チューブリンねじれ変異株を用いた 微小管配向形成機構の解析

博士論文番号：0481003
チューブリンねじれ変異株を用いた
微小管配向形成機構の解析
石田
喬志
奈良先端科学技術大学院大学
バイオサイエンス研究科
（橋本
隆
植物遺伝子機能学講座
教授）
平成１９年５月１日提出
目次
Ⅰ .序 論
図表
-----------------------------
1
6
Ⅱ .材 料 と 方 法
図表
-----------------------------
10
14
Ⅲ .結 果
図表
-----------------------------
22
31
Ⅳ .考 察
図表
-----------------------------
52
60
Ⅴ .謝 辞
---------------
61
Ⅵ .参 考 文 献
---------------
62
Ⅰ.
序論
微小管は真核生物において高度に保存されている細胞骨格の一つである。
α -チ ュ ー ブ リ ン と β -チ ュ ー ブ リ ン の ２ つ の タ ン パ ク が 結 合 し た ヘ テ ロ ダ イ
マ ー が そ の 構 成 単 位 と な り 、こ の ヘ テ ロ ダ イ マ ー が 長 軸 方 向 に 長 く 積 み 重 な
っ て 微 小 管 原 繊 維 が 形 成 さ れ る 。 さ ら に 長 軸 方 向 に 向 け て 13 本 の 原 繊 維 が
全 て 同 じ 方 向 に 、 平 行 に 並 ん で 直 径 約 25nm の 円 筒 状 の 構 造 を と る 。 微 小 管
の 中 で は 、チ ュ ー ブ リ ン は 縦 方 向 、横 方 向 の 相 互 作 用 に よ っ て 安 定 的 に そ の
位 置 を 保 っ て い る 。 微 小 管 に は 極 性 が あ り 、 一 方 の 端 は β -チ ュ ー ブ リ ン が
位 置 す る プ ラ ス 端 、反 対 側 は α -チ ュ ー ブ リ ン が 位 置 す る マ イ ナ ス 端 で あ る 。
生 理 条 件 に お い て 、微 小 管 は 新 た な ヘ テ ロ ダ イ マ ー が 重 合 す る こ と で 伸 長 し 、
逆 に 脱 重 合 す る と 短 縮 す る 。こ の 重 合 と 脱 重 合 と を 繰 り 返 す 性 質 は 動 的 不 安
定 性 (dynamic instability)と 呼 ば れ 、 細 胞 内 に お い て 微 小 管 が 機 能 す る 際 に 非
常 に 重 要 な 性 質 で あ る （ 図 .１ ）。
チ ュ ー ブ リ ン の 立 体 構 造 は 、ブ タ の 脳 か ら 精 製 さ れ た チ ュ ー ブ リ ン へ テ ロ
ダイマーを用いたエックス線結晶構造解析によって明らかにされている。
(Nogales et al., 1998)、 α -チ ュ ー ブ リ ン と β -チ ュ ー ブ リ ン 共 に 12 の α -へ リ
ッ ク ス と 10 の β -シ ー ト か ら な る 球 状 タ ン パ ク で あ る 。そ の 後 、β -チ ュ ー ブ
リンにはさらにいくつかの小さなへリックスが存在することが報告されて
い る が (Lowe et al., 1998)、 全 体 の 構 造 は 非 常 に 似 通 っ て い る 。 縦 方 向 の 結 合
は 、モ ノ マ ー 間 、す な わ ち イ ン ト ラ ダ イ マ ー で 相 互 作 用 が 起 こ る 領 域 と ダ イ
マ ー 間 (イ ン タ ー ダ イ マ ー )で 相 互 作 用 が 起 き る 領 域 と が あ る 。 α -チ ュ ー ブ
リ ン と β -チ ュ ー ブ リ ン は 似 た よ う な 立 体 構 造 を 持 ち 、 同 じ 方 向 を 向 く た め
結 合 表 面 の 形 状 も ほ ぼ 同 様 で あ る と 推 測 さ れ て い る (Nogales et al., 1999)。相
互 作 用 に 関 わ る 領 域 は 縦 方 向 の 露 出 表 面 の 広 範 囲 に わ た り 、イ ン ト ラ ダ イ マ
ー 領 域 で は α -チ ュ ー ブ リ ン 側 の 、 イ ン タ ー ダ イ マ ー 領 域 で は β -チ ュ ー ブ リ
ン 側 の 表 面 の ほ ぼ 中 心 に GTP 分 子 、あ る い は GDP 分 子 を ひ と つ ず つ 結 合 さ
せ る 部 位 が あ る 。こ こ に 結 合 す る グ ア ニ ン ヌ ク レ オ チ ド 分 子 は 分 子 間 結 合 に
寄 与 し て い る だ け で な く 、動 的 な 微 小 管 の 機 能 を 作 る う え で 非 常 に 重 要 で あ
る。
細 胞 質 中 に 存 在 す る 遊 離 の チ ュ ー ブ リ ン へ テ ロ ダ イ マ ー の 多 く は β -チ ュ
ー ブ リ ン に GTP 分 子 が 結 合 し て い る 。 こ の GTP 分 子 は ヘ テ ロ ダ イ マ ー が 微
小 管 に 取 り 込 ま れ る と 、β -チ ュ ー ブ リ ン 自 身 が 持 つ GTPase 機 能 に よ っ て 加
水 分 解 さ れ GDP と な る が 、 こ の と き 、 α -チ ュ ー ブ リ ン が 持 つ GAP (GTPase
activating protein)活 性 に よ っ て 加 水 分 解 が 促 進 さ れ る (図 .２ )。α -チ ュ ー ブ リ
ン の 8 番 目 の α -へ リ ッ ク ス と そ の 直 前 の ル ー プ 構 造 は イ ン タ ー ダ イ マ ー 領
域 に 突 き 出 す よ う に 位 置 し 、こ の 構 造 に 含 ま れ る い く つ か の ア ミ ノ 酸 残 基 が
- 1-
GTP と 接 触 し 、 加 水 分 解 を 促 す と さ れ る (Anders and Bostein, 2000)。
こ の 機 能 に よ り 、 微 小 管 内 部 で は GDP-チ ュ ー ブ リ ン 型 の 微 小 管 が 多 数 を
占 め 、 プ ラ ス 端 近 傍 で は ま だ 加 水 分 解 が 起 き て い な い GTP-チ ュ ー ブ リ ン 型
の ヘ テ ロ ダ イ マ ー で 構 成 さ れ る GTP cap と 呼 ば れ る 構 造 が 形 成 さ れ る 。GTPチ ュ ー ブ リ ン 型 の ヘ テ ロ ダ イ マ ー が 、 α -チ ュ ー ブ リ ン と β -チ ュ ー ブ リ ン と
が 直 線 状 に 並 ぶ の に 対 し 、 GDP-チ ュ ー ブ リ ン 型 の ヘ テ ロ ダ イ マ ー で は β -チ
ュ ー ブ リ ン が や や 外 側 に 反 る よ う な 力 が は た ら く (Krebs et al., 2006)。微 小 管
内部では直線構造をとっているために構造変化のエネルギーを蓄積してい
る が 、そ れ を プ ラ ス 端 に お い て 安 定 な GTP cap が 抑 え る こ と で 微 小 管 構 造 が
保 た れ る 。 微 小 管 の 重 合 速 度 が 低 下 し て 加 水 分 解 の 速 度 を 下 回 る と GTP cap
が消失し、ヘテロダイマーの脱重合による微小管の短縮が始まる。しかし、
短 縮 中 の 微 小 管 の 先 端 に 再 び GTP cap 構 造 が 形 成 さ れ る だ け の GTP-チ ュ ー
ブ リ ン 型 へ テ ロ ダ イ マ ー が 取 り 込 ま れ る と 再 度 伸 長 を 始 め る 。重 合 状 態 に あ
る微小管の先端と脱重合状態にある微小管の先端とでは全く違った構造を
と る こ と が cryo-電 子 顕 微 鏡 (cryo-EM)に よ る 観 察 に よ っ て 報 告 さ れ て い る 。
伸 長 し て い る 微 小 管 の 先 端 で は 微 小 管 原 繊 維 が シ ー ト 状 の 構 造 を 形 成 し 、そ
の シ ー ト が 丸 ま り な が ら 円 筒 状 の 微 小 管 を 形 成 す る (Chretien et al., 1995)。そ
れ に 対 し て 短 縮 し て い る 微 小 管 で は 、原 繊 維 の 先 端 で 外 側 に 反 る よ う に し て
微 小 管 か ら 外 れ て い る 様 子 が 観 察 さ れ て い る (Mandelkow et al., 1991)。
植 物 細 胞 に お け る 微 小 管 は 、細 胞 周 期 依 存 的 に ダ イ ナ ミ ッ ク に 構 造 を 変 化
さ せ 、特 徴 的 な 細 胞 内 構 造 を 形 成 す る こ と が 知 ら れ て い る (図 .３ 、Wasteneys
et al., 2005)。細 胞 が 分 裂 期 に 入 る と 細 胞 膜 直 下 に 前 期 前 微 小 管 束 (preprophase
band;PPB)と 呼 ば れ る 微 小 管 の 束 が 将 来 分 裂 面 と な る 場 所 に 形 成 さ れ る 。PPB
が 形 成 さ れ 微 小 管 が 密 に 並 ぶ 領 域 で は 、微 小 管 同 様 に 細 胞 全 体 に 張 り 巡 ら さ
れている細胞骨格の一つであるアクチンフィラメントが観察されないこと
か ら 、 こ の 領 域 を ア ク チ ン 排 除 領 域 (actin depleted zone; ADZ)と 呼 ぶ (Cleary,
1992; Hoshino et al., 2003)。 ま た 、 近 年 の 研 究 で は む し ろ ADZ を 挟 む よ う に
し て 形 成 さ れ る ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト が 集 中 し た 領 域 を MFTP
(microfilament twin peaks)と 呼 び 重 要 視 す る 動 き も あ る (Sano et al., 2005)。 い
ず れ に し て も 、こ れ ら 細 胞 骨 格 に よ っ て 形 成 さ れ る 構 造 物 が 将 来 の 分 裂 面 を
決 定 す る 上 で 重 要 と 考 え ら れ 、PPB 消 失 後 も そ の 位 置 情 報 を 残 す 役 割 を 植 物
特 有 の 微 小 管 付 随 タ ン パ ク (Microtubule associated protein; MAP)の ひ と つ で
あ る AIR9 が 担 う と い う 説 が 提 唱 さ れ て い る (Buschmann et al., 2006)。そ の 後
微 小 管 は 、動 物 細 胞 に 比 較 的 近 い 紡 錘 体 構 造 を 形 成 し て 染 色 体 の 分 極 を 行 い 、
終期になると分裂赤道面を円筒状に囲うようなフラグモプラストを形成す
る 。フ ラ グ モ プ ラ ス ト は 細 胞 板 に 向 け て 小 胞 を 輸 送 す る ト ラ ッ ク と な っ て 細
胞 板 の 拡 大 に 合 わ せ て 拡 大 し 、細 胞 膜 ま で 到 達 す る と 消 失 す る 。間 期 の 植 物
- 2-
細 胞 で は 細 胞 膜 の す ぐ 内 側 に 裏 打 ち す る よ う に 微 小 管 が 位 置 し て い て 、こ れ
を表層微小管と呼んでいる。
植 物 細 胞 は 、 動 物 細 胞 の よ う な 明 瞭 な 微 小 管 形 成 中 心 (MTOC)を 持 た な い
た め 、表 層 微 小 管 が ど の よ う に し て 生 じ 、そ の 配 向 を 形 成 す る の か は い ま だ
わ か ら な い こ と が 多 い 。最 近 の 研 究 か ら 、細 胞 表 層 に お い て 既 存 の 微 小 管 か
ら 分 枝 す る よ う に 核 形 成 が 起 こ り 、新 た な 微 小 管 が 形 成 さ れ る こ と が 解 明 さ
れ た (Murata et al., 2005)。 こ れ に よ る と 、 表 層 微 小 管 の 側 部 に γ -チ ュ ー ブ リ
ン を 含 む MTOC が 形 成 さ れ 、 そ こ か ら か ら 約 40°の 角 度 で 新 た に 微 小 管 が
生 じ て 伸 長 を 始 め る 。 近 年 、 GFP に よ っ て 標 識 さ れ た 微 小 管 を in vivo で リ
ア ル タ イ ム 観 察 す る 技 術 が 開 発 さ れ 、こ の よ う に 細 胞 質 中 を 動 き 回 る 表 層 微
小 管 の 動 態 を 観 察 す る 試 み が 精 力 的 に な さ れ て い る (Shaw et al., 2003)。 細 胞
表 層 に お い て 新 た に 伸 長 を 始 め た 微 小 管 は 、伸 長 が は じ ま っ た 場 所 か ら 離 れ
て treadmilling に よ っ て 移 動 し て い く も の も あ れ ば 繋 が っ た ま ま で 伸 長 や 短
縮 を 繰 り 返 す も の も あ る が 、大 部 分 の 微 小 管 は 細 胞 内 部 に 入 り 込 ん で い く の
で は な く 細 胞 表 層 の ほ ぼ 平 面 と い え る 空 間 に 存 在 す る と 言 わ れ て い る 。こ の
こ と か ら 、微 小 管 の 動 態 だ け で な く 微 小 管 同 士 の 衝 突 や 束 化 な ど 微 小 管 同 士
の 相 互 作 用 も 表 層 微 小 管 の 配 向 形 成 に 重 要 で あ る と 考 え ら れ て い る (Dixit
and Cyr, 2004)。
微 小 管 の 動 態 や 束 化 な ど の 挙 動 を 制 御 す る 因 子 と し て MAP の 存 在 が 挙 げ
ら れ る 。 動 物 細 胞 や 酵 母 を 用 い た 研 究 か ら 多 数 の MAP の 性 質 が 解 明 さ れ て
い る が 、植 物 の MAP に 関 す る 知 見 は あ ま り 多 く は な い 。動 物 の MAP で あ る
MAP2/tau や MAP4 は 微 小 管 原 繊 維 に 沿 っ て 局 在 し 、 重 合 と 束 化 を 促 進 す る
こ と で 微 小 管 を 安 定 化 す る 活 性 を 持 つ と 考 え ら れ て い る (Al-Bassam et al.,
2002)。 逆 に 、 Op18/Stathmin は チ ュ ー ブ リ ン ダ イ マ ー と 結 合 し て 重 合 を 阻 害
す る こ と で 重 合 速 度 の 低 下 を 導 き 、脱 重 合 を 促 進 す る (Gigant et al.,な ど )。し
か し 、こ れ ら の ホ モ ロ グ が 植 物 ゲ ノ ム 中 に コ ー ド さ れ て い る と の 報 告 は な い 。
一 方 、 植 物 と 動 物 の 間 で 保 存 さ れ て い る MAP の 報 告 も あ る 。
XMAP215/TOG フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク は 、最 初 は 微 小 管 を 安 定 化 す る 活 性 を 持
つ ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の MAP と し て 報 告 さ れ (Gard and Kirschner, 1987)、 シ
ロ イ ヌ ナ ズ ナ で は そ の ホ モ ロ グ MOR1 に つ い て 研 究 が 行 わ れ て い る 。MOR1
の 高 温 感 受 性 変 異 株 mor1-1 で は 制 限 温 度 条 件 下 で 微 小 管 の 断 片 化 が 生 じ る
こ と か ら 、動 物 の も の と 同 様 に 微 小 管 を 安 定 化 す る 機 能 を 持 つ と 考 え ら れ て
い る (Whittington et al., 2001)。
MAP65 は タ バ コ BY-2 培 養 細 胞 か ら 生 化 学 的 手 法 に よ っ て 単 離 さ れ た
MAP で あ り (Jiang and Sonobe, 1993)、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ ゲ ノ ム 中 に も 多 数 の ア
イ ソ フ ォ ー ム が 存 在 し て い る 。そ の う ち の ひ と つ 、AtMAP65-1 は ホ モ ダ イ マ
- 3-
ー を 形 成 し て 微 小 管 同 士 を 架 橋 す る 活 性 を 持 つ こ と が in vitro で 観 察 さ れ て
い る (Smertenko et al., 2004)。 こ の AtMAP65-1 は ほ ぼ 全 て の 組 織 で 発 現 し て
い る 。ま た 、ヒ ャ ク ニ チ ソ ウ の MAP65-1(ZeMAP65-1)ホ モ ロ グ は 、管 状 要 素
分 化 時 の 二 次 壁 形 成 に 先 立 っ て 束 化 し た 微 小 管 に 局 在 し て い る こ と か ら 、こ
の 束 化 に も MAP65 が 関 与 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る (Mao et al., 2006)。
そ の 他 に も MAP の 一 種 で あ る プ ラ ス 端 集 積 タ ン パ ク 質 (+Tips)も 微 小 管 の
安 定 性 の 制 御 に 重 要 な 機 能 を 持 つ と 考 え ら れ て い る 。＋ Tips の ひ と つ で あ る
End-Binding Protein1 (EB1)は 、動 物 細 胞 に お い て ガ ン 抑 制 因 子 で あ る APC タ
ン パ ク と 結 合 す る こ と か ら 発 見 さ れ 、そ の 後 、微 小 管 プ ラ ス 端 に 局 在 し て 他
の タ ン パ ク と の 相 互 作 用 す る こ と が 示 さ れ て い る (Su et al., 1995; Lansbergen
and Akhmanova, 2006)。 ま た 、 EB1 自 体 も 微 小 管 を 安 定 化 し 重 合 を 促 進 す る
活 性 を 持 つ こ と が 報 告 さ れ て い る ( Tirnauer et al., 2002 )。シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ ゲ ノ ム
に は EB1 ホ モ ロ グ が 3 遺 伝 子 コ ー ド さ れ て い て 、そ の う ち AtEB1a、AtEB1b
は 動 物 の ホ モ ロ グ と 同 様 に 微 小 管 プ ラ ス 端 に 局 在 す る (Mathur et al., 2003,
Dixit et al., 2006)。 AtEB1b に 関 し て は in vitro の 実 験 か ら 、 微 小 管 の 重 合 を
促 進 す る 活 性 を 持 つ こ と が 示 さ れ て い る (Abe et al., unpublished data)。
植 物 細 胞 は 、成 熟 の 過 程 に お い て そ の 大 き さ や 形 態 な ど を 多 様 に 変 化 さ せ 、
最 終 的 に そ の 機 能 に 適 し た か た ち を 作 り 上 げ る 。細 胞 の 拡 大 は 膨 圧 に よ っ て
起 こ る が 、そ れ 自 体 に 極 性 は な く 、細 胞 壁 中 の セ ル ロ ー ス 微 繊 維 が 細 胞 の 伸
長軸に対して直交するように並ぶことで横方向への伸長を制限する“たが”
と し て 働 き 、 伸 長 方 向 を 規 定 す る と 考 え ら れ て い る （ 図 .４ , Baskin, 2005）。
セルロース微繊維の合成がどのように起こるかはまだわかっていない部分
が 多 い が 、セ ル ロ ー ス 微 繊 維 の 配 向 と 表 層 微 小 管 の 配 向 と が 平 行 に 並 ん で い
る こ と が 知 ら れ て お り 、セ ル ロ ー ス 微 繊 維 の 配 向 は 細 胞 膜 直 下 の 微 小 管 に よ
っ て 規 定 さ れ る と 考 え ら れ て い る 。微 小 管 が セ ル ロ ー ス 合 成 の 方 向 を 規 定 す
る 仕 組 み に 関 し て は 、議 論 が 分 か れ て い る 。微 小 管 上 を セ ル ロ ー ス 合 成 酵 素
(CesA)複 合 体 が 移 動 す る と す る モ ノ レ ー ル 説 と 、平 行 に 並 ん だ 微 小 管 の 間 に
CesA 複 合 体 が 挟 ま れ 、 結 果 的 に 微 小 管 と 同 じ 方 向 に し か 移 動 で き な く な る
と す る ガ ー ド レ ー ル 説 の ２ 説 が 提 唱 さ れ 、現 在 で も 精 力 的 に 研 究 が 行 わ れ て
い る （ Wasteneys and Yang, 2004; Baskin, 2005, Paradez et al., 2006）。
根 や 黄 化 胚 軸 に お い て 急 速 に 拡 大 す る 細 胞 で は 、縦 方 向 に 長 く 伸 び て 円 筒
状 の 形 態 に な る が 、こ の と き 表 層 微 小 管 は 器 官 の 長 軸 に 対 し て 直 行 す る よ う
に 配 向 し て い る (Sugimoto et al., 2000)。 直 線 的 な 伸 長 の 際 に 微 小 管 が ト ラ ン
ス ヴ ァ ー ス に 配 向 す る こ と の 重 要 性 は 、シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ を 用 い た ね じ れ 変 異
株 に 関 す る 研 究 か ら も 明 ら か で あ る 。spr1 変 異 株 は 根 の 伸 長 領 域 に お い て 細
胞 の 伸 長 方 向 が 傾 き 、表 皮 細 胞 が ね じ れ た よ う な 形 態 を 示 す 。spr2 変 異 株 で
- 4-
は 地 上 部 の 器 官 で ね じ れ が 生 じ 、ロ ゼ ッ ト 葉 や 花 弁 が 反 時 計 回 り に 展 開 す る
(Furutani et al., 2000)。 こ れ ら の 変 異 株 の 原 因 遺 伝 子 は 、 SPR1、 SPR2 と も 植
物 特 有 の 新 規 タ ン パ ク 質 を コ ー ド し て い て 、 SPR1 は 微 小 管 に 局 在 し
(Nakajima et al., 2004, Sebrook et al., 2004)、 SPR2 は MAP で あ る こ と が 示 さ
れ て い る (Shoji et al., 2004., Buschmann et al., 2004)。spr1 変 異 株 で は 、ね じ れ
を 生 じ て い る 根 の 伸 長 領 域 に お い て 、表 層 微 小 管 の 配 向 が 左 巻 き ヘ リ ッ ク ス
に 変 化 し て い る こ と が 確 認 さ れ て い る 。ま た 、左 巻 き ね じ れ 形 質 を 生 じ る 変
異 株 lefty1、 lefty2 で は 、 微 小 管 を 構 成 す る チ ュ ー ブ リ ン の う ち 、 α -チ ュ ー
ブ リ ン (TUA)を コ ー ド す る 遺 伝 子 に 変 異 が 生 じ て い た 。 lefty1、 lefty2 は そ れ
ぞ れ TUA6、 TUA4 の 180 番 目 の セ リ ン が フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン に 置 換 さ れ て お
り 、微 小 管 中 に 変 異 型 チ ュ ー ブ リ ン が 取 り 込 ま れ る こ と で 機 能 異 常 を 生 じ て
し ま う ド ミ ナ ン ト ネ ガ テ ィ ヴ 変 異 で あ っ た (Thitamadee et al., 2002)。 さ ら に
は 前 述 の 高 温 感 受 性 MAP 変 異 株 mor1-1 で は 、微 小 管 が 不 安 定 に な り 断 片 化
する制限温度条件下で左巻きねじれを生じることが報告されている
(Whittington et al., 2001)。 以 上 の こ と か ら も 微 小 管 機 能 の 異 常 が 表 層 微 小 管
の 傾 い た 配 向 を 生 み 出 し 、細 胞 伸 長 の 極 性 形 成 に 影 響 を 与 え て い る こ と が 示
唆される。
こ の よ う に 、多 く の 微 小 管 関 連 因 子 が 微 小 管 の 動 的 不 安 定 性 を 制 御 し 、細
胞 の 状 態 に 適 し た 微 小 管 を 作 り 上 げ て い る 。特 に 植 物 細 胞 に お い て は 表 層 微
小管の配向が細胞のかたちを決定する上で非常に重要な役割を果たすこと
が 推 測 さ れ る 。そ こ で 、本 研 究 で は 微 小 管 と 植 物 の か た ち づ く り に 着 目 し 研
究 を 行 っ た 。シ ロ イ ヌ ナ ナ ズ ナ 植 物 体 に お い て 微 小 管 重 合 阻 害 剤 に 対 す る 感
受性が変化したりねじれ表現型を示したりする変異株をスクリーニングし、
その中からチューブリンに変異を生じたことにより左右いずれかのねじれ
を 生 じ た 変 異 株 を 単 離・同 定 し た 。そ の 後 、こ れ ら の 変 異 株 を 用 い て 微 小 管
機 能 と 細 胞 の 伸 長 方 向 と の 関 係 を 解 析 し 、特 に ２ 種 の 変 異 株 に お い て は 微 小
管 動 態 や 原 繊 維 形 成 に 関 し て 解 析 を 行 う こ と で 、ま っ す ぐ に 伸 長 す る 細 胞 に
おけるトランスヴァースな表層微小管の配向形成を支える機構を明らかに
することを試みた。
- 5-
β-チューブリン
(GTP結合型)
マイナス端
α-チューブリン
プラス端
伸長（重合）
GDP
GTP
β-チューブリン
(GDP結合型)
GDP-チューブリン
収縮（脱重合）
図１. 微小管の動的不安定性
微小管は遊離のへテロダイマーを取り込みながら伸長し、収縮するときはヘテロダイマー
が脱重合する。微小管は常にこの重合と脱重合の位相を行き来している。脱重合時に外れ
たGDP結合型チューブリンは細胞質中で速やかにGTPに交換され、GTP結合型チューブリン
となる。微小管に重合するのはGTP結合型のヘテロダイマーである。GTP結合型へテロダイ
マーは微小管に取り込まれると加水分解を受けコンフォメーション変化が起こる（図２参
照）。
- 6-
A
αβ
activate GTPase
GTP
GDP
B
GTP結合型
GDP結合型
図.２ GTP加水分解によるヘテロダイマーのコンフォメーション変化
A. 遊離のへテロダイマーが新たに原繊維中に取り込まれると、隣接するβ-チューブリン
のGTPaseを活性化する。
B. GTP加水分解によってヘテロダイマーのコンフォメーションが変わり、外側に反るよう
な構造をとる。(Krebs et. al., 2005より改変して転載)
- 7-
PPB
間期
紡錘体
フラグモプラスト
分裂期
表層微小管
間期
図.３ 細胞周期によって姿を変える微小管構造
微小管が姿を変え構成する構造を示す。緑の棒状の構造物が微小管、紫の球が核及び染色
体を示す。各構造が細胞周期のどこで現れるかのおおよその時間を下の軸で示す。
(Wasteneys et al., 2005より改変して転載)
- 8-
表層微小管
B
A
セルロース微繊維
図.４ 微小管、セルロース微繊維による細胞の伸長極性制御のモデル
A. 野生株における表層微小管とセルロース微繊維の配向。細胞膜直下の表層微小管と細
胞壁最内層のセルロース微繊維の配向は同じである。
B. 表層微小管の配向変化による伸長方向の変化のモデル。野生株では細胞長軸に対して
直交するように表層微小管が配向し、長軸方向への伸長が起こる。表層微小管の配向が傾
くと細胞の伸長軸も傾き、微小管の断片化や配向のランダム化によって伸長極性が失われ
て無方向に拡大する。
- 9-
Ⅱ.
材料と方法
植物の取り扱いとスクリーニング法
Methanesulfonate ま た は T-DNA に よ っ て 変 異 誘 起 し た シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ
M2 種 子 は そ れ ぞ れ Lethle Seeds (Round Rock, TX) と ABRC (Columbus,
OH) よ り 購 入 し た 。育 成 の 際 は 、次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム・Triton-X100 を 含
む 溶 液 で 滅 菌 後 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 栄 養 培 地 (Haughn and Somerville, 1986)に
2% sucrose と 1.5% agar を 加 え た 平 板 培 地 上 に 播 種 し 、低 温 処 理 後 23℃ で
育 成 さ せ た 。 3μ M propyzamide 存 在 下 で の ス ク リ ー ニ ン グ は Naoi et al.
の 方 法 (2005)に 従 っ て 行 い 、斜 面 培 地 上 で 育 て た 幼 植 物 体 か ら 薬 剤 応 答 性 に
異 変 が あ っ た も の を 選 抜 し た (図 .４ )。
実体顕微鏡観察
根 の 表 皮 細 胞 の ね じ れ 、肥 大 の 観 察 に は 、実 体 顕 微 鏡 SZX12(オ リ ン パ ス ,
Tokyo, Japan)を 用 い た 。
コンストラクションと再現実験
コ ン ス ト ラ ク シ ョ ン の 概 要 を 図 .６ 、 図 .７ に 示 す 。
イ ン ト ロ ン １ つ を 含 む TUA6 の コ ー デ ィ ン グ 配 列 の C 末 に c-Myc エ ピ ト
ー プ タ グ を 融 合 さ せ た も の (Thitamadee et al., 2002)と 、 TUB 4 の cDNA 配
列 ( 金 子 2003) を そ れ ぞ れ 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 用 い て pDONR221
Gateway entry vector (Invitrogen, Carlsbad, CA) に ク ロ ー ニ ン グ し 、特 異
的 プ ラ イ マ ー を 用 い た site-directed mutagenesis method (東 洋 紡 , Osaka,
Japan) に 従 っ て 各 エ ン ト リ ー ク ロ ー ン に 変 異 を 導 入 し た 。 ク ロ ー ニ ン グ に
用 い た プ ラ イ マ ー を 表 .１ に 、 変 異 の 導 入 に 用 い た プ ラ イ マ ー を 表 .２ に 示 す
（ た だ し 、TUA の R2K 変 異 は ク ロ ー ニ ン グ 用 の プ ラ イ マ ー に 変 異 を い れ る
こ と で 、 ク ロ ー ニ ン グ と 変 異 導 入 を 同 時 に 行 っ た ）。 そ の 後 、 TUA6 の コ ン
ス ト ラ ク ト は Gateway binary vector で あ る pGWB2 に 、TUB4 は pGWB18
に 導 入 し た（ 両 ベ ク タ ー は 島 根 大 学 、中 川 博 士 よ り 譲 っ て い た だ い た ）。TUB4
は pGWB18 上 で ４ ×Myc が N 末 に 融 合 し た も の と な る 。 両 ベ ク タ ー は
CaMV35S プ ロ モ ー タ 、Nos タ ー ミ ネ ー タ 制 御 下 で チ ュ ー ブ リ ン を 発 現 さ せ
る 。 こ の コ ン ス ト ラ ク ト を 野 生 型 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 植 物 体 (Col 系 統 ) に
Agrobacterium-mediated infiltration method (Clough and Bent, 1998) に
より導入した。
免疫組織化学染色法
免 疫 組 織 化 学 染 色 は 、 Abe et al.の 方 法 (2005)に い く つ か の 変 更 を 加 え て
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行 っ た 。4 日 齢 の シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 幼 植 物 体 を 、1.5% (v/v) formaldehyde, 0.5%
(v/v) glutaraldehyde を 添 加 し た PEMT バ ッ フ ァ (50mM PIPES, 2mM
EGTA, 2mM MgSO 4 , 0.05% (v/v) Triton-X100, pH 7.2)に 40 分 間 浸 漬 し 、
そ の 後 PEMT で 洗 浄 し て か ら 0.05% (w/v) Pectolyase Y-23 (Kikkoman) ,
0.4M mannitol を 含 む PEMT で 30℃ 、 18 分 間 処 理 を し た 。 再 度 PEMT で
洗 浄 し 、冷 メ タ ノ ー ル に よ る 脱 水 処 理 を -20℃ で 10 分 間 、PBS (130mM NaCl,
5.1mM Na 2 PO 4 , 1.6mM KH 2 PO 4 , pH 7.4) の 浸 透 を 10 分 間 行 っ た 。1mg/ml
NaBH 4 を 含 む PBS 溶 液 で 15 分 処 理 後 、 1% (w/v) BSA, 50mM glycine を
含 む PBS 溶 液 で 30 分 処 理 し た 後 、 同 量 の glycine を 含 む PBS 溶 液 で 希 釈
し た 一 次 抗 体 に よ る 反 応 を 一 晩 30℃ で 行 っ た 。反 応 後 は glycine を 含 む PBS
で 洗 浄 し 、 同 様 の 溶 液 を 用 い て 希 釈 し た 二 次 抗 体 に よ る 反 応 を 37℃ で 2 時
間 行 っ た 。 反 応 後 は PBS 溶 液 で 洗 浄 し た 後 に ス ラ イ ド グ ラ ス 上 に マ ウ ン ト
し て 顕 微 鏡 観 察 に 用 い た 。マ ウ ン ト 用 の バ ッ フ ァ と し て 50% (v/v) グ リ セ ロ
ー ル を 含 む PBS (pH9.0-9.2) を 用 い た 。
微 小 管 の 染 色 に は 、 一 次 抗 体 と し て 抗 α - チ ュ ー ブ リ ン 抗 体 YOL1/34
(Millipore, Billerica, MA) を 、 二 次 抗 体 と し て Alexa Fluo 568-conjugated
anti-rat IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) を そ れ ぞ れ 1:40、1:500 の 割
合 で 希 釈 し て 用 い 、 Myc エ ピ ト ー プ タ グ 融 合 チ ュ ー ブ リ ン の 検 出 に は 抗
c-Myc 抗 体 9E10 (Roche diagnostic, Bazel, Switzerland) と Alexa Fluor
488-conjugated anti-mouse IgG (Molecular Probes) を そ れ ぞ れ 1:200、
1:500 の 割 合 で 希 釈 し て 用 い た 。顕 微 鏡 画 像 は C1-ECLIPSE E600 コ ン フ ォ
ー カ ル レ ー ザ ー 顕 微 鏡 (Nikon, Tokyo, Japan) を 用 い て 取 得 し た 。
根の伸長方向と表層微小管の配向の定量解析
根 の 伸 長 方 向 は 、垂 直 に 立 て た シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 生 育 培 地 上 で ７ 日 間 育 て た
幼 植 物 を 、 培 地 を 上 側 か ら 撮 影 し た 写 真 を 用 い て 図 .8A の よ う に 計 測 し た 。
表 層 微 小 管 の 配 向 は 、免 疫 組 織 化 学 染 色 に よ り 染 色 し た 根 の 伸 長 領 域 に お け
る 表 皮 細 胞 の 顕 微 鏡 写 真 を 用 い て 図 .8B の よ う に 計 測 し た 。 角 度 の 計 測 は
C++ Builder standard (Borland, Cupertino, CA)を 使 用 し て 作 成 し た 独 自
の画像解析ソフトウェアを用いた。
微小管動態の観察
GFP-TUB6、も し く は GFP-EB1 を 発 現 す る 植 物 体 に お け る 微 小 管 動 態 の
検 証 に は 4 日 齢 の 幼 植 物 体 を 用 い 、配 軸 上 部 の 表 皮 細 胞 を 観 察 し た 。手 法 は
Abe (2005), Nakamura (2004) ら の 方 法 に 従 い 、4 日 齢 の シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 幼
植 物 体 の 胚 軸 上 部 を 切 り 出 し て 2 穴 ス ラ イ ド グ ラ ス (TOP)に 両 面 テ ー プ で 固
定 し 顕 微 鏡 観 察 に 用 い た 。 撮 影 に は DMRE microscope (Leica, Allendale,
NJ) に CSU10 spinning head ( 横 河 電 機 , Tokyo, Japan) と ORCA-ER
- 11 -
CCD camera (浜 松 ホ ト ニ ク ス , Shizuoka, Japan) を 接 続 し た シ ス テ ム を 使
用 し た 。 顕 微 鏡 画 像 は 16 ビ ッ ト tiff フ ォ ー マ ッ ト 画 像 と し て 4 秒 イ ン タ ー
バ ル で 撮 影 し 、GFP-TUB6 を 用 い た 観 察 で は 6 分 間 、GFP-EB1 の 観 察 で は
3 分 間 の タ イ ム ラ プ ス 画 像 を 取 得 し た 。 得 ら れ た 画 像 は 、 ImageJ と 独 自 開
発 し た プ ラ グ イ ン を 用 い て 、補 正 、解 析 を 行 っ た 。動 態 パ ラ メ ー タ の 解 析 法
は 、 GFP-TUB6 に 関 し て は Shaw ら (2003)の 方 法 に 従 い 、 図 .９ に 示 す よ う
な方法でヒストリープロットを描いた。微小管が伸長する位相である
Growth、 収 縮 す る 位 相 で あ る Shrinkage、 伸 長 も 収 縮 も せ ず 一 定 の 長 さ を
保 つ 位 相 で あ る Pause を 読 み 取 り 、 Growth、 Shrinkage の 速 度 、 計 測 し た
時 間 の う ち Growth、 Shrinkage、 Pause の 各 位 相 が 占 め て い た 割 合 (Time
spent)、Catastrophe、Rescue の 各 イ ベ ン ト の 頻 度 を 計 算 し て 動 態 パ ラ メ ー
タ と し た 。 GFP-EB1 に 関 し て は Abe ら の 方 法 (2005)に 従 っ た 。 な お 、 本 研
究 で 用 い た GFP-EB1 発 現 植 物 体 は 、Abe に よ っ て 作 成 さ れ た Col バ ッ ク グ
ラ ウ ン ド の 形 質 転 換 体 で あ る (unpublished data)。
FRAP 解 析
FRAP 解 析 は 、 IX81-FV1000 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 シ ス テ ム に ツ イ ン ス
キ ャ ナ ヘ ッ ド を 装 備 し た シ ス テ ム (オ リ ン パ ス )を 使 用 し た 。 5 日 齢 の 幼 植 物
体の子葉を切り取って蒸留水にマウントし、表皮細胞の観察を行った。
488nm レ ー ザ ー を GFP 励 起 に 用 い 、 4 秒 ご と の タ イ ム ラ プ ス 画 像 を 取 得 し
た 。Photobleaching に は 、SIM ス キ ャ ナ に よ る 405nm ダ イ オ ー ド レ ー ザ ー
光 刺 激 を 用 い 、 100%の 出 力 で 4 秒 間 の bleaching を 行 っ た 。
透過式電子顕微鏡観察
4 日 齢 の 幼 植 物 体 を 2.5% glutaraldehyde と 8% tannic acid を 含 む
pH6.8、 0.1M の リ ン 酸 バ ッ フ ァ に 浸 漬 し 、 室 温 で 3.5 時 間 固 定 し た 。 そ の
後 リ ン 酸 バ ッ フ ァ 溶 液 を 用 い て 洗 浄 し 、 1% OsO 4 中 で 一 晩 染 色 を 行 っ た 。
低 温 条 件 下 で Ethanol に よ る 脱 水 を 行 い 、さ ら に 室 温 で Propylene oxide に
置 換 し た 後 、 sppur ’s resin (TAAB Laboratories, Berkshire, UK) に 包 埋 し
た 。 切 片 は ULTRACUT UCT microtome (Leica Microsystems, Welzlar,
Germany) を 用 い て 作 成 し 、 copper grid に マ ウ ン ト し た 後 に uranyl
acetate, lead citrate に よ る 染 色 を 行 い 、 VE-1010 vacuum evaporator (真
空 デ バ イ ス , Ibaraki, Japan) を 用 い て カ ー ボ ン に よ る コ ー テ ィ ン グ を 施 し
た 。電 子 顕 微 鏡 観 察 は H-7100 透 過 式 電 子 顕 微 鏡 (日 立 ハ イ テ ク ノ ロ ジ ー ズ ,
Tokyo, Japan) を 用 い 、 75kV 条 件 で 行 っ た 。 野 生 型 の 切 片 の 作 成 に は 根 の
長 軸 に 沿 っ て 切 断 を 行 い 、変 異 株 は 傾 い た 配 向 を 持 つ 微 小 管 の 横 断 切 片 を 作
成するために斜めに切断した。
得 ら れ た 顕 微 鏡 画 像 は フ ィ ル ム ス キ ャ ナ Polascan 45 (Polaroid,
- 12 -
Waltham, MA) を 用 い て 2000dpi の 解 像 度 で 電 子 デ ー タ 化 し 、 Mrkham’s
rotational analysis (図 .10、Ledbetter and Porter, 1964) に 用 い た 。こ れ は
電 子 顕 微 鏡 画 像 か ら 、円 周 上 に ほ ぼ 同 じ 形 状・大 き さ の サ ブ ユ ニ ッ ト が 並 ぶ
構造を持つタンパクのサブユニット数の推定を行う際に有効な画像解析手
法 で あ る 。本 研 究 で は 微 小 管 原 繊 維 の 境 界 を 染 色 す る 手 法 を と っ た た め 、適
切 な 角 度 で 回 転 さ せ た 画 像 を 重 ね 合 わ せ 、投 影 像 を 作 っ た 場 合 に は 境 界 部 の
染 色 が 強 調 さ れ る 。一 方 で 、角 度 が 適 切 で な い 場 合 に は 、境 界 部 の 染 色 が 不
明 瞭 な 投 影 像 が で き る 。 画 像 処 理 に は 、 Photoshop Elements 2.0 (Adobe
systems, San Jose, CA) を 用 い て 一 本 の 微 小 管 画 像 の ト リ ミ ン グ と 回 転 処
理 を 行 い そ の 後 ImageJ version 1.34 (http://rsb.info.nih.gov/ij/) を 用 い て
画像をスタックし、投影像を作成した。
その他のコンピュータ解析
系 統 樹 は 、 ClustalW (http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/clustalw-j.html)
と Tree view (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)を 用 い
て作成したものを元に改変した。
タ ン パ ク の 配 列 比 較 は
ClustalW
と
Boxshade
(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html) を 用 い て 作 成 し た
ものを元に改変した。
チ ュ ー ブ リ ン の 三 次 元 構 造 図 は Protein Data Bank(PDB;
http://www.pdbj.org/) の デ ー タ に 基 づ き
RasMol
Version
2.7.1.1(http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm) を 使 用 し て 作
成 し た 。イ ン ト ラ ダ イ マ ー 領 域 、イ ン タ ー ダ イ マ ー 領 域 、横 方 向 の 相 互 作 用
領 域 の モ デ リ ン グ に は“ 1TUB.pdb”フ ァ イ ル を 、GAP 領 域 に 関 し て は よ り
高 解 像 度 の 解 析 か ら 作 ら れ た “ 1JFF.pdb” フ ァ イ ル を 用 い た 。 た だ し 、 こ
れ は ヘ テ ロ ダ イ マ ー の 一 部 の 構 造 を 解 像 で き て い な い た め GAP 領 域 の モ デ
リングでのみ使用した。
- 13 -
変異誘起したシロイヌナズナM2植物
(3µm propyzamide 添加培地上で育成)
ねじれ形質を示す変異株の選抜
原因遺伝子のマッピングによりチューブリン遺伝子との連鎖を確認
Yes
No
候補チューブリン遺伝子に変異が生じているか確認
Yes
No
34 ：チューブリン変異株
27 ：右巻きねじれ
7 ：左巻きねじれ
図.５ スクリーニングの方法と結果
ねじれ変異株を単離したスクリーニングの概要
- 14 -
Myc
primer-F
TUA6
pBluescriptⅡ
primer-R
PCR (attB addition)
att B1
att B2
att P1
att P2
pDONR221
BP reaction
att L1
att L2
Entry clone
site-directed
mutagenesis
att L1
att R1
att L2
att R2
XhoⅠ
Nos
35S
pGWB2
Entry clone
LR reaction
att B1
att B2
TUA6
35S
Nos
Expression clone
図.６
α-チューブリンの変異の再現実験に使用したコンストラクション
- 15 -
primer-F
TUB4
pBluescriptⅡ
primer-R
PCR (attB addition)
att B1
att B2
att P1
att P2
pDONR221
BP reaction
att L1
att L2
Entry clone
site-directed
mutagenesis
4×Myc att R1
att L1
att L2
XhoⅠ
Nos
35S
pGWB18
Entry clone
LR reaction
att B1
att B2
TUB4
35S
Nos
Expression clone
図.７
att R2
β-チューブリンの変異の再現実験に使用したコンストラクション
- 16 -
1st PCR primers
gwTUB4-F
gwTUA6-F
gwTUA6(R2K)-F*
gwMyc-R
5’- AAAAAGCGGCTGCATGAGAGAGATCCTTC
5’- AAAAAGCAGGCTCAATGAGAGAGTGCATTTCG
5’- AAAAAGCAGGCTCAATGAAAGAGTGCATTTCG
5’- AGAAAGCTGGGTGTCACAAGTCTTCCTCAG
2nd PCR primers
attB1 adapter primer
attB2 adapter primer
5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
表.１ クローニングに用いた特異的プライマー
*TUA6のR2K変異はクローニングを目的としたPCRの際にミスセンス変異を持つプライマー
を用いて変異を導入した。
- 17 -
TUA6
TUA6(T56I)-F
TUA6(T56I)-R
TUA6(V62I)-F
TUA6(V62I)-R
TUA6(D205N)-F
TUA6(D205N)-R
TUA6(C213Y)-F
TUA6(C213Y)-R
TUA6(D251N)-F
TUA6(D251N)-R
TUA6(M268I)-F
TUA6(M268I)-R
TUA6(S277F)-F
TUA6(S277F)-R
TUA6(A281T)-F
TUA6(A281T)-R
TUA6(E284K)-F
TUA6(E284K)-R
TUA6(P325S)-F
TUA6(P325S)-R
TUA6(R390W)-F
TUA6(R390W)-R
5’- TCGGTGCAGGTAAGCACGTCCCAC
5’- TTTCACTGAAGAAGGTGTTGAAAGCATC
5’- TCCCACGTGCTGTCTTTGTTGATC
5’- TGTGCTTACCTGCACCGGTTTCAC
5’- ACAATGAAGCTATCTATGAC
5’- TGAGGAGGATGGAGACATCAG
5’- ATAGACGCTCCCTTAACA
5’- AGATGTCATAGATAGCTTC
5’- ATGTTACTGAGTTCCAAACC
5’- TAACATTCAAGGCACCATCG
5’- ACTTTCGTCCTATGCACCAGTC
5’- ATGAAGTGGATCCTTGGGTATGG
5’- TCGCGGAGAAGGCCTTCCATGAGCAA
5’- AGATGACTGGTGCATAGGACGAAAGC
5’- CCTTCCATGAGCAACTCTCAG
5’- TCTTCTCCGCGGAGATGACTG
5’- AGCAACTCTCAGTTGCTGAGATCACG
5’- TATGGAAGGCCTTCTCCGCGGAGATG
5’- TCCAAGGATGTGAACGCAGCGGTTG
5’- GACTACATCACCACGGTACATCAAAC
5’- GGATTGATCACAAGTTTGATC
5’- AGGAGAATACCTCAGCAACAC
TUB4
TUB4(S95F)-F
5’- TTGGTGCCGGAAATAACTGGGCGAAAG
TUB4(S95F)-R
5’- ATTGACCAAAGACGAAGTTATCAGGACG
TUB4(G96D)-F
5’- ATGCCGGAAATAACTGGGCGAAAGGTC
TUB4(G96D)-R
5’- CAGATTGACCAAAGACGAAGTTATCAGG
TUB4(T178I)-F
5’- TGTTGTTGAGCCATACAATGCAACTC
TUB4(T178I)-R
5’- ATGTCAGAGACCTTAGGAGAAGGAAAC
TUB4(L202F)-F
5’- TGACAATGAGGCTCTCTACGATATCTG
TUB4(L202F)-R
5’- AAAACCATACACTCGTCAGCGTTTTCG
TUB4(P220S)-F
5’- CTACCTTTGGTGATCTTAACCATCTC
TUB4(P220S)-R
5’- AATTAGCGAGCTTGAGGGTACGGAAAC
TUB4(P287L)-F
5’- TTGAACTGACCCAGCAGATGTGGGATG
TUB4(P287L)-R
5’- GAACACTCAAGGCACTGTATTGCTGTG
TUB4(E288K)-F
5’- AAACTGACCCAGCAGATGTGGGATG
TUB4(E288K)-R
5’- AGGAACACTCAAGGCACTGTATTGC
TUB4(A393T)F
5’-ACTTTCCTTCATTGGTACACAGGAG
TUB4(A393T)R
5’-CTTTCTCCTGAACATAGCTGTGAACTG
表.２ Site-directed mutagenesis method に用いたプライマー
用いたプライマーセットによって導入した変異をプライマー名の括弧内に示してある。
- 18 -
B
A
＋
↑
↓
－
θ
θ
－ ←
→ ＋
図.８ 根の伸長方向と表層微小管の傾きの角度の計測法
A. 根の伸長方向の計測法。斜面培地上の根の伸長方向を、重力方向を基準として計測し
た。
B. 表層微小管の傾きの計測法。Outer cortical microtubules の傾きを細胞の長軸に対して垂
直となる線を基準として計測した。
- 19 -
A
0
4
8
12
16
20
Leading
end
Lagging
end
Time (sec)
B
9
8
Catastrophe
7
Growth → Shrinkage
の位相変化のイベント
Shrinkage
6
5
Growth
4
3
2
Pause
Rescue
Shrinkage → Growth
の位相変化のイベント
1
0
0
50
100
150
200
(sec)
図.９ 微小管動態の観察と計測したパラメータ
A. GFP-TUB6により標識した微小管のタイムラプス画像。微小管動態の計測は、図のよう
に両端が視野内にある微小管の挙動を追跡し、両端について個別にB.に示すようなヒスト
リープロットを描いた。
B. 微小管の挙動を元に作成したヒストリープロット。Growthは微小管が伸長する位相、
Shrinkageは微小管が収縮する位相、Pauseは微小管が伸長も収縮もせず一定の長さを保つ位
相。
- 20 -
元の画像
27.7°×13回 回転処理
stack, projection
30°×12回 25.7°×14回
でそれぞれ処理した場合の投影像
図.１０
Markham’s rotational analysis
- 21 -
Ⅲ.
結果
3-1. 変 異 株 の ス ク リ ー ニ ン グ と そ の 表 現 型
野 生 型 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 根 は 、３ µM の 微 小 管 重 合 阻 害 剤 propyzamide を
含 む 硬 い 寒 天 培 地 上 で は 根 を 左 方 向 に 伸 張 さ せ る 。左 巻 き ね じ れ 変 異 株 で あ
る lefty1 、 lefty2 で は こ の 薬 剤 に 対 し て 高 感 受 性 を 示 し 、右 巻 き ね じ れ 変 異
株 spr1 の ね じ れ 形 質 は 弱 め ら れ る な ど 野 生 株 と は 違 っ た 反 応 を 示 す 。 こ れ
らの変異株では微小管機能に異常が生じていることが考えられることから、
微小管関連薬剤に対する応答性にも変化があると考えられている。そこで、
薬剤感受性を指標としてスクリーニングを行うことで微小管機能に異常を
持 つ 変 異 株 を 新 た に 単 離 す る こ と が で き る の で は な い か と 考 え 、 EMS ま た
は T-DNA 挿 入 の 変 異 原 処 理 を し た M2 種 子 を propyzamide を 含 む 培 地 上 に
播 種 し 野 生 型 と は 異 な る 反 応 を 示 す 変 異 株 を 選 抜 し た （ Naoi and
Hashimoto, 2004; 図 .11）。 次 に 各 変 異 株 の 原 因 遺 伝 子 を 特 定 す る た め 、 ね
じ れ 形 質 の 原 因 と な る 遺 伝 子 座 を 決 定 し た 。 Thitamadee et al. (2002)、 金
子 (2003)の 研 究 か ら チ ュ ー ブ リ ン 遺 伝 子 の 変 異 に よ っ て ね じ れ 形 質 が 生 じ
る こ と が 報 告 さ れ て い る た め 、 推 定 さ れ た 遺 伝 子 座 に α -ま た は β -チ ュ ー ブ
リ ン 遺 伝 子 が 強 く 連 鎖 し て い た 場 合 に は 、当 該 チ ュ ー ブ リ ン 遺 伝 子 の 配 列 を
調 べ た 。こ れ に よ り 、根 や そ の 他 の 急 速 に 伸 長 す る 器 官 に お い て 左 右 い ず れ
か の ね じ れ 形 質 を 示 す チ ュ ー ブ リ ン 変 異 株 を α -チ ュ ー ブ リ ン 20 系 統 、 β チ ュ ー ブ リ ン 14 系 統 、 合 計 34 系 統 得 た （ 図 .５ 、 表 .３ ）。 い く つ か の 変 異
株 で は 原 因 と な る 変 異 は 同 じ 遺 伝 子 上 の 同 一 の DNA 置 換 で あ っ た た め 、 最
終 的 に 得 ら れ た 変 異 株 は α -チ ュ ー ブ リ ン の 変 異 株 14 種 類 、 β -チ ュ ー ブ リ
ン 12 種 類 で 合 計 26 種 類 で あ る 。チ ュ ー ブ リ ン 変 異 株 の 多 く は 半 優 性 の 形 質
を 示 し 、残 り の 変 異 株 で は ホ モ 接 合 体 で の み ね じ れ 形 質 を 示 し た が 、薬 剤 感
受 性 に 関 し て は 半 優 性 で あ っ た 。ま た 、一 部 の 半 優 性 の 変 異 株 は ホ モ 接 合 体
に お い て 表 皮 細 胞 の 肥 大 や 根 毛 、ト ラ イ コ ー ム の 変 形 と い っ た シ ビ ア な 表 現
形 を 示 し（ 図 .12）、生 育 が 悪 く 種 子 を 残 し て も ご く わ ず か な も の も 存 在 し た 。
最 も シ ビ ア な 表 現 型 を 示 し た tub4 P287L の ホ モ 接 合 体 は 生 殖 成 長 期 ま で 生 き
ることができなかった。
な お 、今 後 の 研 究 に は 左 巻 き ね じ れ 形 質 を 示 す チ ュ ー ブ リ ン 変 異 株 と し て
Thitamadee et al. (2002)に よ っ て 単 離 さ れ た 変 異 株 ( lefty1 ( tua6 S180F )、
lefty2 ( tua4 S180F )) と 金 子 (2003) に よ っ て 単 離 さ れ た 変 異 株 ( tua2 T349I 、
tua4 S 178Δ 、 tua4 T349I 、 tub2 C239Y 、 tub4 L250F 、 tub4 S351F )も 併 せ て 用 い 、チ ュ
ーブリン変異によるねじれ形質と細胞伸長の極性を形成する機構の包括的
な理解を目指して解析を行った。
- 22 -
3-2. ね じ れ 変 異 株 に お け る 分 裂 装 置 の 形 態
シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 根 に お け る 根 端 の 分 裂 領 域 の 細 胞 が 分 裂 す る 時 に は 、野
生 株 で は 分 裂 赤 道 面 は 器 官 長 軸 に 直 交 す る よ う に 形 成 さ れ る 。ね じ れ 変 異 株
に お け る 傾 い た 細 胞 伸 長 と い う 形 質 は 伸 長 領 域 で 現 れ る が 、そ の 起 源 は 分 裂
領 域 で 形 成 さ れ て い る 可 能 性 が あ る 。す な わ ち 、細 胞 の 分 裂 面 が そ も そ も 傾
い て し ま い 、そ の ま ま 伸 長 す る こ と で ね じ れ が 生 じ て い る こ と が 考 え ら れ る 。
シ ビ ア な 表 現 形 を 示 す チ ュ ー ブ リ ン 変 異 株 tub2 C239Y で は 細 胞 質 分 裂 に 失 敗
し 、多 核 化 し た 細 胞 が 観 察 さ れ る（ 金 子 2003）。ま た 、微 小 管 付 随 タ ン パ ク
に変異を持つ高温感受性の変異株であり制限温度条件下で左巻きねじれ形
質 を 示 す 変 異 株 mor1-1 で は 、 ね じ れ と 同 時 に フ ラ グ モ プ ラ ス ト の 形 状 の 乱
れ や 分 裂 が 終 了 す る ま で の 時 間 が 遅 延 し て い る 様 子 が 観 察 さ れ る な ど 、ね じ
れ 変 異 株 に お い て も 分 裂 装 置 に 関 す る 異 常 が 報 告 さ れ て い る（ Kawamura et
al., 2006）。 し か し 、 こ れ ら の 変 異 株 に お い て 分 裂 装 置 が 最 終 的 に ど の よ う
な 分 裂 面 を 形 成 し て い る か は 示 さ れ て お ら ず 、マ イ ル ド な 表 現 形 を 示 す ね じ
れ 変 異 株 に お い て も 細 胞 分 裂 時 の 微 小 管 の 観 察 は さ れ て い な い 。そ こ で 、弱
い ね じ れ 形 質 を 持 つ lefty2 変 異 株 を 用 い 、根 端 の 分 裂 組 織 に お い て 分 裂 期 に
微 小 管 に よ っ て 形 成 さ れ る 構 造 の 観 察 を 行 っ た（ 図 .13）。そ の 結 果 、根 端 領
域で観察された前期前微小管束やフラグモプラストから推測される分裂赤
道面は野生型同様に器官の長軸に対して直交していた。
3-3. ド ミ ナ ン ト ネ ガ テ ィ ヴ 効 果 に よ る ね じ れ 形 質 の 再 現
変 異 型 の チ ュ ー ブ リ ン タ ン パ ク が 微 小 管 に と り こ ま れ 、ド ミ ナ ン ト ネ ガ テ
ィ ブ な 効 果 を 示 す か ど う か を 検 証 し た 。 α -チ ュ ー ブ リ ン の C 末 側 に タ グ を
付 け た 融 合 タ ン パ ク は 微 小 管 に 取 り 込 ま れ 、 β -チ ュ ー ブ リ ン は N 末 に 融 合
さ せ た 場 合 に 取 り 込 ま れ る (Abe et al., 2005)。こ れ に 従 い 、得 ら れ た ア ミ ノ
酸 変 異 を α -チ ュ ー ブ リ ン に 関 し て は C 末 に Myc タ グ を 融 合 さ せ た TUA6 に 、
β -チ ュ ー ブ リ ン に 関 し て は N 末 に ４ ×Myc を 融 合 さ せ た TUB4 に 導 入 し 、
CaMV35S プ ロ モ ー タ 制 御 下 で 発 現 す る コ ン ス ト ラ ク ト を 野 生 型 シ ロ イ ヌ ナ
ズ ナ に 形 質 転 換 し た 。 野 生 型 チ ュ ー ブ リ ン に Myc タ グ を 融 合 さ せ た 融 合 タ
ンパクが微小管に取り込まれることを二重免疫染色によって確認した
（ 図 .14）。こ の と き 、幼 植 物 体 の 形 態 に 影 響 を 与 え る こ と は な か っ た 。そ れ
に 対 し て 、変 異 を 導 入 し た チ ュ ー ブ リ ン を 発 現 さ せ た 場 合 は 内 生 の チ ュ ー ブ
リ ン と 共 に 微 小 管 に 取 り 込 ま れ 、元 の ね じ れ 変 異 株 と 同 じ 方 向 の ね じ れ 形 質
が 再 現 さ れ た（ 図 .14）。Thitamadee et al. (2002)、金 子 (2003)に よ っ て 単 離
された変異株では既に同様の方法でねじれ形質が再現されることが報告さ
れ て い る 。本 研 究 で は 新 た に 発 見 さ れ た ア ミ ノ 酸 置 換 変 異 21 種 中 17 種 で 再
現 を 試 み た が 、そ の 全 て で オ リ ジ ナ ル の 変 異 株 と 同 様 の 方 向 に ね じ れ が 生 じ
て い る こ と を 確 認 し た（ 表 .３ ）。 こ の こ と か ら 、本 研 究 で 得 ら れ た ね じ れ 変
- 23 -
異 株 は 、発 現 し た 変 異 型 チ ュ ー ブ リ ン が 微 小 管 に 取 り 込 ま れ 、ド ミ ナ ン ト ネ
ガティヴ効果によってねじれ形質を生じている変異株であることが示され
た。
3-4. チ ュ ー ブ リ ン 遺 伝 子 の 発 現 量 と 変 異 株 の 出 現 頻 度 の 関 係
シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の チ ュ ー ブ リ ン は 、 α -チ ュ ー ブ リ ン が 6 つ 、 β -チ ュ ー ブ
リンは 9 つの遺伝子によってコードされる遺伝子ファミリーを形成してい
る 。 α -チ ュ ー ブ リ ン 遺 伝 子 は 、 生 殖 組 織 で の 発 現 が 強 い TUA1 を 除 い て 組
織 全 体 で 発 現 し て お り 、栄 養 生 長 器 官 で 発 現 す る も の は ア ミ ノ 酸 レ ベ ル の 配
列 か ら TUA3 / 5 と TUA2 / 4 / 6 の 二 つ の サ ブ フ ァ ミ リ ー に 分 類 さ れ る（ 図 .15A）。
幼 植 物 体 で は TUA2 / 4 / 6 サ ブ フ ァ ミ リ ー の 遺 伝 子 の 発 現 量 が 多 い こ と が 報 告
さ れ て い る （ Abe et al. 2004; 図 .15B）。 実 際 、 α -チ ュ ー ブ リ ン の 変 異 に よ
る ね じ れ 変 異 株 と し て 単 離 さ れ た も の の 多 く が こ の TUA2 / 4 / 6 サ ブ フ ァ ミ リ
ー の 遺 伝 子 に 変 異 を 生 じ て い た 。 (22 系 統 /25 系 統 )
β -チ ュ ー ブ リ ン は 、 TUB2 と TUB3 が ア ミ ノ 酸 レ ベ ル で 同 一 の 配 列 を コ
ー ド し て い る 他 は 明 確 な サ ブ フ ァ ミ リ ー を 形 成 し て い な い （ 図 .15C）。 本 研
究 に お い て 単 離 さ れ た β -チ ュ ー ブ リ ン 変 異 株 の う ち 半 数 以 上 は TUB4 に 変
異 を 持 つ も の で あ り (9 系 統 /17 系 統 )、他 は TUB1 / 2 / 3 の 変 異 に よ る も の で あ
っ た 。 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の β -チ ュ ー ブ リ ン の 発 現 レ ベ ル に つ い て の 詳 細 な 研
究 は こ れ ま で に 報 告 さ れ て い な た め 、発 現 量 の 検 討 に は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の マ
イ ク ロ ア レ イ デ ー タ ベ ー ス で あ る GENEVESTIGATOR (Zimmermann et al.
2004)を 用 い た 。こ れ に よ る と 、TUB2 / 3 / 4 は 植 物 体 全 体 で 比 較 的 強 く 発 現 し
て お り 、 TUB1 は 根 に お け る 発 現 量 が 高 い （ 図 .15D）。
3-5. 分 子 モ デ リ ン グ に よ る 変 異 箇 所 の 分 類 と 機 能 の 推 定
ねじれ変異の原因となった置換や欠損を起こしていたアミノ酸はシロイ
ヌ ナ ズ ナ に お け る ア イ ソ フ ォ ー ム 間 で 保 存 さ れ て い る も の と 、ブ タ と シ ロ イ
ヌナズナの種間でも高度に保存されているアミノ酸の置換によるものであ
っ た（ 図 .16）。そ こ で 、ブ タ 脳 よ り 精 製 し た チ ュ ー ブ リ ン を 用 い て 決 定 さ れ
た ヘ テ ロ ダ イ マ ー の 三 次 元 立 体 構 造 モ デ ル (Nogales et al., 1998, Lowe et
al., 2001)を 元 に 変 異 ア ミ ノ 酸 の 位 置 を マ ッ プ し 、 そ の 位 置 か ら 変 異 株 を 5
種類に分類した。
(ⅰ )イ ン ト ラ ダ イ マ ー イ ン タ ー フ ェ ー ス 領 域 （ 図 .17A）
α -チ ュ ー ブ リ ン と β -チ ュ ー ブ リ ン が ヘ テ ロ ダ イ マ ー を 形 成 す る 際 に 接 触
す る 領 域 で あ る 。本 研 究 に お い て 新 た な 変 異 体 を 単 離 す る こ と は で き な か っ
た が 、 Thitamadee et al. (2002)、 金 子 (2003)に よ る 研 究 か ら 得 ら れ た 左 巻
き ね じ れ 変 異 株 5 種 ( tua4 S 178Δ 、 lefty2 ( tua4 S180F )、 lefty1 ( tua6 S180F )、
- 24 -
tub4 L250F 、 tub4 S351F )は こ の 領 域 に 変 異 が 生 じ て い る 。
(ⅱ )イ ン タ ー ダ イ マ ー イ ン タ ー フ ェ ー ス 領 域 （ 図 .17B）
微 小 管 原 繊 維 内 で ヘ テ ロ ダ イ マ ー 同 士 が 接 触 す る 領 域 で あ る 。金 子 (2003)
に よ っ て 単 離 さ れ た 左 巻 き ね じ れ 変 異 株 2 種 ( tua2 T349I 、 tua4 T349I )は こ の 領
域 に 変 異 を 生 じ て い た 。 本 研 究 で は 、 右 巻 き ね じ れ 変 異 株 5 種 ( tua6 P325S 、
tub4 S95F 、tub1 S96F 、tub4 G96D 、tub4 P220S )と 左 巻 き ね じ れ 変 異 株 2 種（ tub4 T178I 、
tub1 A394T ） が 得 ら れ た 。
(ⅲ )横 方 向 の 相 互 作 用 領 域 （ 図 .17C）
微 小 管 原 繊 維 間 の 相 互 作 用 は 主 に M ル ー プ 領 域 (α -チ ュ ー ブ リ ン で は
K279 か ら S287 ま で 、 β -チ ュ ー ブ リ ン で は S277 か ら S285 ま で の ル ー プ
構 造 )と 、 M ル ー プ に 相 互 作 用 す る 相 手 と な る ル ー プ 領 域 に よ っ て 担 わ れ る
と さ れ る 。こ れ ら の 領 域 と そ の 近 傍 で 生 じ た 変 異 の 多 く は 右 巻 き ね じ れ を 生
じ ( tua2 T56I 、 tua4 T56I 、 tua6 T56I 、 tua4 V62I 、 tua4 S277F 、 tua6 S277F 、 tua6 A281T 、
tua2 E284K 、 tub2 P287L 、 tub3 P287L 、 tub4 P287L )、 1 種 ( tub4 E288K )の み 左 巻 き ね じ
れを生じた。
(ⅳ )GTPase 活 性 化 領 域 （ 図 .17D）
遊 離 の チ ュ ー ブ リ ン ヘ テ ロ ダ イ マ ー が 微 小 管 に 取 り 込 ま れ る と 、隣 接 す る
ヘ テ ロ ダ イ マ ー の β -チ ュ ー ブ リ ン の GTPase を 活 性 化 し 、内 包 す る GTP の
加 水 分 解 を 起 こ す 。 α -チ ュ ー ブ リ ン の 8 番 目 の ヘ リ ッ ク ス と そ の 直 前 の ル
ー プ 構 造 (T240 か ら M259 ま で )が こ の 機 能 を 司 る と さ れ て い る 。 右 巻 き ね
じ れ 変 異 株 tua5 D251N で 変 異 を 生 じ て い た 251 番 目 の ア ス パ ラ ギ ン 酸 は 、重
合 時 に 隣 接 す る β -チ ュ ー ブ リ ン の GTP に 接 触 し 、 GTPase 機 能 を 活 性 化 す
る 重 要 な ア ミ ノ 酸 で あ る と さ れ て い る (Anders and Bostein, 2000)。
(ⅴ )そ の 他
そ の 他 の 5 種 の 変 異 株 ( tua4 R2K 、 tua3 D205N 、 tua3 R390W 、 tub2 C239Y 、
tub1 G245E )に 関 し て は 構 造 解 析 に よ っ て 何 ら か の 機 能 が 推 定 さ れ て い る 領 域
に 位 置 す る ア ミ ノ 酸 の 変 異 で は な か っ た 。 し か し 、 α -チ ュ ー ブ リ ン の N 末
は GTPase 活 性 化 領 域 に 近 接 し て い る こ と か ら 、 tua4 R2K 変 異 は こ の 領 域 に
異 常 を 抱 え て い る 可 能 性 が あ る （ 図 .17D）。
3-6. 根 の 伸 長 方 向 と 表 層 微 小 管 配 向 の 関 係
野生型植物体は硬い寒天培地上で生育させると根をほぼ真下に伸長させ
る 。こ れ を 図 .8A の よ う に 培 地 の 上 か ら 見 て 重 力 方 向 を 基 準 と し 計 測 す る と 、
-3.56°と わ ず か な が ら 左 方 向 に 伸 長 さ せ て い た 。こ の と き 、根 の 表 皮 細 胞 に
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お け る 表 層 微 小 管 は 、細 胞 の 長 軸 に 対 し て 直 交 す る よ う に 並 ぶ 。こ の 配 向 は
表 皮 細 胞 が 外 界 に 接 す る 側 (outer cortical microtubules)で あ っ て も 内 皮 細
胞 に 面 し て い る 側 (inner cortical microtubules)で も 同 様 で あ る （ 図 .18A）。
抗 α -チ ュ ー ブ リ ン 抗 体 を 用 い た 免 疫 染 色 に よ っ て 表 層 微 小 管 を ラ ベ ル し 、
そ れ を 根 の 伸 長 領 域 の 表 皮 細 胞 に お い て 観 察 す る と 、 outer cortical
microtubules の 傾 き は 細 胞 長 軸 に 直 交 す る 角 度 を 基 準 と し て 6.73°で あ り 、
や や 右 上 が り に 傾 い て い る （ 表 .４ 、 図 .19）。
左 巻 き ね じ れ 変 異 株 で あ る lefty2 で は 硬 い 寒 天 培 地 上 で 根 を 左 方 向 に 伸
長 さ せ 、 outer cortical microtubules が 右 上 が り 、 inner cortical
microtubules が 左 上 が り に 傾 く 右 巻 き ヘ リ ッ ク ス 方 向 の 構 造 を と る
(Ishida et al., 2007)。一 方 、植 物 特 異 的 な 微 小 管 付 随 タ ン パ ク の 変 異 に よ る
右 巻 き ね じ れ 変 異 株 で あ る spr1 で は 根 の 伸 長 方 向 は 右 で あ り 、 outer
cortical microtubules が 左 上 が り 、 inner cortical microtubules が 右 上 が
りに傾く左巻きヘリックス方向の構造をとることが報告されている
(Furutani et al., 2000)。
そ こ で 、新 た に 得 ら れ た チ ュ ー ブ リ ン 変 異 に よ る ね じ れ 変 異 株 で も 、根 の
伸長方向と表層微小管の配向を測定し、それらに相関があるかを検証した。
そ の 結 果 、チ ュ ー ブ リ ン 変 異 株 で も 同 様 の 条 件 で 右 巻 き ね じ れ 変 異 株 は 根 を
右 方 向 に 伸 長 さ せ 、左 巻 き ね じ れ 変 異 株 は 左 方 向 に 伸 長 さ せ た （ 表 .４ ）。変
異株のねじれには強い系統から弱い系統までかなりのバリエーションがあ
り 、強 い 表 現 型 を 示 し 表 皮 細 胞 が 肥 大 す る 変 異 株 で は ね じ れ や 根 の 伸 長 方 向
を 正 確 に 測 る こ と が で き な か っ た 。こ の よ う な 変 異 株 は 野 生 株 と 交 配 し て 作
出 し た ヘ テ ロ 接 合 体 を 用 い て 解 析 を 行 っ た 。表 層 微 小 管 の 傾 き を 計 測 す る と 、
新たに単離されたねじれ変異株でも左巻きねじれ変異株では表層微小管は
右 巻 き へ リ ッ ク ス 方 向 の 傾 き を 持 ち 、右 巻 き ね じ れ 変 異 株 で は 左 巻 き ヘ リ ッ
ク ス の 配 向 で あ っ た （ 表 .４ 、 図 .18、 図 .19）。 各 株 の 表 層 微 小 管 の 傾 き を Y
軸 、根 の 伸 長 方 向 を X 軸 に と っ た 分 布 図 を 描 く と 野 生 株 は 原 点 近 く に 位 置 し 、
左 巻 き ね じ れ 変 異 株 で は 図 の 左 上 部 に 、右 巻 き ね じ れ 変 異 株 は 右 下 部 に 集 中
し た （ 図 .20）。 こ の 2 値 の 相 関 係 数 を と る と -0.92 で あ り 、 非 常 に 強 い 負 の
相 関 を 示 す 。こ の こ と は 、表 層 微 小 管 の 傾 き が 大 き く な れ ば ね じ れ の 強 さ も
大きくなるという関係にあることを示している。
3-7. GFP-TUB6 を 用 い た 表 層 微 小 管 動 態 の 観 察
これまでに行われたシロイヌナズナにおけるねじれ形質と微小管動態と
の 関 係 を 検 証 し た 研 究 の 結 果 に よ る と 、低 濃 度 の 微 小 管 脱 重 合 剤 処 理 に よ っ
て 左 巻 き ね じ れ 形 質 が 現 れ 、こ の と き 微 小 管 は 伸 長 し に く く よ り 脱 重 合 寄 り
の 傾 向 を 示 し た (Nakamura et al., 2004)。 一 方 、 N 末 に タ グ を 付 け た α -チ
ューブリンを発現するシロイヌナズナは左巻きへリックス状の表層微小管
- 26 -
配 向 と 右 巻 き の ね じ れ 形 質 を 持 ち 、 微 小 管 動 態 は 重 合 促 進 と dynamicity の
低 下 と い う 傾 向 に あ る こ と が 観 察 さ れ て い て い る (Abe et al., 2005)。こ の こ
と か ら 、微 小 管 動 態 の 変 化 が 表 層 微 小 管 の 形 成 に 影 響 し 傾 い た 微 小 管 配 向 に
影 響 を 与 え る の で は な い か と い う 仮 説 が 提 唱 さ れ て い る (Ishida et al.,
2007)。
そ こ で 、 左 右 の ね じ れ 変 異 株 か ら tua5 D251N と tua4 S 178Δ を 選 び 、
GFP-TUB6 発 現 植 物 体 と 交 配 し た 微 小 管 標 識 系 統 を 作 出 し て 変 異 型 チ ュ ー
ブ リ ン を 含 む 微 小 管 動 態 を 観 察 し た 。 tua5 D251N は GTPase 活 性 化 ド メ イ ン
の 変 異 株 で あ り 、 tua4 S 178Δ は イ ン ト ラ ダ イ マ ー 領 域 の 変 異 で あ る た め 、 微
小管付随タンパクやモータータンパクの結合に関与する領域ではないと考
え ら れ る 。各 系 統 で 幼 植 物 体 胚 軸 上 部 の 伸 長 領 域 の 表 皮 細 胞 に お け る 表 層 微
小 管 ネ ッ ト ワ ー ク を 構 成 す る 微 小 管 の 密 度 を 、細 胞 長 軸 に 対 し て 交 差 す る 微
小 管 の 数 を 計 測 し て 比 較 し た（ 図 .21）。コ ン ト ロ ー ル 株 で は 1µm あ た り 1.18
本 の 微 小 管 が 並 び 、 tua4 S 178Δ で は 1.23 本 /µm と ほ ぼ 同 じ 値 で あ っ た が 、
tua5 D251N で は 1.72 本 /µm と 表 層 微 小 管 が 密 に 並 ん で い た 。
次 に 、2 種 類 の チ ュ ー ブ リ ン 変 異 株 に お け る 表 層 微 小 管 の 動 態 を 解 析 し た 。
解 析 手 法 は 、 Shaw et al., (2003)、 Nakamura et al.,(2004)の 方 法 に 従 い 、
顕微鏡観察によって得られたタイムラプス画像から微小管のプラス端とマ
イ ナ ス 端 を そ れ ぞ れ プ ロ ッ ト し て growth や shrinkage と い っ た 挙 動 を 経 時
的 に 追 跡 し た 。 さ ら に 得 ら れ た デ ー タ か ら growth や shrinkage の 速 度 、
growth/shrinkage/pause と い っ た 位 相 転 換 の 頻 度 と 各 位 相 が 占 め る 割 合 、
そ し て 伸 長 収 縮 に 関 わ ら ず 微 小 管 の 長 さ が 変 化 し た 量 を 示 す dynamicity の
値 を 算 出 し た （ 表 . ５ ）。 コ ン ト ロ ー ル に お け る プ ラ ス 端 の growth と
shrinkage の 速 度 は そ れ ぞ れ 4.68µm/min、11.53µm/min で あ っ た 。tua5 D251N
と コ ン ト ロ ー ル を 比 較 す る と 、主 に プ ラ ス 端 で growth や shrinkage の 速 度
が 遅 く な っ て い る 様 子 が 示 さ れ た (そ れ ぞ れ 2.80µm/min、 6.9µm/min)。 ま
た、マイナス端では急速な脱重合を起こさず高度に安定化しており、
dynamicity の 値 が 小 さ く な っ て い た (コ ン ト ロ ー ル 1.89µm/min に 対 し て
tua5 D251N で は 0.20µm/min)。こ の こ と か ら 、tua5 D251N を 含 む 微 小 管 は 伸 長
も収縮も起こりにくい非常に静的な状態にあると考えられる。一方、
tua4 S 178Δ で は コ ン ト ロ ー ル に 比 べ て growth の 速 度 が 非 常 に 高 く な っ て お り 、
こ れ は プ ラ ス 端 で 特 に 顕 著 で あ る (7.46µm/min)。結 果 と し て プ ラ ス 端 は 非 常
に 動 的 と な っ て い て 、 コ ン ト ロ ー ル の dynamicity は 4.89µm/min で あ る の
に 対 し て tua4 S 178Δ で は 8.41µm/min ま で 上 昇 し て い た 。 Catastrophe や
Rescue と い っ た 位 相 転 換 の 頻 度 は 両 変 異 株 と も 目 立 っ た 違 い は 見 ら れ な か
った。
3-7.
プ ラ ス 端 マ ー カ ー GFP-EB1 を 用 い た 解 析
- 27 -
微 小 管 動 態 を 検 証 し た 結 果 か ら 、 右 巻 き ね じ れ 変 異 株 tua5 D251N 、 と 左 巻
き ね じ れ 変 異 株 tua4 S 178Δ 微 小 管 の プ ラ ス 端 に お け る 動 態 に 対 照 的 な 結 果 が
得 ら れ た た め 、プ ラ ス 端 に 関 し て さ ら に 詳 細 な 解 析 を 行 っ た 。シ ロ イ ヌ ナ ズ
ナ の プ ラ ス 端 集 積 タ ン パ ク で あ る EB1b に GFP を 繋 い だ 融 合 タ ン パ ク
（ GFP-EB1; Mathur et al., 2003） を 用 い て 変 異 株 に お け る プ ラ ス 端 の シ グ
ナ ル の 動 態 を 調 べ た （ 図 .22）。 各 変 異 株 と GFP-EB1 発 現 植 物 体 と を 交 配 し
試 験 系 統 を 作 出 し た 。プ ラ ス 端 の Growth rate は コ ン ト ロ ー ル 、tua5 D251N 、
tua4 S 178Δ で そ れ ぞ れ 4.54 ± 1.64µm/min 、 3.95 ± 2.03µm/min 、 5.35 ±
1.65µm/min（ 各 12 microtubules、 合 計 1000 秒 以 上 ず つ 計 測 ） で あ り 、 速
度 に 関 し て は tua5 D251N で 静 的 、 tua4 S 178Δ で 動 的 と い う GFP-TUB6 を 用 い
た 解 析 と 同 じ 傾 向 を 示 し た 。プ ラ ス 端 領 域 に お け る GFP-EB1 シ グ ナ ル の 強
度 の 変 化 を 計 測 す る と 、 コ ン ト ロ ー ル で は 、 GFP-EB1 は 伸 長 し て い る 微 小
管のプラス端を強く標識し、尾を引いたコメット状の蛍光パターンを示す
（ 図 .23A）。 tua4 S 178Δ で は GFP-EB1 コ メ ッ ト 領 域 の 大 き さ は コ ン ト ロ ー ル
と比べてわずかに小さいもののほとんど変化は見らなかった。一方、
tua5 D251N で は コ メ ッ ト の 大 き さ に 有 意 な 差 は 見 ら れ な い も の の 、 シ グ ナ ル
がプラス端領域のみならず微小管全体にわたって標識している様子が観察
さ れ た 。プ ラ ス 端 を 基 準 に し て や や マ イ ナ ス 端 寄 り (1.0～ 2.0µm)の 領 域 で の
シグナル強度の比を計測した。ピークに対する相対値でコントロール、
tua5 D251N 、 tua4 S 178Δ の 順 に そ れ ぞ れ 0.16、 0.43、 0.10 で あ り 、 tua5 D251N
ではプラス端よりも内側の微小管で強く標識されていることが示された
（ 図 .23B）。
そ こ で 、 GFP-EB1 に よ る 標 識 パ タ ー ン が 変 化 し た 原 因 を 探 る た め 、 EB1
が 微 小 管 プ ラ ス 端 に 集 積 す る 機 構 の 検 証 を 行 っ た 。EB1 の よ う な +Tips が プ
ラ ス 端 に 集 積 す る 機 構 に つ い て は 複 数 の 仮 説 が 提 唱 さ れ て い る (Tirnauer and
Bierer, 2000; Tirnauer et al., 2002)。 す な わ ち 、 １ ） EB1 が 遊 離 の チ ュ ー ブ リ
ン ダ イ マ ー に 結 合 し 、そ れ が 微 小 管 に 共 重 合 さ れ た 後 に 外 れ る こ と で プ ラ ス
端 に 集 中 し て い る よ う に 見 え る と い う モ デ ル と 、 ２ ） GTP 結 合 型 チ ュ ー ブ
リンやシート構造などといった重合状態にあるプラス端特有の構造を認識
し て 結 合 す る た め プ ラ ス 端 に 集 積 す る と い う モ デ ル で あ る（ 図 .24）。各 モ デ
ル に 沿 っ て tua5 D251N に お け る プ ラ ス 端 以 外 の 領 域 で 観 察 さ れ た GFP-EB1
の 標 識 パ タ ー ン が で き た 原 因 を 考 え る と 、プ ラ ス 端 で 微 小 管 に 共 重 合 さ れ た
EB1 が そ の ま ま 外 れ ず 残 っ て し ま っ て い る 可 能 性 と 、 微 小 管 側 の EB1 に よ
っ て 認 識 さ れ る 何 ら か の 構 造 が プ ラ ス 端 領 域 以 外 で も 形 成 さ れ る こ と で 、そ
の 領 域 で も 独 立 に 集 積 が 起 き て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。こ れ を 検 証 す る た
め 、 FRAP 解 析 を 行 っ た 。 GFP-EB1 を 発 現 す る コ ン ト ロ ー ル 植 物 体 を 用 い
た 観 察 で は 、ブ リ ー チ 後 の 蛍 光 回 復 は 新 た に 伸 長 し た 微 小 管 の プ ラ ス 端 先 端
か ら で は な く 、コ メ ッ ト 全 体 で 同 時 に 起 き て い た（ 図 .25、図 .26B）。tua5 D251N
- 28 -
に お け る GFP-EB1 の 蛍 光 は 、ブ リ ー チ 直 後 か ら 急 速 に 回 復 し 、60 秒 後 に は
ほ ぼ ブ リ ー チ 前 の 状 態 に 戻 っ た （ 図 .26A）。 こ れ に 対 し て 、 GFP-TUB6 の
FRAP 解 析 で は 、ブ リ ー チ し た 領 域 で 新 た に 微 小 管 が 伸 長 し た と こ ろ で の み
蛍 光 の 回 復 が 起 こ る た め 、 60 秒 後 で も わ ず か な シ グ ナ ル が 回 復 す る 程 度 で
あ っ た（ 図 .26C）。す な わ ち 、GFP-EB1 で は 新 た な 微 小 管 の 伸 長 が な く て も
微 小 管 全 長 を 標 識 す る 蛍 光 が 回 復 し て い る と 考 え ら れ る 。 EB1 が モ デ ル 1)
の よ う な 振 る 舞 い を す る な ら ば GFP-TUB6 の よ う に 伸 長 す る 微 小 管 で の み
蛍 光 回 復 が 観 察 さ れ る は ず だ が 、実 際 に は 、微 小 管 の 伸 長 と は 無 関 係 に 蛍 光
回 復 が 起 き て い る こ と か ら 、 細 胞 質 中 の EB1 が 直 接 微 小 管 に 集 積 す る と い
う 挙 動 を 示 す と 考 え ら れ る 。 す な わ ち 、 EB1 の 挙 動 と し て は モ デ ル 2)で 言
及される、プラス端特有の構造を認識し集積している可能性が示唆される。
tua5 D251N は 前 述 し た よ う に GTPase 活 性 化 機 能 に 異 常 を 持 ち 、β -チ ュ ー ブ
リ ン に 内 包 さ れ る GTP の 加 水 分 解 が 起 こ り に く く な る こ と で プ ラ ス 端 以 外
の 領 域 に GTP-チ ュ ー ブ リ ン が 残 っ て し ま う と 推 測 さ れ る 。以 上 の こ と か ら 、
EB1 は 本 来 的 に は GTP cap 構 造 を 認 識 す る こ と で プ ラ ス 端 に 局 在 し 、
tua5 D251N で は プ ラ ス 端 以 外 の 領 域 で 形 成 さ れ た GTP cap 様 構 造 を 認 識 し て
しまうことで微小管全体を標識するパターンを作り上げている可能性が考
えられる。
3-8. そ の 他 の チ ュ ー ブ リ ン 変 異 に よ る ね じ れ 変 異 株 の 微 小 管 動 態 観 察
微小管動態の変化が左右のねじれ変異全般に起こっているかを検証する
た め 、左 巻 き ね じ れ 変 異 株 と し て 横 方 向 の 相 互 作 用 領 域 の 変 異 株 tub4 E288K 、
イ ン タ ー ダ イ マ ー 領 域 の 変 異 株 tua2 T349I を 、 右 巻 き ね じ れ 変 異 株 と し て 横
方 向 の 相 互 作 用 領 域 の 変 異 株 tua6 A281T 、tua2 E284K と イ ン タ ー ダ イ マ ー 領 域
の 変 異 株 tub4 G96D を 用 い 、各 変 異 株 に GFP-TUB6 を 導 入 し て 同 様 に 動 態 の
観 察 を 行 っ た（ 表 .６ ）。 そ の 結 果 、 左 巻 き ね じ れ 変 異 株 で は 微 小 管 が 動 的 に
変 化 し て い る 様 子 は 観 察 さ れ ず 、 む し ろ 両 端 と も dynamicity の 値 が や や 小
さ く な っ て い て 静 的 な 状 態 に あ る と 考 え ら れ る 。右 巻 き ね じ れ 変 異 株 で も 用
い た 3 変 異 株 全 て で 両 端 の dynamicity は 小 さ く な っ て い て 静 的 な 状 態 に あ
る と 推 測 さ れ る 。 傾 向 と し て は 右 巻 き ね じ れ 変 異 株 tua5 D251N と 同 じ で あ る
が 、 こ れ は tua5 D251N で 観 察 さ れ た 変 化 に 比 べ る と 小 さ か っ た 。
3-9. TEM に よ る 微 小 管 原 繊 維 構 造 の 観 察
チ ュ ー ブ リ ン を in vitro で 重 合 さ せ る と 、 原 繊 維 の 本 数 が 9 本 か ら 16 本
ま で の バ リ エ ー シ ョ ン を 持 っ た 微 小 管 が 形 成 さ れ る (Chretien et al., 1996)。
こ の 中 で も 、 13 本 の 原 繊 維 か ら な る 微 小 管 の み が 真 っ 直 ぐ な 原 繊 維 構 造 を
も ち 、そ れ 以 外 は 原 繊 維 が ね じ れ を 持 つ ス ー パ ー ツ イ ス ト 構 造 を 持 つ と さ れ
て い る (Chretien et al., 1996)。 そ こ で 、 TEM を 用 い て 野 生 株 、 tua5 D251N 、
- 29 -
tua4 S 178Δ の 根 の 表 皮 細 胞 に お け る 表 層 微 小 管 の 観 察 を 行 い 、合 計 で 13 本 の
微 小 管 の 断 面 像 を 得 た （ 図 .27 ）。 こ の 画 像 か ら Markham’s rotational
analysis に よ っ て 微 小 管 を 構 成 す る 原 繊 維 の 本 数 を 推 定 し た 。 原 繊 維 が 13
本 で あ る と 仮 定 し 27.7°で 回 転 処 理 を し た 場 合 の 投 影 像 で は 明 瞭 な 境 界 の
染 色 が 確 認 さ れ た（ 図 .10）。し か し 、12 本 (30°)や 14 本 (25.7°)を 仮 定 し た
場 合 で は 明 瞭 な 境 界 を 持 つ 投 影 画 像 は で き な か っ た（ 図 .10）。よ っ て 、今 回
観 察 し た 微 小 管 は 全 て 13 本 の 原 繊 維 に よ っ て 構 成 さ れ る 微 小 管 で あ る と 判
断 し た 。す な わ ち 、ね じ れ 変 異 株 に お い て も 表 層 微 小 管 の 大 部 分 は ス ー パ ー
ツイスト構造をとらないと考えられる。
- 30 -
Tubulin Amino acid
TUA4
TUA2
TUA4
TUA6
TUA4
TUA4
TUA4
TUA6
TUA3
TUA5
TUA4
TUA4
TUA6
TUA6
TUA2
TUA6
TUA2
TUA4
TUA3
R2K
T56I
T56I
T56I
V62I
S178Δ
S180F
S180F
D205N
D251N
M268I
S277F
S277F
A281T
E284K
P325S
T349I
T349I
R390W
cDNA
G5A
C167T
C167T
C167T
G184A
Δ*
C539T
C539T
G613A
G751A
G804A
C830T
C830T
G850A
G841A
C973T
C1046T
C1046T
C1168T
Phenotype Complementation
strong (R)
strong (R)
strong (R)
strong (R)
strong (R)
middle (L)
weak (L)
weak (L)
weak (L)
middle (R)
middle (R)
middle (R)
weak (R)
middle (R)
middle (R)
middle (R)
middle (L)
strong (L)
weak (L)
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
n.t.
n.t.
Yes
Position
ecotype
Mutagen
independently
isolated
reference
Others
Lateral
Lateral
Lateral
Lateral
Intardimer
Intardimer
Intardimer
Others
GAP
Lateral
Lateral
Lateral
Lateral
Lateral
Interdimer
Interdimer
Interdimer
Others
Col,Ler
Col
Col
Col,WS
Col
Col
Ler
Ler
Col
Col
Col
Col
Col,WS
Col
Col
Col
Col
Col
Col
EMS
EMS
EMS
EMS
EMS
T-DNA
Fast neutron
Fast neutron
EMS
EMS
EMS
EMS
EMS
T-DNA
EMS
EMS
EMS
EMS
EMS
3
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
This work
This work
This work
This work
This work
1*
2*
2*
This work
This work
This work
This work
This work
This work
This work
This work
1*
1*
This work
TUB1
S96F
C287T
middle (R)
Yes
Interdimer
Col
EMS
1
This work
TUB4
S95F
C284T
strong (R)
Yes
Interdimer
WS
EMS
1
This work
TUB4
G96D
G287A
middle (R)
n.t.
Interdimer
Col
EMS
1
This work
TUB4
T178I
C533T
middle (L)
Yes
Interdimer
Col
EMS
1
This work
TUB4
P220S
C658T
middle (R)
Yes
Interdimer
Col
EMS
1
This work
strong (L)
TUB2
C239Y
G716A
Yes
Others
Col
EMS
1
1*
TUB1
G245E
G734A
middle (L)
n.t.
Others
WS
EMS
1
This work
TUB4
L250F
C748T
middle (L)
Yes
Intardimer
Col
EMS
1
1*
TUB2
P287L
C860T
strong (R)
Yes
Lateral
Col
EMS
1
This work
TUB3
P287L
C860T
strong (R)
Yes
Lateral
Col,WS
EMS
3
This work
TUB4
P287L
C860T
strong (R)
Yes
Lateral
Col
EMS
1
This work
TUB4
E288K
G862A
strong (L)
Yes
Lateral
Col
EMS
1
This work
TUB4
A302V
C905T
middle (L)
n.t.
Interdimer
WS
EMS
1
This work
TUB4
S351F
C1052T middle (L)
Yes
Intardimer
Col
EMS
1
1*
TUB1
A394T
G1180A middle (L)
n.t.
Interdimer
WS
EMS
1
This work
Δ*TCT632-634 の欠損, 1* 金子(2003), 2* Thitamadee et al., (2002)
(R), Right-handed twisting; (L), Left-handed twisting
Lateral, Lateral contact regions; Intradimer, Intradimer interaction regions; Interdimer, Interdimer interaction regions;
表.３
本研究で扱った変異株
- 31 -
Wild-type
(straight)
A
1cm
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
S
T
U
V
W
X
Y
Z
AA
left-handed
mutant
right-handed
mutant
図.１１ 単離された変異株を硬い寒天培地上で生育させた場合の根の伸長方向の異常
7日齢の幼植物体の写真を示す。
A 野生株(Col-0),
B-J 左巻きねじれ変異株 B; tua4S178D, C; tua3D205N, D; tua2T349I, E; tua4T349I, F; tua3R390W,
G; tub4T178I, H; tub4L250F, I; tub4E288K, J; tub4S351F.
K-AA 右巻きねじれ変異株 K; tua2R2K, L; tua4T56I, M; tua6T56I, N; tua4V62I, O; tua5D251N, P;
tua4M268I, Q; tua4S277F, R; tua6S277F, S; tua6A281T T; tua2E284K, U; tua6P325S, V; tub1S95F, W; tub4G96D,
X; tub4P220S, Y; tub2P287L, Z; tub3P287L, AA; tub4P287L.
AA中の矢頭は tub4P287L のホモ接合体を示す。
- 32 -
left-handed mutant
100µm
right-handed mutant
Wild-type (straight)
A
B
C
G
H
D
E
I
J
O
K
L
M
N
Q
R
S
T
W
X
Y
Z
U
F
P
V
図.１２ 根の伸長領域におけるねじれ、表皮細胞の肥大といった表現型
10日齢の幼植物体の実体顕微鏡写真を示す。
A 野生株(Col-0),
B-J 左巻きねじれ変異株 B; tua4S178D, C; tua3D205N, D; tua2T349I, E; tua4T349I, F; tua3R390W,
G; tub4T178I, H; tub4L250F, I; tub4E288K, J; tub4S351F.
K-AA 右巻きねじれ変異株 K; tua2R2K, L; tua4T56I, M; tua6T56I, N; tua4V62I, O; tua5D251N, P;
tua4M268I, Q; tua4S277F, R; tua6S277F, S; tua6A281T T; tua2E284K, U; tua6P325S, V; tub1S95F, W; tub4G96D,
X; tub4P220S, Y; tub2P287L, Z; tub3P287L.
- 33 -
10µm
図.１３ 免疫染色法による分裂装置の形態の検証
抗α-チューブリン抗体を用いて染色したシロイヌナズナ根端の顕微鏡写真。矢印は前期前
微小管束を、矢頭はフラグモプラストを示す。
- 34 -
Expressed Protein
(Myc-tagged)
Primary antibody
seedling
α-tubulin
2cm
10µm
Myc
merge
TUA6WT
10µm
10µm
TUA6D205N
TUA6D251N
TUB4WT
TUB4E288K
TUB4P287L
図.１４ 形質転換植物体によるねじれ形質の再現実験
左右のねじれ変異の代表的な変異を導入し再現された10日齢の幼植物体のねじれ形質を示
す。
各導入遺伝子は左端に示した。
顕微鏡写真は各形質転換体を抗チューブリン抗体（赤）、抗Myc抗体（緑）を用いて免疫染
色し観察した画像とマージ像。
- 35 -
A
B
Vegetative
tubulins
Reproductive
Tubulins
TUA1
(%)
TUA3(2)
TUA5(1)
TUA6 (8)
TUA2 (4)
TUA4 (10)
TUA2 TUA3 TUA4 TUA5 TUA6
(4)
(2)
(10)
(1)
(8)
C
D
TUB2(2)
TUB3(3)
TUB7
TUB1(3)
TUB1(3)
TUB8
TUB8
TUB7
TUB9
TUB2(2)
TUB6
TUB6
TUB5
TUB9
TUB4(9) TUB5
TUB3(3)
TUB4(9)
図.１５ チューブリン遺伝子の発現量とねじれ変異株の出現頻度の関係
A. α-チューブリンの系統樹。括弧内にその遺伝子が原因であった変異株の出現数を示す。
B. 栄養生長期に発現するα-チューブリン遺伝子の根における発現量比較。（Abe et al.,
2004 より改変して転載）
C. β-チューブリンの系統樹。括弧内にその遺伝子が原因であった変異株の出現数を示す。
D. β-チューブリン遺伝子の根における発現量比較。（2006年11月1日現在のGenevestigator
登録のデータより改変して転載）
- 36 -
A. α-tubulin
B. β-tubulin
図.１６ チューブリンタンパクの配列比較と変異箇所
結晶構造解析に用いられたブタのチューブリンの配列を基準とし、シロイヌナズナの各
チューブリンタンパクで配列に違いのある部分を特に示す。
変異が生じていたアミノ酸をブタチューブリン配列上に矢頭で示す。
- 37 -
A
L250
S351
S178
Plus
out
B
G96
in
T349
P325
T178
A394
Minus
S95(TUB4)
S96(TUB1)
P220
C
E288
Plus
in
S277
A281
Minus
out
Plus
out
P287
V62
in
E284
T56
Minus
D
D251
R2
in
out
Plus
GDP
Minus
図.１７ 本研究で扱った変異株の変異アミノ酸残基
A. イントラダイマーインターフェース領域
B. インターダイマーインターフェース領域
C. 横方向の相互作用領域
D. GAPドメイン領域
α-チューブリン; 緑, β-チューブリン; シアン, 右巻きねじれ変異アミノ酸残基; オレン
ジ, 左巻きねじれ変異アミノ酸; 赤, β-チューブリンに内包されるGDP; マゼンタ
- 38 -
cortex side
inner microtubules
A
outside
outer microtubules
inner microtubules
B
outer microtubules
inner microtubules
C
outer microtubules
図.１８ 根の表皮細胞における表層微小管のヘリックス状の配向
抗α-チューブリン抗体を用いて免疫染色した根の表皮細胞の顕微鏡画像。同じ細胞の外界
側と内皮細胞側とを撮影した。
A. 野生株
C. tua6A281T
B. tua4S178Δ
- 39 -
WT(Col)
Right-handed mutants
tua4R2K *
tua4T56I *
tua6T56I *
tua6V62I *
tua5D251N
tua4M268I
tua4S277F
tua6S277F
tua6A281T
tua2E284K
tua6P325S
tub1S96F
tub4G96D
tub4P220S
tub2P287L *
tub3P287L *
Left-handed mutants
tua4S178⊿
tua3D205N
tua2T349I
tua3R390W
tub4T178I
tub4L250F
tub4E288K *
tub4S351F
Root skewing angles
-3.56 ± 3.27
17.17
36.99
22.36
24.79
30.71
51.56
35.02
12.80
49.40
31.60
44.11
32.60
44.10
20.99
8.49
31.89
-45.58
-15.98
-36.93
-9.05
-46.79
-30.41
-35.34
-36.79
Cortical arrays
6.73 ± 18.87
5.71
3.68
5.50
3.92
5.39
5.44
7.11
4.17
6.10
8.01
7.61
6.86
5.83
6.03
4.92
6.39
-2.32
-14.09
-7.25
-10.55
-11.45
-6.40
-18.98
-11.44
-24.62
-3.03
-19.19
-13.02
-13.00
-4.12
-7.14
-7.62
± 13.94
± 16.56
± 12.59
± 13.57
± 18.31
± 15.87
± 19.75
± 13.29
± 17.16
± 15.51
± 14.18
± 11.79
± 13.39
± 12.81
± 10.84
± 18.72
± 5.31
± 4.48
± 8.25
± 5.46
± 9.89
± 3.69
± 7.93
± 12.68
23.44
27.05
26.08
21.48
34.48
13.33
16.66
40.83
± 19.81
± 15.51
± 15.51
± 18.28
± 17.10
± 17.32
± 17.42
± 18.87
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
表.４ 根の伸長方向と表層微小管の傾きの角度
計測の方法は図.８に示した。 *はホモ接合体の表現型がシビアな変異株であり、計測には
ヘテロ接合体を用いた。
- 40 -
25
Wild type
a = 6.73
n = 100
20
15
10
5
0
-90.0
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
25
25
tua4R2K
a = -2.32
n = 60
20
15
25
tua4T56I
a = -14.09
n = 100
20
15
25
tua6T56I
a = -7.25
n = 70
20
15
15
10
10
10
10
5
5
5
5
0
-90.0
0
-90.0
0
-90.0
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
25
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
15
0.0
45.0
90.0
25
25
tua5D251N
a = -11.45
n = 100
20
(°)
-45.0
tua4M268I
a = -6.40
n = 100
20
15
0
-90.0
15
10
5
5
5
5
(°)
45.0
90.0
25
0
-90.0
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
20
15
tua2E284K
a = -3.03
n = 100
20
15
10
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
25
15
45.0
90.0
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
15
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
15
10
5
0
-90.0
0
-90.0
0
-90.0
25
(°)
0.0
45.0
90.0
15
20
15
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
25
25
tua4S178Δ
a = 23.44
n = 100
20
tua3D205N
a = 27.05
n = 100
20
15
0
-90.0
20
15
10
10
10
5
5
5
5
0
-90.0
0
-90.0
0
-90.0
(°)
0.0
45.0
90.0
25
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
20
15
20
15
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
25
25
tub4T178I
a = 34.48
n = 100
tub4L250F
a = 13.33
n = 100
20
15
20
15
10
10
5
5
5
5
(°)
0.0
45.0
90.0
0
-90.0
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
0.0
45.0
90.0
0.0
45.0
90.0
0.0
45.0
90.0
(°)
-45.0
25
tub4E288K
a = 16.66
n = 60
10
-45.0
(°)
-45.0
tua3R390W
a = 21.48
n = 100
0
-90.0
10
0
-90.0
90.0
25
tua2T349I
a = 26.08
n = 100
10
-45.0
45.0
tub3P287L
a = -7.62
n = 90
15
5
-45.0
0.0
20
10
(°)
(°)
-45.0
25
tub2P287L
a = -7.14
n = 100
20
5
90.0
90.0
tub1S96F
a = -13.20
n = 100
0
-90.0
10
45.0
45.0
5
0
-90.0
5
0.0
0.0
10
10
-45.0
(°)
-45.0
15
25
tub4P220S
a = -4.12
n = 100
20
0
-90.0
20
5
0
-90.0
90.0
25
tua6P325S
a = -19.19
n = 80
10
25
tub4G96D
a = -13.00
n = 100
20
0.0
15
5
0
-90.0
(°)
-45.0
20
10
5
0
-90.0
25
25
tua6A281T
a = -24.62
n = 100
45.0
tua6S277F
a = -11.44
n = 80
15
10
0.0
0.0
20
10
-45.0
(°)
-45.0
25
tua4S277F
a = -18.98
n = 90
20
10
0
-90.0
tua4V62I
a = -10.55
n = 100
20
0
-90.0
(°)
-45.0
0.0
45.0
90.0
tub4S351F
a = 40.83
n = 100
0
-90.0
(°)
-45.0
図.１９ 表層微小管の傾きの角度
野生株及び各変異株における表層微小管の角度を計測した結果をヒストグラムで示す。
- 41 -
50
1
Cortical MT array angles
40
2
30
4
3
5
20
6
7
8
10
Wild-type (Col)
0
12
-10
10
9
16
13
17 18
-20
11
14
15
20
19
22
21
23
24
-30
-40
-50
-60
-40
-20
0
20
40
60
root slanting angles
図.２０ 根の伸長方向と表層微小管の傾きの相関関係プロット図
1; tub4S351F, 2; tub4T178I, 3; tua2T349I, 4; tua3D205N, 5; tua4S178Δ, 6; tua3R390W, 7; tub4L250F, 8; tub4E288K,
9; tua4R2K, 10; tub4P220S, 11; tub3P287L, 12; tub2P287L, 13; tua6T56I, 14; tua2E284K, 15; tua6M268I,
16; tua6S277F, 17; tua6V62I, 18; tua5D251N, 19; tub1S96F, 20; tua4T56I, 21; tub4G96D, 22; tua4S277F,
23; tua6P325S, 24; tua6A281T. 近似直線を破線で示す。
- 42 -
A
Wild type
5µm
tua5D251N
tua4S178Δ
B
Number of microtubules / μm
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0.0
Wild type
tua5D251N
tua4S178Δ
図.２１ GFP-TUB6発現植物体
A. 各変異株の胚軸上部の表皮細胞における顕微鏡観察写真。Barは 5μm
B. 表層微小管側の密度。細胞の長軸方向の中心軸に交差する微小管側の数を計測した。
- 43 -
Leading ends
Wild type
Growth rate (µm/min )
Shrinkage rate (µm/min )
Catastrophe frequency ( events/sec )
Rescue frequency ( events/sec)
Time spent
Growth
Pause
Shrinkage
Dynamicity (µm/min )
tua5D251N
4.68
11.53
0.086
0.152
Lagging ends
tua4S178Δ
a
2.80
7.46
6.90a 11.91
0.083 0.092
0.177 0.143
a
76.8% 63.4% 52.2%
9.1% 15.4%
9.8%
14.0% 21.2% 38.0%
4.89
2.65a
8.41a
Wild type tua5D251N tua4S178Δ
a
1.48
5.50
0.174
0.145
1.56
2.31
1.49 a 6.36
0.189 0.203
0.146 0.107
9.1% 14.7%
8.4%
46.2% 55.4% 56.9%
44.7% 30.0% 34.7%
1.89
0.45 a
Wild type, n = 20 and t = 2444sec; tua5D251N, n = 10 and t = 1260sec; tua4S178Δ, n = 10 and t = 1228sec
a Statistically significant difference from wild type (P<0.05)
表.５
tua5D251N、tua4S178Δ代表的な変異株における胚軸上部の表層微小管の微小管動態
- 44 -
1.56
5µm
Wild type
tua5D251N
tua4S178Δ
図.２２ GFP-EB1発現植物体の胚軸上部の表皮細胞の顕微鏡写真
各変異株の胚軸上部の表皮細胞における顕微鏡観察写真。Barは 5μm
- 45 -
intensity relative to peak
A
1.2
Control
tua4S178Δ
tua5D251N
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Distance from the plus end (μm)
intensity relative to peak
B
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
GFP-TUB6
GFP-EB1
tua4(S178Δ)
tua4S178Δ
tua5(D251N)
tua5D251N
図.２３ GFP-EB1コメット領域のシグナルプロファイル
A. 各植物体におけるプラス端領域でのシグナルプロファイル。破線で示すシグナル強度が
ピークの50%よりも大きい領域をプラス端領域とした。四角で囲った範囲のシグナル強度を
Bに示す。
B. プラス端から1.0μm～ 2.0μmでのシグナル強度の平均値。エラーバーは標準偏差
- 46 -
A. モデル１
EB1
B. モデル２
図.２４ EB1のプラス端集積機構のモデル
A. モデル１。細胞質中のチューブリンと共にEB1が微小管に取り込まれる。この場合、微
小管が伸長しない限りEB１の新たな集積は起こらないと考えられる。
B. モデル2。プラス端領域をEB1が認識し、直接微小管に結合する。この場合、プラス端構
造が保たれていれば微小管の伸長を伴わないEB1の集積も起こりうる。
- 47 -
A
-10
B
-8
-6
-4
-2
0 sec
2
4
6
8
10
12
14
16
18
2µm
図.２５ GFP-EB1のFRAP解析
A. GFP-EB1コメット一つのブリーチ前後の連続写真を示す。
B. ブリーチ2秒前からブリーチ後4秒までを拡大した写真。GFP-EB1コメットの先端側を赤
の矢印で示す。破線で示された領域では、微小管の先端でないにもかかわらずブリーチ後
に蛍光の回復が観察される。
- 48 -
A
10µm
-4s
0s
12s
60s
-4s
0s
12s
60s
-4s
0s
12s
60s
B
C
図.２６ FRAP解析
A. tua5D251N GFP-EB1
B. GFP-EB1
C. tua5D251N GFP-TUB6
ブリーチした領域を白の破線で示す。
- 49 -
leading ends
tub4E288K
tua2T349I
tua6A281T
tua2E284K
tub4G96D
Shrinkage
rate
Shrinkage
rate
Rescue
frequency
Catastrophe
frequency
Growth
time
Pause
time
Shrinkage
time
Dynamicity
um/min
um/min
events/s
events/s
%
%
%
um/sec
3.21
3.77
3.30
2.99
4.11
10.69
11.75
12.40
8.69
8.45
0.066
0.039
0.048
0.052
0.085
0.155
0.156
0.147
0.158
0.105
71.6%
77.1%
77.3%
72.3%
59.3%
10.7%
7.1%
10.5%
9.4%
12.3%
17.7%
15.8%
12.1%
18.2%
28.4%
lagging ends
tub4E288K
1.54
4.20
0.170
0.115
10.1%
66.2%
23.7%
tua2T349I
1.49
4.34
0.160
0.078
9.5%
52.5%
38.0%
A281T
tua6
1.51
4.07
0.192
0.115
9.2%
51.1%
39.6%
tua2E284K
1.52
3.36
0.170
0.108
11.1%
61.8%
27.1%
tub4G96D
1.49
3.38
0.208
0.142
5.6%
59.3%
35.1%
E288K
T349I
A281T
, n = 20 and t = 2884sec; tua2
, n = 20 and t = 2264sec; tua6
, n = 20 and t = 2552sec;
tub4
E284K
G96D
tua2
, n = 20 and t = 2720sec; tub4
, n = 20 and t = 2644sec
表.６
tua5D251N、tua4S178Δ以外に解析を行った変異株の微小管動態
- 50 -
3.81
4.38
3.62
3.44
4.72
0.96
1.21
1.46
0.81
0.96
A
CW
PM
100nm
B
C
1
13
13
2
12
D
1
2
3
4
3
11
11
5
4
10
5
8
7
20nm
6
1
2
12
3
4
11
10
10
9
13
12
9
8
7
6
5
9
8
図.２７ TEM観察画像
A. 野生型植物体の根の表皮細胞の細胞膜周辺。CW; 細胞壁, PM; 細胞膜
B. 野生型植物体の表層微小管
C. tua5D251Nの表層微小管
D. tua4S178Δの表層微小菅
- 51 -
7
6
Ⅳ.
考察
こ れ ま で に 植 物 に お け る 伸 長 方 向 制 御 機 構 の 研 究 は 、変 異 に よ っ て 細 胞 の
伸長方向に異常を生じねじれた形質を示す変異株の解析によって進められ
て き た 。そ の 結 果 、多 く の 変 異 株 で 微 小 管 関 連 因 子 に 異 常 を 生 じ て い た こ と
が 報 告 さ れ て い る こ と か ら 、植 物 細 胞 が ま っ す ぐ に 伸 び る た め に は 表 層 微 小
管 が 重 要 な 因 子 で あ る と 考 え ら れ る 。本 研 究 に お い て は 、微 小 管 重 合 阻 害 剤
propyzamide に 対 す る 応 答 性 を 指 標 と し て 変 異 株 の ス ク リ ー ニ ン グ を 行 い 、
ド ミ ナ ン ト 効 果 を 持 つ チ ュ ー ブ リ ン 変 異 株 の コ レ ク シ ョ ン を 多 数 得 た 。変 異
株 は ね じ れ の 強 度 や 変 異 箇 所 な ど バ リ エ ー シ ョ ン に 富 み 、こ れ ら の 解 析 を 通
じて細胞の伸長方向微小管依存的な左右性の形成機構の一端を解明できる
と考え研究を行った。
チューブリン変異によるねじれ変異株はこれまでに報告されているねじ
れ 変 異 株 同 様 、急 速 に 伸 長 す る 器 官 に お い て 表 皮 細 胞 に ね じ れ を 生 じ る 。こ
のねじれ形質は根においては既に報告されているように細胞分裂が終了し
分 化 の ス テ ー ジ へ と 移 行 し て い る 伸 長 領 域 か ら 現 れ る 。一 方 、根 端 の 分 裂 組
織における各細胞はほぼ正常な形態をとり分裂面が傾いているといった様
子 は 観 察 さ れ な か っ た 。こ の こ と か ら も 、ね じ れ の 起 源 は 分 裂 面 の 乱 れ と い
うよりは細胞伸長時における極性形成の異常による可能性が強く示唆され
る 。こ れ ま で に 報 告 さ れ た ね じ れ 変 異 株 は 二 重 変 異 や 薬 剤 の 処 理 な ど で そ の
形 質 を 強 調 し た 場 合 、無 方 向 性 の 生 長 に よ り 細 胞 の 肥 大 が 起 き る こ と が 報 告
さ れ て い る (Furutani et al., 2000, Abe et al., 2004, Naoi et al., 2004)。 チ
ュ ー ブ リ ン 変 異 株 で は 、い く つ か の シ ビ ア な 表 現 型 を 示 す 変 異 株 は ホ モ 接 合
体 で 同 様 に 表 皮 細 胞 の 肥 大 が 観 察 さ れ た が 、肥 大 は 根 端 か ら で は な く 伸 長 領
域から生じていたこともこれを裏付けている。
これまでに単離されたチューブリンねじれ変異株は多くのものが半優性
の 変 異 株 で あ る 。一 部 劣 性 を 示 す 変 異 株 も 含 ま れ て い る が 、そ れ ら は 薬 剤 感
受性などの面から本質的には半優性でありヘテロ接合体では表現型が見ら
れ な い の で は な く 弱 く て 明 瞭 で な い こ と に よ る と 考 え ら れ る 。変 異 型 チ ュ ー
ブ リ ン を 野 生 型 植 物 体 内 で 発 現 さ せ る と 、内 生 の チ ュ ー ブ リ ン と と も に 微 小
管 に と り こ ま れ 、ね じ れ 形 質 を 再 現 す る 。こ の こ と か ら チ ュ ー ブ リ ン 変 異 に
よるねじれは変異型チューブリンによるドミナント効果によるものである
こ と が 示 さ れ 、ヘ テ ロ 接 合 体 で 表 現 型 が 弱 ま る の は 、変 異 型 の チ ュ ー ブ リ ン
が量的に少ないためであると考えられる。
各チューブリン遺伝子の発現量に着目した結果からもこのことは支持さ
れ る 。シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の ゲ ノ ム 中 に は 6 の α -チ ュ ー ブ リ ン 遺 伝 子 と 9 の β -
- 52 -
チ ュ ー ブ リ ン 遺 伝 子 が コ ー ド さ れ て い る (Kopczak et al., 1992, Snustad et
al., 1992)。 α -チ ュ ー ブ リ ン は 3 つ の サ ブ フ ァ ミ リ ー に 分 類 さ れ 、 中 で も
TUA2 / 4 / 6 は 地 上 部 ･地 下 部 と も α -チ ュ ー ブ リ ン の 発 現 量 全 体 の お よ そ 80%
を 占 め て い る が （ Abe et al., 2004）、 本 研 究 で 扱 っ た 変 異 も 多 く が こ の フ ァ
ミリーから発見されている。また、マイクロアレイデータベースによれば
TUB2 / 3 / 4 は 全 組 織 に わ た っ て 高 度 に 発 現 し て い る と さ れ 、 根 に お け る 発 現
量 も 比 較 的 高 い 。一 方 、 TUB1 は 主 に 本 研 究 で 注 目 し た 地 下 部 、根 端 領 域 と
伸 長 領 域 の 表 皮 細 胞 で 強 く 発 現 し て い る と さ れ て い る 。 (Chu et al., 1998)。
この領域はねじれが生じる組織を含んでいるため、これらの細胞における
TUB1 の 割 合 は デ ー タ ベ ー ス 上 の デ ー タ 以 上 に 実 際 に は 大 き い の か も し れ
な い 。β -チ ュ ー ブ リ ン の 変 異 に よ る ね じ れ 変 異 株 17 系 統 の う ち TUB4 が 原
因 で あ る 変 異 株 が 9 系 統 と 非 常 に 偏 っ て お り 、こ の TUB4 や そ の 他 の チ ュ ー
ブリンが極性形成に関して特化したなんらかの機能を持っている可能性を
否 定 は で き な い 。し か し 、α 、β と も 比 較 的 発 現 量 の 大 き い チ ュ ー ブ リ ン 遺
伝 子 か ら ね じ れ 変 異 株 が 発 見 さ れ て い る と い う こ と は 、そ れ だ け 大 き な 影 響
力 を 持 っ て い る の で は な い か と 考 え ら れ る 。ま た 、lefty1 や lefty2 の 抑 圧 変
異 株 の ス ク リ ー ニ ン グ の 結 果 か ら TUA6 , TUA4 の 機 能 欠 失 型 変 異 が 野 生 型
同 様 の ま っ す ぐ な 伸 長 を 示 す こ と が 示 さ れ 、さ ら に は 野 生 型 チ ュ ー ブ リ ン 遺
伝 子 の 過 剰 発 現 も ね じ れ 形 質 は 示 さ な か っ た (Thitamadee et al. (2002)、 本
研 究 )。 こ の こ と か ら も 、 各 チ ュ ー ブ リ ン が そ れ ぞ れ に 右 ま た は 左 へ と ね じ
れ を 生 じ る 偏 り を 持 ち 、野 生 型 の 発 現 量 バ ラ ン ス で は ま っ す ぐ に な っ て い る
というモデルが成立する可能性は低い。
アイソマー間で全く同一のアミノ酸置換変異が生じている例が複数見ら
れ た 。（ α -チ ュ ー ブ リ ン の T56I 変 異 、 S180F 変 異 、S277F 変 異 、 T349I 変
異 、 β -チ ュ ー ブ リ ン の S95F 変 異 (TUB1 で は S96F 変 異 )、 287L 変 異 ） こ
れ ら の 変 異 株 は 、ね じ れ の 方 向 性 は 全 く 同 じ 方 向 で あ っ た (T56I 変 異 、S277F
変 異 S95F 変 異 は 右 巻 き ね じ れ 、S180F 変 異 、T349I 変 異 は 左 巻 き の ね じ れ
を 生 じ た )が 、 同 じ ア ミ ノ 酸 変 異 で あ っ て も ね じ れ の 強 度 に は 明 確 な 違 い が
あ っ た 。α -チ ュ ー ブ リ ン で は 一 貫 し て TUA4>TUA6>TUA2 の 順 で あ り 、β
-チ ュ ー ブ リ ン で は 一 例 の 比 較 の み で あ る が TUB4>TUB3>TUB2 の 順 で あ
っ た （ S95F 変 異 に 関 し て は 背 景 と な る 系 統 が Col と WS で 異 な る た め 単 純
な 比 較 は で き な い ）。 Abe et al. (2004) の 報 告 で は 根 に お け る 発 現 量 は
TUA6 > TUA4 で あ り 変 異 形 質 の 強 度 と は 必 ず し も 一 致 し な い 。し か し 、こ の
報 告 で は 根 全 体 を 用 い て 発 現 量 の 比 較 を し て い る た め 、実 際 に ね じ れ の 起 源
と な る 組 織 に お い て は こ の 割 合 が 変 わ っ て い る か も し れ な い 。こ の 点 に つ い
て の 議 論 は 、ね じ れ る 運 命 を 決 定 す る 組 織 、細 胞 を よ り 精 密 に 決 定 す る こ と
で明確にされると考える。
- 53 -
変 異 型 チ ュ ー ブ リ ン が 微 小 管 に 取 り 込 ま れ る こ と か ら 、こ れ ら 変 異 株 に お
い て は 微 小 管 の 構 造 や 動 態 が 変 化 し て い る こ と が 示 唆 さ れ る 。変 異 を 生 じ た
ア ミ ノ 酸 残 基 の 多 く は α -β チ ュ ー ブ リ ン 間 の 縦 方 向 の 相 互 作 用 領 域 で あ る
イ ン ト ラ ダ イ マ ー も し く は イ ン タ ー ダ イ マ ー の イ ン タ ー フ ェ ー ス や 、隣 接 し
た 原 繊 維 間 の 横 方 向 の 相 互 作 用 領 域 に 位 置 し て い た 。こ の こ と よ り 、多 く の
変異はチューブリン単体の安定性やフォールディングに影響を与えている
と い う よ り は タ ン パ ク -タ ン パ ク 相 互 作 用 に 異 常 を 生 じ て い る こ と が 推 測 さ
れ る 。金 子 (2003)の 報 告 で は ほ と ん ど の 変 異 を 縦 方 向 の 相 互 作 用 領 域 に 結 び
付 け て 考 察 を 行 っ て い た が 、今 回 示 さ れ た 変 異 ア ミ ノ 酸 残 基 を 含 め て そ の 構
造 上 の 意 味 を 再 考 す る 。イ ン ト ラ ダ イ マ ー イ ン タ ー フ ェ ー ス に お け る 変 異 は
その全てが大きな側鎖を持つフェニルアラニンへの置換や１アミノ酸残基
の欠失などヘテロダイマーを形成する際に重要な領域に大きな構造変化を
も た ら し て い る 可 能 性 が あ る 。イ ン タ ー ダ イ マ ー イ ン タ ー フ ェ ー ス 領 域 の 変
異 は ダ イ マ ー 間 の 相 互 作 用 に 変 化 を も た ら し て い る 可 能 性 が あ る 。 α -チ ュ
ー ブ リ ン の P325 や T439、 β -チ ュ ー ブ リ ン の S95 や D96 な ど は 微 小 管 内
に お い て は 、チ ュ ー ブ リ ン ダ イ マ ー 同 士 の 相 互 作 用 の パ ー ト ナ ー で あ る こ と
が 示 さ れ て い る が (Nogales et al., 1999)、 そ の 役 割 を 担 う ア ミ ノ 酸 残 基 が 変
化 す る こ と で 原 繊 維 、微 小 管 の 形 成 が 異 常 に な っ て い る の か も し れ な い 。ま
た 、こ の 領 域 に 位 置 す る β -チ ュ ー ブ リ ン の T178 は イ ン ト ラ ダ イ マ ー 領 域 の
α -チ ュ ー ブ リ ン の S180 に 相 当 す る 。こ れ ら ２ つ の 変 異 は 共 に 左 巻 き ね じ れ
を 生 じ て い た た め 、微 小 管 に 対 し て 同 じ よ う な 影 響 を 与 え て い る 可 能 性 も 考
えられる。横方向の相互作用領域において中心的な役割を果たすのが M ル
ープと呼ばれる構造とそれに隣接した原繊維内に内包されるチューブリン
に お い て M ル ー プ と 相 互 作 用 す る 相 手 と な る 領 域 で あ る (Li et al., 2002,
Nogales et al., 1998)。 Yeast に お け る α -チ ュ ー ブ リ ン の ア イ ソ タ イ プ で あ
る tub1 と tub3 と の 間 で は 、こ の M-loop と そ の 相 互 作 用 領 域 に 保 存 性 が 比
較 的 低 い 部 分 が 集 ま っ て お り 、そ の 違 い が ダ イ ナ ミ ク ス の 違 い を 生 む と 指 摘
さ れ て い る (Bode et al., 2003) 。シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て も こ の 領 域 は 他 の
領 域 に 比 べ て サ ブ フ ァ ミ リ ー 間 で の 保 存 性 が や や 低 い が 、こ れ ま で に メ ン バ
ー 間 に お け る チ ュ ー ブ リ ン の 明 確 な 機 能 分 化 は 示 さ れ て い な い 。本 研 究 よ り
発見されたこの領域の変異は全て種間及びシロイヌナズナゲノム上のファ
ミリー間でも保存されているアミノ酸残基であり構造上重要であると考え
ら れ る が 、そ の ア ミ ノ 酸 の 変 異 の 結 果 、M ル ー プ 領 域 や そ の 相 互 作 用 領 域 が
担 う べ き 微 小 管 機 能 に 異 常 を 生 じ て い る の か も し れ な い 。GTPase 活 性 化 領
域に変異を生じていたものについては後述する。
こ れ ま で に 、 左 巻 き ね じ れ を 生 じ る lefty 変 異 株 で は 右 巻 き の 傾 い た 表 層 微
小 管 配 向 を と り 、 右 巻 き ね じ れ 変 異 株 で あ る spr1 で は 左 巻 き の 傾 い た 配 向
- 54 -
を と る こ と が 示 さ れ て い る 。本 研 究 で は よ り 多 数 の ね じ れ 変 異 株 を 用 い た 定
量 的 な 解 析 を 行 う こ と に よ っ て そ の 相 関 を 検 討 し た 。そ の 結 果 、新 た に 得 ら
れたチューブリン変異株においても左巻きねじれ変異株は右巻きへリック
ス 状 の 表 層 微 小 管 配 向 を 持 ち 、右 巻 き ね じ れ 変 異 株 は 左 巻 き へ リ ッ ク ス 状 の
表 層 微 小 管 配 向 を 持 つ こ と が 示 さ れ た 。こ の ２ 値 に 関 し て 相 関 係 数 は 非 常 に
高 く 、根 の 伸 長 方 向 は 表 層 微 小 管 に 対 し て ほ ぼ 直 交 す る も の で あ り 表 層 微 小
管 配 向 が 植 物 の 左 右 性 を 規 定 す る と 考 え る こ と が で き る 。し か し 、一 部 の 変
異株では表層微小管の傾きが小さいにもかかわらず強くねじれていること
が あ っ た 。こ の こ と か ら 、表 層 微 小 管 依 存 的 な 左 右 性 の 決 定 機 構 の 他 に 、そ
の強度に関しては微小管配向だけでは説明できない新たな機構の存在を考
える必要があるかもしれない。
どのような機構によって傾いた細胞伸長が生み出されるかはいまだにわ
か っ て い な い こ と が 多 い 。1 つ の 可 能 性 と し て 、細 胞 壁 成 分 で あ る セ ル ロ ー
ス が“ た が ”と な り 細 胞 伸 長 を 制 限 す る こ と で 極 性 伸 長 が 起 こ る と い う モ デ
ル が 提 唱 さ れ て い る (Baskin et al., 2005)。 こ の モ デ ル に よ れ ば 、 伸 長 軸 に
対 し て 直 行 す る 表 層 微 小 管 に 従 っ て セ ル ロ ー ス の 合 成 が 進 行 し 、細 胞 長 軸 に
対 し て ト ラ ン ス ヴ ァ ー ス に 配 向 す る 、微 小 管 と 同 様 の 配 向 を 持 つ セ ル ロ ー ス
微 繊 維 の“ た が ”が 形 成 さ れ る こ と で 横 方 向 の 細 胞 伸 長 が 抑 制 さ れ る 。最 近 、
セ ル ロ ー ス 合 成 酵 素 CesA6 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 胚 軸 表 皮 細 胞 の 表 層 に お い
て 細 胞 膜 直 下 の 表 層 微 小 管 に 従 っ て 動 く こ と が 報 告 さ れ た (Paredez et al.,
2006)。 こ れ は 表 層 微 小 管 と セ ル ロ ー ス の 配 向 と を 関 連 付 け る 重 要 な 報 告 で
あ る が 、glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored wall protein の 変 異
株 で あ る cobra 変 異 株 で は 表 層 微 小 管 の 配 向 は 野 生 型 植 物 体 と 変 わ ら な い に
もかかわらずセルロース配向がより不均一になるなどこれに当てはまらな
い 例 も 示 さ れ て い る (Roudier et al., 2005)。 い ず れ に し て も 、 植 物 の 左 右 性
を 生 み 出 す 機 構 の 解 明 に 向 け て は こ の 表 層 微 小 管 -セ ル ロ ー ス 微 繊 維 の 関 係
は ひ と つ の 可 能 性 と し て 考 え ら れ る も の で あ ろ う 。傾 い た 表 層 微 小 管 配 向 は
lefty 変 異 株 に 限 ら れ た も の で な く 、 多 く の チ ュ ー ブ リ ン 変 異 に よ っ て 起 こ
り う る も の で あ る こ と か ら 、こ の よ う な ド ミ ナ ン ト ネ ガ テ ィ ヴ チ ュ ー ブ リ ン
変 異 は 自 然 界 に お け る ま き ひ げ や つ る 、そ の 他 の ね じ れ た 器 官 を 形 成 す る 植
物の進化の下地となっているかもしれない。
一定したヘリックスの配向の形成には微小管自体の左右性が必要である
(Ishida et al., 2007)。表 層 微 小 管 配 向 の 左 右 性 の 起 源 を 探 索 す る た め 、表 層
微 小 管 を 形 成 す る 原 繊 維 の 本 数 を 計 測 し た 。こ れ ま で に 調 べ ら れ た 多 く の 細
胞 に お い て は 、 微 小 管 の 軸 と 原 繊 維 と が 平 行 に 並 ぶ 13 本 の 原 繊 維 か ら な る
微 小 管 を 持 つ こ と が 観 察 さ れ て い る が 、い く つ か の 例 外 も ま た 報 告 さ れ て い
る 。 in vitro の 系 で は 9～ 16 本 の 原 繊 維 か ら な る 微 小 管 が 形 成 さ れ 、中 で も
- 55 -
14 本 の も の が 優 勢 で あ る (Chretien and Wade, 1991)。 実 際 C.elegans の
touch neuron cells で は α -チ ュ ー ブ リ ン MEC12 と β -チ ュ ー ブ リ ン MEC7
か ら な る 微 小 管 が 原 繊 維 15 本 か ら で き て い る と の 報 告 が あ る こ と か ら
(Chalfie and Thomson, 1982)、 こ の よ う な 本 数 の 変 わ っ た 微 小 管 は in vivo
条 件 で も 形 成 し う る と 考 え ら れ る 。 13 本 以 外 の 本 数 に よ っ て 形 成 さ れ る 微
小 管 は 、原 繊 維 が 微 小 管 の 軸 に 対 し て 傾 い て し ま い 結 果 と し て ス ー パ ー ツ イ
ス ト 構 造 が 形 成 さ れ る 。 例 え ば 、 12 本 か ら な る 微 小 管 は 右 巻 き の ヘ リ ッ ク
ス 状 と な り 、14 本 か ら な る 微 小 管 は 逆 に 左 巻 き と な る (Chretien and Wade,
1991)。こ れ ま で に 植 物 で は ビ ャ ク シ ン ( Juniperus chinensis )の 根 端 や ハ ナ
キ リ ン ( Euphorbia milii )の nectaries で TEM 観 察 が 行 わ れ て お り 、 い ず れ
も 原 繊 維 の 数 は 13 本 で あ る と 報 告 さ れ て い る (Ledbetter and Porter, 1964)。
シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 根 の 表 皮 細 胞 に お け る 表 層 微 小 管 の 観 察 の 結 果 、野 生 株 と
tua5 D251N 、 tua4 S 178Δ の 2 種 の 変 異 株 で は 、 根 の 伸 長 領 域 に お け る 表 層 微 小
管 は 主 に 13 本 の 原 繊 維 か ら な る 微 小 管 で 形 成 さ れ て い た 。 明 瞭 な 結 論 を 出
す に は よ り 詳 細 な 研 究 が 必 要 で あ る が 、微 小 管 配 向 の 左 右 性 の 起 源 は ス ー パ
ー ツ イ ス ト に よ る も の で は な い か も し れ な い 。他 に 傾 い た ヘ リ ッ ク ス 状 の 配
向の起源として考えられるものは微小管の中にあるチューブリンモノマー
の 配 列 で あ る 。13 本 の 微 小 管 で は 、最 も 近 接 し た モ ノ マ ー 同 士 は 、12nm の
ピ ッ チ を 持 っ て 並 ん で い る (Chretien and Wade, 1991)。 MAP や モ ー タ ー タ
ン パ ク が 並 ん だ 2 つ の モ ノ マ ー を 認 識 す る か 、よ り 多 数 の モ ノ マ ー 同 士 を つ
な ぐ と し た ら 、も と も と の ヘ リ ッ ク ス と い う 情 報 が 下 流 に 対 し て 流 れ て い く
可 能 性 も あ る 。微 小 管 の ダ イ ナ ミ ッ ク な 性 質 は 、非 対 称 の 情 報 を 、野 生 型 の
伸 長 す る 細 胞 に お い て は い ず れ に し て も 修 正 し 、表 層 微 小 管 配 向 を 細 胞 の 長
軸に対して直交するように並べているのである。
右 巻 き ね じ れ 変 異 株 tua5 D251N の 変 異 は 、重 合 時 に β -チ ュ ー ブ リ ン の GTP
加水分解を誘導する決定的な役割を担う残基であると推測されている
(Anders and Bostein, 2001)。微 小 管 プ ラ ス 端 に お け る GTP キ ャ ッ プ 形 成 は 、
動 的 不 安 定 性 を 生 み 出 す 重 要 な 機 構 で あ る 。α -β 両 サ ブ ユ ニ ッ ト は GTP と
結 合 す る が 、 ヘ テ ロ ダ イ マ ー が 重 合 し て 微 小 管 原 繊 維 を 形 成 し た 後 に β -チ
ュ ー ブ リ ン の み が GTP を 加 水 分 解 し 、 ヘ テ ロ ダ イ マ ー の コ ン フ ォ メ ー シ ョ
ン を 直 線 構 造 か ら β -チ ュ ー ブ リ ン が 外 側 に や や 反 っ た 構 造 へ と 変 化 さ せ る 。
こ れ に よ り 原 繊 維 に ゆ が み が 生 じ て そ の エ ネ ル ギ ー が 蓄 積 さ れ 、脱 重 合 時 の
horn 状 構 造 を 生 み 出 す 力 に な る と 考 え ら れ て い る (Krebs et al., 2005) 。 β
-チ ュ ー ブ リ ン に よ る GTP 加 水 分 解 は α -チ ュ ー ブ リ ン の GTPase 活 性 化 機
能 に よ っ て 誘 導 さ れ る が 、こ の と き 中 心 と な る の が イ ン タ ー ダ イ マ ー イ ン タ
ー フ ェ ー ス に 位 置 す る H8 で あ る と 考 え ら れ て い る 。GTP の リ ン 酸 基 と 相 互
作 用 す る 、シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の α -チ ュ ー ブ リ ン で は N249 と D251 に 相 当 す る
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ア ミ ノ 酸 残 基 は α ,β -チ ュ ー ブ リ ン と も に 高 度 に 保 存 さ れ て い て 、 触 媒 部 位
と し て 働 く と 想 定 さ れ て い る E254 は α - チ ュ ー ブ リ ン で 保 存 さ れ て い る
(Anders and Botstein, 2001)。 酵 母 の α -チ ュ ー ブ リ ン に お い て D251 と
E254 に 相 当 す る ア ミ ノ 酸 残 基 を 置 換 し た 場 合 や シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ で
TUA6 D251A/E254A を 発 現 さ せ た 場 合 で は 微 小 管 の 脱 重 合 を 抑 制 し ダ イ ナ ミ ク
ス を 静 的 に す る こ と が 報 告 さ れ て い る (Anders and Botstein, 2001. Abe et
al., 2005)。 tua5 D251N を 含 む 微 小 管 で は 微 小 管 動 態 が 変 化 し 、 脱 重 合 が 抑 制
さ れ 、 全 体 の ダ イ ナ ミ ク ス が 小 さ く な っ て い た 。 ま た 、 GFP-EB1 が プ ラ ス
端 領 域 だ け で な く 本 来 な ら GFP シ グ ナ ル が 観 察 さ れ な い よ う な 微 小 管 側 壁
に お い て も 相 互 作 用 し て い る こ と が 観 察 さ れ 、マ イ ナ ス 端 に お い て は 脱 重 合
や 核 形 成 後 に 分 枝 の 元 で あ る 微 小 管 か ら 外 れ る detach が 顕 著 に 低 下 し て い
た 。 こ の こ と か ら 、 α -チ ュ ー ブ リ ン の GTPase 活 性 化 機 能 の 欠 損 が ど の よ
う な 異 常 を 引 き 起 こ し た か に つ い て 、図 .28 に 示 す よ う な モ デ ル を 提 唱 す る 。
こ の 図 は tua5 D251N が 取 り 込 ま れ た 微 小 管 の 様 子 を 示 し て お り 、 本 来 加 水 分
解 を 受 け る べ き GTP が 分 解 さ れ ず GTP 結 合 型 の 直 線 構 造 を 持 つ ヘ テ ロ ダ イ
マーがプラス端から離れた領域でも残ることで微小管全長に渡りプラス端
様 の 性 質 を 持 っ て し ま っ た と 考 え て い る 。こ れ が マ イ ナ ス 端 近 傍 で の 脱 重 合
を 抑 制 し た の で は な い だ ろ う か 。 ま た 、 GFP-EB1 が 変 異 型 微 小 管 の 側 壁 に
も 局 在 す る こ と は 、 EB1 が GDP-チ ュ ー ブ リ ン と GTP-チ ュ ー ブ リ ン の わ ず
かなコンフォメーションの違いを認識する可能性を示唆している。
左 巻 き ね じ れ 変 異 株 で あ る tua4 S 178Δ で は tua5 D251N の 場 合 と は 対 照 的 に
特 に プ ラ ス 端 に お い て 微 小 管 動 態 が 動 的 に 変 化 し て い た 。ま た 、全 体 の 傾 向
と し て も 脱 重 合 が 起 こ り や す い 傾 向 に あ る こ と が 観 察 さ れ た 。両 変 異 株 は 右
巻 き・左 巻 き と い っ た 対 照 的 な 表 層 微 小 管 配 向 を 持 つ こ と か ら 、こ の よ う な
微小管動態の変化が最終的な微小管配向形成に関与する重要な因子である
可 能 性 が 考 え ら れ る 。 N 末 に タ グ を 付 け た α -チ ュ ー ブ リ ン を 発 現 す る シ ロ
イヌナズナは左巻きへリックス状の表層微小管配向と右巻きのねじれ形質
を 持 ち 、 微 小 管 動 態 は 重 合 促 進 と dynamicity の 抑 制 と い う 傾 向 に あ る こ と
が 観 察 さ れ て い て 、 こ れ は 本 研 究 と 一 致 す る も の で あ る (Abe et al., 2005)。
ま た 、 最 近 報 告 さ れ た Morlin (7-ethoxy-4-methyl-coumarin)と い う 低 分 子
化 合 物 を 用 い た 試 験 で は 、本 研 究 と 同 様 に シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て 表 層 微 小
管 動 態 の 抑 制 と 右 巻 き ね じ れ 表 現 型 を 示 す と い う こ と が 示 さ れ た (DeBolt et
al. 2007)。 Morlin の 作 用 機 作 に つ い て は 未 解 明 で あ り 、 現 段 階 で も 複 数 の
可 能 性 が 提 示 さ れ て い る が 、 tua5 D251N 変 異 株 と 同 様 の 状 態 が で き て い る 可
能性も考えられる。
し か し 、 単 純 な dynamicity は 必 ず し も 伸 長 方 向 と の 相 関 は 見 ら れ な い 。
低 用 量 の 微 小 管 脱 重 合 剤 処 理 は 、よ り 脱 重 合 す る 傾 向 を 作 り 右 巻 き へ リ ッ ク
ス の 配 向 の 形 成 を 導 い た が (Nakamura et al., 2004)、今 回 試 験 を 行 っ た 他 の
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左 巻 き ね じ れ 変 異 株 の 表 層 微 小 管 動 態 は ど ち ら か と い え ば 静 的 で あ っ た 。右
巻きねじれ変異株における微小管動態は試験した全ての変異株で静的に変
化 し て い た が 、 左 巻 き ね じ れ 変 異 株 に つ い て は dynamicity が 動 的 で あ る か
静的であるかといった因子だけでは説明できない機構を想定する必要があ
る か も し れ な い 。ね じ れ 変 異 株 で は 明 瞭 な 結 果 を 得 る こ と は で き な か っ た が 、
薬剤の機能からも考えられるように微小管が重合的な傾向であるか脱重合
的 な 傾 向 で あ る か と い っ た 因 子 は そ の ひ と つ で あ る と い え よ う 。微 小 管 動 態
の 評 価 手 法 の 一 つ と し て 、動 態 の パ ラ メ ー タ を 元 に し て 確 率 論 的 に 微 小 管 の
平 均 的 な 長 さ が ど の 値 に 収 束 す る か を 計 算 す る 方 法 が あ る (Verde et al.,
1992)。 し か し 、 本 研 究 や 他 の 植 物 細 胞 を 用 い て 研 究 さ れ た 微 小 管 動 態 パ ラ
メ ー タ を こ れ に 当 て は め る と 、微 小 管 の 長 さ が あ る 一 定 の 値 に 収 束 す る こ と
は な く 無 限 大 の 長 さ を 持 つ と い う 結 果 に な っ て し ま っ た 。 こ れ は 、 Verde et
al.が 用 い た ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の よ う な 動 物 細 胞 に お け る 微 小 管 は 中 心 体
か ら 細 胞 辺 縁 ま で と い う 閉 鎖 的 な 系 の 元 に 存 在 す る こ と と は 対 照 的 に 、植 物
細胞の表層微小管はらせん状に細胞を取り巻くことでより長くなれる系の
元にあることがそのような違いを生じてしまう一因であるかもしれない。
あ る い は 、微 小 管 同 士 の 相 互 作 用 や 分 枝 に よ っ て 新 た に 生 じ た 微 小 管 と 元
と な っ た 微 小 管 と の 角 度 、核 形 成 後 の 微 小 管 形 成 中 心 の 安 定 性 な ど と い っ た
別 の イ ベ ン ト も 重 要 な 因 子 と な り う る も の で あ る 。 GFP-EB1 を 発 現 す る タ
バ コ BY-2 細 胞 を 用 い た 表 層 微 小 管 の 極 性 の 研 究 で は 、 細 胞 分 裂 終 了 直 後 は
ランダムな極性を持っていた表層微小管があるひとつの方向に選択的に安
定 化 さ れ る こ と で 平 行 に 並 び 、最 終 的 に は 80%も の 微 小 管 が 同 じ 極 性 を 持 つ
トランスヴァースな表層微小管が形成されていく様子が観察されている
(Dixit et al., 2006)。 し か し 、 本 研 究 で 観 察 対 象 と し た シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ で は
既に表層微小管の配向が出来上がっているためこのような様子を観察する
こ と は で き て い な い 。 ま た 、 BY-2 細 胞 で は 微 小 管 関 連 薬 剤 の 処 理 や 変 異 型
チューブリンの発現によって傾いた表層微小管の配向は形成されないとの
報 告 も あ る (Murata et al., personal communication 、 Abe et al.,
unpublished data)。 こ れ ら の 結 果 は 、 傾 い た 表 層 微 小 管 の 配 向 が 形 成 さ れ
るためには多細胞組織に特有の何らかの機構の存在が示唆している。近年、
盛 ん に 細 胞 間 コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン に 関 す る 研 究 が 行 わ れ て い る が 、表 層 微 小
管 の 形 成 に も 、前 提 と し て そ の よ う な 可 能 性 を 考 え る 必 要 が あ る か も し れ な
い。
ま た 、技 術 的 な 問 題 点 も あ り 非 常 に 微 細 な 空 間 に お け る 微 小 管 動 態 や 相 互
作 用 を 観 察 し 、研 究 を 行 う こ と は 非 常 に 困 難 で あ っ た 。今 後 展 開 さ れ る 研 究
に お い て は 顕 微 鏡 な ど の 光 学 技 術 や 数 理 学 的 な ア プ ロ ー チ 技 術 の 発 展 、微 小
管関連標識系統の充実などによって個別の微小管だけでなくひとつの系と
し て 細 胞 レ ベ ル 、組 織 レ ベ ル で 表 層 微 小 管 が 形 成 さ れ て い く 過 程 に 関 す る 機
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構 が 解 明 さ れ る こ と が 期 待 さ れ る 。そ し て 、そ れ ら を 制 御 す る 微 小 管 付 随 タ
ン パ ク や +Tips と い っ た 微 小 管 制 御 因 子 、さ ら に は そ の 上 流 制 御 を 司 る シ グ
ナル伝達機構の研究などによって表層微小管依存的に起きる植物細胞の極
性形成に関する分子基盤が解明されることが期待される。
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プラス端
Wild Type
GFP-EB1 signals
GDP-チューブリン
Shrinkage
Shrinkage
GTP-チューブリン
プラス端
tua5D251N
GFP-EB1 signals
Suppressed Shrinkage
Suppressed Shrinkage
GTP
GDP
図.２８ GTPase活性化機能欠損変異株tua5D251Nにおける微小管機能変異のモデル
野生型植物体の微小管では、プラス端から取り込まれたヘテロダイマーが内包するGTPは
速やかに加水分解される。一方、tua5D251Nでは変異型チューブリンを取り込んだ部分で
GTPaseが活性化しないためGTP-チューブリンがプラス端以外の領域でも存在する。その結
果、過度に安定な構造を持つ微小管となり両端で脱重合が抑えられていると考えられる。
- 60 -
Ⅴ.謝辞
本 研 究 を 行 う に あ た り 、方 針 の 検 討 か ら 論 文 の 執 筆 に い た る ま で 常 に 熱 心 で
懇 切 丁 寧 な 指 導 を し て く だ さ り 、ま た 、こ の よ う な す ば ら し い 環 境 を 与 え て
くださった奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科植物遺伝
子機能学講座の橋本隆教授に深く感謝いたします。
画像解析プログラムの開発に協力していただいた東京大学の馳澤盛一郎教
授 、 朽 名 夏 麿 博 士 、 Gateway binary vector シ リ ー ズ を 譲 っ て 頂 い た 島 根 大
学の中川強准教授に感謝します。
tua4 R2K 変 異 株 を 譲 っ て 頂 い た 奈 良 先 端 科 学 技 術 大 学 院 大 学 バ イ オ サ イ エ ン
ス 研 究 科 形 質 発 現 植 物 学 講 座 の 田 坂 昌 生 教 授 、 微 小 管 の TEM 観 察 手 法 の 指
導、助言を頂いた細胞間情報学講座の岩野恵助教に感謝します。
有 用 な 助 言 を 数 多 く 頂 い た 中 島 敬 二 准 教 授 、多 く の 実 験 技 術 を 授 け て い た だ
い た 庄 司 翼 助 教 、幾 多 の 相 談 に 時 間 を 割 い て い た だ き 助 言 を 授 け て 下 さ っ た
加藤壮英助教に感謝します。
日 々 の 研 究 を 支 え て い た だ い た 山 下 聡 美 氏 、実 験 を 助 け て い た だ い た 吉 村 美
香氏、西田真子氏、加藤綾子氏に感謝します。
研 究 を 進 め る 上 で 適 切 な 助 言 を 頂 い た 阿 部 竜 也 博 士 、直 井 国 子 博 士 、稲 井 康
二氏、中村匡良氏に感謝します。
研究のみならず日常生活までも私を支えていただいた植物遺伝子機能学講
座 の 皆 様 に 、互 い に 切 磋 琢 磨 し 支 え あ っ て 研 究 を 進 め て き た 同 期 の 友 に 感 謝
します。
最後に、常に私を見守り支えて頂いた父と母に心から感謝します。
平 成 19 年 4 月
石田喬志
- 61 -
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金子弥生
論文
(2003)
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修士