Title The reversion-inducing cysteine

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The reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs
(RECK) interacts with membrane type 1 matrix
metalloproteinase (MT1-MMP) and CD13/aminopeptidase N
(APN), and modulates their endocytic pathways( Abstract_要
旨)
Miki, Takao
Kyoto University (京都大学)
2007-05-23
http://hdl.handle.net/2433/135757
Right
Type
Textversion
Thesis or Dissertation
none
Kyoto University
【２４４】
み
き
氏 名
たか
"
木 貴 維
学紋(専成分野)
博
土(医学)
学佼記番号
医
博 第 3137号
学位授与の日付
平 成 四 年 5 月 23 日
学位授与の要件
学位規郎第
研究科・専攻
医学研究科分子医学系専攻
学技論文題目
The R
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swithMembraneType1MatrixM
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(MT
1
一MMP) andCD13
1
AminopeptidaseN (APN) ，
andModulates
t
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rEn
品o
c
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cPathways
(
耳
目
:
C
KI
ま MTl一MMP及び CDl3
/アミノペブチダーゼ N と作用し、それらの
論文調査委員
4 条 第 1項 該 当
エンドサイト}シス経路を調節する)
(主査)
教授松田進行救援鏑島陽一
教授武藤
誠
論 文 内 容 の 要 旨
活性化主主開sがん遺伝子は、マトリッタス・メタ盟プ口テ 7 -ぜ仏!lM
P) を含む種々のプ世テアーゼむ発現誘導によ坦、
遺伝子は、活性化型 r
a
sがん遺伝子を導入することにより形質転換し
がんの懇性化を促進することが知られている。民ECK
た7 ウス線維芽細胞の、悪性形質の一部を正常復帰させる活性を有する遺伝子として単離された。その後の研究によ担、
RECKは MMP7ァミワーのメンパーである MMP
阻
官
、 MMP-2
、MTI-MMPの活性を負 i
こ制御することが示きれたロ RECK
ノックアウト・
7
ウスは、 MMPの異常活性化が原因と考えられる繊維性コラーゲンの著しい減少や血管形成の異常在示 L、
胎生 1
曲呂田で死に至る。一方、 RECKと既知の MMP制御因子〔すべて分泌型)との構造是比較すると、膜に GPIアンカ
ーされている点で際だった差違がある。よって RECKには、 MMPI
己対し固有の空間的制御機構が存萩すると考えられるが、
孟多い。そのため、本研究では REC
哀の標的の一つである MTI-MMPに対する制御機犠の
詳細なメカニズム等、不明な点 l
可定・解析を B的とした。
詳細な解析、さらに、新規な制御図子<1)1
野生型 RECKを過剰発現させたヒト線維肉腫細胞株 E
町1
0
8
0を用いて、免疫沈降法、精製タンパタ質を用いた阻害実験、
ショ糖密度勾配遠心法、ぜラチン・ザイモグラム法によ世、 RECKによる MTl
品怨亙Fの昔話御機縛を調べた。その結果:
1
)RECKと MTI-MMPが免疫沈降法によち共沈降すること
2
)精製 RECKは精製 MTI-MMPの活性を持抗阻害すること
3)GPIアンカー型の耳目 CKはショ糖密度勾配遠心法ーによりうフト画分へ回収されるが、 RECKの発現に伴って、 MT1-MMP
もラ 7 ト薗分に集積すること
4
) 脂質ラ 7 トの構成成分であるコレスチロールを除去する薬剤 MBCDで細胞を処理すると、 RECKの MTI-MMP告抑制
する機能が失われること
等が観察された。これらの結巣 l
孟
、 RECKが MTI-MMPの脂質ラ 7 トへの局夜を増加吉せ、その活性を制御することを示
唆している。
そこで次に、 RECKが他の標的タンパタ質についても脂質ラアトへの局在を増加させるという可能性を以下の方法で検討
した。すなわち、 RECKまたはコント
p
ール・ベクターを導入 Lた HTI0
呂白細胞のラ 7 ト画分を回収し、 SDS-PAGEによ
笈発現細胞に特異的に出現するバンドが検出され、これを質量分析法
り分離後、銀総色により可視化した。その結果、 REC
によ哲同定 Lた結巣、癌の差是湖、転移、血管新生を促進する換総合型プロチアーゼとして知られる CD1
3
四 i
n
o
p
e
p
t
i
加 eN
であるととが判明した。 MTI-MMPと同様の手法で RECKによる CD1
3の制御機構を検討し、以下のま目見を得た.
。免疫沈降法によ担宜ECKと CD13
1
ま共沈降する
2
) 精製 R
E
ι守主は精製 CD13必ベプチダーぜ活性壷搭抗阻害する
3
)RECK告過剰発現した肢T滞納細胞では、 CD13の活性が誠少している
― 613 ―
4
) MBCDで細胞告処理すると、 RECKによる CDl3抑制効果が減少する
これらの結巣から、 CD13は RECKにより制御される新たな標的タンパク質であることが示唆された。
MTl品岱宮、 CD13は、共に膜結合裂タンパク質のため、エンドサイトーシスによる制御が活性調節に深く関わると考え
られる。そこで、 G
P
Iアンカー型タンパタ質である RECKとの結合はこの機構にどのような影響を及ぼすのかをさらに検
、M
Tl
品
s
f
l
'
、 CD13を抗体で標識し、輸送経路を追跡したところ、 RECK
、M
Tl品岱居、 CDl3
証した。生細胞表面の RECK
が同ーのエンドソームへ輸送されることが判明した。 RECK非存在下で 1
;
1
;
， M
TI-MMPのエンドサイトーシスは、ヂラスリ
ンないし t
Jベオザン依存的であるが、 RECK存在下では、これらとは輿なる経路が選択され、エンドサイトーシスされる
MTl・MMPや CD13の量の増加と、分解の促進が見られた。以上の結果より、 RECKがエンドサイトーシスおよび分解の
促進を介して膜結合型プロテアーゼを負 i
こ
申i
御するととが示唆された。
論文審査の結果の裏書
申請者創立、多くのがんで発現低下している膜結合型 MMP
制御肉子 RECKの作照機構に病療を加える間的で研究を行い、
Fのような知見を得た。
1
) 先ず、 RECKが M
TI-MMPと複合体形成することを確認した。次に、内在性 RECKの発現が低いヒト線維肉腫由来
細胞株 (
H
T
l
飽母〉に REC
玄を強制発現させると、脂質ラフト圏分中の M
TI-MMP量が増加すること、この効巣は、コレ
以
t
h
y
l
-s c
y
c
b
d
.
x
t
r
i
nで締胞を処理することによって消失することを見出した。
ステロール除去作用を持つ血e
2
) RECK依存約に脂質予ブト主題分に局在するタンパタ質を見出し、マススベクトル分析を行った結果、 CDl3(
l
J
J
I
名アミ
まCDl3と複合体を形成し、その活性を盟書するととも示された。
ノベプチダーぜ N) であることが判明した。 RECKI
3
) M
TI-MMPと CDl3のエンドサイトーシスは、 RECK非存在下では、主にクラスリンまたはカベオリン依存的な経路
で起こるが、 RECK発現細胞では、これらとは異なる経路で起こり、分解速度も高まることを見出した。
以上の研究は、 RECKの細胞レベルでの機能解明に貢献し、分子麓療学の発援に寄与する所が大きい。
したがって、本論文は博士(医学〕の学位論文として何億あるものと認める。
なお、本学佼綬与申請おは、平成四年 5月 8 B実施の論文内容とそれに関連した試問を受け、合格と認められたもので
ある。
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