PDF:27KB - GEヘルスケア・ジャパン株式会社 ライフサイエンス統括本部

GE Healthcare
ABI310-Windows 対応
ET インストール簡易プロトコール
用意するもの
・DYEnamic ET terminator 用モビリティファイル
DT310POP6{ET}.mob
・反応済みコントロールサンプル
DYEnamic ET terminator matrix standard for 3100/3700 (US84001)を EDTA で平
衡化した AutoSeq G-50 (27-5340-01)を使用して精製したもの、あるいは、DYEnamic
ET terminator Cycle Sequencing Kit (US81050)に含まれているコントロール DNA
とプライマーとで反応し、エタノール沈殿したサンプル
＜ご注文情報＞
・DYEnamic ET terminator matrix standard for 3100/3700 (US84001)
・AutoSeq G-50(27-5340-01)
・
モビリティファイルのインストール
●モビリティファイル、DT310POP6{ET}.mob を下記のフォルダ内にコピーします。
D：¥AppliedBio¥Shared¥Analysis¥Basecaller¥Mobility
サンプルの泳動
(1) 反応済みコントロールサンプルに TSR 液を 20μl 加える。
AutoSeq G-50 で精製した matrix standard 20μl に TSR 液を 20μl (等量) 加えるか、
エタノール沈殿したコントロールサンプルに TSR 液を 20μl 加えて溶解する。
(2) サンプルチューブを ABI310 のサンプルトレーにセットする。
容量は、精製した matrix standard の場合 40μl、エタノール沈殿したコントロール
サンプルの場合 20μl になります。
(3) 下記泳動条件でシークエンシングランを行う。
・ポリマー：POP6（POP4 は不可）
・キャピラリー：61cm Long Read 用のみ
ショートキャピラリーを使用した場合、シグナルの分離が不十分で作成に失敗するこ
とがあります。
・Dye set/Primer：DT310POP6{ET}.mob
・Matrix：< None >
・Module：ポリマーとキャピラリーに応じた任意の泳動条件（Module 名の最後にアル
ファベット A か E が記載されている場合は記録しておきます。これがフィルターセ
ットの種類を示しています。）
POP6、ロングキャピラリーを使用して 60 分の泳動時間で十分です。200∼300 ベー
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ス分シグナルでよいので、途中で泳動を止めても問題ありません。
マトリックスファイル作成操作
(1) Sample Analysis を起動する。
(2) Sample メニューから Make Matrix コマンドを選択する。
(3) Imput file and dye options ダイアログボックスでファイル数を１、色素の数を４
と入力する。
(4) Sample file を選択するダイアログボックスで、泳動して得られたサンプルファイル
を探して選択する。
(5) ここでマトリックスファイルの作成に成功すればマトリックスファイルのファイル
名入力と保存の画面に進むのでマトリックスファイルを保存する。マトリックスファイ
ルの作成に失敗した場合はエラーメッセージが表示されるので、トラブルシュートを参
考にしてサンプル泳動からやり直す。
トラブルシュート
・マトリックスファイルの作成に失敗した場合、シグナル強度、S/N 比に注意してサン
プルを泳動し直します。
・マトリックスファイル作成には、シグナル強度 500∼1000 で、300 ベース以上きれい
に判読でき、フリーの Dye が 90％以上除去されているような泳動結果が必要です。
・シグナル強度が 4000 を越えるとマトリックスファイル作成に失敗する場合がありま
す。この場合、サンプル液を TSR で希釈します。キットのコントロール DNA とプライ
マーを反応させ、エタノール沈殿させて作成したコントロールサンプルの場合、50μl
の TSR に溶解し、そのうち 20μl を使用すればちょうどよいシグナル強度が得られま
す。
・ショートキャピラリーを使用してマトリックスファイル作成に失敗した場合、ロン
グキャピラリーで泳動し直します。
・フィルターセット A かＥを選択できる装置で泳動した場合、フィルターセットを別
のもの（A ならば E、E ならば A）に換えて泳動し直します。
・泳動パラメーターのインジョクションタイムを 20 秒∼40 秒の範囲で変えるとシグナ
ル強度を変えることができます。
・フリーのダイターミネータ由来のピークが検出される場合、バックグランドが高く
てマトリックスファイルの作成に失敗することがあります。反応後のサンプル溶液を
ゲル濾過するか、エタノール沈殿でのエタノール量を調整する（減らす）、あるいはエ
タノール沈殿を室温で行うことでバックグラウンドを低く抑えることができます。
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＜参考＞ サンプルのシークエンス解析条件
◎ サンプルシート
DyeSet/Primer：DT310POP6{ET}．mob
Matrix file：マトリックスファイル作成操作で保存したファイルの名前
◎ インジェクションシート
Run Module：SeqPOP6＊＊＊＊．md4
（＊＊＊＊の部分はキャピラリーの長さ、シリンジの大きさ、フィルターセット
の種類で変わります。フィルターセット A かＥを選択することができる装置の場
合には、マトリックスファイル作成のためのコントロールサンプルを泳動した時
と同じフィルターセットを選択します。フィルターセットが異なる場合、正常に
解析できません。）
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