
GTP-binding protein
GTP-binding
GTP-binding protein
GTP-binding
GTP-binding protein
GTP-binding
GTP-binding protein
GTP-binding
GTP-binding protein
GTP-binding
GTP-binding protein
unknown
probable O-sialoglycoprotein endopeptidase
2-oxoglutarate dehydrogenase (dihydrolipoamide
unknown
transsuccinylase, E2 subunit)
pyruvate dehydrogenase E1 component, alpha
unknown
subunit
unknown
probable protease
unknown
conserved membrane protein
conserved protein with HD domain of metalunknown
dependent phosphohydrolase
unknown
conserved protein with ATP/GTP-binding site
conserved protein with a putative RNA binding
unknown
motif
unknown
conserved protein
unknown
conserved protein
unknown
conserved protein
unknown
conserved protein
similar to unknown proteins
unknown
unknown
conserved protein
5
付録 1 本研究で用いた枯草菌必須遺伝子を含む遺伝子
非必須遺伝子
SubtiList
Category
XseA
XseB
ykqC
mbl
mreD
bkdR
grpE
ymfL
ymfM
efp
dnaK
tig
rplK
ctc
ybxF
yhzA
ylxQ
ytiA
ypfD
relA
lepA
ylaG
thdF
ynbA
yyaF
DNA metabolism
function
DNA replication
DNA replication
Unknown
unknown
Cell shape and division Cell shape and division
Cell shape and division
RNA metabolism
Protein synthesis
unknown
unknown
Protein synthesis
chaperon
chaperon
ribosoma lprotein
ribosoma lprotein
unknown
unknown
unknown
unknown
unknown
Other
GTP-binding
unknown
unknown
unknown
6
probable exodeoxyribonuclease VII (large
probable exodeoxyribonuclease VII (small
similar to unknown proteins
MreB-like protein
cell-shape determining protein
heat-shock protein (activation of DnaK)
similar to unknown proteins
similar to unknown proteins from B. subtilis
elongation factor P
class I heat-shock protein (molecular chaperone)
trigger factor (prolyl isomerase)
ribosomal protein L11 (BL11)
general stress protein
similar to ribosomal protein L7AE family
similar to ribosomal protein S14
similar to ribosomal protein L7AE family
similar to ribosomal protein
similar to ribosomal protein S1 homolog
GTP pyrophosphokinase (stringent response)
GTP-binding protein
similar to GTP-binding elongation factor
thiophen and furan oxidation
similar to GTP-binding protein protease modulator
similar to GTP-binding protein
付録 2
Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
1st PCR用*
dnaA-gwF
dnaC-gwF
dnaD-gwF
dnaI-gwF
ileS-gwF
valS-gwF
alaS-gwF
secA-gwF
gyrA-gwF
parC-gwF
priA-gwF
leuS-gwF
pheT-gwF
mrpA-gwF
pcrA-gwF
relA-gwF
pbpB-gwF
infB-gwF
nrdE-gwF
bkdR-gwF
fusA-gwF
topA-gwF
glyS-gwF
ligA-gwF
tkt-gwF
metS-gwF
parE-gwF
gyrB-gwF
dxs-gwF
lepA-gwF
ylaG-gwF
yycG-gwF
dnaK-gwF
dnaG-gwF
glmS-gwF
aspS-gwF
menD-gwF
proS-gwF
dnaX-gwF
argS-gwF
groEL-gwF
resB-gwF
pyrG-gwF
ymdA-gwF
pgm-gwF
lysS-gwF
murE-gwF
mrpD-gwF
yueK-gwF
guaB-gwF
menE-gwF
gatA-gwF
tagB-gwF
gltX-gwF
gatB-gwF
dnaB-gwF
配列(5'→3')
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCG ATGGAAAATATATTAGACCTG
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCG ATGACAGACCTTCTGAATG
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCG ATGAAAAAACAGCAATTTATTG
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCG ATGGAACCAATCGGCCGT
AAAAAGCAGGCTCG ATGGATTTTAAAGACACGCTC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAAACGAATGAACAAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAACACTTAACTTCTGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCTTGGAATTTTAAATAAAAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGTGAACAAAACACACC
AAAAAGCAGGCTCG TTGTCACAGCCAGAATTATT
AAAAAGCAGGCTCG ATGAATTTTGCAGAAGTCATC
AAAAAGCAGGCTCG TTGAGTTTTCAGCACAAAGAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTTGTTTCTTATAAATGGT
AAAAAGCAGGCTCG GTGCATACGGGCTGGTTTGT
AAAAAGCAGGCTCG TTGAATTATATTAGCAATCAATT
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCGAACGAACAAGTATTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGATTCAAATGCCAAAAAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTAAAATGAGAGTATAC
AAAAAGCAGGCTCG TTGTCACAAAATCAAGTGCC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCAAAAGGTACTGATAGT
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCAAGAGAGTTCTCC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCTGATTATCTAGTCATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGTAAACAGGATTTACTT
AAAAAGCAGGCTCG ATGGACAAAGAAACAGCGA
AAAAAGCAGGCTCG ATGGATACAATTGAAAAGAAATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCGCAAGAAAACAATAC
AAAAAGCAGGCTCG TTGGCTAGAAAACAGCAATT
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAACAGCAGCAAAACAG
AAAAAGCAGGCTCG TTGGATCTTTTATCAATACAG
AAAAAGCAGGCTCG GTGACAGATAAAGAAAAGCG
AAAAAGCAGGCTCG GTGAAACTTCGAAATGATCTTC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAATAAGGTTGGTTTTTTTC
AAAAAGCAGGCTCG GTGAGTAAAGTTATCGGAATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGGAAATCGGATACCAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTGTGGAATCGTAGGTTA
AAAAAGCAGGCTCG TTGTTTGGAAGAACATATTATTG
AAAAAGCAGGCTCG TTGACAGTCAACCCGATTAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGACAAAGCTTGACGC
AAAAAGCAGGCTCG GTGAGTTACCAAGCTTTATA
AAAAAGCAGGCTCG ATGAACATTGCGGAACAAATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCAAAAGAAATTAAGTTTAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAGCAAGTCAAATGTGAATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGACGAAATATATTTTTGTAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGACCCCAATTATGATGGT
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGTAAAAAACCAGCTGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGTCAAGAAGAGCATAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAACTTACAAAGCTGCT
AAAAAGCAGGCTCG ATGAATAATTTTGTTATTTTGGC
AAAAAGCAGGCTCG GTGTTAGAGTACGGATTTAA
AAAAAGCAGGCTCG ATGTGGGAAAGTAAATTTTCA
AAAAAGCAGGCTCG ATGCTGACAGAACAGCCC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCATTATTTGATCATAAAATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAATAAGATCACTACTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGGAAACGAAGTACGC
AAAAAGCAGGCTCG TTGAACTTTGAAACGGTAATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTGACTATTGGAAAG
7
付録 2
Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
dnaB-gwF
yacA-gwF
cysS-gwF
yurU-gwF
thdF-gwF
murF-gwF
gcaD-gwF
murD-gwF
accC-gwF
yqiB-gwF
ybbT-gwF
ffh-gwF
ftsA-gwF
yurX-gwF
murAA-gwF
murC-gwF
secY-gwF
eno-gwF
asnS-gwF
ydiO-gwF
serS-gwF
hisS-gwF
tig-gwF
rplK-gwF
yrvO-gwF
tyrS-gwF
odhB-gwF
glyA-gwF
fabF-gwF
csd-gwF
ftsW-gwF
metK-gwF
tagH-gwF
cca-gwF
tufA-gwF
pgk-gwF
rodA-gwF
alr-gwF
ydiP-gwF
dxr-gwF
ftsZ-gwF
yvyH-gwF
dnaN-gwF
yqfY-gwF
trmU-gwF
ykuR-gwF
menC-gwF
nusA-gwF
sigA-gwF
yyaF-gwF
murG-gwF
tagO-gwF
yhdL-gwF
prfA-gwF
ddl-gwF
resC-gwF
hepT-gwF
配列(5'→3')
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTGACTATTGGAAAG
AAAAAGCAGGCTCG GTGAAAAGTGTCAAAGATTTTTT
AAAAAGCAGGCTCG ATGACAATCACACTTTATAATAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTAAAAAAATGCCTGA
AAAAAGCAGGCTCG ATGGATACAATTGCGGCAAT
AAAAAGCAGGCTCG TTGATTAAGCGAACAGTAAAA
AAAAAGCAGGCTCG ATGGATAAGCGGTTTGCAG
AAAAAGCAGGCTCG GTGGAAAATGATCAATTTTTAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGATTAAAAAGCTATTGATCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGGTGAAGCAGCGTATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGGCAAGTATTTTGGAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCATTTGAAGGATTAGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAACAACAATGAACTTTAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGACACTAGGTACAAAACT
AAAAAGCAGGCTCG TTGGAAAAAATCATCGTCCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGACTGTTTATCATTTTGTTG
AAAAAGCAGGCTCG TTGTTTAAAACAATCTCCAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCATACATTGTTGATGT
AAAAAGCAGGCTCG TTGAAAACAACAATCAACCAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGACAAATTTTATTTTAAATGAAAAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGCTTGATACGAAAATGCTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGGATATAACATTCCGAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCTGTAAAATGGGAAAAAC
AAAAAGCAGGCTCG GTGGCTAAAAAAGTAGTTAAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAACGGATTTATTTAGATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGACTAACTTACTTGAAGAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCGGAAATTAAGGTACC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAACATTTACCTGCGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGACTAAAAAAAGAGTAGTTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAATATCACAGATATTCGTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTAAAAAAAATGCTAAAATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGTAAAAATCGTCGTTTA
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAACTAAAAGTTTCGTTTC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAAAAAGTTTTTATCAAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTAAAGAAAAATTCGAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAATAAAAAAACTCTCAAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGTCGATATAAGAAACAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGCACAAAACCTTTTTAC
AAAAAGCAGGCTCG TTGAAAGTTGTTAGTTTATTCTCC
AAAAAGCAGGCTCG TTGAAAAATATTTGTCTTTTAGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTGGAGTTCGAAACAAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAAAACTAAAAGTGATGAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAATTCACGATTCAAAAAG
AAAAAGCAGGCTCG TTGCAAGTGAGTGAAATCAC
AAAAAGCAGGCTCG GTGAATGAAATGGAAAAACG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAGATAGAGGAGCTCATCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGATCGAAATAGAAAAAATCAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGCAGTGAATTATTAGATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTGATAAACAAACCC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTTTAACAGCTGGAAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGCGAATTGCAATAAGCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCTTGACGAACGCATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGATGAATGAAGAATTTAAAAAG
AAAAAGCAGGCTCG GTGTTAGACCGTTTAAAATC
AAAAAGCAGGCTCG GTGTACGGAGGAAAGTCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGGCCAACATTGGAATCA
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTAAATATCATTCGTTTAC
8
付録 2
Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
yqeN-gwF
asd-gwF
gcp-gwF
ywlC-gwF
gpsA-gwF
pheS-gwF
mreB-gwF
ynbA-gwF
mbl-gwF
plsX-gwF
yumC-gwF
trpS-gwF
holB-gwF
nrdF-gwF
ftsY-gwF
accA-gwF
birA-gwF
mraY-gwF
pfkA-gwF
fabD-gwF
prs-gwF
fmt-gwF
trxA-gwF
yqfP-gwF
rpoA-gwF
menA-gwF
ppaC-gwF
murB-gwF
yerQ-gwF
yloQ-gwF
glyQ-gwF
tsf-gwF
prsA-gwF
mreC-gwF
ispE-gwF
fbaA-gwF
dapF-gwF
folD-gwF
rplB-gwF
racE-gwF
yqiD-gwF
nadE-gwF
menB-gwF
cdsA-gwF
dapB-gwF
yjbN-gwF
divIB-gwF
accD-gwF
yurY-gwF
tpiA-gwF
tagG-gwF
ypuG-gwF
hepS-gwF
rnc-gwF
map-gwF
fabG-gwF
rpsB-gwF
配列(5'→3')
AAAAAGCAGGCTCG ATGGTATTTGATGTGTGGAAAAGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGGAAGAGGTTTACACG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGTGAGCAAAAAGACATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAACGAAAAGATGGTTTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAAAAGTCACAATGCTT
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAAGAAAAGCTAAAACAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTTGGAATTGGTGCTAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAAGAGCTAGCATCTC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTTGCAAGGGATATTGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGAATAGCTGTAGATGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCGAGAGGATACAAAGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAACAAACGATTTTTTCAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCAATATCCTGGAAGG
AAAAAGCAGGCTCG GTGACAAAAATTTATGACGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGCTTTTTTAAAAAATTAAAAG
AAAAAGCAGGCTCG GTGGCTCCAAGATTAGAAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGCGGTCAACATTAAGAAA
AAAAAGCAGGCTCG ATGCTTGAGCAAGTCATTC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAACGAATAGGGGTATT
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGTAAGATTGCATTTTTAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCTAATCAATACGGAGAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGACGAGAATCGTATTTATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTATCGTAAAAGCAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGACGTAATTAAAATTTCAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGATCGAGATTGAAAAACC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAACCAAACAAATAAGGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAAAAGATACTTATTTTCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAGAAAGTGATACAGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAACGTGCACGCATAAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCTGAGGGCAAAATTATTAAGGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAATATTCAAGACATGATTC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCAATTACTGCACAGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAGAAAATCGCAATAGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCGAATAAGCGGTTAATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCGTATTTTAGAAAAAGCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCTTTAGTTTCTATGAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAACTCATTTCGATTTACC
AAAAAGCAGGCTCG ATGACTGCAACAATCATCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCGATTAAAAAGTATAAAC
AAAAAGCAGGCTCG TTGTTGGAACAACCAATAGG
AAAAAGCAGGCTCG GTGACAAATAAATTAACGAGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGCATGCAGGAAAAGA
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTGAATGGAAAACAAA
AAAAAGCAGGCTCG ATGGTGGACATGAAACAAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCAAACGAAACAATTAAAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAATTTGCCGTATCATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAACCCGGGTCAAGAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGACAAAATGTCCTAAGTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTGCTTCAACATTAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGAAAACCAATTATCGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAATGATTTGTTGCGTATAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAAGAATATCAAGTGAAA
AAAAAGCAGGCTCG TTGCAAGACATCTACGGAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCAAAACACTCACATTATA
AAAAAGCAGGCTCG ATGATTATCTGTAAAACCCC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCTTAATGATAAAACGGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCAGTCATTTCTATGAAG
9
付録 2
Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
trmD-gwF
ykuQ-gwF
yycF-gwF
menH-gwF
yacM-gwF
rplA-gwF
ydiC-gwF
tagF-gwF
cmk-gwF
rpsC-gwF
adk-gwF
ymfM-gwF
tmk-gwF
rplC-gwF
rplD-gwF
ymaA-gwF
gmk-gwF
rpsD-gwF
yhdO-gwF
ytaG-gwF
pgsA-gwF
yneS-gwF
yqeJ-gwF
spoVC-gwF
grpE-gwF
frr-gwF
efp-gwF
resA-gwF
hprT-gwF
tagA-gwF
rplE-gwF
rplF-gwF
ypuH-gwF
infC-gwF
ssb-gwF
mreD-gwF
dfrA-gwF
rplJ-gwF
rpsE-gwF
cspR-gwF
accB-gwF
yacN-gwF
ydiB-gwF
rpsG-gwF
rplI-gwF
yurV-gwF
rplO-gwF
rplM-gwF
rplP-gwF
mrpB-gwF
rpsL-gwF
rpsH-gwF
rpsK-gwF
rpsI-gwF
tagD-gwF
ymfL-gwF
divIC-gwF
配列(5'→3')
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAATCGATTTTTTGACG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAATGATGGACGCAAA
AAAAAGCAGGCTCG ATGGATAAAAAGATCCTTGTAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCAGGACTCAAAAGAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGTTATGATGTGGTGAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTAAAAAAGGTAAAAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGACAATATTAGCAATTGATAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCCTTAGTAGTTGACAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAAAAGAAATTATCGATTG
AAAAAGCAGGCTCG GTGGGTCAAAAGGTAAATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAACTTAGTCTTAATGGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCATTGGATGATCTCCAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGCGGTTTATTTATTACA
AAAAAGCAGGCTCG ATGACCAAAGGAATCTTAGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCAAAAGTAGCATTATAC
AAAAAGCAGGCTCG GTGGTACAAATCATATTTGAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAGAAAGAGGGTTATTA
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTCGCTATACAGGT
AAAAAGCAGGCTCG ATGTATAAGTTTTGTGCAAATG
AAAAAGCAGGCTCG TTGACCTTAGTCATTGGTTT
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCTAACTTACCAAATAAAA
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTAATTGCTTTATTGATTATTTTGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAGAAAATCGGAATTTTC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCTTGTGATTGCCGGTC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCAGAAGAAAAACAAACC
AAAAAGCAGGCTCG GTGTCAAAAGAAGTATTAACTC
AAAAAGCAGGCTCG ATGATTTCAGTTAACGATTTC
AAAAAGCAGGCTCG GTGGACAATGAAGAAAAAAAGGCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGATGAAACATGATATCGAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCAAACAGAGACTATTCAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAACCGCCTTAAAGAAAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCTCGTGTAGGTAAGAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGGGCTTGATATCGTG
AAAAAGCAGGCTCG ATTATTAGCAAAGATCAATTGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCTTAACCGAGTTGTATT
AAAAAGCAGGCTCG GTGAAACGTTTCCTTCTCC
AAAAAGCAGGCTCG ATGATTTCATTCATTTTTGCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGCAGCGCAATTGAAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCGTCGTATTGACCCAAG
AAAAAGCAGGCTCG GTGAACATTGTGGCATTAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTAAATATCAAAGAAATCC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTTAGAATTGGACAAGG
AAAAAGCAGGCTCG GTGAAGCAATTAAAATGGAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCACGTAAAGGTCCTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAGGTTATTTTCTTACAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCTTTTAATGCAAACTTAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAACTTCATGAATTAAAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCGTACAACACCTATGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTATTACCAAAACGCGT
AAAAAGCAGGCTCG GTGAATGAACAAAAAACAAATGA
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCTACAATTAATCAGCT
AAAAAGCAGGCTCG ATGGTTATGACAGATCCAAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTGCTGCTCGTAAATC
AAAAAGCAGGCTCG TTGGCGCAGGTTCAATATTAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAAAAGTTATCACATATG
AAAAAGCAGGCTCG GTGTCGGGAAAACGGAATCG
AAAAAGCAGGCTCG TTGAATTTTTCCAGGGAACG
10
付録 2
Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
rplL-gwF
rplN-gwF
acpS-gwF
rpsM-gwF
rplQ-gwF
rplR-gwF
rplT-gwF
rplS-gwF
ftsL-gwF
rnpA-gwF
rplV-gwF
mrpC-gwF
trxB-gwF
rplX-gwF
rplU-gwF
rpsJ-gwF
gatC-gwF
yqeI-gwF
rplW-gwF
rpmA-gwF
groES-gwF
mrpF-gwF
ylaN-gwF
hbs-gwF
rpsS-gwF
rpsP-gwF
rpsO-gwF
rpsT-gwF
rpsQ-gwF
rpsR-gwF
acpA-gwF
infA-gwF
ykzG-gwF
rpmC-gwF
rpmE-gwF
rpmI-gwF
rpmB-gwF
rpsN-gwF
rpmD-gwF
rpmF-gwF
rpsF-gwF
secE-gwF
rpsU-gwF
yqiC-gwF
rpmGA-gwF
rpmGB-gwF
rpmH-gwF
rpmJ-gwF
prfB-gwF
dnaA-gwR
dnaC-gwR
dnaD-gwR
dnaI-gwR
ileS-gwR
alS-gwR
alaS-gwR
secA-gwR
配列(5'→3')
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTTTAAATATCGAAGAA
AAAAAGCAGGCTCG ATGATTCAACAAGAGACTCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGATTTACGGCATTGGGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTCGTATTGCTGGTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCATACAGAAAACTAGG
AAAAAGCAGGCTCG ATGATTACGAAAACTAGCAAA
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCAAGAGTAAAAGGCG
AAAAAGCAGGCTCG TTGAAAACGATGCAAAAACTA
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGCAATTTAGCTTACC
AAAAAGCAGGCTCG TTGAAGAAGCGAAATCGTTT
AAAAAGCAGGCTCG ATGCAAGCTAAAGCTGTTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAAATCTTAATGGCTGTA
AAAAAGCAGGCTCG GTGTCAGAAGAAAAAATTTATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCATGTAAAAAAAGGCG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTACGCAATCATTAAAACAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCAAAACAAAAAATTCGT
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCACGAATTTCAATAGAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTAACAGGTAAACAAAAACG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAGATCCTCGTGATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCTTAGATTAGATCTTCAG
AAAAAGCAGGCTCG TTGTTAAAGCCATTAGGTGATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGTTTACGCTGATCCTGCA
AAAAAGCAGGCTCG TTGGCTTCAGAGATGATAGT
AAAAAGCAGGCTCG ATGAACAAAACAGAACTTATC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTCGCAGCTTAAAAA
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCAGTAAAAATTCGTTTA
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCAATTACTCAAGAGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCAAACATTAAATCAGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGCGAACGCAACCAAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCAGGAGGACGCAGAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCAGACACATTAGAGC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCGAAAGACGATGTAAT
AAAAAGCAGGCTCG ATGATTTATAAGGTATTTTATCAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAGCTAATGAAATTCGTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAGCAGGAATTCATCC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCCAAAAATGAAAACTCAC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCACGTAAATGCGTTATC
AAAAAGCAGGCTCG GTGGCTAAAAAGTCTATGATTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTAAATTAGAAATTACC
AAAAAGCAGGCTCG ATGGCTGTACCTTTTAGAAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGAAAGTACGAAGTTATG
AAAAAGCAGGCTCG ATGCGTATTATGAAATTCTTTA
AAAAAGCAGGCTCG ATGTCAAAAACGGTCGTTAG
AAAAAGCAGGCTCG GTGCCTCTAGAGCAAGCC
AAAAAGCAGGCTCG ATGCGCGTTAATATTACTTTG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAGAAAAAAGATTACGTTAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAAGAACATTCCAACC
AAAAAGCAGGCTCG ATGAAAGTGAGACCATCAG
AAAAAGCAGGCTCG ATGGAATTATCAGAAATTAGAG
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CGGTCCTGCTATTTAAGC
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC AGCTCTTGGGGCTTATGC
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TTCACTTTATTGTTCAAGCC
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC ACAGCAATTATGGATGTCG
AGAAAGCTGGGTC TCTTTTGCATTATTTTTGATAG
AGAAAGCTGGGTC TTCATTAACCCTTCAGCTC
AGAAAGCTGGGTC TGGGCGAATTATAAAACGG
AGAAAGCTGGGTC CGAACTATTCAGTACGGC
11
付録 2
Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
gyrA-gwR
parC-gwR
priA-gwR
leuS-gwR
pheT-gwR
mrpA-gwR
pcrA-gwR
relA-gwR
pbpB-gwR
infB-gwR
nrdE-gwR
bkdR-gwR
fusA-gwR
topA-gwR
glyS-gwR
ligA-gwR
tkt-gwR
metS-gwR
parE-gwR
gyrB-gwR
dxs-gwR
lepA-gwR
ylaG-gwR
yycG-gwR
dnaK-gwR
dnaG-gwR
glmS-gwR
aspS-gwR
menD-gwR
proS-gwR
dnaX-gwR
argS-gwR
groEL-gwR
resB-gwR
pyrG-gwR
ymdA-gwR
pgm-gwR
lysS-gwR
murE-gwR
mrpD-gwR
yueK-gwR
guaB-gwR
menE-gwR
gatA-gwR
tagB-gwR
gltX-gwR
gatB-gwR
dnaB-gwR
yacA-gwR
cysS-gwR
yurU-gwR
thdF-gwR
murF-gwR
gcaD-gwR
murD-gwR
accC-gwR
yqiB-gwR
配列(5'→3')
AGAAAGCTGGGTC TTTCACACTTCTTCTTGTTC
AGAAAGCTGGGTC TTATTGTTCTGTATGAAGGC
AGAAAGCTGGGTC ATCTTACATCATCATATAAGG
AGAAAGCTGGGTC TAGTTTGCCACAATATTGAC
AGAAAGCTGGGTC TTATCAGCCTCTTAAAACAG
AGAAAGCTGGGTC TTCATTCACCGCTTTTCCCC
AGAAAGCTGGGTC CAATTACTGCTTTTCAATAGG
AGAAAGCTGGGTC AACCCCTTTAGTTCATGACG
AGAAAGCTGGGTC TGCATAACGACGGCTTTC
AGAAAGCTGGGTC GATCACGTTCTTTCAATTTC
AGAAAGCTGGGTC ATCAAACAACACAAGAAAGG
AGAAAGCTGGGTC CTGCAAATTATTGCATGCC
AGAAAGCTGGGTC GGCAAAATCAATTATTCGCC
AGAAAGCTGGGTC TCACCGCTACTTCTGTGG
AGAAAGCTGGGTC TCTTTATTTTACAATAAGGGC
AGAAAGCTGGGTC CTTATTTCTTTAGCTCTCCC
AGAAAGCTGGGTC GCTTACTTATTGATTAATGCC
AGAAAGCTGGGTC TCATTATTTAATTCTTGTGCC
AGAAAGCTGGGTC ATCATTAAACCTCCTCAGC
AGAAAGCTGGGTC CTTTTTATGATTAGATGTCAAG
AGAAAGCTGGGTC GACGTCATGATCCAATTCC
AGAAAGCTGGGTC GCGGCTTCTATTGTTTTTTCGG
AGAAAGCTGGGTC CACGAGATTAAGACAATCCTGC
AGAAAGCTGGGTC TCACGCTTCATCCCAATC
AGAAAGCTGGGTC TTATTTTTTGTTTTGGTCGTC
AGAAAGCTGGGTC TCCTCATCAGTTCTCCAG
AGAAAGCTGGGTC TTATTACTCCACAGTAACAC
AGAAAGCTGGGTC CTGCAAATTCAGTTCTTAAC
AGAAAGCTGGGTC TATGTTTACAGTTCCCATTG
AGAAAGCTGGGTC TCGTTATGGTGATTACTGC
AGAAAGCTGGGTC CGCATAGCATTCACTCTC
AGAAAGCTGGGTC TCGTGATTACATTTTTTCCG
AGAAAGCTGGGTC TTTATTACATCATTCCACCC
AGAAAGCTGGGTC CCTTTTCGCCTATTTCTGTG
AGAAAGCTGGGTC CTTCTGATTTGCAGCTTCG
AGAAAGCTGGGTC CACTTTATTTTGCATACTCTACGGC
AGAAAGCTGGGTC GCATGAGTTTTGTCTCTCC
AGAAAGCTGGGTC TTAGCGTTGTCTCATTTGC
AGAAAGCTGGGTC CTCTTTCCTATGAATTCGTC
AGAAAGCTGGGTC ATCTACTCCTTCAGAACAGC
AGAAAGCTGGGTC CTTTATTCTTCCTCAAGCTC
AGAAAGCTGGGTC ATTATGAAATTGTATAGTTAGG
AGAAAGCTGGGTC CGATCATAGCAGTTCTCC
AGAAAGCTGGGTC CTTACAGTTCAGGTTTTGC
AGAAAGCTGGGTC AACAAGTGTCATCATTTAGC
AGAAAGCTGGGTC TATTTAGATATTCTTTAAACGC
AGAAAGCTGGGTC ATTAGCGTTTTTTAATTTCTTC
AGAAAGCTGGGTC CTCTGTCTTTAATAGGCAG
AGAAAGCTGGGTC CATCATGATTTTGCTTGCCC
AGAAAGCTGGGTC AAGCATCTGTTATTCTCCC
AGAAAGCTGGGTC CATCATTAACCGATAGAACC
AGAAAGCTGGGTC CTTTAATTATTTTCCTAAACAG
AGAAAGCTGGGTC TCTTATGAAAGCGGGCTC
AGAAAGCTGGGTC GATAAACCTCCGAATTTAGG
AGAAAGCTGGGTC TACTTAAGCATATGCACGG
AGAAAGCTGGGTC AATTATGAGCCCATTACATC
AGAAAGCTGGGTC CGTCTGTCATTTTTCTTCC
12
付録 2
Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
ybbT-gwR
ffh-gwR
ftsA-gwR
yurX-gwR
murAA-gwR
murC-gwR
secY-gwR
eno-gwR
asnS-gwR
ydiO-gwR
serS-gwR
hisS-gwR
tig-gwR
rplK-gwR
yrvO-gwR
tyrS-gwR
odhB-gwR
glyA-gwR
fabF-gwR
csd-gwR
ftsW-gwR
metK-gwR
tagH-gwR
cca-gwR
tufA-gwR
pgk-gwR
rodA-gwR
alr-gwR
ydiP-gwR
dxr-gwR
ftsZ-gwR
yvyH-gwR
dnaN-gwR
yqfY-gwR
trmU-gwR
ykuR-gwR
menC-gwR
nusA-gwR
sigA-gwR
yyaF-gwR
murG-gwR
tagO-gwR
yhdL-gwR
prfA-gwR
ddl-gwR
resC-gwR
hepT-gwR
yqeN-gwR
asd-gwR
gcp-gwR
ywlC-gwR
gpsA-gwR
pheS-gwR
mreB-gwR
ynbA-gwR
mbl-gwR
plsX-gwR
配列(5'→3')
AGAAAGCTGGGTC AGACTTCGTTACTCTAATCC
AGAAAGCTGGGTC CCGATTACATAAAAGGTAGC
AGAAAGCTGGGTC TATCTATTCCCAAAACATGC
AGAAAGCTGGGTC ATATTCATTACTTCACTTTCC
AGAAAGCTGGGTC TTATGCATTTAAGTCAGAAACG
AGAAAGCTGGGTC CTTTTTATTATGCCATGACG
AGAAAGCTGGGTC TCCTCTAGTTTTTCATAAATC
AGAAAGCTGGGTC TTATTACTTGTTTAAGTTGTAG
AGAAAGCTGGGTC GTATTACGGATACAGACGG
AGAAAGCTGGGTC TTATCTTAATTGATGTAATGC
AGAAAGCTGGGTC AATTTACGGTTTCATTACTTC
AGAAAGCTGGGTC CACTCCTTATCCCTTTTGG
AGAAAGCTGGGTC CCATATTAACGGTTTTCTAC
AGAAAGCTGGGTC AACAAATTAATCCTCGATTAC
AGAAAGCTGGGTC ATTATGTCAGCCGTTTGAC
AGAAAGCTGGGTC CTTATTTATACGTCACAAGG
AGAAAGCTGGGTC TATTATCCTTCTAATAAAAGCTG
AGAAAGCTGGGTC TAGGATCTTAATAATCTAATTC
AGAAAGCTGGGTC GTTTGGCTTGATTATGATTG
AGAAAGCTGGGTC GTTTGCATTAAAAGACATTTG
AGAAAGCTGGGTC TTCCCCTGTACACACTTG
AGAAAGCTGGGTC AATTATTCTCCTAACGCTTC
AGAAAGCTGGGTC TTATTTCAACATCAAAGTCAG
AGAAAGCTGGGTC TCTTAATGTTGACCGCATG
AGAAAGCTGGGTC CTATTACTCAGTGATTGTAG
AGAAAGCTGGGTC GATTATTTATCGTTCAGTGC
AGAAAGCTGGGTC GGCTGTCTGCATATCAAG
AGAAAGCTGGGTC CCATTTAGGTAAGTTAATTGC
AGAAAGCTGGGTC GTTAAACCTTTTGAAGTTGC
AGAAAGCTGGGTC TATTCACGAACATACCACC
AGAAAGCTGGGTC TTTTGTCCTTTACATTAGCC
AGAAAGCTGGGTC TTATTTGCCTGTAAATGAATC
AGAAAGCTGGGTC GCAGTGTATCGGATTAATAG
AGAAAGCTGGGTC CCCGTCAAGCTTTTTGTG
AGAAAGCTGGGTC TTTATACGTACCACAATTTTG
AGAAAGCTGGGTC GTACTTAATTGGCATAAACAG
AGAAAGCTGGGTC TTCTTAACCATGCTGTGTG
AGAAAGCTGGGTC CTTATTCATCCGATTCAGC
AGAAAGCTGGGTC TCTTATTCAAGGAAATCTTTC
AGAAAGCTGGGTC CATCCTATACATTAAATCGG
AGAAAGCTGGGTC ACCTCGCATTCCATTTGC
AGAAAGCTGGGTC TTTAATTCCTTTTCACCAGC
AGAAAGCTGGGTC CTTACCAGTTCCATAATTCC
AGAAAGCTGGGTC ATCTTAACCTTCCGACTGC
AGAAAGCTGGGTC CTTCTTCATTAGAATGTATGC
AGAAAGCTGGGTC CTATGCATAAGAATGAAGTCC
AGAAAGCTGGGTC GCGGAGAAATTTCTTAATATC
AGAAAGCTGGGTC AACGATCCTCAATAATGGGG
AGAAAGCTGGGTC ATTCTCTCTTTTATACGAGG
AGAAAGCTGGGTC ACGCTATTATCTCGTGAGAC
AGAAAGCTGGGTC TTTCAGCGAATCACTCTTCC
AGAAAGCTGGGTC TGACACTTTTACTTCACTTG
AGAAAGCTGGGTC CTCTTACGCCTGTTTAAAC
AGAAAGCTGGGTC CCCGATTATCTAGTTTTCC
AGAAAGCTGGGTC AGACGTTAACAGTTCTTGGC
AGAAAGCTGGGTC TGAGGTTTGTGAAATCAGC
AGAAAGCTGGGTC CTCCAGACTACTCATCTG
13
付録 2
Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
yumC-gwR
trpS-gwR
holB-gwR
nrdF-gwR
ftsY-gwR
accA-gwR
birA-gwR
mraY-gwR
pfkA-gwR
fabD-gwR
prs-gwR
fmt-gwR
trxA-gwR
yqfP-gwR
rpoA-gwR
menA-gwR
ppaC-gwR
murB-gwR
yerQ-gwR
yloQ-gwR
glyQ-gwR
tsf-gwR
prsA-gwR
mreC-gwR
ispE-gwR
fbaA-gwR
dapF-gwR
folD-gwR
rplB-gwR
racE-gwR
yqiD-gwR
nadE-gwR
menB-gwR
cdsA-gwR
dapB-gwR
yjbN-gwR
divIB-gwR
accD-gwR
yurY-gwR
tpiA-gwR
tagG-gwR
ypuG-gwR
hepS-gwR
rnc-gw-R
map-gwR
fabG-gwR
rpsB-gwR
trmD-gwR
ykuQ-gwR
yycF-gwR
menH-gwR
yacM-gwR
rplA-gwR
ydiC-gwR
tagF-gwR
cmk-gwR
rpsC-gwR
配列(5'→3')
AGAAAGCTGGGTC TTATTTATTTTCAAAAAGACTTG
AGAAAGCTGGGTC GATTAGCGTCTTTTTCTTCC
AGAAAGCTGGGTC CATTGTACAAGCTTATCCC
AGAAAGCTGGGTC AGCAGATATTATATCTGCTC
AGAAAGCTGGGTC GCCTTTTTCTTAATCGTCG
AGAAAGCTGGGTC TTAGTTTACCCCGATATATTG
AGAAAGCTGGGTC AACACATTAGCCCAATTCG
AGAAAGCTGGGTC CACTTATAACCACACCTCG
AGAAAGCTGGGTC GTACATTAGATAGACAGTTC
AGAAAGCTGGGTC TCATTAAGCATTATCATTCTC
AGAAAGCTGGGTC GTTTAGCTGAACAGATAGC
AGAAAGCTGGGTC CGATGTCACGAACACTAG
AGAAAGCTGGGTC ATTAAAGATGTTTGTTTACAAG
AGAAAGCTGGGTC CCTCAGTTTTTTGCTTTTAC
AGAAAGCTGGGTC ACTAGTCAATCGTCTTTGC
AGAAAGCTGGGTC TTTTATTATCGGAAATAGCTG
AGAAAGCTGGGTC GCTTATTCAGCCATTGCG
AGAAAGCTGGGTC CTTGAATCAGCGATTTCCG
AGAAAGCTGGGTC TTAGTCATCCAACTGTTCCG
AGAAAGCTGGGTC TGCTAATACCTCGGCTTTCTG
AGAAAGCTGGGTC GTTTACTCATGAGAAGAACC
AGAAAGCTGGGTC CACCATTATTTTTTCACTTGG
AGAAAGCTGGGTC TATTATTTAGAATTGCTTGAAG
AGAAAGCTGGGTC ACGTTTCACGATCCTTCC
AGAAAGCTGGGTC ATTTAATCAAGAGCGTTCTG
AGAAAGCTGGGTC TTAAGCTTGGTTTGAAGAAC
AGAAAGCTGGGTC GTTTTACAAGAAATAGACACC
AGAAAGCTGGGTC AATTATCTATGATAACGTACG
AGAAAGCTGGGTC GTTATTTATTTTTACGACGAC
AGAAAGCTGGGTC GGGAAAACTATCTTTTAATCGG
AGAAAGCTGGGTC CGATCAATCGTTCGCCTC
AGAAAGCTGGGTC CTTATTTCCACCAGTCATC
AGAAAGCTGGGTC GATCACGGAAAACGAGGG
AGAAAGCTGGGTC TTATGAAAAAAGGGCAAGCAG
AGAAAGCTGGGTC CCCCCCGTCTAATCAATG
AGAAAGCTGGGTC TCTTTCTATTCACCTTTTCC
AGAAAGCTGGGTC AAGGACTGCTGATTTGCC
AGAAAGCTGGGTC CTAATCTTGGAGCCACTC
AGAAAGCTGGGTC ACGCTTACGCTTCTTGGC
AGAAAGCTGGGTC TTTACTCATATTGACCTTCC
AGAAAGCTGGGTC GTATTAAAGAAAGTCAACAAAC
AGAAAGCTGGGTC TTCACGATATCAAGCCCC
AGAAAGCTGGGTC TTACCCTTCTTCCACTTTC
AGAAAGCTGGGTC GGATTTTATTGTTTCGTATGG
AGAAAGCTGGGTC TCATCATCTAGACTCTCG
AGAAAGCTGGGTC AACTTACATCACCATTCCG
AGAAAGCTGGGTC TTACGCAGTTGTTGTTTCTG
AGAAAGCTGGGTC CTATTCTTTTTCCCATTCAG
AGAAAGCTGGGTC TTTTCCTTACAGCTGGCG
AGAAAGCTGGGTC GCATTAGTCCTGTTCTGGG
AGAAAGCTGGGTC TTTCATTTCCATCCGATATG
AGAAAGCTGGGTC TTCTAAACATGTTTATTCCC
AGAAAGCTGGGTC ATATTATTTTACGTTAAAAGTTG
AGAAAGCTGGGTC CCTACTTTTGACTTTCAATCC
AGAAAGCTGGGTC AAAATAACCTAAATTATTCAGC
AGAAAGCTGGGTC CATTTGCCATCCTCAGCG
AGAAAGCTGGGTC TATTATTTTCCTCCTTCCTC
14
付録 2
Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
adk-gwR
ymfM-gwR
tmk-gwR
rplC-gwR
rplD-gwR
ymaA-gwR
gmk-gwR
rpsD-gwR
yhdO-gwR
ytaG-gwR
pgsA-gwR
yneS-gwR
yqeJ-gwR
spoVC-gwR
grpE-gwR
frr-gwR
efp-gwR
resA-gwR
hprT-gwR
tagA-gwR
rplE-gwR
rplF-gwR
ypuH-gwR
infC-gwR
ssb-gwR
mreD-gwR
dfrA-gwR
rplJ-gwR
rpsE-gwR
cspR-gwR
accB-gwR
yacN-gwR
ydiB-gwR
rpsG-gwR
rplI-gwR
yurV-gwR
rplO-gwR
rplM-gwR
rplP-gwR
mrpB-gwR
rpsL-gwR
rpsH-gwR
rpsK-gwR
rpsI-gwR
tagD-gwR
ymfL-gwR
divIC-gwR
rplL-gwR
rplN-gwR
acpS-gwR
rpsM-gwR
rplQ-gwR
rplR-gwR
rplT-gwR
rplS-gwR
ftsL-gwR
rnpA-gwR
配列(5'→3')
AGAAAGCTGGGTC ATAATCATTTTTTTAATCCTCC
AGAAAGCTGGGTC ATCGCGCACTCAAATCCAGG
AGAAAGCTGGGTC GGGAAACAGGTCACAATTG
AGAAAGCTGGGTC AATTATTTAGATTTAACAGCAC
AGAAAGCTGGGTC TTCATTATGCAAGCACCTC
AGAAAGCTGGGTC TTCGTTATTTAACTGGATCC
AGAAAGCTGGGTC TGATTATTCAACCTCCAGC
AGAAAGCTGGGTC GATTAACGAGAGTAGAACTC
AGAAAGCTGGGTC GAACGCCTTATAGCTGATC
AGAAAGCTGGGTC GTATTATGCCCAGCTGTTC
AGAAAGCTGGGTC TTAGTTAGATGTTTTTAACGC
AGAAAGCTGGGTC TTTTAAGCTTATAACCATTTTAC
AGAAAGCTGGGTC CCTCACGATTCATATAAACC
AGAAAGCTGGGTC GTTACATTTTATACCTTTGCG
AGAAAGCTGGGTC AATTATTGATTCACTTTGACC
AGAAAGCTGGGTC TCATTAAACTTCCATGATTTC
AGAAAGCTGGGTC CTTTCTATGCTCTTGAAACG
AGAAAGCTGGGTC CTTCATCCCGAAGTCTCTCC
AGAAAGCTGGGTC GATCAGCTTTCATAAACTGC
AGAAAGCTGGGTC TTTAAATCTGTTTTGTATGATC
AGAAAGCTGGGTC ATTGATTATTTCTGGAACGG
AGAAAGCTGGGTC TCTTACTTAGCAGATTTACC
AGAAAGCTGGGTC GCGCGATTCATTAAACTTC
AGAAAGCTGGGTC TCCTCCTTATTGCTTTTCG
AGAAAGCTGGGTC TCACATTAGAATGGAAGATC
AGAAAGCTGGGTC ATCCTTTTTACTCATCTCTC
AGAAAGCTGGGTC ACCAATTAAAATCCTCCCG
AGAAAGCTGGGTC CTGGATTAGATTAAGCGCC
AGAAAGCTGGGTC CCTTATCCTAACAGTTCTTC
AGAAAGCTGGGTC TTTCACTATTTTAAATCACGG
AGAAAGCTGGGTC TTCAGTCTCCTTACTCCG
AGAAAGCTGGGTC AGTTAGCCTTTTTGTATCAG
AGAAAGCTGGGTC GTATCAATTGCTAATATTGTCATG
AGAAAGCTGGGTC ATCCTACCAGCGATAGTG
AGAAAGCTGGGTC CTATTAAGCTTCTTCTTTTAC
AGAAAGCTGGGTC TTTAATTGCCGCCTTCTTC
AGAAAGCTGGGTC CAAGTTAGATCACCTCAGC
AGAAAGCTGGGTC TAATTAACCGCGAAGTTCG
AGAAAGCTGGGTC TCATTAGCTTTCATTTGATTC
AGAAAGCTGGGTC TTATTCTTCCTCTCCAATCG
AGAAAGCTGGGTC CGTATATTATTTTGCTTTAGG
AGAAAGCTGGGTC CTTACCAAACGTATGCTAG
AGAAAGCTGGGTC TACAAACAAATTACACGCGG
AGAAAGCTGGGTC TTAACGTTTTGAGAACTGAG
AGAAAGCTGGGTC GATCCTAAATTATAAACCAGC
AGAAAGCTGGGTC ACACCTTCCAATTTTAAAAATC
AGAAAGCTGGGTC GTCAACAAGGCTACTTGC
AGAAAGCTGGGTC ATTACTTAACTTCTACAGAAG
AGAAAGCTGGGTC AATTAGATAACTTCTGGAGC
AGAAAGCTGGGTC CAGACTAGCTTGACAACC
AGAAAGCTGGGTC TTACTTATTTTTTCTTGTTAGC
AGAAAGCTGGGTC ATATGTGATTAAACCAATTCG
AGAAAGCTGGGTC TTAAAATTTAAGTCCAGCTTC
AGAAAGCTGGGTC TGATTACTTGTTTAATTGAGC
AGAAAGCTGGGTC TATCATTATCGTCTGATCTC
AGAAAGCTGGGTC GGCATTTGAATCATTCCTG
AGAAAGCTGGGTC GTGATGCCTACTTTGACG
15
付録 2 Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
rplV-gwR
mrpC-gwR
trxB-gwR
rplX-gwR
rplU-gwR
rpsJ-gwR
gatC-gwR
yqeI-gwR
rplW-gwR
rpmA-gwR
groES-gwR
mrpF-gwR
ylaN-gwR
hbs-gwR
rpsS-gwR
rpsP-gwR
rpsO-gwR
rpsT-gwR
rpsQ-gwR
rpsR-gwR
acpA-gwR
infA-gwR
ykzG-gwR
rpmC-gwR
rpmE-gwR
rpmI-gwR
rpmB-gwR
rpsN-gwR
rpmD-gwR
rpmF-gwR
rpsF-gwR
secE-gwR
rpsU-gwR
yqiC-gwR
rpmGA-gwR
rpmGB-gwR
rpmH-gwR
rpmJ-gwR
prfB-gwR
prfB-lig1
prfB-lig2
配列(5'→3')
AGAAAGCTGGGTC CACTACTTATCCCTCCTTC
AGAAAGCTGGGTCTAACAAAATTATTCATGTTGATC
AGAAAGCTGGGTC TTTATTTTAAGGTTTTCAGCG
AGAAAGCTGGGTC CTATTTATCTAGAACTTGCC
AGAAAGCTGGGTC GAATCATGCTTACGCGTTG
AGAAAGCTGGGTC TTTAGAATTAAAGTTTAATTTCG
AGAAAGCTGGGTC CTTTAGTCCAGAATTGATGG
AGAAAGCTGGGTC ACCACCTTTAAGGAAGCTCG
AGAAAGCTGGGTC TAATTAAGCTTCAAAAATTTCG
AGAAAGCTGGGTC AATCATTATTGAGCTACAGG
AGAAAGCTGGGTC AAGAATTAGCCGATAACAGC
AGAAAGCTGGGTC CAACGACCTTAGCGGTTTCG
AGAAAGCTGGGTC CATTTATTTAGCTGTAAACGCG
AGAAAGCTGGGTC GTTGCCGGAAAATAATTGTG
AGAAAGCTGGGTC TCCTCTCTTAGCGTCTTG
AGAAAGCTGGGTC TCATTACTTGCCTTGTTTAG
AGAAAGCTGGGTC CGATTATCGACGTAAGCC
AGAAAGCTGGGTC TTATATTATGCAGAAAGTCCG
AGAAAGCTGGGTC TTTATTAGATAATAACAGCTTC
AGAAAGCTGGGTC CATATCAGCTTACTCACCG
AGAAAGCTGGGTC GCATCAGCTTATTGCTGG
AGAAAGCTGGGTC GCTTTATTTGTAACGGTACG
AGAAAGCTGGGTC ACCGCTCATAACTCCAATAC
AGAAAGCTGGGTC CAGTGATTATTTATTAGCAGC
AGAAAGCTGGGTC ATCTATTATTACTTAAGACCG
AGAAAGCTGGGTC TTACTTGATGTTAGCAAGC
AGAAAGCTGGGTC TTTTGTTATACACGCTCAAC
AGAAAGCTGGGTC TTGGGGATTACCAGCTGG
AGAAAGCTGGGTC TTTATTGTTCTTTAACAGAAAC
AGAAAGCTGGGTC TTTCTCATTAGTTACTTTTTAC
AGAAAGCTGGGTC TGCTTATTCTTCTTCTTTAAC
AGAAAGCTGGGTC ATCATTATTCAACTATTAAACG
AGAAAGCTGGGTC TCTTTTAGAATTTGCGTTTTC
AGAAAGCTGGGTC ATTTATTTGTCACCTTCGTC
AGAAAGCTGGGTC GCTGTTATTTTGTTTCACGG
AGAAAGCTGGGTC ACTATTTTGTTTCAAGATGAG
AGAAAGCTGGGTC TGGCCTAAGCTGATAATAC
AGAAAGCTGGGTC CCTCCTTATAAATTATCCTTG
AGAAAGCTGGGTC CTTATGAAAGCTTAGAACGC
GCCTCCTTTGATTCGAGGTC AAGAGACCCCCTAAAGTCCG
CGGACTTTAGGGGGTCTCTT GACCTCGAATCAAAGGAGGC
sequencing用
ileS.seq1
ileS.seq2
ileS.seq3
valS.seq1
valS.seq2
valS.seq3
alaS.seq1
alaS.seq2
alaS.seq3
secA.seq1
secA.seq2
gyrA.seq1
gryA.seq2
CATATGTGACATTAAAACCG
ACGGTTTAGATGTGCTTTG
GTTTGATTCAGGCTCTTCAC
ATTCCCGTGAACGTTTTAC
GATCGTTTTGAATGCCGC
CAAGGCATTGAATTTACAGG
TCGGTATTCCTGAAGAAAG
GATCAACATCCATCGTCC
ATGAAACACCGTTCTATGC
TGGTTCTTTATAAAGAGCAG
TGGAAGGAAAGTTTAAGGC
ACAAACATTCCTCCGCAC
CGTAATTCTCAAACGGCTG
16
付録 2 Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
parC.seq1
parC.seq2
priA.seq1
priA.seq2
leuS.seq1
leuS.seq2
pheT.seq1
pheT.seq2
mrpA.seq1
mrpA.seq2
pcrA.seq1
pcrA.seq2
pbpB.seq1
pbpB.seq2
infB.seq1
infB.seq2
nrdE.seq1
nrdE.seq2
bkdR.seq1
bkdR.seq2
fusA.seq1
fusA.seq2
topA.seq1
topA.seq2
glyS.seq1
glyS.seq2
ligA.seq1
ligA.seq2
tkt.seq1
tkt.seq2
metS.seq1
metS.seq2
parE.seq1
parE.seq2
gyrB.seq1
gyrB.seq2
relA.seq1
rela.seq2
dxs.seq1
yycg.seq1
dnaG.seq1
glmS.seq1
aspS.seq1
menD.seq1
proS.seq1
dnaX.seq1
argS.seq1
groEL.seq1
resB.seq1
pyrG.seq1
ymdA.seq1
pgm.seq1
lysS.seq1
murE.seq1
mrpD.seq1
yueK.seq1
guaB.seq1
配列(5'→3')
GATACGCGACCGACATTC
TTGGATGAAGTGATTGCAAC
AATGGTCAGGCATATTCAG
AATCATCGATGAAGAGCAC
TGACGGCAAGAGCGAAC
GGAAGCGATTGAAAAAGTG
ATGCCATGAACATGCTTGG
TGATCCATCTGTATGCCG
TTCAGTATTCGAGAGATGG
GCCTACCGCCGTTTAAC
ACCGAACCGGAGGAATTC
CTTCACAGCACAGGCAAG
ATATTACGTATTCACAAAAGC
ATGACGGCGTCCTAAGG
CACTTGCTGAAGAGCTTG
TAGATAAAGAATCCGCAAAC
TGTAAACCTGATGATCAATC
GACATGAACGAAATGTACG
GAAGAAATCATTCTCTTTAAC
AGAAGTGATCGTTAATGTAG
GACAAAATCGGTGCAGAC
AGTTATGACTGACCCTTAC
AGCGAGACGTATTTTAGAC
GAAGCAGCTGCATTTATTG
AATTACAAGCTTGCATTTCC
GCCACGCGATTGAAAATG
ACAAGAGGTGACGGGAC
GCCATCGCGTATAAGTTTC
ATTGCTGAACGCCATTTAG
TGAGCATTTCGCTGTAGC
CTGGTACAGCATCCCTG
CAAAGCAAGTATTCGCGC
GTGCATCAGTCGTGAATG
CAAAAACTGCGATGACGC
GAGGAAAATTTGACGGAAG
GCTTTGCAATACAATGACAG
CGGACACTGAAACATCTGCC
GGGGTTGCGGCTCACTGGGC
CGGGGAAATACCAGTGGGTC
ATACTGGCGTCCGGCACAGG
ATTTAGTGAGGCGCAAATGG
TCTATTAGTAGGTCTTGGAG
AGCACGCCTGAAGGCGCACG
CCATGTGAATGTGCCGCTGC
GCGTACTCTTTCCATGCATC
TAGCAACAACTGAACCGCAC
GCTTTCAAAAGCGGGTTACG
CTCTGCTGCTGATGAGGAAG
AGCGTTAAAAAACCAAGGTG
ACTGTCGGAGACATCGAATC
TTCGTATGCAGCAGTCTGAG
AAGCTTGCGAAAAAAGAAGG
AAATGTAGGCGAATTGTCTG
TGAAAAAAGCGGGAAAACGC
GCGATTTATTTAATATGTACG
GGTAGAAGCGCAGCTGATTG
TGTTCCGATTGTAAATAACG
17
付録 2 Gateway cloning で使用したプライマー
プライマー
menE.seq1
gatA.seq1
tagB.seq1
gltX.seq1
gatB.seq1
dnaB.seq1
yacA.seq1
cysS.seq1
yurU.seq1
murF.seq1
gcaD.seq1
lepA.seq1
ylaG.seq1
thdF.seq1
dnaK.seq1
配列(5'→3')
AACGATTGATGTGGATGAAC
CGGAAAACTGAACATGGACG
CGAAATGTATCCAAGTATGG
CGTGAAGAACAGATTGCCCG
CATCGGCATCACGCGCCTTC
TCCGCCGCTCAGACCAAATG
TGTCGAAGCACCAAGCGGAC
CCTTCATCCGCGAGTAATGG
GCTGAACAAAAATACCTTGC
CGCGTGTCATCGGAGTAACC
TTTGACAGCAGAGACGATGG
AGAACAAATCGTAGAAAAGG
AAAACATGGAAGCTTTATATG
GAGACTGGCAGAGCCTGGTG
GGTGTATTCGAAGTTCGTTC
*プライマー配列のうち、空白の左側の配列が Gateway system の BP reaction
に必要な組み換え配列、右側が目的遺伝子に特異的な配列である。
18
DivIB17
MraY54
MreB32
AccB33
SpoVC
YhdO
MrpB
Ddl
AccC51
Tsf
TufA
MurAA
BirA11
PrfA
FabG51
TrpS
ValS52
MetS
RpsD43
RpsB45
TpiA
RplM
YurX
RacE
MenB
ParC
MenC
HprT
Gro
ES
ResA
Rnc
PyrG
YacM
NadE
YqfY
RpsF47
TopA
YycG12
YycF
PolC36
FtsA28
AccA
AcpS
DnaB
MurG
MrpB
FtsW3
YmaA21
Dxr
YdiO
YneS15
RelA53
GatC
DnaC38
YueK29
RplX
FabG51
YbbT
YlaN
YkqC
PolC36
DnaX38
DnaG
YnbA35
FtsL
MreD
RplP
YlaG
FolD
GlyQ
TopA6
Csd
RplN27
MurF
GatB
GrpE22
YpfD23
YpuH20
Map
OdhB
PheS
RpmF13
Asd
MrpF
Era19
YqiD
Tmk14
RpsE
RpsQ9
YdiC
YkqC
RpsD43
HisS
YhdL41
Div
IB
FolD
Gmk
YneS15
DfrA
MurB
YqfP
RplE
PrfB
MrpC
GlyS
RplB
YqeH
Tkt34
PdhA10
MrpA
RplN27
YkzG
Ydi
MrpD30
付録 3 スクリーニング実験により検出された相互作用の地図
Prs
NrdF
NrdE
MenA
DnaN
YneS15
ParE
ParC
YmaA21
Pgm
InfA
RplO
Cmk
ThdF
RplD
Pgk
RpmGA8
RplT
GroES
HolB
Ppac1
RpmD46
FtsW3
SerS50
HolA
TopA6
DivIB17
RplN
CspR26
RpmA
PpnK
LigA
TagO
RpmA
YphC7
SecE
AccB33
YqjK
FtsA28
YsxC5
YtiA
Tkt34
XseB40
XseA31
YmfL2
1
YmdA
RpsL16
FabF
ProS
frr
DnaI56
GuaB
Eno
CdsA
MreC18
PgsA
RplQ
一対一酵母２ハイブリット法におけるスクリーニング実験で検出された相互作用を示した。
YpfD23
GlyA
タンパク質の右上にある数字は、そのタンパク質が地図上の複数箇所に記述されていることを示しており、
MraY54
これと同じ数字が別の箇所にある同じタンパク質に記述されている。矢印、色の説明は Fig.7 と同じである。
19
TagA
RpsL16
YmfL2
YlqF
YpfD23
RplU
DnaE
DapB
RplD
YacN
TrmU
RplU
RpsS
YerQ
ResC
RpmF13
Ppac1
PriA
GlyQ
YnbA35
RnpA23
PcrA
Fmt
ValS52
YdiP
PdhA10
RpsJ
RplR
YrvO
MenE
Ssb
TagG
Ffh
GatB
YycG12
DapA
DivIB17
TagH
TrxA
DnaD
YwIC
YyaF
AcpA
HepS
DapD
AspS
YycG12
XseA31
HepT
RpmD46
RplJ44
YhdL41
YqeJ
AccD
BirA11
RplC42
GcaD
DapF
FabD
RpsL16
RpsF47
RpsB45
XseB40
XseA31
YpfD23
DnaA37
GatA
MetK
PolC39
YtaG
RpsH48
RpoC
FtsY
RodA
Era19
DivIC
GyrA
GyrB
SigA
RpmI
RpmGA8
RpsH49
YlxQ
RpsD
RpsO
AccB33
Ctc
RplU
TagB
FtsZ
TyrS
AccC51
RpsM
DnaC38
Mbl
RplL
Pbpb
RpsN
SerS50
DnaX38
RpsL16
ResA
NusA
RplW
InfC
RplC42
ArgS
DnaI56
MreC18
GrpE22
YurU
RelA53
YueK29
RplB
FusA
YpuH20
Smc
MurE
RplJ44
RpsD
CspR26
Tmk14
RplA
RpsR
YpuG
RpsQ9
CysS
YurY
Cca
TagF
SecE
RnpA23
YueV
RplS
MenD
TrmD
RpoA
YloQ
MrpD30
RplP
GltX
RplX
YsxC5
FbaA
YphC7
付録 4 既知の相互作用と本研究で検出された相互作用との比較
文献情報より既知の相互作用を調べた。そのうち、今回の酵母 2 ハイブリット法により検出されたものを○で、検出されなかったものを×
で Result に示している。既知の相互作用を調べた方法は Methods に示し、Y2H；酵母２ハイブリット法、GF；ゲルろ過法、DG；密度勾配
法、GR；ゲルシフト・アッセイ、CR；クロスリンク法、IP；免疫沈降法、AC；アフィニティークロマトグラフィー、NP；Native-PAGE、
EM；電子顕微鏡、SPR；表面プラズモン共鳴、として略語で記載している。どの生物由来のたんぱく質で相互作用を示したのかは Species
に示し、文献も右端に記載した。枯草菌以外の生物由来のタンパク質を用いた場合には、タンパク質名の横に枯草菌由来タンパク質との
Identity を示した。
Category
Protein
DNA replication
DnaA
DNA replication
DnaB
DNA replication
DnaC
DnaC (79%)
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DnaD
Interactive
Protein
DnaA
DnaD
DnaB
DnaC
DnaD
DnaB
DnaC
DnaG
DnaI
DnaX
DnaA
DnaB
DnaD
PriA
DnaG
DnaC
DnaI
DnaC
DnaN (26.6%) PolC
HolA(yqeN)
DnaN
HolB (25.3%)
Result
Methods
Species
文献
○
○
○
×
○
×
○
○
○
○
Y2H (Library)
Y2H (full length)
GF / DG
genetic
GR (with DNA)
genetic
GF
Y2H (Library)
GF / DG
GF / CR
Noirot MF et al.,2002
Ishigo-Oka et al.,2001
Velten M et al.,2003
Velten M et al.,2003
Marsin S et al.,2001
Velten M et al.,2003
Marion V et al.,2003
Ishigo D et al.,2001
Velten M et al.,2003
Haroniti A et al.,2003
○
○
○
○
○
○
×
×
×
Y2H (full length)
GF (with DNA)
GF / DG
GR (with DNA)
Y2H (Library)
GF / DG
Y2H (Library)
Y2H (Library)
???
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis (DnaX)
B. stearothermophilus
(DnaC)
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
E. coli
20
Ishigo-Oka et al.,2001
Marsin S et al.,2001
Marsin S et al.,2001
Marsin S et al.,2001
Ishigo-Oka et al.,2001
Velten M et al.,2003
Noirot MF et al.,2002
Noirot MF et al.,2002
付録 ４
既知の相互作用と本研究で検出された相互作用の比較
Category
Protein
Interactive
Protein
DNA replication
DnaX
DnaC
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA replication
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DNA packaging
DnaN
DnaX
DnaX (40%) HolA (28%)
HolB (29%)
PolC (51.0%)
HolB (25.3%) DnaN (26.6%)
HolB (28%)
DnaX (40%)
PolC
DnaN
PolC (51.0%) DnaX (40%)
PpaC
PpaC
PriA
DnaD
YqiB (XseA) YqiC
(40.3%)
YqiC (XseB ) YqiB
(37.3%)
YqiC
GyrA
GyrB
GyrB
GyrA
Hbs
Hbs
ParC
ParE
ParE
ParC
Smc
Smc
ScpA
ScpA (YpuG) Smc
ScpA
ScpB
ScpB (YpuH ) ScpA
ScpB
TopA (40.6%) RpoC (47.0%)
Result
Methods
Species
文献
○
GF / CR
Haroniti A et al.,2003
×
×
○
○
○
×
○
×
○
×
○
○
???
GF / CR
GF / DG
GF / DG
GF / DG
GF / DG
Y2H (Library)
GF / DG
GF
GR (with DNA)
co-purification
B.subtilis (DnaX)
B. stearothermophilus
(DnaC)
E. coli
B.subtilis
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pyogenes
E. coli
Streptococcus pyogenes
B.subtilis
Streptococcus pyogenes
B.subtilis
B.subtilis
E. coli
○
co-purification
E. coli
Vales LD et al.,1982
×
○
○
×
○
○
×
○
○
×
○
○
×
×
co-purification
???
???
???
???
???
EM
co-isolation / Y2H
co-isolation / Y2H
GF/ DG
FRET / IP
FRET / IP
GF/ DG
AC / overlay blotting
E. coli
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
E. coli
Vales LD et al.,1982
Barnes MH et al.,2003
Barnes MH et al.,2003
21
Haroniti A et al.,2003
Bruck I et al.,2000
Bruck I et al.,2000
Bruck I et al.,2000
Bruck I et al.,2000
Noirot- MF et al.,2002
Bruck I et al.,2000
Young TW et al.,1998
Marsin S et al.,2001
Vales LD et al.,1982
Barnes MH et al.,2003
Barnes MH et al.,2003
Hirano M et al.,2002
Soppa J et al.,2002
Soppa J et al.,2002
Volkov A et al.,2002
Mascarenhas J et al.,2002
Mascarenhas J et al.,2002
Volkov A et al.,2002
Cheng B et al.,2003
付録 ４
既知の相互作用と本研究で検出された相互作用の比較
Category
Protein
Interactive
Protein
cell division
cell division
DivIC
FtsA
Result
Methods
Species
文献
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
B.subtilis
Thermus thermophilus
E. coli
Mycobacterium
Mycobacterium bovis
Sievers J et al.,2000
Feucht A et al.,2001
Wang X et al.,1997
Sievers J et al.,2000
Wang X et al.,1997
Wang X et al.,1997
Badet MA et al.,1997
Hadfield A et al.,1999
Cirilli M et al.,2003
Beaman TW et al.,2002
FtsL
FtsA
FtsZ
FtsL
DivIC
FtsZ
FtsA
FtsZ
GlmS (43.0%) GlmS
Asd (27.4%) Asd
DapB (45.9%) DapB
YkuQ (DapD) DapD
(35.1%)
×
×
○
×
○
○
×
×
○
×
NP / Y2H (Full length)
GF / NP (in vivo )
Y2H (Full length)
NP / Y2H (Full length)
Y2H (Full length)
EM / CR / Y2H (Full
???
dimer
crystallography
crystallography
cell wall
Alr (56.0%)
Alr
×
GF
cell wall
cell wall
TagD
TagG
TagD
TagH
×
○
cell wall
TagH
TagG
○
membrane lipid
AccA (53.8%) AccA
AccD
AccB (41.5%) AccB
AccC (55.9%) AccC
AccB
AccD (48.6%) AccA
AccD
AcpA
AcpS
FabD (31%)
FabF (54.0%)
FabG (51.2%)
AcpS
AcpA
AcpS
cell division
cell division
cell wall
cell wall
cell wall
cell wall
membrane lipid
membrane lipid
membrane lipid
membrane lipid
membrane lipid
×
○
○
×
○
○
×
○
×
○
○
○
○
Bacillus
psychrosaccharolyticus
crystallography
B. subtilis
genetic & similarity with B. subtilis
transporters
genetic & similarity with B. subtilis
ABC proteins
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
copurification
E. coli
E. coli
E. coli
crystallography
B. subtilis
Streptomyces coelicolor
E. coli
E. coli
crystallography
B. subtilis
crystallography
B. subtilis
22
Yokoigawa K et al.,2003
Pattridge KA et al.,2003
Lazarevic V et al.,1995
Lazarevic V et al.,1995
Cronan JE et al.,1996
Cronan JE et al.,1996
Cronan JE et al.,1996
Cronan JE et al.,1996
Cronan JE et al.,1997
Cronan JE et al.,1996
Cronan JE et al.,1996
Parris KD et al.,2000
Keatinge AT et al.,2003
Edwards P et al.,1997
Zhang YM et al.,2003
Parris KD et al.,2000
Parris KD et al.,2000
付録 ４
既知の相互作用と本研究で検出された相互作用の比較
Category
Protein
Interactive
Protein
membrane lipid
FabD (31%)
AcpA
membrane lipid
FabF (54.0%) FabF
AcpA (63.9%)
×
○
membrane lipid
purine/pyrimidine
purine/pyrimidine
cofactor
cofactor
cofactor
FabG (51.2%) AcpA (63.9%)
FabG
Eno
Eno
PfkA (86.2%) PfkA
Prs
Prs
TpiA (68.4%) TpiA
Gmk (42.7%) Gmk
NrdE (44.7%) NrdF (43.6%)
NrdF (43.6%) NrdE (44.7%)
NrdF (43.6%)
PyrG (64.9%) PyrG
Tmk (35.8%) Tmk
FolD (52.2%) FolD
GlyA (54.4%) GlyA
Dxr (48.7%) Dxr
○
○
×
×
○
×
×
○
○
×
○
○
×
×
×
cofactor
cofactor
Dxs (39.3%)
IspE
Dxs
IspE
×
×
cofactor
cofactor
cofactor
cofactor
cofactor
cofactor
cofactor
YacM (36.5%)
YacN (35%)
HepS
HepT
MenB (48%)
NadE
PpnK (YjbN)
(54.2%)
YacM
YacN
HepT
HepS
MenB
NadE
PpnK
○
○
○
○
○
×
×
glycolysis
glycolysis
glycolysis
glycolysis
purine/pyrimidine
purine/pyrimidine
purine/pyrimidine
Result
×
Methods
Species
computional prediction
Streptomyces coelicolor
from crystallographic data
GF
E. coli
computional prediction
E. coli
from crystallographic data
SPR / FRET (in vitro)
E. coli
crystallography
E. coli
octamer
B. subtilis
Bacillus
hexamer
B. subtilis
crystallography
Bacillus
GF
E. coli
enzymatic assay
Salmonella
enzymatic assay
Salmonella
enzymatic assay
Salmonella
CR
Lactococcus lactis
GF / DG
E. coli
GF
GF
Mycobacterium
NP
Synechocystis sp.
PCC6803
GF
Streptomyces sp. Strain
GF / MALD TOF MS /
E. coli
crystallography
GF
E. coli
DG / crystallography
Thermus thermophilus
GF / CR
B. subtilis
GF / CR
B. subtilis
crystallography
Mycobacterium
crystallography
B. subtilis
GF
E. coli
23
文献
Keatinge AT et al.,2003
Edwards P et al.,1997
Huang W et al.,1998
Xhang YM.,2003
Price AC et al 2001
Brown CK et al.,1998
Evans PR et al.,1986
Arnvig et al.,1990
Delboni LF.,1995
Gentry D et al.,1993
Jordan A et al.,1994
Jordan A et al.,1994
Jordan A et al.,1994
Wadskov SL et al.,2001
Tourneux L et al.,1998
D'Ari L et al.,1991
Chaturvedi S et al.,2003
Yin X et al,.2003
Kuzuyama T et al.,2000
Miallau L et al.,2003
Rohdich et al.,1999
Kishida H et al.,2003
Zhang YM et al.,1998
Xhang YM et al.,1998
Truglio JJ et al..,2003
Rizzi M et al.,1998
Kawai S et al.,2001
付録 ４
既知の相互作用と本研究で検出された相互作用の比較
Category
Protein
Interactive
Protein
cofactor
YqeJ (NadD) YqeJ
×
cofactor
cofactor
transcription
MetK (63.6%) MetK
TrxB (38.0%) TrxB
NusA (40.2%) RpoA (45.8%)
RpoB (46.0%)
RpoC (47.0%)
RpoA (44%)
RpoA
RpoB (55%)
RpoC (51%)
NusA (40.2%)
RpoB (55%)
RpoA (44%)
RpoC (51%)
SigA (53%)
NusA (40.2%)
RpoC (51%)
RpoA (44%)
RpoB (55%)
SigA (53%)
NusA (40.2%)
TopA (40.6%)
SigA (53%)
RpoB (55%)
RpoC (51%)
Cca (44%)
Cca
InfA (67.6%) InfB (50.5%)
InfB (50.5%) InfA (67.6%)
InfC (51.8%)
InfC (51.8%) InfB (50.5%)
Tsf (36.5%)
Tsf (72.8%)
TufA (72.8%)
TufA (72.8%) TufA
Tsf (36.5%)
○
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
○
×
○
transcription
transcription
transcription
transcription
RNA modification
translation
translation
translation
translation
translation
Result
Methods
Species
文献
crystallography / GF /
analytical
GF
crystallography
AC
AC
AC
crystallography
crystallography
crystallography
B. subtilis
Olland AM et al.,2002
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus
E. coli
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus
E. coli
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus
E. coli
E. coli
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus
Bacillus
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
Thermus thermophilus
Thermus thermophilus
Thermus thermophilus
Thermus thermophilus
Markham GD et al.,1988
Lennon BW et al.,1999
Liu K et al.,1996
Liu K et al.,1996
Liu K et al.,1996
Zhang G et al.,1999
Zhang G et al.,1999
ZhangG et al.,1999
Liu K et al.,1996
Zhang G et al.,1999
Zhang G et al.,1999
Murakami KS et al.,2002
Liu K et al.,1996
Zhang G et al.,1999
Zhang G et al.,1999
Murakami KS et al.,2002
Liu K et al.,1996
Cheng B et al.,2003
Murakami KS et al.,2002
Murakami KS et al.,2002
Li F et al.,2002
Boileau et al.,1983
Boileau et al.,1983
Boileau et al.,1983
Boileau et al.,1983
Wang Y et al.,1998
Wang Y et al.,1997
Wang Y et al.,1997
Wang Y et al.,1997
crystallography
crystallography
crystallography
crystallography
crystallography
crystallography
crystallography
crystallography
crystallography
CR
CR
CR
CR
GF
crystallography
crystallography
crystallography
24
付録 ４
既知の相互作用と本研究で検出された相互作用の比較
Category
Protein
Interactive
Protein
Result
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
AlaS (45.4%)
AsnS (55.4%)
AspS (52.0%)
GlyQ (63.7%)
tRNA synthetase
GlyS (35.3%)
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
HisS (45.7%)
LysS (53.3%)
MetS (71.6%)
AlaS
AsnS
AspS
GlyQ
GlyS (35.3%)
GlyQ (63.7%)
GlyS
HisS
LysS
MetS
tRNA synthetase
Methods
Species
文献
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
GF
crystallography
crystallography
Thermus thermophilus
Thermus thermophilus
Thermus thermophilus
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
tRNA synthetase
PheS (48.2%) PheS
PheT (39.9%)
PheT (39.9%) PheS (48.2%)
PheT
ProS (49.7%) ProS
SerS (51.9%) SerS
TrpS
TrpS
TyrS (70.6%) TyrS
×
×
×
×
×
×
×
×
HPLC
HPLC
HPLC
HPLC
couldn't read
tRNA synthetase
GatA
×
Enzymatic analysis
E. coli
Bacillus
stearothermophilus
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
B. subtilis
Bacillus
stearothermophilus
B. subtilis
Lechler et al.,1997
Berthert et al.,1998
Ng JD et al.,2002
Webster TA et al.,1983
Webster TA et al.,1983
Webster TA et al.,1983
Webster TA et al.,1983
Arnez JG et al.,1995
Onesti S et al.,1995
Mulvey et al.,1976
tRNA synthetase
GatB
×
Enzymatic analysis
B. subtilis
Curnow AW et al.,1997
tRNA synthetase
GatC
×
Enzymatic analysis
B. subtilis
Curnow AW et al.,1997
tRNA synthetase
heterotrimer with
GatB and GatC
heterotrimer with
GatA and GatC
heterotrimer with
GatA and GatB
crystallography
crystallography
crystallography
crystallography
25
Bobkova EV et al.,1991
Bobkova EV et al.,1991
Bobkova EV et al.,1991
Bobkova EV et al.,1991
Eriani G et al.,1990
Price S et al.,1993
Ala P et al.,1993
Brick P et al.,1989
Curnow AW et al.,1997
付録 ４
Category
既知の相互作用と本研究で検出された相互作用の比較
Protein
protein folding and GroEL
modification
(61.5%)
protein folding and GroES
modification
(46.2%)
Interactive
Protein
Result
Methods
Species
文献
GroEL
×
cryo-electron microscopy
E.coli
Ranson NA et al.,2001
GroES (46.2%)
GroEL (61.5%)
×
×
cryo-electron microscopy
cryo-electron microscopy
E.coli
E.coli
Ranson NA et al.,2001
Ranson NA et al.,2001
×
○
cryo-electron microscopy
crystallography
E.coli
E.coli
Ranson NA et al.,2001
Harrison CJ et al.,1997
×
×
crystallography
GF / DG
Harrison CJ et al.,1997
Chung JM et al.,2002
×
×
×
×
×
×
×
×
×
○
crystallography
crystallography
FRET in vitro
E.coli
Bacillus
stearothermophilus
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus
B. subtilis
E. coli
B. subtilis
E. coli
B. subtilis
E. coli
GroES
protein folding and GrpE (32.2%) GrpE
modification
DnaK (56.7%)
protein folding and Map (63%
Map
modification
partial)
secretion
Ffh (35.6%)
FtsY (50.2%)
secretion
FtsY (50.2%) Ffh (35.6%)
secretion
SecA
SecA
SecY
secretion
SecE
SecY
SecE (30.8%) SecE (30.8%)
secretion
SecY
SecE
SecA
unknown
Obg
L13 (RplM)
unknown
YqeN (HolA) DnaX (40%)
(28%)
DnaN (26.6%)
Metabolism of
RelA (39.1%) RelA
nucleotides and
nucleic acids
protein folding and DnaK
GrpE
modification
Metabolism,Amino DapA (45.5%) DapA
Acid
Metabolism,Lysine
FRET in vitro
CR (in vivo)
FRET in vitro
copurification / affinity
GF / DG
Focia PJ et al.,2004
Focia PJ et al.,2004
Ding H et al.,2003
Snyders et al.,1997
DingH et al.,2003
Kaufmann A et al.,1999
Ding H et al.,2003
Snyders et al.,1997
Scott JM et al.,2000
Streptococcus pyogenes Bruck I et al.,2000
×
×
copurification / CL / Y2H
B.subtilis
E.coli
Noirot MF et al.,2002
Yang X et al.,2001
×
crystallography
E.coli
Harrison CJ et al.,1997
○
crystallography
E.coli
Mirwaldt C et al.,1995
26
(a)
DnaA
DnaE
DnaG
HolB
付録 5
蛍光顕微鏡によるYFP融合タンパク質の局在
0.5mM IPTGを添加したLB培地で培養した対数増殖期の細胞から各YFP融合タンパク質の
局在を観察した。位相差、核様体、YFP融合タンパク質のfociを重ね合わせた像を表示して
いる。ここでは局在が見られたタンパク質について、その局在の種類を4パターンに分けて
それぞれ示した。
(a)染色体上にfociとして局在したタンパク質
(b)染色体上の一面に分布したタンパク質
(c)染色体を避けるように分布したタンパク質
(d)分裂隔壁に局在したタンパク質
27
(a)続き
DnaX
PriA
Ssb
HolA
YpuG
PolC
付録5 蛍光顕微鏡によるYFP融合タンパク質の局在
28
(a)続き
YpuH
Smc
(b)
SigA
付録5 蛍光顕微鏡によるYFP融合タンパク質の局在
29
(ｃ)
OdhB
YkqC
Ｙｅｒ
Ｑ
YpfD
(d)
FtsZ
付録5 蛍光顕微鏡によるYFP融合タンパク質の局在
30