牛体外受精における精子処理法 の簡略化に関する研究

佐賀大農業 (
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牛体外受精における精子処理法
の簡略化に関する研究
小林
真・古賀
満*・岡田育穂
(動物生産生理学研究室)
平成 7年 1
1月2
0日 受 埋
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緒 雲
日高乳動物の体外受精に関する研究は近年極めて盛んであって，技術改良に関しては著しい進
歩がみられる九特に牛については，実験的段階から実用段階に進みつつあるのが現状である
が，それでもまだだ、多くの解決すべき課題が残つている幻
体外受精は那子子.と精子を 仇
1
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件牛で受精させ，肢を一定の水準まで発育させる技術で
あるから，高水準の成果を得るためには，卵子の操作のみならず，精子処理に関しでも十分な
技術水準に達していなければならない.牛の体外受精に供試する積子は市販の凍結精液を用い，
ホ現在伊藤ハム株式会社九州事業部，佐賀県三養基郡基山町長野 9
7
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佐賀大学農学部粂報第 8
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凍結精液ストローの温湯による融解，希釈と遠沈による洗浄，受精能付加操作，精子数の調整
を行った後，受精培地に適量の精子‘浮遊液を添加する.この基本的な流れはどの報告において
もほぼ一致しているが，個々の操作内容に関しては相当の違いがある.精子の遠沈洗諦に関し
ては，遠沈の重力は 2
0
0
2
0
0
0g3，
4¥ 遠沈時間に関しては 51
0分以 7)，遠沈の繰り返し回数は 1
-43，
6，7)と報告により違いがみられる.精子に対する受精能付加操作は，カブェインやへパリン
等の薬剤を受精培地に加えて誘起させるのが一般的であるが，受精能付加のための精子前培養
時間は非常に様々であって， 1
5
分から 5時間まで報告されている 3，
6，
8-10) また，最近では，全く
前培養を行わない報告も多くなっているが 10-13h 受精能獲得能力が母い精子に対しては前培養
が必要との報告もある 10) すなわち，この点に関しては見解がまだ一致していないと考えられ
5
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!の 幅 が あ
る . ま た ， 受 精 培 地 の 精 子 濃 度 に つ い て は ， 報 告 に よ り ら x10
る3ム 14，
1九このように個々の操作技術に関して違いが大きい理由として，受精能獲得能力の個体
差 lト
1
8
)
の問題があり，同じ処理方法で対応できず，種雄牛個々に対処せざるをえないことが挙
げられる.すなわち，未だにどの種雄牛に対しでも有効な普遍的な技術が開発されていないこ
とが問題である 29)
凍結融解精子は生存能力が低く，融解後は活力が急速に低下するので，精子は融解後出来る
だけ速やかに受精培地に導入することが望ましい 3) しかしながら，現在一般的に行われている
精子処理操作は複雑であり，時間を必要とし，場合によっては精液の融解から卵子への導入ま
でに 6時間近くも要することがある lへこのような場合，精子の運動性が著しく低下することも
予想できる.
牛の凍結精液は高値であり，入手しにくい貴重なものも少なくない.従って，出来るだけ少
ない精子を用い，効率的に受精させることが必要と忠われる.
そこで，本研究においては，現在行われている各操作内容を単純化と簡略化の方向で再検討
し，出来るだけ簡債で有効な精子処理方法を考案することと，効率的な体外受精に必要な最少
の精子濃度を求めることを自的として計画された.
材料及び方法
供試牛精子:
本実験で使用した牛凍結精液は，
1頭の黒毛和種種雄牛より採取されたものであり，佐賀県
酪農業協同組合連合会より購入した.入手後直ちに 1
9
6Cの液体窒素容器に格納し，使用直前
0
に38SC
の混湯中で融解した.精子処理に当たっては BO
液刷を基礎培地として用いた.
各実験における精子運動性の評価(活力)については，目測 5段階法を用いた.精子浮遊液
μ
lのドロップを 3
5
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mプラスチックシャーレの中央部に 2
個作成し，高ちにミネラルオイル
の5
(
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) で覆って 3
70Cで]分間加温した. 1
0
0倍の生物顕微鏡で全面にわたって観察し，視野
中で，ほとんど全部の精子が活発な前進運動をしている場合をム運動している精子の割合の
低下に従って願次 3， 2， 1とランキングし，ほとんど前進運動が見られないものについては
これを Oとした.
各実験における精子操作:
1)実験 1
実験 1では精子の前培養処理の必要性を調べるために実施した.前培養時間を 0， 1，及び
2時間の 3区に分け，それぞれを， H 0区
， H 1区及び H 2
!
豆とした.
小林・古賀・岡田:牛体外受精における精子処理法の簡略化に関する研究
4
9
0
m
!ガラス製遠沈管に移し，精子洗浄液 (10mMカフェイン
融解した精液を自盛り共栓付き 1
加 B O液)を加え 1
0
m
!とし軽く撹枠後，室温で7
0
0g， 7分間違沈した.上清液を取り除き，同
0
m
!とした.同様操作により遠沈を行い，沈澱分画約 0
.
4
m
!について精
じ精子洗浄液を加え再度 1
子数算定を行って 2x
1
07/
m
!に調整した.この精子浮遊液に対して 2
0
m
g
/
m
!BSA (片山， Frac
巴
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0
μ g/m!
へパリン加 B O液で等量希釈後(終濃度:精子数 1
0/
m
!，BSA10
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m
!
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フェイン 5.0mM，へパリン 10μg1
m
!
)，直ちに活力検査を行った. H 0区に闘しては，そのま
0
0
μ
1のドロップを作成して受精培養を開始し，日 1区と H2区については，それぞれ 1と 2
ま1
7
時間，炭酸ガス培養装置 (
5%炭酸ガス， 95%空気，38SC
，98%湿度)内に静置した.これ
ら両区については前培養終了後に精子の活力を判定し，受精培養を開始した.実験 1は 6反復
行った.
2)実験 2
実験 2では精子の遠沈希釈による洗浄操作の簡略化を目的とした.凍結精液は融解後ストロ
ーから精子浮遊液を取り出さず，そのまま遠沈管に垂直に立てて 1回だけ遠沈ずる区 (S1
区)，実験 1と同じ手願で遠沈洗浄を 1回 (C1s
)及び 2田 (C2区)行う区の計 3区を設定
した. 3区とも遠沈は室混で700g7分間行った. S 1区に関しては，遠沈後0
.
4
m
!の洗浄液中
にストロー下部の沈澱物をストローもろともハサミで切り落とし，軽く撹押して，精子を十分
に浮遊させた後，ストロ一片を取り出し精子数のカウントを行った. 3区共に精子数を最終濃
度1
07I
叫に調整し，受精培養直前に活力検査を実施した.なお，実験 1の結果から，精子前培養
の必要はないと考えられたので，この操作は行わなかった.実験 2についても 6反復行った.
3)実験 3
実験 3は受精培地における精子数と受精成績の関係を明らかにするために行った.
精子前培養は行わず，また，実験 2の結果では S1区が最も操作が簡便であり精子活力の低
下が少なかったので，遠沈はストロー内で 1回のみ行った.前述の方法により 5.0mMへパリ
0
μ g/m!カフェイン， 1
0
m
gBSA加 B O液で希釈し，精子数の濃度を 1
07/
m
!，1
06/
m
!及び、1
05I
ン
， 1
m
!に調整し，それぞれを C7区
， C6区及び C5区とした.以上の 3精子浮遊液は作成後車ち
に活力検査し， 1
0
0
μ
1のドロップを作って受精培地とした.実験 3は 4反擾行った.
牛卵巣と卵子の採取及び成熟培饗:
牛卵巣は，屠場(佐賀県畜産公社)において，屠殺後誼ちに採取し(黒毛和種，ホルスタイ
ン種及びこれらの F1
)，
約3
4Cに保った抗生物質入り 0.85%生理的食塩水に投入した.卵子は屠
0
mの小卵胞より， 19G注射針付き 5m!ディスポーザブツレ
殺後 5時間以内に卵巣表面の誼窪 2-7m
投射筒を用いて卵胞液とともに吸引採取した.得られた卵子を 5 %の非働化牛胎児期清 (FCS，
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により吸引・排出を繰り返して 3-4回洗った.これらの卵子のうち，卵丘細胞が少なくとも卵
5
m
mプラスチックシャーレに成熟培地
子表面の 2/3以上覆っている卵子のみを選択した.直径3
(5% FCS加 25mMHepes緩衝 E
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lドロップを作製し，
表商をミネラルオイルで覆った.これに各ドロップ当り 2
0
3
0個の卵子を投入し，炭離ガス培養
2時間培養した.これらの操作の大要は後藤 21) の方法によった.
装置内で約 2
体外受精操作:
成熟培養終了後の卵子をへパリン加 B O液中でピペッティングにより 2 3回洗浄した.その
後
， 1精子ドロップ当たり 2
0
2
5個の卵子を投入した.受精培養は炭酸ガス培養装置内で 5時間
5
0
佐賀大学農学部重量報 第 8
0考(19
9
6
)
行った.受精培養終了後，発生培地 (10%FCS加 TCM199) で 3-4回洗浄した.この時，ピ
ペッティングにより卵子の周囲に付着した精子を出来るだけ除去した.発生培地に 2
0
3
0個/ド
ロップ (
1
0
0
μ 1)の卵子をドロップの中心に寄せて投入し，発生培養を開始した.受精培養を開
始して， 7
2時 間 後 (3日目)に1[t1]自の分割検査と培地交換を行った.その際，シャーレの底
面に付着した卵丘細胞の単層(シート)は残したままで引き続いて培養した.その後， 4
8時間
毎に培地を交換し，
9日目まで観察した.その際においても，シートはそのままとし，培養液
のみを交換した.卵子の形態は実体顕微鏡下で培地交換毎に観察し，受精と発生成績は培養開
始 3日目の分割率，
7日目の桑実在と目玉盤胞の合計発生率及び 9日後のJi'E盤胞率をそれぞれ求
めた.これらの諜作の大要も後藤山の方法によった.
統計処狸:
精子活力評価額はその数値を，分割率及び発生率(%)はアークサイン変換後 l元配置分散
分析法により処理の効果を検定し，有意な効果があった場合には， D
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tにより区間の平均値間走の有意性を検定した.実験 3においては，精子濃度 (
対する 3 臼目の分割率と 7 日目の桑実匪・ ~1~盤臨率 (Y) の直線回帰式を求めた.
結果及び考察
屠場における卵巣採取は計 1
6問実施し，ホルスタイン種6
3頭，黒毛和種 1
0
6頭及びこれら両品
種の F1
7
6頭，合計2
4
5
頭から未成熟那子を合計2，
3
8
1侶得た.成熟培養は大部分の場合，成熟培
地中で卵丘細胞の活発な増殖とシャーレ底に良好なシートの形成が見られたことから成功した
ものと思われた.
実験 1)
実験 1における H 0I
哀の精子運動性評価値の平均値と標準偏差は 2
.
8
3土 0
.
6
1であった. 一
方
，
前培養実施区では，
1時間の前i
音養終了後には，急速に活力が低下し， H 1区と日 2区の平均
値は 1程度，あるいはそれ以下となった.このように，前培養後には，ほとんどの精子は運動
を停止.した状態であったが，なかには活発に前進運動するものも観察された.この割合は視野
中精子のおよそ 1 5%程度であった.受精能力を獲得した精子は頭部を強く左右に振る特有の
運動挙動 (
H
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o討を示すといわれているが21 本実験で観察された運動精子はこの
運動型に相当するものが多かった.
実験 1の体外受精結果を表 1に示した. 3日目の分割率は各区とも 60%程度で、差がなかった.
これらの値を従来の報告 8，
23，
24) と比較しでも大差がなく，分割率に関しては，王子均的な成績と考
6%高くなっているが統計的に有意で、はな
えられた. 7日目の成績では H2区が HOIRよりも 5，
かった.同様の{頃向は 9日自の成績でも観察されたが，区間に有意差はなかった.以上のよう
に，前培養の有無による発生成績の差は有意で、はないという結果が得られた.受精培地に対し
てへパリンの添加ヲまたは，へパリンとカフェインの同時添加が受精能獲得を有効に誘導する
ことについては，すでに多くの報告がある 3，
16，
25). P
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he
ta
l
.3)はへパリン添加受精培地の場
合，長時間の前培養はいたずらに精子活力を損耗するだけと述べて，前培養時聞を 1
5分程度に
止めている.地の報告でも，前培養時間を短時間に限ったものが多い 8，
9，
2べさらに， T
suzuki
e
ta
l
.7)は前培養をしない区と 3時間実施した区の膝盤施発生率には有意な区間差はみられな
いことそ報告している.これらの結果から，通常の牛精液を供試する場合にはへパリン添加培
5
1
小林・古賀・岡田:牛体外受精における精子処理法の簡略化に関する研究
Table1
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地では，前培養をしなくても十分な精子の受精能力付加が起こるものと考えられる 11-1九 し か
し，福田川は，受精能獲得が困難な特性を持つ牛精子に対しては，短時間の Caイオノフォア処
理精子，または， Caイオノフォア処理後へパリン添加域地に移した精子に対して 3時間の前培
養を行うことが卵子への侵入率を有意に上昇させたと報告している.また，受精能獲得を斉ー
な時間内に行わせるためには， 3時間の前培養が有効とする報告もある川.従って，精子の前培
養の必要性は牛の個体または実験の目的により異なっていると考えられる.
実験 2)
実験 2における精子運動牲の観察結果を表 2に示した.運動性評髄鑓はストローのまま遠沈
し，希釈洗浄のない S1区が最も高く，遠沈が 2回，希釈洗浄が 2閉の C2区よりも有意に高
くなった.この原因は，遠沈操作の物理的な力により，一部の精子が損傷を受けた可能性があ
ること，さらには，処理時間経過による精子の損耗が考えられる.特に C2区は，問要因の効
果が加算され，運動性の領下が強く現れたものであろう.
実験 2の体外受精結果を表 3に示した. 3区とも分割率は 66%以上であり，実験 lの場合よ
りも若干高くなった.区間の差は最高値の C 1区と最低値の C2区との開で3.8%であったが，
これは有意ではなかった. 7日目と 9日目の発生成績は C 1区が最も高くそれぞれ 37.5%と
12.8%であるが，他の区と有意差はなかった. S 1区は融解した精子を洗浄していないので，
グリセロールや卵黄等の凍結保護剤が受精培地に混入することは避けられない.しかし，スト
ロー内で濃縮された精子塊を B O液で精子数の調整を行うので，凍結保護剤の大部分は B O液
Table2
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えられる.従っ
て，この程度では，受精にはほとんど影響がなかったと思われる.マウスの凍結精子を体外受
精に供試する場合，融解後の精子の活力が低く，遠沈等による洗浄が掻めて難しいことから精
子をあらかじめ高濃度で凍結し，精子数調整希釈のみで受精培地としても受精率には差がなか
ったとの報告 26) があり，凍結保護剤の受精培地への混入は，低濃度であれば体外受精の成績に
は影響しないと思われる.遠沈操作において，精子洗浄に必要とする以との重力と時簡を精子
に対して与えることは精子の活力低下を招くことは明かであるが，反面，重力と時間の不足は，
活力の高い精子を取り逃がす可能性があり好ましくない.効率の良い精子の洗浄方法について
今後の研究が必要と思われる.
実験 3)
実験 3の結果を表 4に示した. C 71Rでは分割率が66.3%であって，実験し 2の場合と大
0
分の lとなった C6区では分割率はその半分以
差がなかった.しかし，精子濃度が両実験の 1
下に抵下した. C 5区はさらに低く 6 %程度の卵子が分割したにすぎなかった.この傾向は 7
日目，
9日自の成績にも反映し C5区は佐盤胞が全く発生しなかった.しかし， 9日自の腔盤
胞発生率では C7区と C6区の成績の差は有意ではなかった.
Table4
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小林・古賀・凋田:牛体外受精における精子処理法の街絡化に関する研究
3日 目 の 分 割 率 ， 及 び 7日 目 の 桑 実
腔・腔盤胞発生率 (Y) の精子濃度 (X)
への回帰車線を図 1に示した.それぞれ
(P<.
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Yニ ー 79.20十 15.93X
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)であった.この 2直線から， 3
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発生率に影響を及ぼすことを示している.
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牛の受精培養における精子濃度は，多
濃度の報告もある口 0，
3九 こ の よ う な 場 合
には Swimup法により，運動性の高い
精子のみを分画採取していることが多い.
しかし，これらの実験結果を相互に比較
してみると，受精率，分割率あるいは発
に大きな違いは認められない.出
来るだけ少ない精子を供試して，良好な
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度を決定することが重要でトあろう.この点に関しても，今後の研究が必要である.
商常
約
本研究は牛の体外受精技術のうち，精子処理方法を簡略化する事を目的として計画された.
実 験 1においては精子の受精能獲得の為の前培養の必要性を追究し，実験 2においては，精子
の遠沈と希釈の回数について，実験 3では受精培地の精子濃度と体外受精成績について検討し
た.
本実験の結果から，精子の前培養処理は必要がないことが示された.また，遠沈洗浄の回数
は 1回で十分と考えられ，凍結用ストローのまま遠沈する方法が提案された.さらに，精子濃
度の低下は，受精成績を低下させる事がわかった. 3日目の分割率及び 7日自の桑実1ff.1ff盤
Y
) の精子濃度 (
X
) への回 J席 式は，それぞれ Y=-147.22+30.14X(P<.
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)
謝 辞
本実験における牛卵巣の採取にご協力環いた佐賀県畜産公社並びに佐賀県食肉衛生検資所職
の方々に深く感謝します.
文 献
1.金川弘司 (
1
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. 長室近2
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における畜産学の進歩.室長畜・家禽の繁殖に関する研究の動向. I
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. 繁頬の
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2
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人為支配関係. E
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