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アスパラギン酸 -β -セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が増強するよう
JP 2007-513601 A 2007.5.31 (57)【 要 約 】 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 活 性 が 増 強 す る よ う に 改 変 さ れ た エ シ ェ リ ヒ ア 属 に 属 す る 細 菌 を 用 い る L-ス レ オ ニ ン の 製 造 方 法 を 開 示 す る 。 (2) JP 2007-513601 A 2007.5.31 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 活 性 が 増 強 す る よ う に 改 変 さ れ た 、 エ シ ェ リ ヒ ア 属 に 属 す る L-ス レ オ ニ ン 生 産 細 菌 。 【請求項２】 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 活 性 が 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を上昇させることにより増強している請求項１ 記載の細菌。 【請求項３】 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 活 性 が 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ 10 アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、又は、前記遺伝子の発 現調節配列を遺伝子発現が上昇するように改変することにより、増強している請求項１記 載の細菌。 【請求項４】 前記遺伝子を含むベクターにより前記細菌を形質転換することによりコピー数が増加して いる請求項３記載の細菌。 【請求項５】 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 が 、 エ シ ェ リ ヒ ア 属 細 菌 に 由 来する請求項２記載の細菌。 【請求項６】 20 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 が 下 記 の 群 か ら 選 択 さ れ る タ ンパク質をコードする請求項５記載の細菌。 (A) 配 列 番 号 ２ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む タ ン パ ク 質 、 及 び 、 (B) 配 列 番 号 ２ の ア ミ ノ 酸 配 列 に お い て 、 １ 又 は 数 個 の ア ミ ノ 酸 の 欠 失 、 置 換 、 挿 入 又 は 付 加 を 含 む ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 み 、 か つ 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ーゼ活性を有するタンパク質。 【請求項７】 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 が 下 記 の 群 か ら 選 ば れ る Ｄ Ｎ Ａを含む請求項５記載の細菌。 (a) 配 列 番 号 １ に お け る 塩 基 番 号 １ ∼ １ １ ９ ６ の 塩 基 配 列 を 含 む Ｄ Ｎ Ａ 、 及 び 、 30 (b) 配 列 番 号 １ に お け る 塩 基 番 号 １ ∼ １ １ ９ ６ の 塩 基 配 列 、 又 は 、 同 塩 基 配 列 か ら 調 製 さ れ得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アスパラギン酸β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ 。 【請求項８】 ス ト リ ン ジ ェ ン ト な 条 件 が 、 60℃ で 、 １ × SSC及 び 0.1％ SDSの 塩 濃 度 で 15分 洗 浄 を 行 う こ とを含む請求項７記載の細菌。 【請求項９】 さらに、下記の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されている請 求項１記載の細菌。 スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲ 40 ナ ー ゼ Ｉ を コ ー ド す る 変 異 thrA遺 伝 子 、 ホ モ セ リ ン キ ナ ー ゼ を コ ー ド す る thrB遺 伝 子 、 ス レ オ ニ ン シ ン タ ー ゼ を コ ー ド す る thrC遺 伝 子 、 及 び 、 推 定 膜 貫 通 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る rhtA遺 伝 子 。 【請求項１０】 変 異 thrA遺 伝 子 、 thrB遺 伝 子 、 thrC遺 伝 子 及 び rhtA遺 伝 子 の 発 現 が 上 昇 す る よ う に 改 変 さ れている請求項９記載の細菌。 【請求項１１】 請 求 項 １ 記 載 の 細 菌 を 培 地 で 培 養 し 、 培 地 中 に L-ス レ オ ニ ン を 蓄 積 せ し め 、 培 養 培 地 か ら L-ス レ オ ニ ン を 採 取 す る こ と を 含 む L-ス レ オ ニ ン の 製 造 法 。 50 (3) JP 2007-513601 A 2007.5.31 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 本 発 明 は 、 発 酵 に よ る L-ア ミ ノ 酸 の 製 造 方 法 に 関 し 、 詳 し く は 、 こ の 発 酵 を 促 進 す る エ シ ェ リ ヒ ア ・ コ リ 由 来 の 遺 伝 子 に 関 す る 。 本 遺 伝 子 は 、 L-ア ミ ノ 酸 生 産 、 具 体 的 に は 例 え ば L-ス レ オ ニ ン 生 産 の 改 良 に 有 用 で あ る 。 【背景技術】 【０００２】 従 来 、 L-ア ミ ノ 酸 は 、 天 然 か ら 得 ら れ た 微 生 物 株 、 又 は 、 L-ア ミ ノ 酸 の 生 産 収 率 が 増 強 するように改変されたその変異体を用いる発酵法により工業的に生産されている。 10 組 換 え DNAに よ る 微 生 物 の 形 質 転 換 (例 え ば 、 米 国 特 許 4,278,765参 照 )な ど の 、 L-ア ミ ノ 酸の生産収率を増強するための多くの技術が報告されている。生産収率を増強する他の技 術 に は 、 ア ミ ノ 酸 生 合 成 に 関 与 す る 酵 素 の 活 性 を 上 昇 さ せ る こ と 、 及 び ／ 又 は 、 生 じ る Lア ミ ノ 酸 に よ る フ ィ ー ド バ ッ ク 阻 害 に 関 し 目 的 酵 素 を 非 感 受 性 に す る こ と が あ る (例 え ば 、 WO 95/16042又 は 米 国 特 許 4,346,170; 5,661,012及 び 6,040,160)。 【０００３】 発 酵 に よ る L-ス レ オ ニ ン の 生 産 に 有 用 な 株 と し て は 、 L-ス レ オ ニ ン 生 合 成 に 関 与 す る 酵 素 の 活 性 が 上 昇 し た 株 (米 国 特 許 5,175,107; 5,661,012; 5,705,371; 5,939,307; EP02190 27)、 L-ス レ オ ニ ン 及 び そ の ア ナ ロ グ な ど の 化 学 物 質 に 耐 性 の 株 (WO0114525A1, EP301572A 2, US 5,376,538)、 生 産 さ れ る L-ア ミ ノ 酸 又 は そ の 副 生 物 に よ る フ ィ ー ド バ ッ ク 阻 害 が 解 20 除 さ れ た 目 的 酵 素 を 有 す る 株 (米 国 特 許 5,175,107; 5,661,012)、 不 活 性 化 さ れ た ス レ オ ニ ン 分 解 酵 素 を 有 す る 株 (米 国 特 許 5,939,307; 6,297,031)な ど が 知 ら れ て い る 。 【０００４】 既 知 の ス レ オ ニ ン 生 産 株 VKPM B-3996 (米 国 特 許 5,175,107及 び 5,705,371)が 、 現 在 知 ら れ て い る 最 も 優 れ た ス レ オ ニ ン 生 産 株 で あ る 。 VKPM B-3996の 構 築 の た め 、 下 記 に 記 載 す る よ う に 、 い く つ か の 変 異 及 び プ ラ ス ミ ド が 、 親 株 の E. coli K-12 (VKPM B-7)に 導 入 さ れ た 。 変 異 thrA遺 伝 子 (変 異 thrA442)は 、 ス レ オ ニ ン に よ る フ ィ ー ド バ ッ ク 阻 害 に 非 感 受 性 の ア ス パ ル ト キ ナ ー ゼ ホ モ セ リ ン デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ Ｉ を コ ー ド す る 。 変 異 ilvA遺 伝 子 ( 変 異 ilvA442) は 、 活 性 の 低 下 し た ス レ オ ニ ン デ ア ミ ナ ー ゼ を コ ー ド し 、 そ の 結 果 、 イ ソ ロ イ シ ン 生 合 成 の 速 度 が 低 下 し 、 イ ソ ロ イ シ ン 飢 餓 に 対 し リ ー キ ー (leaky)な 表 現 型 を 示 30 す 。 ilvA442変 異 を 有 す る 細 菌 で は 、 thrABCオ ペ ロ ン の 転 写 が イ ソ ロ イ シ ン で 抑 制 さ れ ず 、 従 っ て 、 ス レ オ ニ ン 生 産 に 極 め て 効 率 が よ い 。 tdh遺 伝 子 の 不 活 性 化 は 、 ス レ オ ニ ン 分 解 を 防 止 す る 。 サ ッ カ ロ ー ス 資 化 の 遺 伝 決 定 因 子 (scrKYABR遺 伝 子 )が 前 記 株 に 移 さ れ た 。 ス レ オ ニ ン 生 合 成 を 調 節 す る 遺 伝 子 の 発 現 を 上 昇 さ せ る た め 、 変 異 ス レ オ ニ ン オ ペ ロ ン th rA442BCを 含 む プ ラ ス ミ ド pVIC40が 中 間 体 TDH6株 に 導 入 さ れ た 。 こ の 株 の 発 酵 中 に 蓄 積 す る L-ス レ オ ニ ン の 量 は 85 g/lに も な り 得 る 。 【０００５】 本 発 明 者 ら は 、 E. coli K-12に 関 し 、 最 少 培 地 に お い て 高 濃 度 の ス レ オ ニ ン 又 は ホ モ セ リ ン に 耐 性 の 変 異 体 thrR (以 下 、 rhtA23と も い う )を 得 た (Astaurova, O.B. et al., Appl . Bioch. and Microbiol., 21, 611-616 (1985))。 そ の 変 異 は 、 VKPM B-3996株 の よ う な 40 、 E. coliの 生 産 菌 に よ る L-ス レ オ ニ ン (SU特 許 974817)、 ホ モ セ リ ン 、 及 び 、 グ ル タ ミ ン 酸 (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. and Microbiol., 27, 556-561, 1991, EP 10 13765 A)の 生 産 を 改 善 す る 。 さ ら に 、 本 発 明 者 ら は 、 rhtA遺 伝 子 が 、 E. coliの 染 色 体 の 1 8分 に 、 グ ル タ ミ ン 輸 送 系 の 構 成 要 素 を コ ー ド す る glnHPQオ ペ ロ ン に 近 接 し て 存 在 す る こ と 、 及 び 、 rhtA遺 伝 子 が 、 pexB遺 伝 子 と ompX遺 伝 子 と の 間 に 位 置 す る ORF1(ybiF遺 伝 子 , G enBankア ク セ ッ シ ョ ン 番 号 AAA218541に お け る 764∼ 1651, gi:440181)と 同 一 で あ る こ と を 明 ら か に し た 。 ORF1に よ り コ ー ド さ れ る タ ン パ ク 質 を 発 現 す る 単 位 は 、 rhtA (rht: ホ モ セ リ ン 及 び ス レ オ ニ ン に 耐 性 )遺 伝 子 と 名 づ け ら れ た 。 ま た 、 本 発 明 者 ら は 、 rhtA23変 異 が ATG開 始 コ ド ン に 対 し -1の 位 置 の G→ A置 換 で あ る こ と を 見 い 出 し た (ABSTRACTS of 17 t h International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 50 (4) JP 2007-513601 A 2007.5.31 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biol ogy, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457; EP 1013765 A)。 【０００６】 主流のスレオニン生合成経路が最適化された条件下におけるスレオニン生産株の改良は 、アスパラギン酸のような、スレオニンから離れた前駆体の量を増加させることによって なし得る。 【０００７】 アスパラギン酸は、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸（スレオニン、メチオニン、 リジン）、及び、細菌細胞壁の構成成分であるジアミノピメリン酸の炭素の供与体である 10 ことが知られている。これらの合成は、いくつかの分岐点及び極めて感受性の調節機構を 有する複雑な経路により行われる。分岐点（アスパラギン酸、アスパラギン酸セミアルデ ヒド、ホモセリン）では、この生合成段階から誘導されるアミノ酸と同数のアイソザイム が 存 在 す る 。 thrABCオ ペ ロ ン の 一 部 に よ り コ ー ド さ れ る ア ス パ ル ト キ ナ ー ゼ ホ モ セ リ ン デ ヒドロゲナーゼＩは、スレオニン生合成の第１及び第３の反応を生じさせる。スレオニン 及びイソロイシンは、アスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩの発現を調節し 、 ス レ オ ニ ン は 、 上 記 反 応 を 触 媒 す る 活 性 を 共 に 阻 害 す る (Escherichia coli and Salmon ella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C. , 1996)。 【０００８】 20 asd遺 伝 子 は 、 リ ジ ン 、 メ チ オ ニ ン 、 ス レ オ ニ ン 及 び ジ ア ミ ノ ピ メ リ ン 酸 の 生 合 成 経 路 の キ ー 酵 素 で あ る ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ (Asd; EC 1.2.1. 11)を コ ー ド す る 。 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ は 、 NADPの 還 元 を 伴 っ て 、 L-ア ス パ ル チ ル -4-Pを L-ア ス パ ラ ギ ン 酸 セ ミ ア ル デ ヒ ド に 可 逆 的 に 変 換 す る 。 ア ス パ ラ ギ ン 酸 フ ァ ミ リ ー の ア ミ ノ 酸 で あ る L-リ ジ ン の 生 産 に 対 す る asd遺 伝 子 の 増 幅 の 効 果 が 知 ら れ て い る (米 国 特 許 6,040,160)。 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ が 、 コ リ ネ 型 細 菌 に よ り L-リ ジ ン 、 L-ス レ オ ニ ン 及 び L-イ ソ ロ イ シ ン の 生 産 に 有 用 な こ と も 知 ら れ て い る (EP 0219027 A)。 【０００９】 し か し 、 L-ス レ オ ニ ン の 生 産 の た め に 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ 30 ナーゼ活性が増強されたエシェリヒア属に属する細菌を用いることは現在まで報告されて いない。 【発明の開示】 【発明が解決しようとする課題】 【００１０】 本 発 明 の 課 題 は 、 L-ス レ オ ニ ン 生 産 株 の 生 産 性 を 増 強 す る こ と 、 及 び 、 こ れ ら の 株 を 用 い る L-ス レ オ ニ ン の 製 造 法 を 提 供 す る こ と で あ る 。 【課題を解決するための手段】 【００１１】 こ の 目 的 は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ を コ ー ド す る asd遺 40 伝 子 を 低 コ ピ ー プ ラ ス ミ ド に ク ロ ー ニ ン グ し た と き に 、 L-ス レ オ ニ ン 生 産 が 増 強 さ れ る こ とを見出し達成された。このようにして、本発明は完成した。 【００１２】 本 発 明 で は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 活 性 が 増 強 す る よ う に 改 変 さ れ た 、 エ シ ェ リ ヒ ア 属 に 属 す る L-ス レ オ ニ ン 生 産 細 菌 を 提 供 す る 。 【００１３】 ま た 、 本 発 明 で は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 活 性 が 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の 発 現 を 上 昇 さ せ る こ と に よ り 増強している上記細菌が提供される。 【００１４】 50 (5) JP 2007-513601 A 2007.5.31 ま た 、 本 発 明 で は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 活 性 が 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の コ ピ ー 数 を 増 加 さ せ る こ と 、 又は、前記遺伝子の発現調節配列を遺伝子発現が上昇するように改変することにより増強 している上記細菌が提供される。 【００１５】 また、本発明では、前記遺伝子を含むベクターにより前記細菌を形質転換することによ りコピー数が増加している上記の細菌が提供される。 【００１６】 ま た 、 本 発 明 で は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 が 、 エ シェリヒア属細菌に由来する上記細菌が提供される。 10 【００１７】 ま た 、 本 発 明 で は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 が 下 記 の群から選択されるタンパク質をコードする上記細菌が提供される。 (A) 配 列 番 号 ２ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む タ ン パ ク 質 、 及 び 、 (B) 配 列 番 号 ２ の ア ミ ノ 酸 配 列 に お い て 、 １ 又 は 数 個 の ア ミ ノ 酸 の 欠 失 、 置 換 、 挿 入 又 は 付 加 を 含 む ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 み 、 か つ 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ーゼ活性を有するタンパク質。 【００１８】 ま た 、 本 発 明 で は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 が 下 記 の群から選ばれるＤＮＡを含む上記細菌が提供される。 20 (a) 配 列 番 号 １ に お け る 塩 基 番 号 １ ∼ １ １ ９ ６ の 塩 基 配 列 を 含 む Ｄ Ｎ Ａ 、 及 び 、 (b) 配 列 番 号 １ に お け る 塩 基 番 号 １ ∼ １ １ ９ ６ の 塩 基 配 列 、 又 は 、 同 塩 基 配 列 か ら 調 製 さ れ得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アスパラギン酸β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ 。 【００１９】 ま た 、 本 発 明 で は 、 ス ト リ ン ジ ェ ン ト な 条 件 が 、 60℃ で 、 １ × SSC及 び 0.1％ SDSの 塩 濃 度 で 15分 洗 浄 を 行 う こ と を 含 む 上 記 細 菌 が 提 供 さ れ る 。 【００２０】 また、本発明では、さらに、下記の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現が上昇するよ うに改変されている上記細菌が提供される。 30 スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲ ナ ー ゼ Ｉ を コ ー ド す る 変 異 thrA遺 伝 子 、 ホ モ セ リ ン キ ナ ー ゼ を コ ー ド す る thrB遺 伝 子 、 ス レ オ ニ ン シ ン タ ー ゼ を コ ー ド す る thrC遺 伝 子 、 及 び 、 推 定 膜 貫 通 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る rhtA遺 伝 子 。 【００２１】 ま た 、 本 発 明 で は 、 変 異 thrA遺 伝 子 、 thrB遺 伝 子 、 thrC遺 伝 子 及 び rhtA遺 伝 子 の 発 現 が 上昇するように改変されている上記細菌が提供される。 【００２２】 ま た 、 本 発 明 で は 、 上 記 細 菌 を 培 地 で 培 養 し 、 培 地 中 に L-ス レ オ ニ ン を 蓄 積 せ し め 、 培 40 養 培 地 か ら L-ス レ オ ニ ン を 採 取 す る こ と を 含 む L-ス レ オ ニ ン の 製 造 法 が 提 供 さ れ る 。 【発明を実施するための最良の形態】 【００２３】 本 発 明 に お い て 、 「 L-ス レ オ ニ ン 生 産 細 菌 」 と は 、 培 地 で 培 養 し た と き に 培 地 中 に L-ス レ オ ニ ン を 蓄 積 す る 能 力 を 有 す る 細 菌 を 意 味 す る 。 L-ス レ オ ニ ン 生 産 能 は 、 育 種 に よ り 付 与 又 は 増 強 で き る 。 本 明 細 書 に お け る 「 L-ス レ オ ニ ン 生 産 細 菌 」 の 語 は 、 ま た 、 培 地 中 に 、 E. coli K-12株 な ど の 野 生 型 株 又 は 親 株 と 比 べ て 多 量 の L-ス レ オ ニ ン を 生 産 し 、 蓄 積 さ せることのできる細菌を意味する。 【００２４】 「エシェリヒア属に属する細菌」の語は、当業者に知られた微生物学の分類により細菌 50 (6) JP 2007-513601 A 2007.5.31 がエシェリヒア属に分類されることを意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属 す る 微 生 物 の 例 と し て は 、 エ シ ェ リ ヒ ア ・ コ リ (E. coli)が 挙 げ ら れ る が 、 こ れ に 限 定 さ れるものではない。 【００２５】 本発明で使用できるエシェリヒア属に属する細菌は、特に限定されるものではないが、 例 え ば 、 Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Ame rican Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)に 記 載 の 細 菌 が 含 まれる。 【００２６】 「 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 活 性 」 の 語 は 、 リ ン 酸 又 は ヒ 酸 10 の 存 在 下 で 可 逆 的 な NADPの 基 質 依 存 性 還 元 を 触 媒 す る 活 性 を 意 味 す る 。 ア ス パ ラ ギ ン 酸 β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 活 性 は 、 例 え ば 、 Preiss, J. et al (Curr. Microbi ol., 7: 263-268 (1982))に 記 載 の 方 法 に よ り 測 定 す る こ と が で き る 。 【００２７】 「 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 活 性 を 増 強 す る よ う に 改 変 さ れ た」とは、細胞あたりの活性が非改変株例えば野生型株より高いことを意味する。このよ う な 改 変 の 例 と し て は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 細 胞 あ た り の 分 子 数 を 増 加 さ せ る こ と 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 分 子 あたりの比活性を上昇させることなどがある。比較の目的に用いる野生型株は、例えば、 エ シ ェ リ ヒ ア ・ コ リ K-12で あ る 。 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の 20 細 胞 内 活 性 の 増 強 の 結 果 、 培 地 に お け る L-ス レ オ ニ ン 蓄 積 量 が 増 加 す る 。 【００２８】 細 菌 細 胞 中 の ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 活 性 の 増 強 は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ を コ ー ド す る 遺 伝 子 の 発 現 の 上 昇 に よ っ て 達 成 す る こ と が で き る 。 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 と しては、エシェリヒア属に属する細菌に由来する遺伝子、及び、コリネ型細菌などの他の 細菌に由来する遺伝子を用いることができる。 【００２９】 エ シ ェ リ ヒ ア ・ コ リ の ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ を コ ー ド す る 遺 伝 子 に つ い て は 、 asd遺 伝 子 が 既 に 解 明 さ れ て い る (GenBankア ク セ ッ シ ョ ン 番 号 NC#00 30 0913.1の 配 列 に お け る 塩 基 番 号 3572511∼ 3571408, gi:16131307)。 従 っ て 、 asd遺 伝 子 は 、 そ の 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 に 基 づ い て 調 製 し た プ ラ イ マ ー を 用 い る PCR(ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 ; White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参 照 )に よ っ て 得 る こ と が で き る 。 他 の 微 生 物 に 由 来 す る ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ を コ ー ド する遺伝子も同様にして得ることができる。 【００３０】 エ シ ェ リ ヒ ア ・ コ リ 由 来 の asd遺 伝 子 の 例 は 、 下 記 (A)又 は (B)の タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNAで あ る 。 (A) 配 列 番 号 ２ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む タ ン パ ク 質 、 又 は 、 (B) 配 列 番 号 ２ の ア ミ ノ 酸 配 列 に お い て 、 １ 又 は 数 個 の ア ミ ノ 酸 の 欠 失 、 置 換 、 挿 入 又 は 40 付 加 を 含 む ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 み 、 か つ 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ーゼ活性を有するタンパク質。 【００３１】 「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類 に よ っ て も 異 な る 。 タ ン パ ク 質 (A)に つ い て は 、 ２ か ら ３ ０ 個 、 好 ま し く は 、 ２ か ら １ ５ 個、より好ましくは２から５個となり得る。アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加は、タ ンパク質の、その機能に重要でない領域に生じ得る。これは、いくつかのアミノ酸は互い に高い類似性を有するため、その変化により立体構造や活性が影響されないためである。 従 っ て 、 タ ン パ ク 質 変 異 体 (B)は 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 活 性 が 維 持 さ れ る 限 り 、 配 列 番 号 ２ に 示 す ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ 50 (7) JP 2007-513601 A 2007.5.31 ナ ー ゼ の ア ミ ノ 酸 配 列 全 体 に 対 し 、 70%以 上 、 好 ま し く は 80%以 上 、 さ ら に 好 ま し く は 90% 以 上 、 も っ と も 好 ま し く は 95%以 上 の 相 同 性 を 有 す る も の で あ り 得 る 。 二 つ の ア ミ ノ 酸 配 列の間のホモロジーは、周知の方法、例えば、スコア、同一性及び類似性の三つのパラメ ー タ ー を 算 出 す る コ ン ピ ュ ー タ ー プ ロ グ ラ ム BLAST 2.0を 用 い て 求 め る こ と が で き る 。 【００３２】 上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、酵素活性が維持 される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換 と み な さ れ る 置 換 と し て は 、 Alaか ら Ser又 は Thrへ の 置 換 、 Argか ら Gln、 His又 は Lysへ の 置 換 、 Asnか ら Glu、 Gln、 Lys、 His又 は Aspへ の 置 換 、 Aspか ら Asn、 Glu又 は Glnへ の 置 換 、 Cysか ら Ser又 は Alaへ の 置 換 、 Glnか ら Asn、 Glu、 Lys、 His、 Asp又 は Argへ の 置 換 、 Gluか 10 ら Asn、 Gln、 Lys又 は Aspへ の 置 換 、 Glyか ら Proへ の 置 換 、 Hisか ら Asn、 Lys、 Gln、 Arg又 は Tyrへ の 置 換 、 Ileか ら Leu、 Met、 Val又 は Pheへ の 置 換 、 Leuか ら Ile、 Met、 Val又 は Phe へ の 置 換 、 Lysか ら Asn、 Glu、 Gln、 His又 は Argへ の 置 換 、 Metか ら Ile、 Leu、 Val又 は Phe へ の 置 換 、 Pheか ら Trp、 Tyr、 Met、 Ile又 は Leuへ の 置 換 、 Serか ら Thr又 は Alaへ の 置 換 、 T hrか ら Ser又 は Alaへ の 置 換 、 Trpか ら Phe又 は Tyrへ の 置 換 、 Tyrか ら His、 Phe又 は Trpへ の 置 換 、 及 び 、 Valか ら Met、 Ile又 は Leuへ の 置 換 が 挙 げ ら れ る 。 【００３３】 上 述 の ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ と 実 質 的 に 同 じ タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNAは 、 例 え ば 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ を コ ー ド す る DNAの 塩 基 配 列 (配 列 番 号 １ )を 、 部 位 特 異 的 変 異 誘 発 な ど に よ っ て 、 特 定 の 部 位 20 の１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加となるように改変することによ り 得 る こ と が で き る 。 上 述 の よ う に 改 変 さ れ た DNAは 、 従 来 知 ら れ て い る 変 異 処 理 に よ り 得 る こ と が で き る 。 こ の よ う な 処 理 に は 、 本 発 明 の タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNAの ヒ ド ロ キ シ ア ミ ン 処 理 、 該 DNAを 有 す る 細 菌 の 、 UV照 射 や N-メ チ ル -N'-ニ ト ロ -N-ニ ト ロ ソ グ ア ニ ジン又は亜硝酸などの試薬による処理がある。 【００３４】 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ と 実 質 的 に 同 じ タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNAは 、 上 述 の よ う な 変 異 を 有 す る DNAを 適 切 な 細 胞 で 発 現 さ せ 、 発 現 産 物 の 活 性 を 調 べ る こ と に よ り 得 る こ と が で き る 。 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ と 実 質 的 に 同 じ タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNAは 、 ま た 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ 30 ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ を コ ー ド す る 変 異 DNA又 は 変 異 体 を 含 む 細 胞 か ら 、 例 え ば 配 列 番 号 １の塩基配列を含む塩基配列を有するプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイ ズ し 、 か つ 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNAを 単 離 す る こ と に よ っ て 得 る こ と が で き る 。 「 ス ト リ ン ジ ェ ン ト な 条 件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成さ れない条件をいう。この条件を数値で明確に示すことは困難であるが、一例を示せば、相 同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズ し、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件である。あるいは、通 常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％Ｓ ＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズ 40 する条件である。洗浄の時間は、ブロッティングに用いるメンブランの種類によるが、通 常 は 、 製 造 者 に よ り 推 奨 さ れ た 条 件 で あ る 。 例 え ば 、 Hybond T M N+ナ イ ロ ン メ ン ブ ラ ン (Am ersham)の ス ト リ ン ジ ェ ン ト な 条 件 で の 推 奨 さ れ る 洗 い の 時 間 は １ ５ 分 で あ る 。 【００３５】 配列番号１の塩基配列の部分配列は、プローブとしても使用できる。プローブは、配列 番号１の塩基配列に基づくプライマー、及び、テンプレートとして配列番号１の塩基配列 を 含 む DNAフ ラ グ メ ン ト を 用 い る PCRに よ り 調 製 で き る 。 約 300 bpの 長 さ の DNAフ ラ グ メ ン トをプローブとして用いる場合、洗いのためのハイブリダイゼーション条件は、例えば、 50℃ で 、 ２ × SSC、 0.1%SDSで あ る 。 【００３６】 50 (8) JP 2007-513601 A 2007.5.31 上述のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加は、また、例えば、アスパラギン酸β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ を 含 む 細 菌 の 種 間 や 属 間 で の 相 違 に よ る 、 天 然 に 存 在する変異（ミュータント又はバリアント）も含む。 【００３７】 「 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNAに よ る 細 菌 の 形 質 転 換 」 と は 、 例 え ば 、 従 来 の 方 法 に よ る 、 DNAの 細 菌 へ の 導 入 を 意 味 す る 。 こ の DNAの 形 質 転 換 は 、 本 発 明 の タ ン パ ク 質 を コ ー ド する遺伝子の発現の上昇をもたらし、細菌細胞中のタンパク質の活性を増強させる。 【００３８】 遺伝子発現上昇の方法としては、遺伝子コピー数を増加させることが挙げられる。遺伝 子を、エシェリヒア属に属する細菌で機能できるベクターに導入することにより遺伝子の 10 コピー数が増加する。好ましくは、低コピーベクターが使用される。低コピーベクターの 例 と し て は 、 pSC101、 pMW118、 pMW119な ど が 挙 げ ら れ る が 、 こ れ ら に 限 定 さ れ な い 。 「 低 コピーベクター」とは、コピー数が細胞あたり５コピーまでのベクターである。形質転換 の方法としては、これまでに報告されている既知の方法が挙げられる。例えば、レシピエ ン ト 細 胞 を 塩 化 カ ル シ ウ ム で 処 理 し 、 細 胞 の DNAに 対 す る 透 過 性 を 増 加 さ せ る 方 法 が 、 エ シ ェ リ ヒ ア ・ コ リ K-12に つ い て 報 告 さ れ て お り (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol ., 53, 159 (1970))、 こ れ を 使 用 で き る 。 【００３９】 遺 伝 子 発 現 上 昇 は 、 例 え ば 、 相 同 組 換 え 、 Muイ ン テ グ レ ー シ ョ ン 等 に よ り 、 複 数 コ ピ ー の 遺 伝 子 を 細 菌 染 色 体 に 導 入 す る こ と に よ っ て も 達 成 で き る 。 例 え ば 、 １ 回 の Muイ ン テ グ 20 レーションで、細菌染色体に３コピーまでの遺伝子を導入することができる。 【００４０】 遺 伝 子 発 現 上 昇 は 、 ま た 、 本 発 明 の DNAを 強 力 な プ ロ モ ー タ ー の 制 御 下 に 置 く こ と に よ っ て も 達 成 で き る 。 例 え ば 、 lacプ ロ モ ー タ ー 、 trpプ ロ モ ー タ ー 、 trcプ ロ モ ー タ ー 、 ラ ム ダ フ ァ ー ジ の PR 及 び PL プ ロ モ ー タ ー が 強 力 な プ ロ モ ー タ ー と し て 知 ら れ て い る 。 強 力 な プロモーターの使用は、遺伝子コピーの複数化と組み合わせることができる。 【００４１】 あるいは、プロモーターの効果を、例えば、プロモーターに変異を導入してプロモータ ーの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加させることによって増強させることができ る 。 さ ら に 、 リ ボ ソ ー ム 結 合 部 位 (RBS)と 開 始 コ ド ン と の 間 の ス ペ ー サ ー 、 特 に 開 始 コ ド 30 ン の 直 ぐ 上 流 に お け る 配 列 に お け る い く つ か の 塩 基 の 置 換 が mRNAの 翻 訳 性 に 大 き く 影 響 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 例 え ば 、 開 始 コ ド ン に 先 行 す る ３ つ の 塩 基 の 性 質 に よ り 20倍 の 範 囲 の 発 現 レ ベ ル が 見 出 さ れ て い る (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984)。 以 前 に 、 rhtA23変 異 が ATG開 始 コ ド ン に 対 し -1位 置 の G→ A置 換 で あ る こ と が 示 さ れ た (ABSTRACTS of 17 t h International Congr ess of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meetin g of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457)。 従 っ て 、 rhtA23変 異 は 、 rhtA遺 伝子の発現を上昇させ、その結果、スレオニン、ホモセリン及びその他のいくつかの、細 胞の外へ輸送される物質に対する耐性を増加させていることが示唆される。 40 【００４２】 さ ら に 、 細 菌 染 色 体 上 の ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の プロモーター領域に塩基置換を導入し、プロモーター機能を高めることが可能である。発 現 調 節 配 列 の 改 変 は 、 例 え ば 、 国 際 公 開 WO00/18935及 び 特 公 平 1-215280に 開 示 さ れ て い る ように、温度感受性プラスミドを用いる遺伝子置換と同様に行うことができる。 【００４３】 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の コ ピ ー 数 の 増 加 は 、 ま た 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の 複 数 コ ピ ー を 細 菌 の 染 色 体 DNAに 導 入 す る こ と に よ り 達 成 で き る 。 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の 複 数 コ ピ ー を 細 菌 染 色 体 に 導 入 す る に は 、 染 色 体 DNA中 に タ ー ゲ ッ ト と し 50 (9) JP 2007-513601 A 2007.5.31 て 複 数 コ ピ ー 存 在 す る 配 列 を 用 い て 相 同 組 換 え を 行 う 。 染 色 体 DNAに 複 数 コ ピ ー あ る 配 列 と し て は 、 反 復 DNAや 転 移 可 能 因 子 の 末 端 に 存 在 す る 逆 方 向 反 復 配 列 が 挙 げ ら れ る が 、 こ れ ら に 限 定 さ れ な い 。 ま た 、 米 国 特 許 5,595,889に 開 示 さ れ て い る よ う に 、 ア ス パ ラ ギ ン 酸 -β -セ ミ ア ル デ ヒ ド デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ を ト ラ ン ス ポ ゾ ン に 組 み 込 み 、 転 移 さ せ る こ と で 、 遺 伝 子 の 複 数 コ ピ ー を 染 色 体 DNAに 導 入 す る こ と が で き る 。 【００４４】 プ ラ ス ミ ド DNAの 調 製 方 法 に つ い て は 、 DNAの 消 化 及 び 連 結 、 形 質 転 換 、 プ ラ イ マ ー と し てのオリゴヌクレオチドの選択等やその他の当業者に周知の方法が挙げられるが、これら に 限 定 さ れ な い 。 こ れ ら の 方 法 は 、 例 え ば 、 Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniati s, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harb 10 or Laboratory Press (1989)に 記 載 さ れ て い る 。 【００４５】 本 発 明 の 細 菌 は 、 上 記 の DNAを 、 L-ス レ オ ニ ン 生 産 能 を 元 々 有 す る 細 菌 に 導 入 す る こ と に よ り 得 る こ と が で き る 。 あ る い は 、 本 発 明 の 細 菌 は 、 上 記 DNAを 既 に 含 む 細 菌 に L-ス レ オニン生産能を付与することにより得ることができる。 【００４６】 本 発 明 に 含 ま れ る 親 株 の 例 と し て は 、 E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) 株 (米 国 特 許 5,175,107, 米 国 特 許 5,705,371), E. coli NRRL-21593株 (米 国 特 許 5,939,307), E. co li FERM BP-3756株 (米 国 特 許 5,474,918), E. coli FERM BP-3519及 び FERM BP-3520 株 ( 米 国 特 許 5,376,538), E. coli MG442株 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 1 20 4, 947-956 (1978)), E. coli VL643及 び VL2055株 (EP 1149911 A)等 の エ シ ェ リ ヒ ア 属 に 属するスレオニン生産菌が挙げられるが、これらに限定されない。 【００４７】 TDH-6株 は 、 thrC遺 伝 子 を 欠 損 し 、 ス ク ロ ー ス 資 化 性 で 、 ilvA遺 伝 子 が リ ー キ ー 変 異 を 有 す る 。 こ の 株 は 、 rhtA遺 伝 子 に 、 高 濃 度 の ス レ オ ニ ン 又 は ホ モ セ リ ン に 対 す る 耐 性 を 付 与 す る 変 異 を 有 す る 。 B-3996株 は 、 ス レ オ ニ ン に よ り フ ィ ー ド バ ッ ク 阻 害 が 実 質 的 に 解 除 さ れ た ア ス パ ル ト キ ナ ー ゼ ホ モ セ リ ン デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ Ｉ を コ ー ド す る 変 異 thrA遺 伝 子 を 含 む thrA*BCオ ペ ロ ン を 、 RSF1010由 来 ベ ク タ ー に 挿 入 す る こ と に よ り 得 ら れ た プ ラ ス ミ ド pVIC40を 含 む 。 B-3996は 、 All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 113105 Moscow, Russian Federation)に 、 1987年 11月 19日 に 寄 託 さ れ 、 受 30 託 番 号 RIA1867が 付 与 さ れ て い る 。 ま た 、 同 株 は 、 Russian National Collection of Indu strial Microorganisms (VKPM) (Dorozhny proezd. 1, Moscow 113545, Russian Federat ion)に も 1987年 4月 7日 に 寄 託 さ れ 、 受 託 番 号 B-3996が 付 与 さ れ て い る 。 【００４８】 好 ま し く は 、 本 発 明 の 細 菌 は 、 asd遺 伝 子 に 加 え て 、 さ ら に 、 下 記 の 群 か ら 選 ば れ る １ 以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されている。 スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲ ナ ー ゼ Ｉ を コ ー ド す る 変 異 thrA遺 伝 子 、 ホ モ セ リ ン キ ナ ー ゼ を コ ー ド す る thrB遺 伝 子 、 ス レ オ ニ ン シ ン タ ー ゼ を コ ー ド す る thrC遺 伝 子 、 及 び 、 40 推 定 膜 貫 通 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る rhtA遺 伝 子 。 【００４９】 本 発 明 の 好 ま し い 態 様 は 、 asd遺 伝 子 の 増 強 に 加 え て 、 推 定 膜 貫 通 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る rhtA遺 伝 子 が 増 強 す る よ う に 改 変 さ れ た 細 菌 で あ る 。 最 も 好 ま し い 態 様 は 、 asd遺 伝 子 、 変 異 thrA遺 伝 子 、 thrB遺 伝 子 、 thrC遺 伝 子 及 び rhtA遺 伝 子 の 発 現 が 上 昇 す る よ う に 改 変されている細菌である。 【００５０】 本 発 明 の L-ス レ オ ニ ン の 製 造 方 法 は 、 本 発 明 の 細 菌 を 培 地 で 培 養 し 、 培 地 中 に L-ス レ オ ニ ン を 蓄 積 せ し め 、 培 養 培 地 か ら L-ス レ オ ニ ン を 採 取 す る こ と を 含 む 。 【００５１】 50 (10) JP 2007-513601 A 2007.5.31 本 発 明 で は 、 培 養 、 培 地 か ら の L-ス レ オ ニ ン の 採 取 及 び 精 製 な ど は 、 微 生 物 を 用 い て Lスレオニンを生産する従来の発酵法と同様に行うことができる。 【００５２】 培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機物、及び、必要により、微生物が生育に必 要とする栄養素を適当量含む限り、合成培地でも、天然培地でもよい。炭素源としては、 グルコース及びスクロースなどの種々の炭水化物、種々の有機酸が挙げられる。選択した 微生物の資化形態により、エタノールやグリセロールなどのアルコールを使用してもよい 。窒素源については、アンモニアや硫酸アンモニウムなどの種々のアンモニウム塩、アミ ンなどのその他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、発酵微生物消化物などの天然 窒素源が挙げられる。無機物については、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カル 10 シウムなどが使用される。ビタミンについては、チアミン、イーストエキストラクトなど が使用される。必要であれば、付加的な栄養素を培地に添加できる。例えば、微生物が生 育にイソロイシンを要求する場合（イソロイシン要求性）には、十分な量のイソロイシン を培養培地に添加し得る。 【００５３】 培 養 は 、 20∼ 40℃ 、 好 ま し く は 30∼ 38℃ で 、 好 ま し く は 、 振 盪 培 養 、 通 気 に よ る 撹 拌 培 養 の よ う な 好 気 的 条 件 で 行 う 。 培 養 pHは 、 通 常 に は ５ ∼ ９ 、 好 ま し く は 6.5∼ 7.2で あ る 。 培 養 pHは 、 ア ン モ ニ ア 、 炭 酸 カ ル シ ウ ム 、 種 々 の 酸 、 種 々 の 塩 基 、 緩 衝 液 で 調 整 で き る 。 通 常 に は 、 １ ∼ ５ 日 の 培 養 で 、 液 体 培 地 に L-ス レ オ ニ ン が 蓄 積 す る 。 【００５４】 20 培養後、細胞などの固形物を液体培地から遠心分離や膜濾過により除くことができ、次 い で 、 L-ス レ オ ニ ン を 、 イ オ ン 交 換 、 濃 縮 、 結 晶 化 の 方 法 に よ り 採 取 及 び 精 製 す る こ と が できる。 【実施例】 【００５５】 本発明を下記の非限定的な実施例によりさらに具体的に説明する。 【００５６】 実 施 例 １ ： pMベ ク タ ー へ の E. coli由 来 asd遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ asd遺 伝 子 は 、 Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) ( Dorozhny proezd. 1, Moscow 113545, Russian Federation)か ら 得 た E. coli株 (K12 Mu 30 cts62 Mud5005) (VKPM B-6804)の 染 色 体 DNAか ら ク ロ ー ニ ン グ し た 。 ま ず 、 E. coli株 (K12 Mu cts62 Mud5005) (VKPM B-6804)中 mini-Muフ ァ ー ジ を 誘 導 し た 。 次 い で 、 染 色 体 の 一 - 部 を 含 む プ ラ ス ミ ド pMud5005の 得 ら れ た 誘 導 体 の セ ッ ト を 、 asd の SH 309株 の 形 質 転 換 に 用 い た 。 Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Dorozhn y proezd. 1, Moscow 113545, Russian Federation)よ り 得 ら れ る SH 309 株 (VKPM B-3899 )は 、 F - araD139 rpsL150 deoC1 ptsF25 relA1 feb5301 rbsR ugpA704::Tn10 Del (argF - lac) U169 Del (mal - asd) Tet R R - Str の 表 現 型 を 有 し て い る 。 asd の SH 309株 は 、 Ｌ 培 地 で は 生 育 で き ず 、 生 育 に ジ ア ミ ノ ピ メ リ ン 酸 (DAPA)を 要 求 す る 。 プ ラ ス ミ ド pMud5005 + -asd を 保 持 す る SH 309の asd ク ロ ー ン を Ｌ 培 地 で 選 択 し た 。 プ ラ ス ミ ド pMud5005-asdを 単 離 し 、 asd遺 伝 子 を 含 む BamHI-PstI DNA フ ラ グ メ ン ト (1646 bp)を 、 予 め 改 変 し て プ ロ 40 モ ー タ ー Pl a c を プ ロ モ ー タ ー PR で 置 換 し た プ ラ ス ミ ド pMW119中 に 再 ク ロ ー ニ ン グ し た 。 こ の よ う に し て 、 プ ロ モ ー タ ー PR の 調 節 を 受 け る asd遺 伝 子 を 有 す る プ ラ ス ミ ド pMW-asdが 構 築 さ れ た 。 プ ラ ス ミ ド pMW-asdは 、 プ ラ ス ミ ド pVIC40 (レ プ リ コ ン pRSF1010)と 和 合 性 で あ り 、 二 つ の プ ラ ス ミ ド pVIC40及 び pMW-asdを 同 時 に 細 菌 に 保 持 さ せ る こ と が で き た 。 【００５７】 プ ラ ス ミ ド pMW-asdを ス ト レ プ ト マ イ シ ン 耐 性 ス レ オ ニ ン 生 産 E. coli B-3996株 に 導 入 し た 。 こ の よ う に し て 、 B-3996(pMW-asd)株 が 得 ら れ た 。 【００５８】 実 施 例 ２ ： ス レ オ ニ ン 生 産 に お け る asd遺 伝 子 増 幅 の 効 果 E. coli B-3996及 び B-3996(pMW-asd)株 を 、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン (100 μ g/ml)又 は ア ン 50 (11) JP 2007-513601 A 2007.5.31 ピ シ リ ン (100 μ g/ml)を 含 む Ｌ 寒 天 プ レ ー ト 上 で 37℃ で 18∼ 24時 間 培 養 し た 。 種 培 養 を 取 得 す る た め 、 株 を 、 ロ ー タ リ ー シ ェ イ カ ー (250 rpm)を 用 い て 、 ４ ％ ス ク ロ ー ス を 添 加 し た ２ mlの Ｌ 培 地 を 含 む 20x200 mm試 験 管 中 、 32℃ で 18時 間 培 養 し た 。 次 い で 、 発 酵 培 地 に 0 .1 ml(5%)の 種 培 養 を 接 種 し た 。 発 酵 を 、 20x200 mm試 験 管 中 、 ２ mlの 発 酵 用 最 少 培 地 で 行 っ た 。 細 胞 は 、 250 rpmで 振 盪 し な が ら 32℃ で 24時 間 培 養 し た 。 【００５９】 培 養 後 、 培 地 中 の L-ス レ オ ニ ン 蓄 積 量 を TLCで 測 定 し た 。 Sorbfilプ レ ー ト (Stock Compa ny Sorbopolymer, Krasnodar, Russia)を 、 プ ロ パ ン -2-オ ー ル ： ア セ ト ン ： 水 ： 25%ア ン モ ニ ア 水 = 25 : 25 : 7 : 6 (v/v)の 移 動 相 で 展 開 し た 。 ニ ン ヒ ド リ ン 酢 酸 溶 液 (2%)を 、 可視化試薬として用いた。結果を表１に示す。 10 【００６０】 【表１】 20 30 【００６１】 発 酵 培 地 の 組 成 (g/l)は 以 下 の 通 り で あ る 。 【００６２】 40 (12) JP 2007-513601 A 2007.5.31 【表２】 10 【００６３】 ス ク ロ ー ス 及 び 硫 酸 マ グ ネ シ ウ ム は 、 別 に 滅 菌 す る 。 CaCO3 は 180℃ で ２ 時 間 乾 熱 滅 菌 す る 。 pHは 7.0に 調 整 す る 。 滅 菌 後 、 抗 生 物 質 を 培 地 に 加 え る 。 【００６４】 好ましい態様について、本発明を詳細に説明したが、当業者にとって、本発明の範囲内 で様々な改変を行い、等価物を用いることができることは明らかである。上記の文献は、 参照により全体を本明細書に含める。 【産業上の利用可能性】 【００６５】 L-ス レ オ ニ ン を 効 率 よ く 生 産 で き る 。 【配列表】 2007513601000001.xml 20 (13) 【国際調査報告】 JP 2007-513601 A 2007.5.31 (14) JP 2007-513601 A 2007.5.31 (15) JP 2007-513601 A 2007.5.31 (16) JP 2007-513601 A 2007.5.31 フロントページの続き (81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM), EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ, CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR, CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,L U,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA ,UG,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW (72)発明者 サヴラソヴァ エカチェリナ アレクセエヴナ ロシア連邦 モスクワ １０７３７０ オトクルゥィトエ ショッセ ３ ビルディング７ ナン バー５０ (72)発明者 カプラン アーラ マルコヴナ ロシア連邦 モスクワ １０７２５８ グレボフスカヤ ウル． ７ ナンバー１１ (72)発明者 ロバノフ アンドレイ オレゴヴィッチ ロシア連邦 モスクワ １１７４６５ ウル． ゲネラル チュレネフ ２９ ビルディング３ ナンバー２８ (72)発明者 コズロフ ユーリ イヴァノヴィッチ ロシア連邦 モスクワ １１７５７４ ウル． ゴルビンスカヤ ７ ビルディング２ ナンバー ６５３ Ｆターム(参考) 4B024 AA03 AA05 BA73 CA02 DA06 EA04 FA13 GA11 HA03 4B064 AE10 CA02 CA19 CA21 CC24 CE11 CE15 DA10 DA16 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14 BA02 CA17 CA41