Get pureDNA Kit - Agarose

カードマニュアルは下記アドレスからダウンロードできます。
http://www.dojindo.co.jp/manual/gk01.html
Technical
Manual
Get pureDNA Kit - Agarose
200 samples
はじめに
キット内容
キット以外に必要な試薬・機器類
保存方法
注意事項
キットの使用方法
トラブルシューティング
フローチャート
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P2
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P3
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1
はじめに
アガロース電気泳動後の目的 DNA の回収には、透析膜を用い
た電気泳動濃縮法、アガラーゼのようなゲル分解酵素を用いた
方法、シリカ担体を用いた方法等が汎用されています。中でも
シリカ担体を用いた方法はキットとして市販されていますが、
1)処理するゲルの使用量に制限がある、2)高分子量の DNA では
回収量が低い、という問題がありました。
Get pureDNA Kit-Agarose はゲル溶解剤、ゲル除去剤および
DNA 共沈剤で構成され、目的 DNA を簡便に高回収率で回収し
ます。DNA はペレットで回収されますので、バッファーで目的
濃度の水溶液に調製でき、PCR、ライゲーション等にそのまま
ご使用頂けます。
キットの使用方法
ゲルスライスは 200 mg 以下でご使用下さい。
Step 1
EtBr 等で染色したアガロースゲルから目的のバンド
を切り出す。
TAE 及び TBE buffer で泳動したゲルがご使用できます。ゲ
ル濃度 3%以内でご使用下さい。
Step 2
切り出したゲルを 1.5 ml 遠心チューブに入れ、ピペ
ットチップなどで細かく砕く。
Step 3
Gel lysis buffer 300μl を加え、60℃で 10 分間イン
キュベーションする。2∼3 分毎に vortex する。
キット内容
ゲルが完全に溶解していない場合は加温時間を延長し完全
にゲルを溶解させてください。
・Gel lysis buffer
65 ml x 1 本
・Precipitation solution 65 ml x 1 本
・Ｃo-precipitation solution (20 mg/ml glycogen)
0.5 ml x 1 本
保存方法
本キットは 冷蔵保存（0∼5℃）して下さい。
Step 4
Precipitation solution を添加すると沈殿が析出します。
Step 5
13,000×g 以上で 5 分間遠心分離する。
Step 6
上澄みをピペットで新しい 1.5 ml 遠心チューブに移
す。
上澄みに沈殿物が混入している際は、再度遠心分離し上澄
みのみを回収して下さい。
キット以外に必要な試薬・機器類
・
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・
・
・
・
100％エタノール
70％エタノール
1.5 ml 遠心チューブ
マイクロピペット及びチップ
ボルテックスミキサー
60℃恒温槽
ゲルが完全に溶解した後、室温に 2 分静置する。
Precipitation solution 300μl を加え、転倒混和する。
Step 7
Co-precipitation solution 2μl を加え、5 秒間 vortex
する。更にエタノール 800μl を加え 5 秒間 vortex
する。
Step 8
13,000×g 以上で 3 分間遠心分離し、上澄みをピペ
ットで除去する。
上澄みを完全に除去してください。微量の上澄みの残存に
より、PCR 反応を阻害することがあります。完全に上澄み
を除去するために、除去の最終段階では、最小容量用マイ
注意事項
クロピペット(<20 μl)のご使用をお勧めします。
＊ゲルを切出す際、余分なゲルはなるべく含まないようにして下さい。
＊ゲル重量が 200 mg 以上の場合は、ゲル重量の 1.5 倍容量の Gel lysis
buffer 及び Precipitation solution、4 倍容量のエタノール及び 70％ エタ
ノールをご使用下さい。Co-precipitation solution は 2μl ご使用下さい。
またその際 1.5 ml チューブはご使用になれませんのでご注意下さい。
＊ゲルスライスを切り出す際は、短波長の UV 照射を避け、照射をできるだ
け短時間で行ってください。
Step 9
DNA ペレットに 70% エタノールを 1 ml 加え、5 秒
間 vortex する。13,000×g 以上で 3 分間遠心分離し、
上澄みをピペットで除去する。同じ操作をもう一度
繰り返す。
Step 10 DNA ペレットはそのまま保存するか、TE buffer (10
mmol/l Tris、1 mmol/l EDTA)に溶解する。
2
トラブルシューティング
1)
フローチャート
DNA が回収できない、または回収率が低い。
Gel slice (---Step 1, 2)
300 µl Gel lysis buffer (---Step 3)
インキュベート（60℃,10 分以上）
-ゲルスライスを完全に溶解してください（（2）を参照）。
-遠心操作後、使用するチューブによっては DNA ペレットがチューブ壁
室温、2分間静置 (---Step 4)
300 µl Precipitation solution
転倒混和
面にしっかりと付着していない場合があります。上澄み除去の際に、
DNA ペレットを吸い込まないようご注意ください。
2)
ゲルが溶解しにくい。
-1.5 ml チューブ内でゲルスライスをあらかじめ細かく刻んでください。
-加温溶解の際、サンプル溶液を 2 分毎にピペッティングまたは vortex
してください。
-加温時間を延長し完全にゲルを溶解させてください。
3)
室温で遠心分離 (13,000xg以上、5 分間) (---Step 5)
*上澄みに沈殿物が混入している際は再度
遠心分離し上澄みのみを回収して下さい
*
上澄み (---Step 6)
2 µl Co-precipitation solution (---Step 7)
5 秒間 vortex
800 µl エタノール添加
5 秒間 vortex
Step 6 の遠心分離後の沈殿物が固くパックされていない。
-ゲルスライスを完全に溶解し Precipitation solution を加えてください。
-Precipitation solution を加えた後、均一になるようタッピングまたは
vortex を行ってください。
-13,000xg 以上の遠心が困難な場合は、フルスピードでの遠心時間を長
室温で遠心分離 (13,000xg以上、3 分間) (---Step 8)
沈殿
くし沈殿物が完全にパックされるまで遠心して下さい。尚、遠心操作は
室温以下で行って下さい。
4)
1 ml 70-75％エタノール (---Step 9)
5 秒間 vortex
室温で遠心分離 (13,000xg以上、3 分間)
取り出した DNA の純度が低い。
-Step 6 で白色沈殿物をピペットで吸いこまないようご注意ください。
吸いこんだ場合は再度遠心分離し上澄みのみを回収して下さい。
沈殿
(---Step 10)
-Step 8 及び 9 において上澄み除去の最終段階では、最小容量用のマイ
クロピペットを使用し、上澄みを完全に除いてください。
<開発元>
<委託製造元>
Dojindo Molecular Technologies, Inc.
株式会社同仁化学研究所
211 Perry Parkway, Suite 5, Gaithersburg, MD 20877
Telephone : +1-301-987-2667
Fax : +1-301-987-2687
URL : http://www.dojindo.com/
Tel: 096-286-1515(代表) Fax: 096-286-1525
ドージン・イースト（東京）
Tel: 03-3578-9651(代表) Fax: 03-3578-9650
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