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北米株およびヨーロッパ株による H5N2 型鳥インフルエンザウイルス 不
北米株およびヨーロッパ株による H5N2 型鳥インフルエンザウイルス 不活化ワクチンはアジア株 H5N1 型高病原性鳥インフルエンザウイルスから 鶏を防御する Avian Pathology (April 2006) 35(2), 141-146 David E. Swayne*、Chang-Won Lee、Erica Spackman 米国農務省農業研究部南東部家禽研究所（College Station Road 934、Athens、GA 30605、USA） ───────────────────────────────────────── 高病原性（HP：high-pathogenicity）鳥インフルエンザ（AI：avian influenza）ウイルスの サブタイプ H5N1 は、1996 年の初報以来、アジアの 9 つの国/地域の鳥類に空前の動物間流 行病を引き起こしている。将来的な根絶を目的としたこの感染の管理の方法としてワクチン 接種が浮上してきている。本試験は、ヨーロッパ株と北米株の低病原性 AI ウイルス由来の 2 種類の H5N2 型市販のワクチン株が、新しい H5N1 型 HPAI ウイルスアジア株から鶏を防御 する可能性を判定するために実施された。ワクチンウイルスである北米株およびヨーロッパ 株と、感染攻撃ウイルスである H5N1 型 HPAI インドネシア株の血球凝集素蛋白 HA1 セグ メントのアミノ酸配列の相同性は、各々84％および 91％と推定された。これら 2 種のワクチ ン株は、臨床症状および死亡に対して完全な防御効果を示した。これらのワクチンによって 感染個体数の減少がみられ、ウイルス増殖のピーク時における呼吸器・腸管からの排出ウイ ルス数は減少した。さらに、排出されるウイルス量は 50％胚感染量で 10 4∼105 減少した。 ワクチン接種群内の感染鶏は、特異的ノイラミダーゼ阻害試験によって同定が可能であった。 以上のデータから、現在利用可能なヨーロッパ株および北米株系 H5 ワクチンは、H5N1 型 HPAI ウイルスアジア株から鶏を防御し、H5N1 型 HPAI ウイルスによる環境汚染を低減させ ることが示唆される。これらのワクチンは、ウイルス伝播を低減させるためのバイオセキュ リティ対策の有効な手段の 1 つとなると考察される。 ───────────────────────────────────────── 緒言 高病原性（HP）H5N1 型鳥インフルエンザ（AI）アジア株は、1996 年に中国の食用ガチョ ウで最初の大発生が報告され（Xu ら、1999）、その後、香港や中国で大発生が続いている（Sims ら、2003a、b；Chen ら、2004）。2003 年 12 月からは、東アジアおよび東南アジアの 9 カ国 において、家禽、野生鳥類または捕獲された非家禽鳥類において H5N1 型 HPAI の発生が報 告された（Li ら、2004；Lee ら、2005）。コントロール対策の主要措置として、隔離、殺処 分、清掃洗浄および消毒が用いられた（FAO 2004）。さらに、中国、香港およびインドネシ アでは、この疾患の予防または管理に有効な対策として、最終的な根絶を目的とした H5 型鳥 インフルエンザ不活化ワクチンを用いたワクチン接種プログラムが制定されている（FAO、 2004）。 1 市販および実験的 H5 型 AI 不活化ワクチン、H5 型 AI 血球凝集素遺伝子を組み入れた遺伝子 組換え鶏痘ワクチンおよびバキュロウイルス圧搾血球凝集素蛋白ワクチンが、人および鶏か ら分離された H5N1 型 HPAI ウイルス 1997 年香港株に対して鶏を防御することは、これま でに明らかとなっている（Swayne ら、2000a、b、2001）。香港は、1997 年からの 3 度にわ たる H5N1 型 HPAI の大発生を受けて、2002 年 4 月、生鳥市場で販売する農場で飼育される 鶏に対してのワクチン接種プログラムを導入した（Sims ら、2003a）。1994 年にメキシコの 鶏から分離された低病原性（LP：low-pathogenicity）H5N2 型 AI ウイルス株を含有する現 行の市販の不活化ワクチンを使用した。2003 年、このワクチン接種プログラムは範囲を広げ、 中国本土から輸入される全ての鶏が対象となった（Ellis ら、2004c）。このワクチン接種プロ グラムの導入後、鶏において鳥インフルエンザの罹患や死亡の発生は見られていない（Ellis ら、2004b、c）。 十分な予防効果を得るために頻繁な変更が必要なヒトインフルエンザワクチン株とは異な り、鶏用の H5 型 AI ワクチンは分離された H5 型 AI ウイルスに対して長年にわたり予防効 果を示すことが証明されている（Swayne ら、1999、2000a、b）。しかし、最近、メキシコ で 9 年間使用された H5N2 型不活化ワクチンを再評価したところ、野外ウイルスの顕著な変 異がみられ、もはや中央アメリカに蔓延している H5N2 型 LPAI ウイルスに対しては予防効 果がないことが判った（Lee ら、2004）。本試験は、インドネシアの鶏から分離された H5N1 型 AI ウイルス 2003 年アジア株に対して、現在市販されている異なるバックグラウンドを持 つ 2 種類のワクチンの防御効果を判定するために実施された。 材料および方法 ウ イ ル ス ． ワ ク チ ン ウ イ ル ス は 市 販 の ワ ク チ ン を 供 試 し 、 こ れ は LPAI ウ イ ル ス 株 A/duck/Potsdam/1402/86 （ H5N2 ）（ Potsdam/96 ）（ Matrosovich ら 、 1999 ） お よ び A/chicken/Mexico/232/94（H5N2）（Mexico/94）（Lee ら、2004）由来であった。感染攻撃ウ イルスは、HPAI ウイルスアジア株 A/chicken/Indonesia/7/03（Indonesia/03）を使用した。 このウイルスは、2003 年 12 月初旬にブロイラーで高死亡率が発生した 1 農場から提出され た診断材料から分離された。AI ウイルスは、全て、標準法により（Swayne ら、1998）、9 日 齢発育鶏卵の尿膜腔内に接種して増殖させた。 ───────────────────────────────────────── 連絡先： TEL: +1 706 546 3433、 FAX: +1 706 546 3161、E-mail：[email protected] 2005 年 8 月 22 日受付、2005 年 10 月 29 日条件付き受理。2005 年 11 月 28 日受理。 ISSN 0307-9457（印刷物）/ISSN 1465-3338（オンライン）/06/20141-06©2006 Houghton Trust Ltd DOI:10.1080/03079450600597956 2 ワクチン中 AI ウイルスの定量．ワクチンウイルス定量のための RNA 抽出。オイルエマルジ ョンワクチンから RNA を抽出する特殊な方法を開発した。ワクチンは、回転式振とう器を用 いて室温で中速度 30 分間混和後、100 µL を取り分け、ヌクレアーゼ不含水 150 µL と Trizol LS 試薬 750 µL（Invtirogen, Inc. Carlsbad, California、USA）を添加した。そのサンプル を、ボルテックスで混和、室温にて 7 分間インキュベート後、クロロホルム 200 µL を添加し た。さらに、室温にて 7 分間インキュベート後、14000 x g、15 分間遠心分離した。上部 2 層を同時に取り、同量の RLT 緩衝液（Qiagen, Inc., Valencia, California, USA）および同量 の 70％エタノールを添加して、転倒混和した。Qiagen RNeasy カラム（Qiagen, Inc.）に注 入し、キットの使用法に従って洗浄およびヌクレアーゼ不含水に溶出させた。オイルエマル ジョンワクチンからの各 RNA の抽出は、各々6 回反復し、再現性を確認した。 定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応．定量標準物質として相同なウイルス分離 株を使用した。尿膜腔液ウイルス保存株をブレインハートインヒュージョン培地 （Becton-Dickinson, Sparks, Maryland, USA）で希釈し、標準法にしたがって（Swanye ら、 1998）発育鶏卵の希釈倍数で滴定した。同じ方法で、ワクチンサンプルからウイルスの全 RNA を抽出した。インフルエンザマトリックス遺伝子についてリアルタイム逆転写酵素ポリメラ ーゼ連鎖反応（RRT-PCR）を実施した（Spackman および Suarez、2005）。全 6 種の RNA 抽出物は、サンプルごとに個別に測定を行った。既に報告されているように、オイルエマル ジョンワクチンから抽出した RNA には AI ウイルスは含まれていなかったので、陰性対照と して使用した。ワクチン中の血球凝集素（HA）蛋白量は、ワクチンの感染価および HA 蛋白 量を報告した過去のデータ（Swayne ら、1999）から算出した。 系統発生解析および塩基配列の比較．ワクチンウイルスの塩基配列は Genbank より入手し （AF082042 および AV497063）、感染攻撃ウイルスの塩基配列は Genbank に提出した （Genbank 承認番号申請中）。これら 3 種のウイルス全ての血球凝集素遺伝子 HA1 領域につ いて、Clustal W アルゴリズム（Lasergene, DNASTAR Inc., Madison, Wisconsion, USA） を用いてアライメントを行った。500 回のブートストラップを実施した発見的探索法による最 大節約系統樹作製法を用いた PAUP* 4.0b10（Sinauer Associates, Inc., Sunderland, マサチ ューセッツ州、USA）で系統樹を作成した。 動物および飼育．米国農務省南西部家禽研究所で維持されていた鶏群より 3 週齢の SPF 白色 レグホン種を入手した。試験のワクチン接種および感染攻撃のため、鶏は陰圧のステンレス 製アイソレーションキャビネット内で飼育した。HEPA フィルターでろ過した空気で換気を 行い、連続照明とした。感染攻撃試験は全て、米国農務省の承認を受けたバイオセイフティ レベル 3 の農場施設で実施した。飲水および飼料は自由摂取とした。 3 試験計画．1 群あたり 10 羽の鶏の頚部に皮下に、Nobilis Hepatitis +ND 不活化（Intervet、 Boxmeer、オランダ：プラセボ）、Nobilis IA 不活化（Mexican/94）および Nobilis インフル エンザ H5N2（Potsdam/86）の 3 種類のワクチン各 0.5 ml を接種した。 ワクチン接種後 3 週間目に HPAI ウイルス indonesia/03 株 106.0 50％胚致死量（ELD50 ）を鶏の鼻腔内に接種 し、感染攻撃を行った。臨床症状を感染攻撃後 14 日間記録し、ワクチンによって得られる防 御効果を確認した。臨床症状としては、削痩、うずくまり姿勢、起立遅延または不能ならび に翼の下垂、そして死亡が観察された。 ワクチン接種日、感染攻撃日、感染攻撃後 14 日に、各個体から血清を採取した。核蛋白/マト リックス蛋白に対する抗体の有無（寒天ゲル沈降[AGP]試験）、血球凝集素（血球凝集素阻害 [HI]試験）およびノイラミダーゼ（ノイラミダーゼ阻害[NI]試験）について血清を検査した （Van Deusen ら、1983、Swayne ら、1998）。HI 試験では、10 倍以上の力価を陽性とみな した。感染攻撃後 2 日に口咽頭および総排泄腔ぬぐい液を採取し、標準法にしたがって （Swayne ら、1998）10 日齢 SPF 発育鶏卵でのウイルス分離および力価測定を実施した。予 備試験では、感染攻撃後 2 日の分離ウイルス力価が最も高かった。力価はぬぐい液 1 ｍL あ たりの ELD50 で示した。 統計分析．パーソナルコンピュータ用ソフトウェア（SgimaStat 2.0, Jandel Scientific, San Rafel、カリフォルニア州、USA）を用い、罹患率、死亡率、ウイルス分離率および抗インフ ルエンザウイルス抗体検出率の有意性（P<0.05）を Fisher の正確確率検定により検定した。 ウイルス分離および血清 HI 力価の正規性を検定した。正規分布していたデータセットは、パ ラメトリックな一元配置分散分析（ANOVA）でさらに検定した。これらの有意差のある ANOVA データセットは、さらに Student-Newman-Keuls の多重比較検定で検定した。デー タセットが正規分布していない場合は、ノンパラメトリックな分散分析法（Kruskal-Wallis） で解析し、有意差のある群（p<0.05）については Dunn の多重比較検定を行った。正規性、 ANOVA、Kruskal-Walis、Student-Newman-Keuls および Dunn の検定は、パーソナルコン ピュータ用ソフトウェア（SigmaStat）で行った。 本試験のウイルス分離法によって検出された最小ウイルス力価は 101.0 ELD50 /ml であった。 したがって、統計分析では、ウイルスが分離されなかった全ての口咽頭および総排泄腔ぬぐ い液を 100.9 ELD50 /mL とした。これは、1 サンプルあたり発育鶏卵 3 個を使用するのではな く、発育鶏卵 4 個を使用するようにウイルス分離法を変更した場合の最低ウイルス検出レベ ルに相当する。 結果 ワクチン中 AI ウイルス量の定量．AI ウイルス標準力価曲線および定量的 RRT-PCR より、 Potsdam/86 および Mexico/94 AI ウイルス分離株を含有するワクチンのウイルス力価はワク 4 チン 1 mL あたり各々105.1 および 105.9ELD50 に相当した。血球凝集素蛋白に関する以前の力 価測定（Swayne ら、1999）から、Potsdam/86 および Mexico/94 AI ウイルス分離株 1 mL 中の HA 蛋白量は各々0.025 および 0.16 µg、すなわち 接種 1 回あたりの HA 蛋白量は各々 0.0125 および 0.08 µg に相当すると考えられる。 系統発生解析および塩基配列比較．感染攻撃ウイルス Indonesia/03 と 2 種類の AI ワクチン ウイルスの HA1 遺伝子配列を比較した。感染攻撃ウイルス indonesia/03 株は、Mexico/94 分 離株よりも Potsdam/86 株により近縁であった（図 1）。Potsdam/86 分離株と 感染攻撃ウイ ルス Indonesia/03 株のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の相同性は、各々89.4％および 91.9％であった。Mexico/94 分離株と感染攻撃ウイルス Indonesia/03 株のヌクレオチドとア ミノ酸配列の相同性は、各々78.5％および 84.8％であった。3 種の分離株はともに、11 番お よび 286 番に N 結合型糖鎖付加の可能性のある同一部位が存在する。 5 血清学的検査．ワクチン接種日の AGP、HI（H5）、および NI（N1、N2）抗体は、全個体 とも陰性であった。感染攻撃日、プラセボワクチン群では抗 AI 抗体陰性であった（表 1）。 しかし、Mexico/94 および Potsdam/86 H5N2 型ワクチン群では、ワクチン接種 3 週間後に AGP および HI 抗体が各々100％および 90％誘導され、感染攻撃後 14 日目に生存した個体の AGP および HI 抗体保有率は 100％であった。感染攻撃日の平均 HI 力価については、2 種類 の AI ワクチン群に有意差は認められなかった。感染攻撃後 14 日には、両 AI ワクチン群の力 価が 3 倍に上昇し、既往応答が見られた。数字の上では Mexico/94 群の平均力価の方が高い が、Potsdam/86 群の平均力価との有意差は認められなかった（表 1）。NI 抗体に関して、 H5N2 型ワクチン群では、感染攻撃前および感染攻撃後ともに N2 抗体が 100％確認されたが、 N1 抗体が確認されたのはわずかな割合であり H5N1 型 HPAI ウイルスによる感染攻撃後に 6 限られていた。 罹患率、死亡率および感染率．Indeonesia/03 株による感染攻撃後、プラセボ群では全個体が 臨床徴候を発現し、死亡した（表 2）。感染攻撃後 2 日には、プラセボ群全個体の口咽頭およ び総排泄腔から、高力価のウイルスが回収された。2 種類のワクチンは、臨床症状および死亡 を 90∼100％予防した。Potsdam/86 接種群では 1 個体が臨床症状を発現し、死亡した。この 個体は、感染攻撃日に抗 AI 抗体が確認されなかった。 ウイルス排出ピーク時（感染攻撃後 2 日）の調査では、2 種類のワクチンによって感染個体 数および排出される感染攻撃ウイルス数は減少した。総排泄腔ぬぐい液では、ワクチン接種 群のウイルス排出個体数は減少し、プラセボ投与群と比べて有意に少なかった。しかし、ワ クチン接種群間のウイルス排出個体数には有意差は認められなかった。口咽頭ぬぐい液では、 プラセボ群に対して Mexico/94 群は有意に減少していたが、2 種類のワクチン群間には有意 差は認められなかった（表 2）。2 種類のワクチン群では、排出される感染攻撃ウイルス量が プラセボ群と比べて 104∼105EID50/1 mL 有意に減少していたが、排出される感染攻撃ウイル ス量にはワクチン接種群間の差は認められなかった（表 2）。 考察 本試験において、2 種類の市販の H5N2 型 AI ワクチンは両方とも、高用量の H5N1 型 HPAI ウイルス 2003 年インドネシア株で感染攻撃した鶏に対し同等の防御効果を示した。この防御 効果とは、死亡および臨床症状の予防、感染攻撃後 2 日目の感染個体数および呼吸器・消化 管から排出される感染攻撃ウイルス量の減少、ならびに抗インフルエンザウイルス抗体の産 生であった。既報では、ウイルス複製のピーク日だけでなくピーク前後の数日間にわたり感 染個体数および呼吸器・腸管から排出される LPAI または HPAI 感染攻撃ウイルス量の減少 が明らかとなっている（Stone、1987；Kodihalli ら、1994）。しかし、このような予防効果 は、ワクチン接種済みの鶏がまったく感染しない、あるいは少量のウイルスさえ排泄しない 7 ことを示しているわけではない。臨床的に疾病が認められずに感染している個体（すなわち 「不顕性感染」）が存在していることから、野外での AI ウイルスの伝播、拡散および維持を 予防するための管理戦略にはバイオセキュリティ対策の導入が必要である（Swayne ら、 1997；Swayne および Akey、2005）。有効な予防接種によって、家禽間の HPAI ウイルスの 接触感染が低減したことがこれまでに報告されている（Swayne ら、1997）。 有効なワクチンには適量の HA が不可欠であるが、従来の検査法を用いた HA 含量の定量に は問題がある。この方法では、油脂や乳化によって最終製品を製剤化する前に、HA 蛋白、血 球凝集単位または感染力価を測定する。HA 蛋白含量の測定は、最も直接的な方法であるが、 複雑で比較的感度が低い方法であるためウイルスを大量に増殖させる必要があり超遠心で濃 縮し一元放射免疫拡散法で測定する（Wood ら、1985；Swayne ら、1999）。血球凝集単位は HA 蛋白含量の間接測定法として使用されているが HA 蛋白含量との相関性は低く、感染力価 は HA 含量との相関性が良好である（Swayne ら、1999）。一方、間接定量的 RRT-PCR は、 HA 含量と相関している RNA 量を技術的に正確に測定するもので、ワクチンを製剤化する前 でも製剤化した後でも使用することができる。各サンプルを各々6 回測定した結果は、今回の 測定では 1.5 サイクルの標準偏差の正常範囲内であったので、定量的 PRT-PCR 測定は有望で あると考えられる（Spackman および Suarez、2005）。さらに、PRT-PCR 産物のサイズは 小さく 99 塩基対であるため、ワクチン中での RNA 分解の影響は軽微なものと考えられる。 本試験では、定量的 RRT-PCR 測定を用いてワクチン中の HA 含量を測定し、ウイルス感染 力価と比較して HA 蛋白含量を求めた。 既報では、Mexico/94 ワクチン株 HA 蛋白 0.016 µg は、感染攻撃ウイルス H5N2 型 HPAI メキシコ株（A/chicken/Queretaro/14588-19/94 [H5N2]）に対して 50％感染予防量（PD50） であった（Swayne ら、1999）。本試験における Mexico/94 および Potsdam/86 ワクチンの HA 蛋白含量は各々0.0125 および 0.08 µg と優れており、臨床徴候および死亡に 90~100％の 防御効果を示し、感染攻撃ウイルス inndonesia/03 株の複製を大幅に抑制した（104∼105 に 対して 101∼102.1EID50/mL）。鶏の週齢、ワクチン接種経路と部位および感染攻撃ウイルス量 は両試験間で同一であったことから、この優れた防御効果は独自のアジュバントシステムに よるものと考えられる。既報では Mexico/94 ワクチンと H5N2 型 HPAI 感染攻撃ウイルス株 8 の HA1 アミノ酸配列の相同性は 98.2％であったのに対して（Swaine ら、1999）、本試験に おけるワクチンと感染攻撃ウイルス間の HA1 アミノ酸配列の相同性は各々89.4 および 91.9％にすぎなかったにもかかわらず優れた防御効果が明らかであった。鶏痘-H5 型 AI 遺伝 子組換えワクチンに関する鶏を対象とした研究では、感染攻撃ウイルスとワクチン株間の口 咽頭ぬぐい液の力価低下の亢進と HA アミノ酸配列の相似性の増大（87.3％∼100％）の間に 有意な相関性が証明された。しかし、不活化ウイルスワクチンを使用した別の試験では、ワ クチンと感染攻撃ウイルスの HA アミノ酸配列の相同性（91.7％∼100％）とは関係なく、口 咽頭ぬぐい液での複製がかなり減少していることが証明された（Swayne、1999、2000a）。 香港では、2002 年以降、Mexico/94 ワクチン株が使用されており、鶏に防御効果を示し、野 外の AI 対策に有効であることが証明されている（Ellis ら、2004a、b）。従来の AI 北米株不 活化ワクチン、H5N1 型 AI リバースジェネティックスワクチンおよび AI H5 遺伝子を組み 込んだ遺伝子組換え鶏痘ワクチンなど、その他のワクチンが、多様な H5N1 型 HPAI アジア 株に防御効果があることは実験室内で証明されている（Swayne ら、2001；Liu ら、2003； Qiao ら、2003；Swayne、2004；Swayne および Beck、2005）。このことは、人の A 型イン フルエンザのサブタイプ H1 および H3、ならびに B 型インフルエンザワクチン株では抗原性 が急激に変異するため頻繁に変更しなければならないが、家禽の H5 型 AI ワクチン株ではこ のような必要性はないことを示唆している。しかし、家禽感染攻撃モデルにおける AI ワクチ ンウイルスの評価は、蔓延している野外ウイルスに対する防御効果を評価するために、少な くとも 2 年毎に行う必要がある。防御効果が不十分であれば、ワクチン株を変更する必要が ある。さらに、十分な抗原量の高品質のワクチンだけを認可し、使用しなければならない （Garcia ら、1998）。 家禽集団における AI ウイルス感染の有病率を評価する際にはサーベイランスが不可欠であり、 コントロール対策の各項目の有効性を評価するには適切な特異的血清学的サーベイランスが きわめて重要である（Swayne および Suarez、2000）。適正に計画された血清学的サーベイ ランスなしにワクチン接種を行うと、ワクチン接種群内における感染の検出および科学的な 根拠に基づいたコントロールプログラムの変更実施が妨げられるために、根絶への取り組み は大幅に制限されると考えられる（Capua ら、2003；Swayne、2003）。AGP、ELISA およ び HI などの従来の血清学的検査は、各々、核蛋白/マトリックス蛋白に対する抗体ならびに 血球凝集素を検出するもので、不活化全粒子 AI ワクチンの接種によって誘導される。このよ うなワクチン接種集団において感染を検出するには、ワクチン未接種の指標個体の AGP およ び HI 試験、ワクチン接種個体の非構造蛋白または異種ノイラミダーゼに対する抗体を検出す る特殊な試験など、特別な検出法をあらかじめ計画した上で実施する必要がある（Beard、 1987；Swayne および Suarez、2000；Capua ら、2003；Swayne、2003；Tumpey ら、2005）。 本試験では、H5N2 型 AI ワクチン接種群において AGP、HI（H1）および NI（N2）抗体が 9 証明された。Mexico/94 ワクチン接種群 10 羽中 6 羽の HI 既往応答が≧3 log2 で認められた にもかかわらず、N1NI 抗体が検出されたのは H5N1 型 HPAI ウイルスで感染攻撃後におい てワクチン接種群の少数の個体のみであった。このことから、NI 試験は、その感度が HI 既 往応答よりも低いために不活化ワクチン接種免疫群で感染を検出するための個別検査法とし ては実用的ではないが、農場レベルでの検出には有用であることが示唆される。野外では、 ワクチン未接種のおとり鶏およびワクチン接種群の異種ノイラミダーゼ試験の両方に使用さ れ、成果をあげている（Halvorson、2002；Capua ら、2003：Swayne および Akey、2005）。 最後に、定量的 RRT-PCR は、さらに評価の必要はあるものの、抗体に基づく放射免疫拡散 法とは異なり抗原性変異の影響を受けず、オイルエマルジョンワクチンの HA 含量の評価に 使用することが可能だと考えられ、また、最終製品の定量的評価が可能であるという有効性 もあわせ持っている。 謝辞 本試験における Joan Beck、Scot Lee および James Doster の技術的支援に深謝する。 図 1 の説明： 選抜した H5 サブタイプの血球凝集素遺伝子 HA1 セグメントの系統樹。この系統樹は、500 回のブートストラップを実施した発見的探索法による最大節約系統樹作成法を用いた PAUP 4.0BI0 によって作成した。配列間の距離は系統樹に示す。本試験で使用したワクチンウイル スには下線をつけ、感染攻撃株は太字で表す。CK；鶏、DK；アヒル、TK；七面鳥。州は、 2 文字の標準郵便番号で示す。 表 1 の説明： 3 週齢でワクチン接種し、6 週齢で HPAI ウイルス Indonesia/03 株 106.0 EID50 で感染攻撃し た鶏群の血清学的データ 1/ワクチン群 2/血清 AGP 試験（陽性数/総数） 3/感染攻撃前 4/感染攻撃後 5/血清 HI 試験 a（陽性数/総数）（GMT） 6/血清 NI 試験 a（陽性数/総数） 7/プラセボ Mexican/94 European/86 8/ 感染攻撃前はワクチン接種後 3 週間であり、攻撃感染後は感染攻撃後 2 週間であった。 a ワクチン接種日、全個体の抗 AI ウイルス抗体は陰性であった。HI 力価は、相乗平均力価 10 （GMT）として報告した。 大文字は、各々、処置群間の有意差を意味する（Fisher の正確確率検定、P<0.05）。小文字 は、各々、一元配置 ANOVA、正規性検定が否定された場合の Kruskal-Wallis の順位による 一元配置 ANOVA、または感染攻撃後の血清 HI 試験で第 2 群と第 3 群を比較する場合の Mann-Whitney の順位和検定を用いた処置群間の有意性（P<0.05）を示す。 表 2 の説明： 3 週齢で AI 不活化ワクチンを接種し、6 週齢で HPAI ウイルス Indonesia/03 株 106.0 EID50 で経鼻感染攻撃した鶏群の罹患率およびウイルス分離データ 1/ワクチン群 2/罹患率（病鳥数/総数） 3/死亡率（死亡数/総数）（死亡までの平均期間[日]） 4/感染攻撃後 2 日目のウイルス分離 5/（陽性数/総数、log10 EID50 力価/mL） 6/口咽頭ぬぐい液 7/総排泄腔ぬぐい液 8/プラセボ Mexican/94 Potsdam/86 9/大文字は、各々、処置群間の有意性を表す（Fisher の正確確率検定、P<0.05 ）。小文字は、 各々、一元配置 ANOVA または正規検定が否定された場合の Krusakal-Wallis の一元配置 ANOVA 順位検定を用いた処置群間の有意性（P<0.05）を表す。 11 12 13