当日配布資料（5.00MB）

GP2タンパクを標的とする新規
経口粘膜ワクチンの開発
独立行政法人理化学研究所
統合生命医科学研究センター
粘膜システム研究グループ
グループディレクター 大野 博司
研究の背景〜ワクチンとは〜
あらかじめ接種することで、防御体制を誘
導し、感染症を予防する物質
注射
注射器・針
滅菌装置
医療従事者
IgGのみ誘導
経口
スポイト・スプーン
IgG+IgAも誘導
感染前に抗原を排除
粘膜ワクチンの問題点
・消化酵素、ムチンなどの分泌物の存在
・絨毛で覆われている
効率良く届きにくい
弱毒生ワクチンが使われている
感染する危険 （例：ポリオ）
不活化ワクチンの可能性？
効率的なデリバリーが必要
ワクチンデリバリーに必要な要素
標的となるもの
届けるためのツール
特異的な分子を発現している
特異的に結合できる
タンパク
脂質
微生物
核酸
抗体
低分子化合物
細胞
アプタマー
糖鎖
生体に害のあるもの
抗原性の低いもの
腸管関連リンパ組織
濾胞関連上皮層
(FAE)
M細胞
腸管内腔
上皮細胞
パイエル板
微絨毛
Mø
B
パイエル板
Mowat, Nature Rev. Immunol 2003
M細胞（microfold cell）
ワクチンデリバリーのための有効な標的となる細胞
・短い不規則なひだ状の突起をもった細胞
細胞特異的マーカー分子は分かっていなかった
・基底膜に免疫細胞を抱え込むポケット構造あり
・一方向性の物質輸送能が発達 (トランスサイトーシス)
M細胞特異的発現分子の同定
絨毛
(VE)
濾胞関連上皮層
(FAE)
FAE,VEにおけるGP2の
発現比較
GP2とUEA‐1
との共染色
FAE
GP2
FAE
UEA‐1
Mowat, Nature Rev. Immunol 2003
K. Hase, et al. Nature, 2009.
UEA‐1
FAE
今まで使用されていた
M細胞マーカー
M細胞、杯細胞に結合する
GP2はM細胞特異的マーカー分子である
抗GP2抗体のM細胞への取り込み
腸ループアッセイ
X‐Y
GFP‐E. coli
(上面）
PP
腸ループ
X‐Z
(側面）
GP‐2と細菌との結合
In vitro 結合実験
細菌
25

mGP2‐Fc

洗浄
細菌ゲノムDNAの抽出
定量 PCR
(16S rDNA )
hGP2‐Fc
hFc
20
相対的結合量
リコンビナントタンパク質
mGP2‐Fc hGP2‐Fc hFc
15
10
5
0




GP2依存的な大腸菌のM細胞への取り込み
GP2-/-
Num. of bac. transcytosis/PP (cells)
GP2+/+
70
60
50
40
30
20
10
0
GP2+/+ GP2-/Mouse genotype
GP2 UEA-1 GFP-E. coli K12
GP2依存的なサルモネラの取り込み
経口感染後のコロニー形成アッセイ
Salmonella Typhimurium
(FimH +)
経口感染
or
Yersinia enterocolitica
(FimH ―)
1 day
WT or GP2 KO
mice
Y. enterocolitica
S. Typhimurium
20
p = 0.0374
MLN
MLN
100
80
80
CFU / mg organ
16
200
PP
CFU / mg organ
400
300
100
p = 0.0037
CFU / mg organ
CFU / mg organ
500
PP
パイエル板（PP)・腸間膜リ
ンパ節（MLN)の摘出とコロ
ニー形成アッセイ
60
12
60
40
8
40
100
4
20
20
0
0
0
0
WT GP2 KO
WT GP2 KO
WT GP2 KO
WT GP2 KO
サルモネラ経口感染後のGP2依存的免疫応答
T細胞増殖
糞便中IgA
血清IgG
全身応答
（サルモネラ腹腔投与）
血清IgG
4
3.5
3
GP2+/+
GP2-/-
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Day0
Day9
GP2はサルモネラや大腸菌を特異的に取
り込むM細胞受容体である
菌
GP2
パイエル板上皮
M cell
樹状細胞
抗GP2抗体による抗原デリバリーツール
ラット抗マウスGP2
モノクローナル抗体
ストレプトアビジン
（SA)
VH
VH
VL
VL
CH1
CL
CH2
CH3
CH1
-S-S-S-S-
CL
CH2
CH3
Kipriyanov et al. Protein Engineering (1996)
抗GP2抗体による抗原デリバリーツール
Anti‐GP2‐SA
抗GP2抗体Fab
ビオチン
ストレプトアビジン
CH1
VH
CL
VL
anti‐GP2‐SAのM細胞への結合
‐ ループアッセイ ‐
抗GP2抗体
Nati‐GP2‐SA
SA
UEA-1: M cell or Goblet cell Phalloidin: F-actin
anti‐GP2‐SAによる免疫応答 ‐ OVA ‐
PBS(to 200 l)
bOVA(50 g)
SA(30 g) antiGP2-SA(30 g) CT(10 g)
PBS
○
×
×
×
×
OVA
○
○
×
×
×
SA
○
○
○
×
×
AntiGP2-SA ○
○
×
○
×
PC
×
×
×
○
○
糞便中抗OVA
IgA抗体
(ELISA)
○
○
×
×
○
○
○
×
(経口免疫３週後）
OC
SC
VC
Reciprocal log 2 titer
○14
12
○
**
**
×
*
○
10
8
6
4
2
0
*
P <0.05
** P <0.01
Bar = SE
○
○
○
anti‐GP2‐SAによる免疫応答 ‐ サルモネラ ‐
サルモネラ
2w
1 3 5
AntiGP2-SA+BP
BP:ビオチン化サ
ルモネラタンパク
1x107 virulent S. typhimurium
Survival rate
PBS(to 200 l) bBP⊿FimH
SA(30 g) antiGP2-SA(30 g)
PBS
○
×
×
×
CT(10
g)
×
BP
○
○
×
×
×
SA+BP
○
○
○
×
×
AntiGP2-SA+BP
○
○
×
○
×
PC
○
×
×
×
○
OC
○
○
×
×
○
SC
○
○
○
×
○
anti‐GP2‐SAによる免疫応答 ‐ サルモネラ ‐
糞便中サルモネラ特異的IgA
anti‐GP2‐SAによる免疫応答 ‐ サルモネラ ‐
生存曲線
100%
Survival
80%
60%
*
40%
20%
0%
0
5
10
Days after inoculation
* : P = 0.0223 Calculated by Log-rank test
新技術の特徴・従来技術との比較
• 従来技術の問題点であった、少量の抗原でも
粘膜免疫応答を惹起する可能性を示した。
• 本技術の適用により、不活化ワクチンでも有
効な粘膜免疫応答を惹起できる可能性があ
る。
想定される用途
• インフルエンザ等経粘膜感染する感染症に
対する粘膜ワクチンへの応用
実用化に向けた課題
• 全身免疫系の賦活（血清IgG上昇）ができる
か、さらなる検討が必要である。
• 抗ヒトGP２抗体による検証が必要
• ワクチンに抗体医薬を使う経済的メリットがあ
るか。（企業への期待）
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称
GP2の使用
• 出願番号
• 出願人
• 発明者
：腸管M細胞マーカーとしての
：特願2006‐331950
：理化学研究所
：大野博司、河野和也、長谷耕二
お問い合わせ先
独立行政法人理化学研究所 社会知創成事業
創薬・医療技術基盤プログラム
事業開発室
住所：〒230-0045 神奈川県横浜市鶴見区末広町1-7-22
TEL：045-503-9153
Mail：[email protected]
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