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パピローマウイルスの表面カプシド抗原または 癌誘発関連抗原に対する
JP 2006-502732 A 2006.1.26 (57)【要約】 【課題】パピローマウイルスの表面カプシド抗原または 癌誘発関連抗原に対するワクチンを発現させるベクター 、前記ベクターによって形質転換された微生物、および 前記形質転換された微生物またはその抽出精製物を用い たワクチンを提供する。 【解決手段】ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体を コードする遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡのうち のいずれか１つまたは２つ以上と、ヒト・パピローマウ イルス（ＨＰＶ）の表面カプシド抗原タンパク質または 癌誘発関連抗原タンパク質遺伝子を含むワクチン製造用 表面発現ベクターを提供する。 (2) JP 2006-502732 A 2006.1.26 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子であるｐｇｓＢ、ｐｇｓＣお よびｐｇｓＡのうちのいずれか１つまたは２つ以上と、ヒト・パピローマウイルスの抗原 タンパク質遺伝子を含むワクチン製造用ベクター。 【請求項２】 前記抗原タンパク質遺伝子はヒト・パピローマウイルスのカプシドＨＰＶ Ｌ１およびＨ ＰＶ Ｌ２からなる群より選択されるいずれか１つまたは２つ以上の遺伝子であることを 特徴とする、請求項１に記載のワクチン製造用ベクター。 【請求項３】 10 前記抗原タンパク質遺伝子はヒト・パピローマウイルスの腫瘍誘発抗原タンパク質である ＨＰＶ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７からなる群より選択されるいずれか１つまたは２つの遺伝 子であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン製造用ベクター。 【請求項４】 第１項において、 前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇ ｓＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン製造用ベクター。 【請求項５】 請求項１に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換されたグラム陰性微生物。 【請求項６】 前記微生物は 大膓菌、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス 20 菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈ ｏ ｌ ｅ ｒ ａ ｅ ） 、 ウ シ 型 結 核 菌 (Ｍ ｙ ｃ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｂ ｏ ｖ ｉ ｓ )お よ び 赤 痢 菌 （Ｓｈｉｇｅｌｌａ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項５に記載の微 生物。 【請求項７】 請求項１に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換されたグラム陽性微生物。 【請求項８】 前記微生物はバチルス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、スタフィロコッカス、リステ リア、モノサイトゲネスおよびストレプトコッカスからなる群より選択されることを特徴 とする、請求項７に記載の微生物。 30 【請求項９】 抗原タンパク質が細胞表面に発現した請求項５及び請求項７に記載の微生物、前記微生物 から粗抽出された抗原タンパク質または前記微生物から精製された抗原タンパク質を有効 成分として含む粘膜腫瘍治療または予防用ワクチン。 【請求項１０】 前記ワクチンは経口用または食用として投与できることを特徴とする、請求項９に記載の 粘膜腫瘍治療または予防用ワクチン。 【請求項１１】 前記ワクチンは皮下または腹腔に注射用できることを特徴とする、請求項９に記載の粘膜 腫瘍治療または予防用ワクチン。 40 【請求項１２】 前記ワクチンは鼻腔に噴霧できることを特徴とする、請求項９に記載の粘膜腫瘍治療また は予防用ワクチン。 【請求項１３】 前記ベクターは図１に示す遺伝子地図をもつことを特徴とし、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ −ＨＰＶＬ１と呼称される、請求項１に記載のワクチン製造用ベクター。 【請求項１４】 前記ベクターは 図５に示す遺伝子地図をもつことを特徴とし、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓ ＢＣＡ−ＨＰＶＥ７と呼称される、請求項１に記載のワクチン製造用ベクター。 【請求項１５】 50 (3) JP 2006-502732 A 2006.1.26 請求項１３または請求項１４に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換された微生 物。 【請求項１６】 前記微生物はラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）またはサルモネラ（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ）が宿主細胞として利用されていることを特徴とする請求項１５に記載の微 生物。 【請求項１７】 請求項１３に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換された大腸菌（ＫＣＴＣ１０ ３４９ＢＰ）。 【請求項１８】 10 請求項１４に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換された大腸菌（ＫＣＴＣ１０ ５２０ＢＰ）。 【請求項１９】 抗原タンパク質が細胞表面に発現した請求項１６に記載の微生物、前記微生物から粗抽出 された抗原タンパク質または前記微生物から精製された抗原タンパク質を有効成分として 含む粘膜腫瘍治療または予防用ワクチン。 【請求項２０】 前記ワクチンは経口用または食用として投与できることを特徴とする請求項１９に記載の 粘膜腫瘍治療または予防用ワクチン。 【請求項２１】 20 前記ワクチンは皮下または腹腔に注射できることを特徴とする請求項１９に記載の粘膜腫 瘍治療または予防用ワクチン。 【請求項２２】 前記ワクチンは鼻腔に噴霧できることを特徴とする請求項１９に記載の粘膜腫瘍治療また は予防用ワクチン。 【請求項２３】 抗原タンパク質が細胞表面に発現した請求項１６に記載の微生物, 前記微生物から粗抽出 された抗原タンパク質または前記微生物から精製された抗原タンパク質を有効成分として 含む生殖器洗浄液。 【発明の詳細な説明】 30 【技術分野】 【０００１】 本発明は、パピローマウイルスの表面抗原に対するワクチンを発現させるベクター、前記 ベクターによって形質転換された微生物、および前記形質転換された微生物またはその抽 出精製物を用いたワクチンに関するものである。 【背景技術】 【０００２】 微生物の細胞表面に所望のタンパク質を付着させ発現させる技術を細胞表面発現（ｃｅｌ ｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技術という。タンパク質の分泌メカニズムとして 分子生物学的情報を利用しての応用方も解明されている。この細胞表面発現技術は、バク 40 テリアや酵母などの微生物の表面タンパク質を表面発現母体（ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｃｈ ｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）として使用して外来タンパク質を表面に発現させる技術であっ て、組み換え生ワクチンの生産、ペプチド／抗体ライブラリー製造およびスクリーニング 、全細胞アブソルベント、全細胞生物転換触媒などの様々な応用範囲を有する技術である 。すなわち、細胞表面に発現した外来タンパク質の多様性が高ければそれだけ応用範囲が 広くなる。したがって本技術の産業的利用の可能性は甚大であると言える。 【０００３】 細胞表面発現技術を成功させるためには表面発現母体が最も重要な要素となる。より効果 的に外来タンパク質を細胞表面に発現させ得る母体を選定することがこの技術の核心とな る。 50 (4) JP 2006-502732 A 2006.1.26 【０００４】 したがって、次のような性質を有する表面発現母体を選定しなければならない。第一に、 外来タンパク質を細胞表面まで送り出すために、外来タンパク質の細胞内膜通過を助け る分泌信号があること、第２に、細胞外膜表面に外来タンパク質が確実に付着するように 手伝う標的信号があること、第３に、細胞表面に多量に発現しても細胞成長にはほとんど 影響を及ぼさないこと、第４に、タンパク質の大きさに関係なく外来タンパク質の３次元 的な構造変化なしに安定的に発現されることである。しかし、上記条件を全て満たす表面 発現母体は未だに開発されておらず、現在までは上記各短所を補う程度の水準である。 【０００５】 今まで知られていて使用される表面発現母体としては、細胞外膜タンパク質、リポタンパ 10 ク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉ ｎ）、鞭毛タンパク質のような表面器官タンパク質などの４種に大別される。グラム陰性 菌 の 場 合 、 Ｌ ａ ｍ Ｂ 、 Ｐ ｈ ｏ Ｅ ［ Ｃ ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｔ ｅ ｔ ａ ｌ .， Ｊ .Ｉ ｍ ｍ ｕ ｎ ｏ ｌ .， １ ３ ９ ： １ ６ ５ ８ − １ ６ ６ ４ （ １ ９ ８ ７ ） ； Ａ ｇ ｔ ｅ ｒ ｂ ｅ ｒ ｇ ｅ ｔ ａ ｌ .， Ｖ ａ ｃ ｃｉｎｅ，８：８５−９１（１９９０）］、ＯｍｐＡなどのような細胞外膜に存在するタ ンパク質を主に用いており、リポタンパク質であるＴｒａＴ［Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ .， Ｊ .Ｍ ｏ ｌ .Ｂ ｉ ｏ ｌ .， ２ ２ ２ ： ３ ０ １ − ３ １ ０ （ １ ９ ９ １ ） ］ ， ペ プ チ ド グ リ カ ン 関 連 リ ポ プ ロ テ イ ン （ Ｐ Ａ Ｌ ） ［ Ｆ ｕ ｃ ｈ ｓ ｅ ｔ ａ ｌ .， Ｂ ｉ ｏ ／ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ，９：１３６９−１３７２（１９９１）］そしてＬｐｐ［Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａ ｌ .， Ｐ ｒ ｏ ｃ ． Ｎ ａ ｔ ｌ ． Ａ ｃ ａ ｄ ． Ｓ ｃ ｉ ． Ｕ Ｓ Ａ ， ４ ８ ９ ： ２ ７ １ ３ − ２ ７ １ ７ 20 （１９９２）］なども用いられ、ＦｉｍＡやｔｙｐｅ １ ｆｉｍｂｒｉａｅのＦｉｍＨ ａｄｈｅｓｉｎ のようなｆｉｍｂｒｉａｅ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｈｅｄｅｇａｒｄ ｅｔ ａ ｌ .， Ｇ ｅ ｎ ｅ ， ８ ５ ： １ １ ５ − １ ２ ４ （ １ ９ ８ ９ ） ］ 、 Ｐ ａ ｐ Ａ ｐ ｉ ｌ ｕ ｓ ｕ ｂ ｕｎｉｔのようなピリープロテインなどを細胞表面発現母体として用いての外来タンパク 質の発現が試みられてきた。この他、氷核活性タンパク質（ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ） ［ Ｊ ｕ ｎ ｇ ｅ ｔ ａ ｌ .， Ｎ ａ ｔ ． Ｂ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ， １ ６ ： ５ ７ ６ − ５ ６ ０ （ １ ９ ９ ８ ） ， Ｊ ｕ ｎ ｇ ｅ ｔ ａ ｌ .， Ｅ ｎ ｚ ｙ ｍ ｅ Ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，２２（５）：３４８−３５４（１９９８），Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ. ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：６４５−６４８（２０００）］、Ｋｌｅｂｓ ｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａのｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ［Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ ｅｔ ａ 30 ｌ ． 、 Ｍ ｏ ｌ ． Ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｌ .， ４ ： １ １ ０ １ − １ １ ０ ９ （ １ ９ ９ ０ ） ］ 、 Ｎ ｅ ｉ ｓ ｓ ｅ ｒ ｉ ａ の Ｉ ｇ Ａ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ ［ Ｋ ｌ ａ ｕ ｓ ｅ ｒ ｅ ｔ ａ ｌ .， Ｅ Ｍ Ｂ Ｏ Ｌ .， ９ ：１９９１−１９９９（１９９０）］などが表面発現母体となることが報告されている。 グラム陽性菌に関しては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ来由のプロテイ ンＡを表面発現母体として用いてマラリア抗原を効果的に発現させたことや、乳酸菌の表 面外皮タンパク質が表面発現したことが知られている。したがって、グラム陽性菌の表面 タンパク質は細胞表面タンパク質となることが明らかにされた。 【０００６】 本発明者らは、バチルス属菌株来由のポリ−γ−グルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇ ｓＢＣＡ）を新たな表面発現母体としての活用の可能性をすることに対し、鋭意研究した 40 ところ、ｐｇｓＢＣＡ遺伝子を用いて外来タンパク質を微生物の表面に効果的に発現させ る新たなベクター、および微生物の表面に外来タンパク質を多量に発現させる方法を開発 した（韓国特許出願番号第１０−２００１−４８３７３）。 【０００７】 上述の各表面発現母体を用いて病原体の抗原または抗原決定基を遺伝工学的な方法を利用 して大量生産の可能な細菌で安定的に発現させようとする研究が数多く行われている。特 に、非病原性の細菌表面に外来免疫源を発現させて生きている状態で経口投与する場合、 従来の弱毒化された病原性細菌やウイルスを用いたワクチンに比べてより持続的で強力な 免疫反応を誘導できると報告されている。細菌の各表面構造物は表面発現した外来タンパ ク 質 の 抗 原 性 （ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ） を 増 加 さ せ る ア ジ ュ バ ン ト (ａ ｄ ｊ ｕ ｖ ａ ｎ 50 (5) JP 2006-502732 A 2006.1.26 ｔ )作 用 を す る た め で あ り 、 生 き て い る 菌 に よ り 誘 発 さ れ る 体 内 の 免 疫 反 応 に よ る も の と して知られている。このような表面発現システムを用いた非病原性細菌の組み換え生ワク チンの開発は注目すべきものである。 【０００８】 ヒト・パピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ，以下ＨＰＶ と称する。）による感染は、世界的に全体の大人のうちの５０％以上を占めていると推定 されており、パピローマウイルスのうち、特にＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およ びＨＰＶ４５の４種は、子宮頸部癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）の原因の８０％ 以 上 を 占 め る こ と が 確 認 さ れ た ［ Ｌ ｏ ｗ ｒ ｙ ， Ｄ .Ｒ .， Ｋ ｉ ｒ ｎ ｂ ａ ｕ ｅ ｒ ， Ｒ .， Ｓ ｃ ｈ ｉ ｌ ｌ ｅ ｒ Ｊ .Ｔ .， （ １ ９ ９ ４ ） Ｐ ｒ ｏ ｃ .Ｎ ａ ｌ ｔ .Ａ ｃ ａ ｄ .Ｓ ｃ ｉ .９ １ ， ２ ４ ３ 10 ６−２４４０］。パピローマウイルスは非常に種特異的な小型のＤＮＡ腫瘍ウイルスであ って、人間、牛、兎、羊などの哺乳動物に感染し、皮膚や粘膜でイボや乳頭腫を誘発する パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ ）の一種である［Ｐｆｉｓｔｅｒ，Ｈ. （ １ ９ ８ ７ ） Ａ ｄ ｖ ． Ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ Ｒ ｅ ｓ .４ ８ ， １ １ ３ − １ ４ ７ ］ 。 そ の 中 で も ヒ ト ・ パピローマウイルスは約７０余種のタイプが知られており、その中で約２０余種のタイプ が口腔や生殖器官の皮膚粘膜で腫瘍を誘発するが、特に、ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８とのタ イプは、女性癌の大部分を占める子宮頸部癌を誘発すると報告されている［Ｚｕｒ Ｈａ ｕｓｅｎ Ｈ，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，８：１４７−１５ ０］。 【０００９】 20 世界的に子宮頸部癌は、女性にとっては乳房癌に次いで発生頻度の高い癌であって、世界 保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ， ＷＨＯ）によれば 、毎年全世界で５０万人以上の子宮頸部癌患者が発生し、毎年３０万人以上が子宮頸部癌 によって死亡している。特に、開発途上国では、女性の死亡の主原因となっている（Ｐｉ ｓ ａ ｎ ｉ ， Ｐ .， Ｐ ａ ｒ ｋ ｉ ｎ ， Ｄ .Ｍ .， Ｆ ｅ ｒ ｌ ａ ｙ ， Ｊ .（ １ ９ ９ ３ ） Ｉ ｎ ｔ Ｊ Ｃ ａｎｃｅｒ ５５：８９１−９０３）。ＩＡＲＣの統計によれば、特に慢性感染者が先進 国に比べて格段に多い開発途上国においてパピローマウイルス感染を根絶するための長期 的で最も効果的な方法は、パピローマウイルス予防ワクチンを投与することとして報告さ れた。 【００１０】 30 ある種のウイルスに対するワクチンを開発するためには、適当な動物培養システムを備え なければならず、これを用いてウイルス粒子を大量に生産、精製すべきである。しかし、 ＨＰＶは最終的に分化が終わった上皮細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）でのみ、ウイ ルス粒子（ビリオン）を形成するため、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉ ｎ ｖｉｖｏ）でウイルス粒子を大量に生産しにくいという問題点があり、研究に必要な ウイルス粒子の十分な生産はもとより、子宮頸部癌に対する予防用または治療用ワクチン を実用化することが難しかった。子宮頸部癌に係るワクチン開発の方法として、予防ワク チン（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）と治療ワクチン（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）との２つ の 形 態 に 焦 点 が 当 て ら れ て い る 。 予 防 ワ ク チ ン は 、 Ｈ Ｐ Ｖ Ｌ １ ／ L２ 抗 原 タ ン パ ク 質 に よ って強力な中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が生成されるよう 40 にすることで宿主がＨＰＶに感染することを阻止し、既に感染したとしてもそれ以上疾病 が進展しないようにすることを目的とする。一方、治療ワクチンは、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ を対象とし、特異的な細胞性免疫を誘導し、既に形成された病斑や悪性腫瘍を退化させる ことを目的とする。 【００１１】 人間の上皮細胞に感染するヒト・パピローマウイルスは、去る２０余年間の研究結果によ れば、種々の遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が存在し、様々な良性および悪性腫瘍の原因 に関わっている。かかる様々なＨＰＶに対する実験結果および発見は、ＨＰＶワクチンの 開発を促進するようになった。パピローマウイルス以外に、他のウイルスに比べてＨＰＶ の免疫誘導能が比較的に良いという特徴のため、いくつかのＨＰＶワクチン候補物質のう 50 (6) JP 2006-502732 A 2006.1.26 ちＨＰＶ類似粒子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ）は、動物モデルおよび人間を対象としたワクチン效能実験において非常に楽観的な結果 を 示 し た ［ Ｋ ｏ ｕ ｔ ｓ ｋ ｙ ， Ｌ .Ａ .， Ａ ｕ ｌ ｔ ， Ｋ .Ａ .， Ｗ ｈ ｅ ｅ ｌ ｅ ｒ ， Ｃ .Ｍ .， Ｂ ｒ ｏ ｗ ｎ ， Ｄ .Ｒ .， Ｂ ａ ｒ ｒ ， Ｅ .， Ａ ｌ ｖ ａ ｒ ｅ ｚ ， Ｆ .Ｂ .， Ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｃ ｈ ｉ ｅ ｒ ｉ ｎ ｉ ， Ｌ .Ｍ .， Ｊ ａ ｎ ｓ ｅ ｎ ， Ｋ .Ｕ .（ ２ ０ ０ ２ ） Ｎ .Ｅ ｎ ｇ ｌ .Ｊ .ｏ ｆ Ｍ ｅ ｄ ３ ４ ７（２１）：１６４５−１６５１］。すなわち、ＨＰＶ感染が癌を誘導する最も核心的な 原因であるということが近年確証されて以来、世界的に多くの科学者らがＨＰＶの研究に 興味をもって参加するようになり、ＨＰＶワクチンの開発に拍車がかかった。現在、世界 的に開発されているＨＰＶワクチンとしては、ＨＰＶタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ ｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＰＶ類似粒子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｌｉｋ 10 ｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）、ＨＰＶ ＤＮＡなどを用いた製品が挙げられる。 【００１２】 バクテリア、酵母、動物細胞などにおいて、ＨＰＶ構成体の一部を組み換え技術にて生産 された組み換えタンパク質と、直接主要エピトープ部位を合成した合成ペプチドとをワク チンとして使用しようとする研究が進められてきた。組み換えタンパク質は、一般に広く 使用されている生産方法であるバクテリア、酵母、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉ ｒｕｓ）、組み換えワクチン用ウイルス（ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）などのシステムを用いて生産しており、これらの方法によってＨＰＶの組 み換えタンパク質を生産する研究と、一部生産された組み換えタンパク質を用いて血清内 ＨＰＶに対する抗体形成能および細胞性免疫誘導能などを検証する研究とが行われている 20 。しかし、動物および昆虫細胞を用いたウイルスシステムの場合、培養過程での汚染およ び精製過程での難しさなどの問題点がある。また、合成ペプチドの合成を通じる場合を含 み全体としてコストが高いという短所があり、パピローマウイルス感染患者が主に低開発 国家に集中しているという現実から商業的な制約が伴う。 【００１３】 組み換え生ウイルスワクチン（Ｌｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）としてＨＰＶ Ｌ１ウイルス類似粒子（ ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔ ｉｃｌｅ ：以下ＶＬＰという。）を乳腺細胞培養を通じて生産する方法が知られており ［ Ｈ ａ ｇ ｅ ｎ ｓ ｅ ｅ ， Ｍ .Ｅ .， Ｙ ａ ｅ ｇ ａ ｓ ｈ ｉ ， Ｎ .， Ｇ ａ ｌ ｌ ｏ ｗ ａ ｔ ， Ｄ .Ａ .（ １ ９９３）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７：３１５−３２２］、ＶＬＰはマウスモデルにおいて、 30 中 和 抗 体 を 誘 導 産 生 す る と い う 報 告 が あ る ［ Ｓ ｃ ｈ ｉ ｌ ｌ ｅ ｒ ， Ｊ .Ｔ .， Ｌ ｏ ｗ ｒ ｙ ， Ｄ .Ｒ .（ １ ９ ９ ６ ） Ｓ ｅ ｍ ｉ ｎ ａ ｒ ｓ ｉ ｎ Ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ Ｂ ｉ ｏ ｌ .７ ， ３ ７ ３ − ３ ８ ２ ］。治療ワクチンは子宮頸部癌で発現する唯一のＨＰＶタンパク質であるＥ６とＥ７を用 いて開発されてきた［Ｂｕｂｅｎｉｋ Ｊ．（２００２）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ４９：２ ８５−２８９］。ＨＰＶのＥ６／Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶに感染した細胞の癌化に係る 癌特異抗原であるため、子宮頸部癌の免疫治療のターゲットとしてＥ６／Ｅ７タンパク質 を用いた治療ワクチンの研究が続けて進行されてきた。実際、微生物システムで合成され たＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７タンパク質を腫瘍細胞が注入されたマウスに投与したとき腫瘍形成 が 阻 害 も し く は 遅 延 さ れ る と い う 報 告 が あ る ［ Ｇ ａ ｏ ， Ｌ .， Ｃ ｈ ａ ｉ ｎ ， Ｂ .， Ｓ ｉ ｎ ｃ ｌ ａ ｉ ｒ ， Ｃ .（ １ ９ ９ ４ ） Ｊ .Ｇ ｅ ｎ Ｖ ｉ ｏ ｌ ， ７ ５ ： １ ５ ７ − １ ６ ４ ， Ｍ ｅ ｎ ｅ ｇ ｕ 40 ｚ ｚ ｉ ， Ｇ .， Ｃ ｅ ｒ ｎ ， Ｃ .， Ｋ ｉ ｅ ｎ ｙ ， Ｍ .Ｐ .（ １ ９ ９ １ ） Ｖ ｉ ｒ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， １ ８ １：６２−６９］。しかし、他の場合と同様に、生ウイルスワクチンを用いる場合、過多 なウイルス複製による問題点が誘発され得るので、実際には、研究レベルに止まる場合が 多く、商業化までは長年の期間と相当な臨床実験が要されるという短所がある。このよう な短所を克服するために、ウイルスの複製能が阻害もしくは欠乏したウイルスベクターの 開 発 に 関 す る 研 究 も 行 わ れ て い る が 、 ま だ 商 業 化 さ れ て い な い ［ Ｍ ｏ ｓ ｓ ， Ｂ .（ １ ９ ９ ６ ） Ｐ ｒ ｏ ｃ .Ｎ ａ ｔ ｌ .Ａ ｃ ａ ｄ .Ｓ ｃ ｉ .Ｕ Ｓ Ａ ９ ３ ， １ １ ３ ４ １ − １ １ ３ ４ ８ ］ 。 【００１４】 一方、バクテリアベクターを用いたワクチン開発の研究も活発に進行されつつあり、弱化 したサルモネラ菌（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ 50 (7) JP 2006-502732 A 2006.1.26 ｕｍ）から合成されたＨＰＶ １６ ＶＬＰがマウスの粘膜や全身で抗原特異的な抗体生成 を 誘 導 す る と い う 報 告 も あ る ［ Ｄ ｅ ｎ ｉ ｓ ， Ｎ ａ ｒ ｄ ｅ ｌ ｉ − ｈ ａ ｅ ｆ ｌ ｉ ｇ ｅ ｒ .， Ｒ ｉ ｃ ｈ ａ ｒ ｄ ， Ｂ .， Ｓ .Ｒ ｏ ｄ ｅ ｎ .（ １ ９ ９ ７ ） Ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｉ ｍ ｍ ｕｎｉｔｙ ６５：３３２８−３３３６］。合成ペプチドを用いたワクチンは免疫反応を 誘導するのに必要なエピトープのみを合成して接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）させるも のであって、既にＨＰＶ １６ Ｅ６／Ｅ７に対する細胞性免疫反応（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）を起こすエピトープが究明されている［Ｒｅｓｓ ｉ ｎ ｇ ， Ｍ .Ｅ .， Ｓ ｅ ｔ ｔ ｅ ， Ａ .， Ｂ ｒ ａ ｎ ｄ ｔ ， Ｒ .Ｍ .（ １ ９ ９ ５ ） Ｊ ． Ｉ ｍ ｍ ｕ ｎ ｏｌ １５４：５９３４−５９４３］。 【００１５】 10 このような試みのほか、植物からウイルス抗原を産生するために、トマトやじゃがいもな どの野菜類を用いてその形質転換体の野菜類そのものを経口用ワクチンまたは食物ワクチ ンとして使用しようとする研究が進行中である。代表的な例として肝炎ウイルス表面抗原 粒子（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ） ［ Ｔ ｈ ａ ｖ ａ ｌ ａ ， Ｙ .Ｆ .ａ ｎ ｄ Ｃ .Ｊ .Ａ ｒ ｔ ｚ ｅ ｎ .（ １ ９ ９ ５ ） Ｐ ｒ ｏ ｃ .Ｎ ａ ｔ ｌ . Ａ ｃ ａ ｄ .Ｓ ｃ ｉ .Ｕ Ｓ Ａ ９ ２ ： ３ ３ ５ ８ − ３ ３ ６ １ ］ 、 お よ び パ ピ ロ ー マ ウ イ ル ス の カ プシドＬ１およびＬ２タンパク質（韓国特許出願番号第１０−２０００−０００７０２２ ）が挙げられる。しかし、植物を用いたシステムの場合、発現されるＨＰＶ Ｌ１タンパ ク質の量が少なく精製過程に問題があり、同じく商業的な制約が伴うという問題がある。 【００１６】 20 したがって、ヒト・パピローマウイルスの感染者が主に低開発国家に集中している点を勘 案すれば、パピローマウイルス来由の口腔または生殖器官の皮膚粘膜の腫瘍に対する予防 と治療のために、より経済的で安定的にヒト・パピローマウイルス抗原を作製する方法の 開発が切望される。 【発明の開示】 【発明が解決しようとする課題】 【００１７】 前述の技術的問題点を解決するために、本発明は、微生物の表面発現システムを用いてＨ ＰＶ抗原を製造できるベクター、および前記ベクターによって形質転換された微生物を提 供することを目的とする。 30 【００１８】 また、本発明は、ＨＰＶ抗原が表面に発現した前記形質転換された微生物、前記微生物か ら粗抽出されたＨＰＶ抗原、または前記微生物から精製されたＨＰＶ抗原を有効成分とす る粘膜腫瘍治療・予防用ワクチンを提供することを目的とする。 【課題を解決するための手段】 【００１９】 上記目的を達成するために、本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコード する遺伝子であるｐｇｓＢ、ｐｇｓＣおよびｐｇｓＡのうちのいずれか１つまたは２つ以 上と、ヒト・パピローマウイルスの表面抗原タンパク質遺伝子を含むワクチン製造用表面 発現ベクターを提供するものである。 40 【００２０】 本発明において、前記遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡはそれぞれ配列１、配列２、 配列３と記載された塩基配列を持つ。 【００２１】 本発明において、前記表面抗原タンパク質遺伝子としてはＨＰＶ表面構成体タンパク質を 暗号化する遺伝子であればいずれも使用可能である。例えば、ヒト・パピローマウイルス のカプシドであるＨＰＶ Ｌ１またはＨＰＶ Ｌ２抗原タンパク質遺伝子を単独で用いるこ ともできれば、２つ以上を複合的に用いることもできる。しかし、ＨＰＶの主要カプシド であるＬ１抗原タンパク質の遺伝子を用いるのがより望ましい。 【００２２】 50 (8) JP 2006-502732 A 2006.1.26 また、本発明において、前記腫瘍関連抗原タンパク質遺伝子としてはＨＰＶの腫瘍関連タ ンパク質を暗号化する遺伝子であればいずれも使用でき、ヒト・パピローマウイルスの腫 瘍関連抗原タンパク質であるＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７抗原タンパク質遺伝子を単独 で用いることもできれば、２つ以上を複合的に用いることもできる。また、Ｅ６およびＥ ７の腫瘍誘発に係る遺伝子を変形して発現させた抗原も使用可能である。しかし、ＨＰＶ の主要腫瘍関連抗原タンパク質であるＥ７抗原タンパク質の遺伝子を用いるのがより望ま しい。 【００２３】 また、本発明では、前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子には ｐｇｓＡが含まれることが好ましい。 10 【００２４】 本発明はまた、前記ワクチン製造用ベクターで形質転換された微生物に関するものである 。 【００２５】 本 発 明 に お い て が は 、 生 体 適 用 の 際 に 毒 性 が な く 、 弱 毒 化 さ れ た （ attenuated） 微 生 物 で あればいずれも使用可能である。例えば、グラム陰性菌としては、大膓菌、チフス菌（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ ｉｍｕｒｉｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、赤痢菌などを、グラム陽性菌としては、バチルス 、ラクトバチルス、ラクトコッカス、スタフィロコッカス、リステリア・モノサイトゲネ 20 スおよびストレプトコッカスなどを適宜選択することができる。 【００２６】 本発明はまた、前記抗原タンパク質が表面に発現した微生物そのもの及び、前記微生物を 破壊してメンブレイン成分を粗抽出物質、前記微生物から精製した抗原タンパク質を有効 成分として含む各種の粘膜腫瘍治療・予防用ワクチンを提供するものである。すなわち、 本発明に係るワクチンは、ＨＰＶによって誘発される、口腔や生殖器官などの粘膜に発生 した腫瘍、特に女性子宮頸部癌の治療・予防薬として用いることができる。 【００２７】 本発明に係るワクチンは、経口用または食用として摂取可能であり、皮下または腹腔に注 射可能で、更に生殖器の洗浄液としても使用可能である。女性生殖器に直接適用する場合 30 は、女性生殖器に棲息する有用菌、例えば乳酸菌を宿主とすることが好ましく、このよう にすることは当業者にとっては非常に容易なことであろう。 【００２８】 また、本発明に係るワクチンはスプレー方式による鼻腔への適用も可能である。 【００２９】 ＨＰＶの感染は粘膜組織表面（ｍｕｃｏｓａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）に発生することが多い ので、粘膜免疫による感染の防御は非常に重要である。ＨＰＶの抗原を表面に発現する微 生物は粘膜での抗体形成（ｍｕｃｏｓａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を更に効果的に誘導でき るという長所があり、前記形質転換された微生物そのものを用いた経口用ワクチンが非経 口用（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）ワクチンに比べてＨＰＶの防御により高い効果が期待され 40 る。 【００３０】 具体的には、本発明は、バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成複合体の遺伝 子のうちｐｇｓＡを含み、ｐｇｓＡのＣ末端にＨＰＶ Ｌ１のＮ末端を連結し、ＨＰＶ Ｌ １を融合タンパク質の形態でグラム陰性菌およびグラム陽性菌の表面に発現させることの できるワクチン用表面発現形質転換ベクター［ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１ （図１参照）］、およびこれによって形質転換された微生物を提供するものである。前記 ワクチン製造用ベクターで形質転換された大腸菌は別に寄託した（ＫＣＴＣ １０３４９ ＢＰ）。 【００３１】 50 (9) JP 2006-502732 A 2006.1.26 また、本発明は、バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成複合体の遺伝子のう ちｐｇｓＢＣＡを含み、ｐｇｓＡのＣ末端にＨＰＶ Ｅ７のＮ末端を連結し、ＨＰＶ Ｅ７ を融合タンパク質の形態でグラム陰性菌およびグラム陽性菌の表面に発現させることので きるワクチン用表面発現形質転換ベクター［ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ ７（図５参照）］、およびこれによって形質転換された微生物を提供するものである。前 記ワクチン製造用ベクターで形質転換された大腸菌は別に寄託した（ＫＣＴＣ １０５２ ０ＢＰ）。 【発明の効果】 【００３２】 本発明者らは、バチルス属菌株来由のポリ−γ−グルタミン酸の合成遺伝子（ｐｇｓＢＣ 10 Ａ）を用いてヒト・パピローマウイルスのカプシドＬ１タンパク質を微生物の表面に、特 に経口投与可能な乳酸菌表面およびワクチン菌株であるサルモネラ菌株の表面に效果的に 発現させる方法、およびその用途を開発し、この組み換え菌株はＨＰＶの予防および治療 のためのワクチンなどの開発に使用可能である。特に、ＨＰＶの抗体誘導のための抗原の 大量生産が不可能であるのに対し、本発明のＨＰＶ抗原を発現する組み換え菌株を低コス トで大量増殖させ経口用ワクチンとして直接あるいは膣部位に直接適用可能な経済性のあ るワクチンとして用いることができる。 【発明を実施するための最良の形態】 【００３３】 以下、本発明を実施例によって更に詳しく説明する。但し、これらの実施例は本発明をよ 20 り具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に局限されないこ とは、当業界で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。 【００３４】 特に、下記実施例では、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原タンパク質遺伝子を適用したが、他のＨＰ Ｖのタイプストレイン（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）のＬ１およびＬ２など、ＨＰＶのカプ シドであるいずれかの抗原タンパク質遺伝子を、単独または２つ以上を複合的に用いるこ ともできる。また、下記実施例では、ＨＰＶ ｔｙｐｅ１６の主要癌誘発関連抗原タンパ ク質であるＥ７遺伝子を適用したが、他のＨＰＶのタイプストレインの癌誘発抗原タンパ ク質遺伝子を単独または複合的に用いることもできる。 【００３５】 30 また、下記実施例ではバチルス・サブチルス清麹醤（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ ｓ ｖａｒ．ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ, ＫＣＴＣ ０６９７ＢＰ）からポリ−γ−グ ルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子ｐｇｓＢＣＡを獲得して用いたが 、遺伝子はポリ−γ−グルタミン酸を産生する全てのバチルス属菌株からｐｇｓＢＣＡを 獲得して製造されたベクター、またはこのベクターを用いた形質転換微生物なども本発明 の範囲に含まれる。例えば、バチルス・サブチルス清麹醤に存在するｐｇｓＢＣＡ遺伝子 の塩基配列と８０％以上の相同性を有する他の菌株来由のｐｇｓＢＣＡ遺伝子を用いてワ クチン用ベクターを製造すること及び、これを用いることも本発明の範囲に含まれる。 【００３６】 また、下記実施例および間接実施例に示すように、遺伝子ｐｇｓＢＣＡの全部または一部 40 のみを用いてワクチン用ベクターを製造することも本発明の範囲に含まれる。 【００３７】 また、下記実施例では、前記ベクターに対する宿主として、グラム陰性菌であるチフス菌 とグラム陽性菌であるラクトバチルスのみを用いたが、これらの細菌のほか、如何なるグ ラム陽性菌またはグラム陽性菌も本発明に係る方法で形質転換させれば同様の結果が得ら れるという事実も当業者にとっては自明なことであろう。 【００３８】 また、下記実施例では、ワクチン用ベクターで形質転換された微生物そのものを生ワクチ ンとして生体に適用した例のみが提示されている。しかし、ワクチン関連技術分野の知識 上、前記微生物から抽出された発現タンパク質（すなわち、ＨＰＶ抗原タンパク質）また 50 (10) JP 2006-502732 A 2006.1.26 は精製された発現タンパク質を生体に適用しても同一または類似の結果が得られることは 当然であろう。 ＜実施例１＞表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ：ＨＰＶ Ｌ１）の 製造 【００３９】 バチルス属菌株から由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の 遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用いてグラム陰性微生物およびグラム陽性微生 物を宿主としてヒト・パピローマウイルスｔｙｐｅ１６（以下、パピローマウイルスをＨ ＰＶという。）の主要カプシドタンパク質Ｌ１を表面発現できる形質転換ベクター（ｐＨ ＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）を製造した。 10 【００４０】 まず、グラム陰性微生物を宿主とする表面発現ベクターｐＧＮＡ（韓国特許出願第１０− ２００１−４８３７３号の出願人から提供される。）にＨＰＶのＬ１をコードする遺伝子 を 導 入 す る た め に 、 ｐ Ｕ Ｃ １ ９ に ク ロ ー ニ ン グ さ れ て い る 約 １ .５ ｋ ｂ の ヒ ト ・ パ ピ ロ ー マ ウ イ ル ス 遺 伝 子 を 鋳 型 と し て 用 い 、 Ｈ Ｐ Ｖ Ｌ １ を コ ー ド す る 遺 伝 子 配 列 ４ （ ５ -ｃ ｇ ｃ ｇ ｇ ａ ｔ ｃ ｃ ｔ ｃ ｔ ｃ ｔ ｔ ｔ ｇ ｇ ｃ ｔ ｇ ｃ ｃ ｔ ａ ｇ − ３ ） お よ び 配 列 ５ （ ５ -ｇ ｇ ａ ａ ａ ｇ ｃ ｔ ｔ ｔ ｔ ａ ｔ ｔ ａ ｃ ａ ｇ ｃ ｔ ｔ ａ ｃ ｇ ｔ ｔ ｔ ｔ ｔ ｔ ｇ -３ ） の 塩 基 配 列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌ ｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）を行った。この結果、増幅され た遺伝子部位の大きさは１５１８ｂｐであった。 20 【００４１】 前記プライマー配列４および配列５には表面発現ベクターｐＧＮＡに存在する制限酵素Ｂ ａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの認識部位が存在するように構成した。前記増幅されたＨＰ Ｖ Ｌ１抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断し、予め用意した表 面発現ベクターｐＧＮＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の 遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端部位に翻訳コドンを合わせて連結し、形質転換ベクターｐＧＮＡ -Ｈ Ｐ Ｖ Ｌ １ を 製 造 し た 。 【００４２】 製造された形質転換ベクターｐＧＮＡ−ＨＰＶ Ｌ１からＨＣＥプローモータ、ｐｇｓＡ 、そしてＨＰＶ Ｌ１を含む切片を得るために、ｐＧＮＡ−ＨＰＶ Ｌ１を制限酵素である 30 ＮｈｅＩとＳｃａＩとで切断して切片を用意し、グラム陽性の汎用ベクターであるｐＡＴ １９のマルチクローニングサイト内の制限酵素であるＸｂａＩとＳｍａＩ部位とでその切 片を連結し、形質転換ベクター［ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１（図１）］を 製造した。 【００４３】 本表面発現ベクターで大腸菌を形質転換させ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１ を含む大腸菌を韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ，韓国大田広域市儒城区魚隠洞 ５２番地）に受託番号ＫＣＴＣ １０３４９ＢＰにて寄託した。 ＜実施例２＞ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｌ１の表面発現 【００４４】 40 前記表面発現ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）を用いてグラム陰性 菌であるチフス菌（Ｔｙ２１ａ）を形質転換させた後、チフス菌（Ｔｙ２１ａ）において のｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｌ１抗原のタンパク質発現を調べ、グラム陽性菌であるラ クトバチルスを形質転換させた後、ラクトバチルス内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰ Ｖ Ｌ１プラスミドの存在を確認し、ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｌ１抗原のタンパク質発 現を調べた（図２参照）。 【００４５】 ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端と融合したＨＰＶ Ｌ１抗原 の細菌発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＨＰＶ Ｌ１に対する特 異抗体を用いたウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉ 50 (11) JP 2006-502732 A 2006.1.26 ｎｇ）を行って確認した。 【００４６】 具体的には、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１に形質転換されたチフス菌（Ｔｙ ２１ａ）を抗生剤のエリスロマイシン１００ｍｇ／Ｌの添加された５０ｍｌのＬＢ培地（ 酵 母 エ キ ス ５ ｇ ／ Ｌ ， ト リ プ ト ン １ ０ ｇ ／ Ｌ ， 食 塩 ５ ｇ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ７ .０ ） を 含 む ５ ０ ０ ｍｌフラスコで増殖させることで、表面発現を誘導した。これとは別に、ｐＨＣＥ２ＬＢ ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１に形質転換されたラクトバチルスカゼイをＭＲＳ培地（Ｌａｔ ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎ ｙ Ｓｐａｒｋｓ，ＵＳＡ）上で３７℃で静置培養・増殖させることで、表面発現を誘導 した。 10 【００４７】 発現が誘導されたチフス菌（Ｔｙ２１ａ）およびラクトバチルスカゼイを同じ細胞濃度か ら得たタンパク質で変性させて試料を用意し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動で分析した後、分画された各タンパク質をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｌｉｄｅ ｎｅ−ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）メンブレインに移 した。各タンパク質が移されたＰＶＤＦメンブレインをブロッキング緩衝溶液（５０ｍＭ ト リ ス 塩 酸 ， ５ ％ ス キ ム ミ ル ク ， ｐ Ｈ ８ .０ ） で １ 時 間 振 っ て ブ ロ ッ キ ン グ さ せ た 後 、 Ｈ ＰＶ Ｌ１に対するマウス来由のモノクローナル一次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０ ００倍希釈し、１２時間反応させた。反応の終わったメンブレインは緩衝溶液で洗浄し、 ビオチンの接合したマウスに対する２次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈し 20 、４時間反応させた。反応の終わったメンブレインは緩衝溶液で洗浄し、アビジン−ビオ チン試薬を１時間反応させて再び洗浄した。洗浄されたメンブレインに基質と発色試薬と してＨ２ Ｏ２ およびＤＡＢ溶液を添加して発色させ、ＨＰＶ Ｌ１に対する特異抗体と前 記融合タンパク質と間の特異的な結合を確認した（図２）。 【００４８】 図２のＡにおいて、レーン１は形質転換されていない宿主細胞であるチフス菌（Ｔｙ２１ ａ）を示し、レーン２およびレーン３は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰ Ｖ Ｌ１／チフス菌（Ｔｙ２１ａ）を示す。なお、図２のＢにおいて、レーン１は形質転 換されていないラクトバチルスカゼイを示し、レーン２は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１／ラクトバチルスカゼイを示す。同図に示すように、ｐＨＣＥ 30 ２ Ｌ Ｂ ： ｐ ｇ ｓ Ａ − Ｈ Ｐ Ｖ Ｌ １ プ ラ ス ミ ド に よ っ て 約 ９ ７ .４ ｋ Ｄ ａ の 融 合 タ ン パ ク 質 バ ン ド を 確 認 す る こ と が で き た 。 ｐ ｇ ｓ Ａ が 約 ４ １ .８ ｋ Ｄ ａ で 、 Ｌ １ タ ン パ ク 質 が 約 ５ ５ . ６ ｋ Ｄ ａ で あ る の で 、 上 記 の ９ ７ .４ ｋ Ｄ ａ を 示 す バ ン ド は 、 ｐ ｇ ｓ Ａ と Ｌ １ タ ン パ ク 質 とが融合した融合タンパク質であることが分かる。 ＜実施例３＞ＨＰＶ Ｌ１抗原を表面発現するラクトバチルスの免疫反応誘導能調査 【００４９】 前記表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）でグラム陽 性菌であるラクトバチルスカゼイを形質転換させ、実施例２と同様の方法で前記抗原をラ クトバチルスカゼイにおいて表面発現を誘導した後、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与 する細胞外膜タンパク質ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ１６のＬ１抗原の抗原性を調べた。 40 【００５０】 具体的に、本発明の表面発現形質転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１ でラクトバチルスカゼイを形質転換させ、それぞれ同じ細菌濃度になるように獲得した細 胞 を 緩 衝 溶 液 （ Ｐ Ｂ Ｓ ｂ ｕ ｆ ｆ ｅ ｒ ， ｐ Ｈ ７ .４ ） で 数 回 洗 浄 し 、 Ｈ Ｐ Ｖ １ ６ の Ｌ １ 抗 原 が表面発現したラクトバチルスおよび形質転換されていないラクトバチルス（それぞれ５ ×１０ １ ０ 菌）を、４∼６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの口腔に第１週および第２週に１日 おきに３回、そして２週間後に更に、同じく１日おきに３回投与した。対照群としては、 酵母で発現して得たＨＰＶ１６のＬ１ ＶＬＰ（ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌ ｅ）を１日おきに ２回静脈投与したマウスを用いた。 【００５１】 50 (12) JP 2006-502732 A 2006.1.26 経口投与および静脈投与後、２週間おきにマウスを犠牲にしてそれぞれの１マウス群の血 清を採って血清内のＨＰＶ１６のＬ１抗原に対するＩｇＧ抗体価、および２マウスの内臓 、気管支、肺そして膣を採ってその内部を洗浄した浮遊液内でのＨＰＶ１６のＬ１抗原に 対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ ｅｎｔ ａｓｓａｙ）で抗原に対する抗体価を測定した（図３ａ，図３ｂ）。ＨＰＶ１６ のＬ１抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体価を測定するためのＥＬＩＳＡ方法では、酵 母で発現させて得たＨＰＶ１６のＬ１ ＶＬＰ（ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌ ｅ）を抗原として使用し、ＩｇＧ抗体価測定のためには、ホースラディッシュ・過酸化酵 素コンジュゲート（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔ ｅｄ）抗マウスＩｇＧを、そしてＩｇＡ抗体価測定のためには、ホースラディッシュ・ 10 過酸化酵素コンジュゲート抗マウスＩｇＡを使用した。 【００５２】 【００５３】 20 その結果、図３ａに示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１で形質転換さ せたラクトバチルスカゼイを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群の血清希釈液において、ヒト ＨＰＶのＬ１抗原に対するＩｇＧ抗体が、対照群であるＢＡＬＢ／ｃマウスのそれより格 段に高く現れることを確認し、ＨＰＶ１６のＬ１ ＶＬＰを静脈投与した群に比べても、 比較できるような抗体価の上昇を確認した。 【００５４】 また、図３ｂに示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１で形質転換させた ラクトバチルスカゼイを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群の内臓、気管支、肺、そして膣内 部などを洗浄した浮遊液内でのＨＰＶ１６のＬ１抗原に対するＩｇＡ抗体が、対照群とＨ ＰＶ１６のＬ１ ＶＬＰを静脈投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群とも比較できるような抗体 30 価の上昇を確認した。特に、内臓浮遊液内のＨＰＶ１６のＬ１抗原に対するＩｇＡ抗体価 の差がより大きく現れた。 【００５５】 したがって、本発明に係る形質転換微生物は、全身的免疫誘導の指標であるＨＰＶに対す るＩｇＧ抗体および局所免疫である粘膜免疫誘導の指標であるＨＰＶに対するＩｇＡ抗体 を形成することが確認され、これらの形質転換微生物が生ワクチンとして活用可能である ことが分かった。 ＜実施例４＞ＨＰＶ Ｌ１抗原を表面発現するラクトバチルスで兔疫された動物からの脾 臓細胞の細胞融解活性 【００５６】 40 ＨＰＶ Ｌ１抗原を表面発現するラクトバチルスで免疫が確認されたマウスにおいて発生 する免疫反応の中で細胞媒介性免疫反応が同様の過程を通じて誘導されるか否かを確認す るために、兔疫された動物から脾臓の細胞を分離して細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）の活性 を測定した。 【００５７】 具体的には、免疫化されていないＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞と１０μｇの合成ＨＰＶ １６のＬ１ペプチドとを３７℃で３時間インキュベートし、４０００ｒａｄで照射して刺 激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を用意する。 【００５８】 前記実施例３でのＨＰＶ Ｌ１抗原を表面発現するラクトバチルスで兔疫されたＢＡＬＢ 50 (13) JP 2006-502732 A 2006.1.26 ／ｃマウスから脾臓細胞を分離し、合成ペプチドをローディングした刺激細胞と混合して ６日間培養し、効果細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）を用意する。この際、刺激細胞 と効果細胞との割合は２：１にする。６日目に更に刺激を与える。アッセイの前日、標的 細胞として使用される細胞に１０μｇの合成ＨＰＶ１６のＬ１ペプチドを入れてインキュ ベートする。アッセイの当日に、ペプチドローディングされた標的細胞に１００ｕＣｉ／ １０ ６ ｃｅｌｌの ５ １ ＣｒＯ４ を入れて２時間インキュベートした後、洗浄する。用意さ れた効果細胞を９６ウエルに５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの標的細胞と１：１００ない し１：２５までの割合で分注する。標的細胞と効果細胞とを混合した後、３７℃で４時間 インキュベートする。４時間後、上清液を集めて ５ １ ＣｒＯ４ のリリース（ｒｅｌｅａｓ ｅ ） を 測 定 す る 。 １ ％ ｔ ｒ ｉ ｔ ｏ ｎ Ｘ -１ ０ ０ と 標 的 細 胞 と を 混 合 し た 時 を 最 大 リ リ ー ス 10 、メジアー（ｍｅｄｉａ）と標的細胞とを混合した時を自然リリース（ｓｐｏｎｔａｎｅ ｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ ）とし、以下の計算式によって特異的分解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）を換算する。 ［ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ ＝１００×（ｅｘｐｅｒｉｍｍｅｎｔａｌ ｃｐｍ− ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｐｍ）／ｍａｘｉｍｕｍ ｃｐｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕ ｓ ｃｐｍ ］ 【００５９】 換算された細胞融解活性の結果を図４に示した。 【００６０】 その結果、同図に示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１で形質転換させ 20 たラクトバチルスカゼイを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞での特異的な細胞融解 の割合が、形質転換されていないラクトバチルスを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのそれよ り高く現れることが確認された。 【００６１】 したがって、本発明に係るＨＰＶ１６のＬ１抗原を表面発現させたラクトバチルスによっ て誘導された免疫は、経口ワクチンとしての主要効果である細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ） を活性化させるような特異性を現わす細胞媒介性免疫反応であることが確認された。 ＜実施例５＞表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ：ＨＰＶ Ｅ７ ）の製造 【００６２】 30 バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝 子（ｐｇｓＢＣＡ）のうち、ｐｇｓＢＣＡを用いてグラム陰性微生物およびグラム陽性微 生物を宿主としてＨＰＶ ｔｙｐｅ１６の主要癌誘発関連抗原タンパク質Ｅ７を表面発現 させることのできる形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−Ｅ７）を製造し た。 【００６３】 まず、グラム陰性微生物を宿主とする表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡ（韓国特許出願第１ ０−２００１−４８３７３号の出願人から提供される。）にＨＰＶ１６のＥ７をコードす る遺伝子を導入するために、ｐＵＣ１９にクローニングされている約３２４ｂｐのヒト・ パピローマウイルスｔｙｐｅ１６のＥ７遺伝子を鋳型として使用し、ＨＰＶ１６ Ｅ７を 40 コ ー ド す る 遺 伝 子 配 列 ６ （ ５ -ｃ ｇ ｃ ｇ ｇ ａ ｔ ｃ ｃ ｃ ｃ ａ ｇ ｇ ａ ｇ ｇ ｔ ａ ｔ ｇ ｃ ａ ｔ -３ ） お よ び 配 列 ７ （ ５ -ｇ ｇ ａ ａ ａ ｇ ｃ ｔ ｔ ｔ ｔ ａ ｔ ｇ ｇ ｔ ｔ ｔ ｃ ｔ ｇ ａ ｇ ａ ａ ｃ ａ ｇ ａ -３ ） の 塩 基 配 列 を 有 す る オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を プ ラ イ マ ー と し て 用 い た ポ リ メラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）を 行った。この結果、増幅された遺伝子部位の大きさは３２４ｂｐであった。 【００６４】 前記プライマー配列６およびプライマー配列７には表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡに存在 する制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの認識部位が存在するように構成した。前 記増幅されたＨＰＶ Ｌ１抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断 し、予め用意された表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与 50 (14) JP 2006-502732 A 2006.1.26 する細胞外膜タンパク質の遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端部位に翻訳コドンを合わせて連結し、 形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７を製造した。 【００６５】 製造された形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７からＨＣＥプローモータ、ｐｇ ｓＢＣＡ、およびＨＰＶ Ｌ１を含む切片を得るために、ｐＧＮＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７を制 限酵素であるＮｈｅＩとＳｃａＩとで切断して切片を用意し、グラム陽性の汎用ベクター であるｐＡＴ１９のマルチクローニングサイト内の制限酵素であるＸｂａＩとＳｍａＩ部 位とでその切片を連結し、形質転換ベクター［ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７（図５）］を製造した。 【００６６】 10 本表面発現ベクターで大腸菌を形質転換させ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７を含む大腸菌を、韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ，大田広域市儒城区魚隠 洞５２番地所在）に受託番号ＫＣＴＣ １０５２０ＢＰにて寄託した。 ＜実施例６＞ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｅ７の表面発現 【００６７】 前記表面発現ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）でグラム陽性菌 であるラクトバチルスを形質転換させた後、ラクトバチルス内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓ ＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７プラスミドの存在を確認し、ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｅ７抗原の タンパク質発現を調べた（図６参照）。 【００６８】 20 このために、前記発現ベクターでラクトバチルスを形質転換させ、実施例２と同様の過程 で発現を誘導した後、ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端と融合 したＨＰＶ Ｅ７抗原タンパク質のラクトバチルスの発現をＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動、およびｐｇｓＡ（図６のＡ）とＨＰＶ Ｅ７（図６のＢ）に対する特異抗 体を用いたウエスタンブロッティングを行って確認した（図６）。図６において、レーン １は形質転換されていないラクトバチルスカゼイを示し、レーン２およびレーン３は形質 転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７／ラクトバチルスカゼイを示す 。 【００６９】 同図に示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７プラスミドによって約 30 ６ ０ .８ ｋ Ｄ ａ の 融 合 タ ン パ ク 質 バ ン ド が 確 認 さ れ た 。 ｐ ｇ ｓ Ａ が 約 ４ １ .８ ｋ Ｄ ａ で 、 典 型 的 な Ｈ Ｐ Ｖ １ ６ の Ｅ ７ 抗 原 タ ン パ ク 質 が 約 １ ９ ｋ Ｄ ａ で あ る の で 、 前 記 ６ ０ .８ ｋ Ｄ ａ を示すバンドはｐｇｓＡとＨＰＶ１６のＥ７抗原タンパク質とが融合した融合タンパク質 であることが分かった。 ＜実施例７＞ＨＰＶ Ｅ７抗原を表面発現するラクトバチルスで兔疫された動物への腫瘍 細胞チャレンジ 【００７０】 前記表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）でグラ ム陽性菌であるラクトバチルスカゼイを形質転換させ、実施例２と同様の方法で前記抗原 をラクトバチルスカゼイにおいて表面発現を誘導した後、ポリ−γ−グルタミン酸合成に 40 関与する細胞外膜タンパク質ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ１６のＥ７抗原の免疫化による腫 瘍増殖抑制效果を調べた。 【００７１】 具体的には、本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰ Ｖ Ｅ７）で形質転換させたラクトバチルスカゼイ、および形質転換されていないラクト バチルスをそれぞれ実施例３のように処理し、５×１０ １ ０ 菌を４∼６週齢のＣ５７／Ｂ Ｌ／６マウスの口腔に第１週および第２週に１日おきに３回、そして２週間後に更に、同 じく１日おきに３回投与した。 【００７２】 最後に投与した後、ＨＰＶのＥ７を発現する腫瘍細胞ＴＣ−１細胞株（１×１０ ４ ／５０ 50 (15) JP 2006-502732 A 2006.1.26 μｌ）をマウスの左わき腹に皮下注射することで、チャレンジした。 【００７３】 ＨＰＶのＥ７発現腫瘍細胞を発現させるＴＣ−１腫瘍細胞株は、先行文献［Ｌｉｎ ｅｔ ａ ｌ .， Ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ Ｒ ｅ ｓ .５ ６ ： ２ １ − ２ ６ （ １ ９ ９ ６ ） ］ に 記 載 の よ う に 、 Ｈ Ｐ Ｖ１６のＥ６およびＥ７遺伝子と、活性化されたヒト・ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子とで免疫 ・形質転換させることで、Ｃ５７／ＢＬ／６マウスの一次肺細胞から誘導されたものであ る。 【００７４】 腫瘍チャレンジ２週間後から腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさは、２日おきに週３ 回測定し、最長の長さと最短の長さとを測定し、それらを掛け算して表示した。腫瘍チャ 10 レンジの後、腫瘍の大きさを測定した結果は図７に示した。 【００７５】 図７に示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−Ｅ７で形質転換させたラクトバチル スカゼイを投与したＣ５７／ＢＬ／６マウスでチャレンジした腫瘍細胞の増殖が形質転換 されていないラクトバチルスを投与したＣ５７／ＢＬ／６マウスの場合に比べて著しく抑 制された。 【００７６】 したがって、本発明に係るＨＰＶ１６のＥ７抗原を表面発現させたラクトバチルスによっ て誘導された免疫は、腫瘍細胞でチャレンジしたマウスの腫瘍細胞の増殖を抑制すること が確認された。 20 ＜間接実施例＞ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、およびｐｇｓＡの組み合わせが挿入されたワクチン 用ベクターの作製およびそれを用いた外来タンパク質表面発現実験 【００７７】 ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、および ｐｇｓＡのうちのいずれか一つまたは２つ以上と、外来タンパク質をコードする遺伝子が 含まれた表面発現ベクターとの製造が可能であり、これらのベクターで微生物を形質転換 させることで、外来タンパク質が微生物の表面に発現することを確認した。 【００７８】 これにより、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇ ｓＣ、およびｐｇｓＡのうちのいずれか１つまたは２つ以上を含むワクチン用ベクター及 30 び、本発明に係るＨＰＶ抗原タンパク質をコードする遺伝子を含むワクチン用ベクターを 製造できることが間接的に確認された。 【００７９】 間接実施例において、プラスミドｐＧＮＢＣＡ、ｐＧＮＣＡは、それぞれ本発明でのプラ スミドｐＧＮｐｇｓＢＣＡ、ｐＧＮｐｇｓＣＡと等しいものである。 ＜間接実施例１＞表面発現形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８の製造およびＳ抗 原の中和抗体形成抗原基の表面発現 【００８０】 バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝 子（ｐｇｓＢＣＡ）を用い、グラム陰性微生物を宿主としてＢ型肝炎ウイルスＳ抗原の中 40 和抗体形成抗原基を表面発現できる形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８を製造し た。 【００８１】 グラム陰性微生物を宿主とする表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡにＢ型肝炎ウイルスＳ抗原 遺伝子を導入するために、汎用クローニングベクターであるｐＵＣ８にクローニングされ て い る 約 １ .４ ｋ ｂ の Ｂ 型 肝 炎 ウ イ ル ス 遺 伝 子 を 鋳 型 と し て 使 用 し 、 配 列 ８ （ ５ -ｃ ｔ ｇ ｇ ｇ ａ ｔ ｃ ｃ ｃ ａ ａ ｇ ｇ ｔ ａ ｔ ｇ ｔ ｔ ｇ ｃ ｃ ｃ ｇ ｔ ｔ ｔ ｇ -３ ） お よ び 配 列 ９ （ ５ ｔ ｇ ａ ａ ｇ ｃ ｔ ｔ ａ ｔ ｔ ａ ｇ ｇ ａ ｃ ｇ ａ ｔ ｇ ｇ ｇ ａ ｔ ｇ ｇ ｇ ａ ａ ｔ -３ ） の 塩 基 配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応を行っ てＳ抗原遺伝子を増幅させた。このとき、増幅された遺伝子部位の大きさは１６８ｂｐで 50 (16) JP 2006-502732 A 2006.1.26 あった。 【００８２】 前記配列８および配列９のプライマーは、表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡに存在する制限 酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの認識部位が存在するように構成した。前記増幅され たＢ型肝炎ウイルスＳ抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、 予め用意された表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する 細胞外膜タンパク質の遺伝子のＣ末端部位に翻訳コドンを合わせて連結した。このように して形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８を製造した（図８参照）。 【００８３】 前記表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８を用いて大腸菌でのＢ型肝炎ウイルスＳ 10 抗原の中和抗体形成抗原基の表面発現を調べた。 【００８４】 実施例２で製造された発現ベクターで大腸菌を形質転換させた後、抗生剤のアンピシリン １００ｍｇ／Ｌの添加された５０ｍｌのＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／Ｌ，トリプトン１０ ｇ ／ Ｌ ， 食 塩 ５ ｇ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ７ .０ ） を 含 む ５ ０ ０ ｍ ｌ フ ラ ス コ で 増 殖 さ せ る こ と で 、 表 面発現を誘導した。 【００８５】 ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子のＣ末端と融合したＳ抗原の中和抗体形成抗原 基の細菌発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳ抗原に対する抗体を 用いたウエスタンブロッティングを行って確認した。具体的には、同じ細胞濃度より得た 20 タンパク質を変性させて試料を用意し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 で分析した後、分画された各タンパク質をＰＶＤＦメンブレインに移した。各タンパク質 の移されたＰＶＤＦメンブレインをブロッキング緩衝溶液（５０ｍＭトリス塩酸，５％ス キ ム ミ ル ク ， ｐ Ｈ ８ .０ ） で １ 時 間 振 っ て ブ ロ ッ キ ン グ さ せ た 後 、 Ｓ 抗 原 に 対 す る ヒ ツ ジ 来由のポリクローナル一次抗体をブロッキング緩衝溶液で１０００倍希釈し、１２時間反 応させた。反応の終わったメンブレインを緩衝溶液で洗浄し、ビオチンの接合されたヒツ ジに対する２次抗体をブロッキング緩衝溶液で１０００倍希釈し、４時間反応させた。反 応の終わったメンブレインを緩衝溶液で洗浄し、アビジン−ビオチン試薬を１時間反応さ せ、再び洗浄した。洗浄されたメンブレインに基質と、発色試薬としてＨ２ Ｏ２ およびＤ ＡＢ溶液を添加して発色させ、Ｓ抗原に対する特異抗体と前記融合タンパク質と間の特異 30 的な結合を確認した（図９のＡ）。図９において、レーン１は形質転換されていない宿主 細胞であるＪＭ１０９を示し、レーン２は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／Ｊ Ｍ１０９を示す。同図に示すように、ｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８プラスミドによって約４ ８ｋＤａの融合タンパク質バンドを確認することができた。 【００８６】 また、Ｓ抗原の中和抗体形成抗原基が大腸菌の表面に位置し発現されることを直接確認す るために、外幕分画法で発現を誘導させた大腸菌の可溶性成分、内膜、外膜などを分離し た後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳ抗原に対する抗体を用いたウエ スタンブロッティングを行って確認した。具体的には、上記方法で融合タンパク質の表面 発現が誘導された大腸菌を、形質転換されていない大腸菌と同じ細胞濃度となるように獲 40 得 し 、 細 胞 を 緩 衝 溶 液 （ １ ０ ｍ Ｍ Ｈ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ ｂ ｕ ｆ ｆ ｅ ｒ ， ｐ Ｈ ７ .４ ） で 数 回 洗 浄 し た後、１０μｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および１ｍＭ ＥＤＴＡが含有され た 緩 衝 溶 液 で 浮 遊 さ せ 、 ４ ℃ で １ ０ 分 間 反 応 さ せ た 後 、 Ｄ Ｎ ａ sｅ （ ０ .５ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ ） と Ｒ Ｎ ａ ｓ ｅ （ ０ .５ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ ） と を 加 え た 後 、 超 音 波 処 理 で 細 胞 を 破 壊 し た 後 、 無 傷 の 大 膓 菌 と 細 胞 残 屑 が ４ ℃ で ２ ０ 分 間 の 遠 心 分 離 （ １ ０ ,０ ０ ０ ｇ ） に よ っ て 分 離 さ れ 、 分 離 さ れ た 大 腸 菌 の 細 胞 残 屑 が ４ ℃ で ２ 時 間 の 遠 心 分 離 （ １ ５ ,０ ０ ０ ｇ ） に よ っ て 大 腸 菌 のペリプラズムと細胞質とのタンパク質を含む分画を得ることができた。得られたペレッ ト を １ ％ サ ル コ シ ル （ Ｎ -ｌ ａ ｕ ｒ ｙ ｌ ｓ ａ ｒ ｃ ｏ ｓ ｉ ｎ ａ ｔ ｅ ， ｓ ｏ ｄ ｉ ｕ ｍ ｓ ａ ｌ ｔ ） を 含 む 緩 衝 溶 液 （ Ｐ Ｂ Ｓ ， ｐ Ｈ ７ .４ ） で 浮 遊 さ せ た 後 、 ４ ℃ で ２ 時 間 の 遠 心 分 離 （ １ ５ ,０ ０ ０ ｇ ） に よ っ て 上 清 液 は 大 腸 菌 の 内 膜 、 ペ レ ッ ト は 大 腸 菌 の 外 膜 の タ ン パ ク 質 50 (17) JP 2006-502732 A 2006.1.26 からその分画を得た後、それぞれの分画をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およ びＳ抗原に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを行ってそれぞれの大膓菌分画 中のＳ抗原の中和抗体形成抗原基が外膜に位置することを確認した（図９ａ；大膓菌メン ブレイン分画ウエスタンブロッティングの結果）。図９において、レーン１は形質転換さ れていないＪＭ１０９を、レーン２は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１ ０９の全細胞を、レーン３は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９の可 溶性分画を、レーン４は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９の内膜分 画を、レーン５は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９の外膜分画をそ れぞれ示す。 【００８７】 10 Ｓ抗原の中和抗体形成抗原基が、ポリ−γ−グルタミン酸合成タンパク質のＣ末端によっ て大腸菌の表面に発現されることを、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ， Ｆｌｕｏｒｅ ｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）で確認した。 【００８８】 免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）染色のために、発現を誘導させた大 腸著菌を同じ細胞濃度となるように獲得し、細胞を緩衝溶液（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ，ｐ Ｈ ７ .４ ） で 数 回 洗 浄 し た 後 、 １ ％ ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン を 含 む 緩 衝 溶 液 １ ｍ ｌ に 浮 遊 さ せ 、Ｓ抗原に対するヒツジ来由のポリクローナル一次抗体を１０００倍希釈し、４℃で１２ 時間反応させた。反応の終わった各細胞を緩衝溶液で数回洗浄し、１％ウシ血清アルブミ ンを含む緩衝溶液１ｍｌに浮遊させた後、ビオチンが結合されている２次抗体を１０００ 20 倍希釈し、４℃で３時間反応させた。更に、反応の終わった細胞は緩衝溶液で数回洗浄し 、 １ ％ ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン が 入 っ て い る 緩 衝 溶 液 ０ .１ ｍ ｌ に 浮 遊 さ せ た 後 、 ビ オ チ ン に 特異的なストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン染色試薬を１０００倍希釈して結合 させた。 【００８９】 反応の終わった大腸菌を数回洗浄してＦＡＣＳで測定した結果、形質転換されていない大 腸菌と比較されるＳ抗原の中和抗体形成抗原基タンパク質が表面に発現することを確認し た（図９のＢ）。同図において、白色は形質転換されていないＪＭ１０９を示し、黒色は 形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９から来由したものを示す。なお、 同図に示すように、形質転換されていない大腸菌ではＳ抗原中和抗体形成基が発現されな 30 かったが、表面発現ベクターによって形質転換された大膓菌ではＳ抗原中和抗体形成基の 表面発現が明らかに確認された。 ＜間接実施例２＞表面発現形質転換ベクターｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８の作製およびＢ型肝 炎ウイルスＳ抗原の中和抗体形成抗原基の表面発現 【００９０】 バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝 子（ｐｇｓＢＣＡ）のうち、ｐｇｓＣとｐｇｓＡとを用いたグラム陰性微生物を宿主とす る表面発現ベクターを製造した。 【００９１】 ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質のうち、ｐｇｓＣとｐｇｓＡ 40 とのＮ末端およびＣ末端を暗号化する遺伝子を得るために、前記全染色体を鋳型として用 い 、 Ｎ 末 端 に は 配 列 １ ０ （ ５ -ｇ ｃ ａ ｃ ａ ｔ ａ ｔ ｇ ｔ ｔ ｃ ｇ ｇ ａ ｔ ｃ ａ ｇ ａ ｔ ｔ ｔ ａ ｔ ａ ｃ ａ ｔ ｃ -３ ） 、 Ｃ 末 端 に は 配 列 １ １ （ ５ -ｃ ｔ ｃ ｇ ｇ ａ ｔ ｃ ｃ ｔ ｔ ｔ ａ ｇ ａ ｔ ｔ ｔ ｔ ａ ｇ ｔ ｔ ｔ ｇ ｔ ｃ ａ ｃ ｔ -３ ） の 塩 基 配 列 を 有 す る オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を プ ライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応を行った。 【００９２】 Ｎ末端に対するプライマーである配列には、発現ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）に存在 する制限酵素ＮｄｅＩの認識部位が存在するように構成した。このとき、増幅された遺伝 子部位は、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質遺伝子であるｐｇ ｓ Ｃ の Ｎ 末 端 部 位 か ら ｐ ｇ ｓ Ａ の Ｃ 末 端 部 位 ま で の 約 １ .６ ｋ ｂ の 大 き さ の 部 位 で あ っ た 50 (18) JP 2006-502732 A 2006.1.26 。 【００９３】 ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された遺伝子を、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで 切断し、既にＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで切断された常時的な高発現ベクターであるｐＨＣ Ｅ１９Ｔ（ＩＩ）に挿入し、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質 の 遺 伝 子 に 終 止 コ ド ン が な く 新 た な 制 限 酵 素 認 識 部 位 の 添 加 さ れ た 新 規 の 約 ５ .３ ｋ ｂ の 大きさのベクターを製造し、これをｐＧＮＣＡと命名した。 【００９４】 ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）の うち、ｐｇｓＣとｐｇｓＡとを用い、グラム陰性微生物を宿主としてＢ型肝炎ウイルスＳ 10 抗原の中和抗体形成抗原基を表面発現することのできる形質転換ベクターｐＧＮＣＡ−Ｈ Ｂ１６８を、上記実施例２と同様の方法で製造した。このようにして製造した形質転換ベ クターｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８を図１０に示した。 【００９５】 前記表面発現ベクターｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８を用い、大膓菌でのＢ型肝炎ウイルスＳ抗 原の中和抗体形成抗原基の発現を調べた。 【００９６】 このために、前記発現ベクターで大膓菌を形質転換させ、上記実施例３と同様の過程で発 現を誘導した後、細胞外膜タンパク質ｐｇｓＣＡと融合したＳ抗原の中和抗体抗原基が大 腸菌で発現することを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳ抗原に対する 20 抗体を用いたウエスタンブロッティングを行って確認した。 【００９７】 図１１において、レーン１は形質転換されない宿主細胞であるＪＭ１０９を示し、レーン ２は形質転換されたｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９を示す。同図に示すように、ｐ ＧＮＣＡ−ＨＢ１６８プラスミドによって約４８ｋＤａの融合タンパク質バンドを確認す ることができた。 【図面の簡単な説明】 【００９８】 【図１】本発明に係るグラム陰性およびグラム陽性微生物を宿主細胞とする表面発現形質 転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）の遺伝子地図である。 30 【図２】ＡおよびＢは、本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ −ＨＰＶ Ｌ１）で形質転換させたサルモネラ菌株および乳酸菌株内において、ｐｇｓＡ と融合したＨＰＶ Ｌ１抗原の融合タンパク質発現の様子を、特異抗体でウエスタンブロ ッティングした写真である。 【図３−ａ】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）で形質転換させたラクトバチルスカゼイ菌株において、抗原基の表面発現が確認さ れた一定量の菌を口腔に一定期間投与したマウスの血清内ＨＰＶ Ｌ１抗原基に対するＩ ｇＧ抗体価の結果を示したグラフである。 【図３−ｂ】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）で形質転換されたラクトバチルスカゼイ菌株において、抗原基の表面発現が確認さ 40 れた一定量の菌を一定期間口腔に投与したマウスの小腸、気管支、肺および膣洗浄液内の ＨＰＶ Ｌ１抗原基に対するＩｇＡ抗体価の結果を示したグラフである。 【図４】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１ ）で形質転換させたラクトバチルスカゼイ菌株において、抗原基の表面発現が確認された 一定量の菌を一定期間口腔に投与した後、マウスの脾臓細胞の細胞毒性Ｔリンパ球の細胞 融解活性の結果を示したグラフである。 【図５】本発明に係るグラム陰性およびグラム陽性微生物を宿主とする表面発現形質転換 ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）の遺伝子地図である。 【図６】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）で形質転換させた乳酸菌株内において、ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｅ７抗原の融 50 (19) JP 2006-502732 A 2006.1.26 合タンパク質発現の様子を、特異抗体でウエスタンブロッティングした写真である。 【図７】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）で形質転換させたラクトバチルスカゼイ菌株における抗原基の表面発現が確認され た一定量の菌を一定期間口腔に投与した後、マウスに腫瘍細胞をチャレンジして経時によ る腫瘍増殖率を測定した結果を示したグラフである。 【図８】本発明に係る間接実施例において、表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡおよび形質転 換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８の遺伝子地図である。 【図９−ａ】本発明に係る間接実施例において、表面発現形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ −ＨＢ１６８で形質転換させたグラム陰性微生物におけるＢ型肝炎ウイルスの表面抗原基 タンパク質の表面発現を示すウエスタンブロッティング写真およびＦＡＣＳによる測定結 10 果グラフである。 【図９−ｂ】本発明に係る間接実施例において、表面発現形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ −ＨＢ１６８で形質転換させたグラム陰性微生物におけるＢ型肝炎ウイルスの表面抗原基 タンパク質の表面発現を示すウエスタンブロッティング写真およびＦＡＣＳによる測定結 果グラフである。 【図１０】本発明に係る間接実施例において、表面発現ベクターｐＧＮＣＡおよび形質転 換ベクターｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８の遺伝子地図である。 【図１１】図１１ａおよび図１１ｂは、本発明に係る間接実施例において、表面発現形質 転換ベクター（ｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８：Ａ２，ｐＧＮＡ−ＨＢ１６８：Ａ３、およびｐ ＧＮＨＢ−Ａ：Ａ４）で形質転換させたグラム陰性微生物におけるＢ型肝炎ウイルスの表 面抗原基タンパク質の表面発現を示すウエスタンブロッティング写真およびＦＡＣＳによ る測定結果グラフである。 【配列表】 20 (20) JP 2006-502732 A 2006.1.26 10 20 30 40 (21) JP 2006-502732 A 2006.1.26 10 20 30 (22) JP 2006-502732 A 2006.1.26 10 20 30 40 (23) JP 2006-502732 A 2006.1.26 10 20 30 40 (24) JP 2006-502732 A 2006.1.26 10 20 30 (25) JP 2006-502732 A 2006.1.26 10 20 30 (26) JP 2006-502732 A 2006.1.26 10 【図１】 【図２】 (27) 【図３−ａ】 【図３−ｂ】 【図４】 【図６】 【図５】 JP 2006-502732 A 2006.1.26 (28) 【図７】 【図９−ａ】 【図８】 JP 2006-502732 A 2006.1.26 (29) 【図１０】 JP 2006-502732 A 2006.1.26 (30) 【国際調査報告】 JP 2006-502732 A 2006.1.26 (31) JP 2006-502732 A 2006.1.26 (32) JP 2006-502732 A 2006.1.26 (33) JP 2006-502732 A 2006.1.26 フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 14/025 (2006.01) (2006.01) テーマコード（参考） Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/025 (81)指定国 AP(GH,GM,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT, BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IT,LU,MC,NL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA, GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ, EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,M W,MX,MZ,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,YU,ZA ,ZM,ZW (72)発明者 スング，ムーン−ヒー 大韓民国 ３０５−３０１ テジョン，ユセオン−グ，ボンミョン−ドン，５３８−８，ドン−エ ー ベンチャー ビルディング ９０８ ホ (72)発明者 プー，ハ−リョウン 大韓民国 ３０２−１２１ テジョン，セオ−グ，ダンサン−ドン，オナー ヴィル，１６１９ ホ (72)発明者 リー，ジョン−ソウ 大韓民国 ３０５−３０８ テジョン，ユセオン−グ，ジャンダエ−ドン，３０７−１１ (72)発明者 ジュン，チャン−ミン 大韓民国 １５８−８１１ ソウル，ヤンチェオン−グ，モック３−ドン，６１８−１３ (72)発明者 ホン，セウン−ピョ 大韓民国 ３０５−７５１ テジョン ユセオン−グ，ソンガン−ドン，ソンガン グリーン ア パートメント ３１０−１５０３ (72)発明者 キム，チュル−ジューン 大韓民国 ３０５−３４５ テジョン ユセオン−グ，シンセオン−ドン，ハンウール アパート メント １０３−８０１ (72)発明者 パク，スエ−ニエ 大韓民国 １２０−０９０ ソウル セオダエムーン−グ，ホンジェ−ドン，インワンサン ヒュ ンダイ アパートメント １０３−２０２ (72)発明者 ピョ，ヒュン−ミ 大韓民国 ３０２−７４４ テジョン，セオ−グ，サムチェオン−ドン，ガラム アパートメント ２−９０１ Ｆターム(参考) 4B024 AA01 BA07 BA32 CA02 CA07 DA05 DA06 DA07 EA04 4B065 AA01X AA15X AA15Y AA26X AA30X AA36X AA46X AA49X AA53X AA55X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA27 CA45 4C084 AA02 AA03 BA44 CA01 CA53 DA01 MA52 MA56 MA59 MA66 NA14 ZA812 ZB092 ZB262 ZB332 4C085 AA03 BA76 BB11 CC08 DD62 EE01 GG04 GG06 GG08 4H045 AA11 AA20 AA30 BA41 CA01 CA11 EA31 FA74