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第2回 糸状菌類の簡便で安全な凍結保存法
Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006. p. 105 110 連載「微生物資源の保存技術講座」 Vol. 22, No. 2 Ｎ２ 第 2 回 糸状菌類の簡便で安全な凍結保存法 岡田 元 独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室 〒351-0198 埼玉県和光市広沢 2-1 Cryopreservation methods for filamentous fungi: Simple and safety techniques Gen Okada Microbe Division / Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198, Japan 1．はじめに に述べる器具は必要に応じて適当な容器に入れ，乾熱 筆者は主として子嚢菌類と子嚢菌系不完全菌類，さ またはオートクレーブ滅菌する．さらに，無菌操作は らに一部の異担子菌類，担子菌系不完全菌類，接合 クリーンベンチなどで行う． 菌類の菌株保存に携わってきたが，担子菌類の代表格 であるハラタケ類や凍結保存が極めて困難な鞭毛菌類 2．凍結保存法 についてはその経験がほとんどない．そのため，本 1）培養 稿では糸状菌類全般に関する菌株保存の解説はできな 糸状菌類に限ったことではないが，千差万別の種や いが，幸いなことに，凍結保存，凍結乾燥，L-乾燥， 株ごとにできるだけ適した培養方法を用いることが肝 流動パラフィン重層などの微生物株の代表的な長期 要である．実際にはなかなか難しいことであるが，以 保存法については既に優れた解説がある（Kirsop ＆ 下に，一般的な要点や特殊な例を列記し，参考として Doyle，1991; Malik，1992; 根井，1977；農林水産省 供したい． 農林水産技術会議事務局 , 農林水産省農業環境技術 ・凍結保存は菌糸のみで増殖する菌群にも適用可能だ 研 究 所，1987；Simione ＆ Brown，1991; Smith ＆ が，分散能力のある胞子や耐久性のある厚膜胞子な Onions，1994） ．詳細については，必要に応じてこれ どを可能な限りつくらせるに越したことはない．こ らをご覧いただきたい． れに適した培地や培養条件を検討することが，凍結 本稿では，胞子（分生子や子嚢胞子など）を形成せ 保存の成否に直結する重要なポイントの一つであ ず，菌糸のみで生育する高等菌類（子嚢菌類，担子 る． 菌類，不完全菌類）や接合菌類の長期保存法として簡 ・培地は一般的に寒天培地が多用され，合成培地より 便かつ信頼性があり，さらに通常の研究施設で実施可 も天然培地（オートミール寒天培地，コーンミール 能な凍結保存法について，筆者が会得したこつや工夫 寒天培地，ジャガイモ寒天培地，麦芽寒天培地など） を含めた基本技術を紹介したい．胞子を多数形成する 糸状菌類にのみ適用可能で，郵送が容易な凍結乾燥や の方が適している． ・好稠性菌類に対しては糖などを多量に添加し L-乾燥（坂根ら，1996）の技術は，酵母や細菌などの 他の微生物群で用いられているものと基本的に同じな た 培 地 を 用 い る こ と は 当 然 で あ る が， 例 え ば， （アナモルフは ので，その紹介は「微生物資源の保存技術講座」（岡 ）では培地に対する厳密な管理が要求 根 , 2006）の他項などに譲ることとする．なお，以下 される．すなわち，本種に対しては M60Y などの 寒天培地の表面を完全に乾かす必要があり，干から E-mail: [email protected] びる寸前になった斜面培地上部にのみ閉子嚢殻をつ ─ 105 ─ 糸状菌類の凍結保存法 岡田 元 くる（他の部位では胞子発芽や菌糸生育さえみられ 成についてさまざまな報告があるが，以下にいく ない） ．干からびかけた培地を常備できない場合は， つかのカルチャーコレクションにおける使用例を示 斜面培地やシャーレ（後者の場合は滅菌した紙箱に 入れる）をバッチ式真空乾燥機で様子を見ながら急 す． CBS: 10％グリセロール; −135℃/LN2（Gams 速乾燥させるとよい． ., 1998） ・培地に滅菌した天然基質を添加し（基質添加後に培 ATCC: 10％グ リ セ ロ ー ル，5％DMSO；−150℃/ 地を滅菌することも多い） ，菌を生育させた後に， LN2（Alexander その基質ごと定法により凍結保存すると生残性が上 1991） がることがある．基質が胞子形成を誘導したり，そ IMI/CABI: 10％ グ リ セ ロ ー ル; LN2（Smith ＆ れ自体が保護剤の役目を果たしたりするのであろ う．基質としては，植物の茎，葉，種子などさまざ ., 1980; Simione ＆ Brown， Onions，1994） IFO/NBRC: 10％グリセロール＋ 5％トレハロース; まなものが考えられる． −80℃/LN2 ・培養期間の目安は一概には言えないが，筆者はコ JCM: 10％グリセロール/DMSO ＋ 5％トレハロース; ロニーがシャーレ全面に広がる少し前までには保存 −80℃/LN2 処理を行うように心がけている．種によっては，菌 筆者はトレハロースぬきの 10％グリセロールと 糸がシャーレの蓋の隙間からはみ出るほど生育が 10％DMSO を長年使用してきたが，5％トレハロー 旺盛なものもある．このようなものを含む複数株の スの保護効果を聞き（中桐 昭，私信），数年前より 保存処理を同時に行う場合は，汚染を防ぐために 添加している．当初はどの保護剤がよいか分からず， アルコール綿などでクリーンベンチをこまめに除菌 10％のグリセロールと DMSO の 2 本立てで凍結保存 清掃することはもちろんであるが，準備段階から を始め，そのまま現在に至っているというのが本音で 培養プラスチックシャーレを 1 枚ずつパラフィルム ある．しかし，取り扱った菌群は限られているもの （Parafilm M）などでシールし，シャーレの大きさ の，ほとんどの場合（ハラタケ類の一部はうまく凍結 にあったポリプロピレン容器やスチロール容器に入 保存できない），どちらの保護剤でも問題なく保存で れて培養するなどの配慮が必要である．さらに，株 きている．また，少例ではあるが，以下の菌種/菌株 ごとの生育度合いを確認しながら，同程度の速度の で，保護剤により顕著な保護効果の差が見られたこと 株を選んで保存する．生育の遅い菌に関しては，コ は大変興味深い： ロニーがシャーレ全面に広がる前であっても，あま JCM 13154, JCM 13541（10％グリセ り古くならない適当な時期を見はからって保存処理 ロールで生残；10％DMSO で死滅）; sp. すべきである．長期培養するとむしろ活きが悪くな JCM 11504， り，保存性が低下することを経験しているため，筆 DMSO で生残；10％グリセロールで死滅）．この様に， 者の場合は最長でも 1 ヶ月半程度の培養を目安とし 簡単な組成の 2 種類の保護剤を用いるだけでも，死滅 ている．このような生育の極めて遅いものでは，菌 の危険を減らす大きな効果が得られる場合がある． sp．JCM 11505（10％ をできるだけシャーレ全体に広げて接種すれば十分 な量の保存材料が得られる． 3）手順と関連情報 ① 10％グリセロールと 10％DMSO を必要な本数の凍 2）保護剤（凍害防止剤） 結チューブ（Nunc 363401, 容量 1.8 m ，インナー ① 10％（v/v）グリセロール＋ 5％（w/v）トレハロー キャップ式; Nunc A/S，Roskilde，Denmark）に ス水溶液（トレハロース：商品名 とれはのいのち， 1 m ずつ無菌的に分注する． （株）林原，岡山）をメディウム瓶や試験管などに 凍結チューブの蓋の形状に関しては，アウター 分注し，オートクレーブ滅菌する（以下，特に言及 キャップ型の方が汚染し難いと思われるが，Nunc しない限り，10％グリセロールと略記） ． 社の製品に関しては，インナーキャップ型の方がネ ② 10％（v/v）ジメチルスルホキシド＋ 5％（w/v） ジやシリコンパッキンの具合がよいと思われる．操 トレハロース水溶液を同様に調製する（以下，同様 作性が総合的に優れていると判断し，筆者はイン に，10％DMSO と略記） ． ナーキャップ型を使用している． 保護剤は凍結保存にとって極めて重要である．組 IFO/NBRC では保護剤を凍結チューブに分注し ─ 106 ─ Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006 Vol. 22, No. 2 ステンレス棒 （ステンレスチューブ内側の棒） 先端が鋭利な ステンレスチューブ 菌糸と（厚膜）胞子 菌糸のみ ミクロスパーテル 1 凍結チューブ 3 2 コロニー ’ 打ち抜いた コロニーディスク (直径約6mm) 1 10% glycerol + 10% DMSO + 5% trehalose 5% trehalose 4 保護剤への十分な浸漬 (4℃, 数時間)) → 凍結 （-80℃） 図 1 糸状菌類の凍結保存： コロニーパンチ法 作業手順： 1/1' → 2 → 3 → 4 と進む． E D D A&B B A 図 3 Transfertube（Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA） ポリプロピレン製，直径 6 mm のコルクボーラー様で， オートクレーブ滅菌の繰り返しが可能（最下段は 5 回 オートクレーブ滅菌したもの）． C 図 2 糸状菌類の凍結保存（コロニーパンチ法）に用い る器具の一例 A：先端が鋭利なステンレスチューブ，B：ステンレス 棒（ステンレスチューブ内側の棒），C：ミクロスパー テル，D：コロニーディスクを凍結チューブに移動した 後の糸状菌コロニー，E：凍結チューブ用のステンレス 製ラック． リセロールを添加した適当な寒天培地で菌を培養 し，コロニー外縁をストローで打ち抜いたものを凍 結チューブに直接入れて凍結する方法を紹介してい る．しかし，筆者の経験では，彼も述べているよう に浸透圧の関係で生育の悪い株もあり，全てに適用 た後，オートクレーブ滅菌して使用しているが，こ の点に関しては，利用者の都合に合わせて材質劣化 できる方法ではない． ② 適当な状態に生育した菌株のコロニーを，先端を などの事前検討後に自由に選択すればよい． 鋭利にしたステンレスチューブで打ち抜く（コロ Hoffman（1989; Malik, 1992，WFCC Technical ニーパンチ法； 図 1-1，図 2-D）．白金耳やメスな Information Sheet No. 5 を参照）は 5％（w/v）グ どを用いて適当な大きさのコロニー片を切り出して ─ 107 ─ 糸状菌類の凍結保存法 岡田 元 である． A ③ ミクロスパーテルを用いて（図 1-2，図 2-C） ，保 護剤 1 m 入りの凍結チューブに打ち抜いたコロ ニーディスクを 5 枚程度入れる（寒天培地の厚さ の目安： 直径 9 cm シャーレに 20 m 程度の培地を まいた厚さ）．キャップをしっかり閉め，保護剤を 菌体に馴染ませるために手で数回激しく振る．コロ ニーディスクが保護剤に完全に浸っていることを確 認し（図 1-3），適当なラックに並べる（図 2-E） ． なお，保護剤の項で述べたように，筆者は 10％ グリセロールと 10％DMSO の 2 種類の保護剤を各 菌株に対して用いている（ミクロスパーテルは保 護剤ごとに使い分ける）．凍結チューブにおける保 護剤の簡便識別には，クライオカラーコード（色つ きキャップカバー，Nunc A/S）が便利である（図 1-3）． ④ コロニーディスクの入った凍結チューブをラック ごと，4℃に数時間（オーバーナイトすることもある） 静置し，保護剤を菌糸や胞子にできるだけ浸透させ る（図 1-4）． ⑤ −80℃の作業用ディープフリーザーに予め入れた 発泡ポリスチレン（発泡スチロール）容器（厚さ 図 4 凍結保存に用いる容器の一例 A: 発泡ポリスチレン容器，厚さ約 4 cm，B: BICELL Bio Freezing Vessel（日本フリーザー（株），東京） ，C: Mr. Frosty - NALGENE Cryo 1℃ Freezing Container （Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA）． 約 4 cm）に，凍結チューブをラックごと入れ（図 4-A），蓋を閉めて凍結する（冷却速度の詳細は不 明）．数時間放置し，完全に凍結したら，凍結チュー ブを保存用の−80℃ディープフリーザーや液体窒素 タンク（約−170℃の気相）に移し替え，長期保存 もよい．コロニーより打ち抜いたディスク（以下， に備える．当然ながら，停電対策，液体窒素の供給， コロニーディスクと略記）がステンレスチューブ内 凍結標品のバックアップについても十二分に配慮し に入ってしまった場合は，対になったステンレス棒 なくてはならない． で押し出す（図 1-1'，図 2-A, B） ．なお，成書では ④，⑤の行程においては，発泡ポリスチレン容 活きのよいコロニー周辺部（菌糸の先端）を打ち抜 器の代わりに，市販の簡便緩慢凍結保存容器（冷却 くように書かれているが，筆者の経験では，より成 速度は−0.6℃/min 程度と思われる）の BICELL - 熟して分生子などの胞子や厚膜胞子を多く形成して Bio Freezing Vessel（日本フリーザー（株） ，東 いる内側の部分も保存した方がよい（図 1） ．Nishii 京；図 4-B）や Mr. Frosty - NALGENE Cryo 1℃ ＆ Nakagiri（1991）も卵菌類（現在では菌類から Freezing Container（Nalge Nunc International 除外されている）に関して同様に報告している． Corp., Rochester, NY, USA; 図 4-C）を使用しても ステンレスチューブやコルクボーラーの代替え品 よい．その場合，凍結チューブを容器に入れ，指 として，形状の良く似た直径 6 mm，ポリプロピレ 示書に従って保護剤の浸透や予備冷却を行った後 ン製の Transfertube（Spectrum Laboratories, Inc., に，−80℃作業用ディープフリーザーで凍結する． Rancho Dominguez, CA, USA; 図 3）がお勧めであ なお，本稿では述べないが，鞭毛菌類などの保存が る〈http://www.spectrapor.com/1/3/8.html〉．コ 難しい菌群については，プログラムフリージングす ロニーが緻密で硬いものにもほぼ問題なく使えるで る必要があろう． あろう．本来は使い捨てであるが，オートクレーブ 滅菌を 5 回繰り返しても何ら変化なく，再利用可能 ─ 108 ─ Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006 1 2 Vol. 22, No. 2 い場合は冷蔵庫（4℃）で保存して，数日以内に指定 3 培地に移植する． 凍結解凍標品の開封は以下の手順で行う: 1）チュー ブのキャップがしっかり閉まっていることを確認し， チューブ表面，特にキャップのパッキン部をアルコー ル綿（70％消毒用エタノール）で殺菌する; 2）輸送中 にチューブ内が陽圧になる場合があるので，念のため 乾熱滅菌ガーゼや脱脂綿などでパッキン部を覆い（ア ルコール綿は使用しない），無菌環境下でキャップを 図 5 凍結解凍標品の梱包手順 1：キャップパッキン部をパラフィルムで巻く． 2：ビニール袋に入れる． 3：エアーキャップ（プチプチ・エアパッキン）で包む． 徐々にゆるめる．この時，チューブ内の保護剤が噴出 してしまったら，再度キャップを硬くしめ，アルコー ル綿でパッキン部を再度殺菌し，アルコール分を蒸発 させた後に，キャップを開ける; 3）コロニーディスク をミクロスパーテルで取り出し，指定培地に移植して 4）復元 培養する． 凍結標品を取り扱う場合は専用手袋を着用し，素手 や軍手などでは行わない．また，液体窒素タンクから 3．おわりに の取り出しに際しては，気相保存の場合でも念のため ひとことに糸状菌類と言っても，分類，系統，生 フェイスマスクをつけて行う． 態，生理などの観点からみて実にさまざまなものがあ 急速解凍する装置としては湯浴が一般的だが，筆 る．我々に身近な麹菌などは保存が容易なものが多い 者は汚染防止のため，凍結チューブの径に合ったア が，植物や動物などに寄生・共生する菌類は培養や保 ルミブロックを装着したドライバスを使用している． 存が困難なものが普通である．また，たとえ培養でき コロニーディスクが 5 枚入った凍結チューブの場合， ても，性状を変えずに長期保存することは容易ではな 40℃，4 分程度で解凍している．ディスク枚数が少な い．本稿で紹介した糸状菌類の簡便凍結保存法は初歩 いチューブでは解凍時間を短くし，氷粒が消失した時 的な内容であるが，読者自らがいろいろな局面に対応 点で終了する． しながら改良し，その技術や経験を菌株同様に後世に 凍結保存における微生物の生残の可否は，凍結条件 受け継いでいただきたい．不幸にも死滅した株は二度 だけでなく，解凍条件も深く関与していると思われ とは生き返らないが，我々が微生物の性質をよく理解 る．解凍温度は 35 40℃が一般的であるが，Nishii ＆ すれば，同じような環境から同じ種を再分離できるこ Nakagiri（1991）は卵菌類において，IFO でそれまで ともある．保存技術や機器の開発と共に，多様な自然 用いられた条件（40℃，3 分）よりは，30℃，5 分の 環境もできるだけ維持したいものである．本講座が微 方が復元率は高かったと報告している． 彼らはその後， 生物株保存に従事する方々にとって多少なりとも役立 同じ解凍条件を担子菌類などにも適用している． てば，筆者らにとって望外の喜びである． 当然，培養の項で述べたように，復元時の培養条件 にも十分注意する必要がある． また， 初回の復元チェッ 謝 辞 クの時期は，その凍結標品が死滅している可能性もあ 的 確 な 情 報 や 助 言 を 終 始 い た だ い た 中 桐 昭 ることを考慮し，あまり遅くならない方がよい． 博 士（（ 独 ）製 品 評 価 技 術 基 盤 機 構 ）， な ら び に Transfertube に関する情報やサンプルをご提供いた 5）凍結解凍標品の輸送と開封 だいた Dr. Gerald Bills（Merck Sharp ＆ Dohme de 上述の手順で作製，解凍した糸状菌類の凍結解凍標 España）に感謝いたします． 品を郵送する方法（Ito, 1993; コロニーディスク 2 枚 を 10％グリセロールで保存したもの；図 5）が極めて 文 献 有効である．国内のみならず，海外にも航空便で送る Alexander, M., Daggett, P.M., Gherna, R., Jong, S., ことができる．1 週間程度は解凍された状態で問題な く保つことができ，もしも到着後に直ちに復元できな ─ 109 ─ Simione, F. ＆ Hatt, H. (1980). American Type Culture Collection Methods. I. Laboratory Manual 糸状菌類の凍結保存法 岡田 元 on Preservation: Freezing and Freeze-drying as of oomycetous fungi in liquid nitrogen. IFO Res. Applied to Algae, Bacteria, Fungi and Protozoa. Comm. 15: 105-118. American Type Culture Collection, Rockville. 農林水産省農林水産技術会議事務局，農林水産省農業 Gams, W., Hoekstra, E.S. ＆ Aptroot, A. (eds.) 環境技術研究所（編） （1987）．微生物の長期保存法− (1998). CBS Course of Mycology, fourth edition. 農林水産関連．農林水産省農林水産技術会議事務局， Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn. 東京；農林水産省農業環境技術研究所，筑波． Ito, T. (1993). A simple method for the transport of 岡根 泉（2006）．連載にあたって．日本微生物資源 fungal cultures stored by freezing. Bull. JFCC 9: 9-12. 学会誌 22：35． 坂根 健，西井忠止，伊藤忠義，見方洪三郎（1996） ． Kirsop, B.E. ＆ Doyle, A. (1991). Maintenance of L-乾燥法による微生物株の長期保存法 . 日本微生物 Microorganisms and Cultured Cells: A Manual of Laboratory Methods, second edition. Academic 資源学会誌 12：91-97. S i m i o n e , F . P . ＆ B r o w n , E . M . (1991) . A T C C Press, London. 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