Kobe University Repository: Kernel

Kobe University Repository : Kernel
Title
ラット骨芽細胞様細胞株ROS17/2.8におけるPTH/PTHrP
受容体のごく早期の同種脱感作に及ぼすベータアドレナ
リン受容体キナーゼ1の影響(Effect of β-Adrenergic
Receptor Kinase 1 on the Very Rapid Phase
Homologous Desensitization of PTH/PTHrP Receptors
in Rat Osteoblastic Osteosarcoma Cells, ROS17/2.8)
Author(s)
陳, 新 / 中田, 裕久 / 馬場, 久光
Citation
神戸大学医学部紀要=Medical journal of Kobe
University,62(1/2):1-10
Issue date
2001-12
Resource Type
Departmental Bulletin Paper / 紀要論文
Resource Version
publisher
DOI
URL
http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/00097792
Create Date: 2017-03-29
1
フット骨芽細胞様細胞株 ROS1
7/2.8における
PTH/PTHrP受容体のごく早期の同種脱感作に及ぼす
ベータアドレナリン受容体キナーゼ 1の影響
新 1) 中 田 裕 久 1)2) 馬 場 久 光 1)2)
陳
神戸大学大学院医学系研究科病態情報学 1)
神戸大学保健管理センタ _ 2 )
連絡先:陳
新 XINCHEN
Departmento
fO
r
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p
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e
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CaseWesternR
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BiomedicalResearchB
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tRoad，C
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d，
OH4
4
1
0
6
5
0
0
0，USA
(平成 1
3年 3月 2日受付)
要
約
緒
PTH/PTHrP受容体におけるごく早期の受容体
冨
副甲状腺ホルモン (PTH) は，高等動物において
7
脱感作のメカニズムを明らかにする目的で， ROS1
血中カルシウム濃度を調節し，体内のカルシウムホメ
/2.8細 胞 に お け る ヒ ト PTH(
13
4
) による細胞内
cAMP産生に対するベータアドレナリン受容体キナーゼ
1(βARKl)の影響を検討した。細胞に1Q-7Mヒト PTH
オスターシスを維持する上で重要な役割をもっ (1)0
8
4アミノ酸から成る PTHおよびその N末端の 3
4アミ
ノ酸断片は，おもに腎や骨などの標的臓器の細胞膜に
(
13
4
) を 2分間前投与した後， 1
Q
- M ヒト PTH(
13
4
)
受容体を介してその生理作
ある特異的な PTH/PTHrP
を 2分間再投与し，
受容体の機能異常は，
用を発現する 0-5)0 PTH/PTHrP
7
ヒト PTH(
13
4
) を一度だけ 2分間
濃度はヒ
投与した場合と比較した。細胞隔解液の cAMP
トPTH(
13
4
)を一度だけ投与した場合に比べて約 30%
低下し，同種脱感作の現象が認められた。 f
o
r
s
k
o
l
i
nを
用いた同様の検討では同種脱感作は認められず，
ヒト
PTH(
13
4
)による cAMP産生反応の脱感作は， PTH/
PTHrP受容体を含めて adenyl
yl
c
y
c
l
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eよりも上流の
J
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h
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lc
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n
d
r
o
d
y
s
p
l
a
s
i
a
(
6
)に
おける PTH/PTHrP受 容 体 の 構 成 的 な 活 性 化 や
pseudohypoparathyroidismを伴う早期に発症する
HTLVI
a
s
s
o
c
i
a
t
e
dmyelopathy にみられる PTH
受容体の変化(7)に認められるように，いくつかの疾患
でのカルシウム代謝異常の原因となることがある。こ
メカニズムが原因となっていることが示唆された。細
受容体の機能異常は
れらのことから， PTH/PTHrP
胞に βARK1アンチセンス p
h
o
s
p
h
o
r
o
t
h
i
o
a
t
eo
l
i
g
o
-
高カルシウム血症や骨組懸症などの骨代謝異常に関与
DNAを投与して sARK1の機能を阻害すると， ヒト
PTH(
13
4
) による cAMP産生のごく早期の同種脱感
作 は 抑 制 さ れ た 。 同 様 に ， 細 胞 に sARK1アンチ
センス mRNAを発現させて βARK1の機能を阻害す
している可能性が考えられる。ある受容体をリガンド
で刺激し続けるとその受容体の反応性が急速に低下す
る受容体脱感作の現象は，最も重要な受容体制御機能
の一つで、ある。ある種の心不全におけるベータアドレ
ると，ヒト PTH(
13
4
) による cAMP産生のごく早期
ナリン受容体の不応性の原因としてベータアドレナリ
r
t
h
e
r
nb
l
o
t法 で
の同種脱感作は抑制された。 No
ン受容体の脱感作機構の異常が指摘されているよう
sARK1アンチセンス mRNAの発現を確認した。こ
受容体脱感作機構の異常が骨代
に(ぺ PTH/PTHrP
れらの結果から， ROS 1
7
/
2
.
8細胞において PTH/
PTHrP受容体の 2分以内というごく早期の同種脱感
謝異常の原因となることも考えられる。
作に βARK1が関与していることが示唆された。
感作は ln VIVOで観察され(べ種々の細胞株において
PTH!こ対する PTH/PTHrP受容体反応の同種脱
キーワード:PTH/PTHrP受容体，ベータアドレナリン受容体キナーゼ 1(βARKl)，同種脱感作，副甲状線
， G蛋白共役型受容体キナーゼ
ホルモン，細胞内 cAMP
(1)
2
i
nv
i
t
r
oでも観察されているが(1札
， PTHに対する
L~glutamine ，
1
1
)
1
0
0 IU/ml p
e
n
i
c
i
l
l
i
n，100μg/
ても異なっており，未だ日月らかではなし、。受容体の脱
ml streptomycin(GIBCO-BRL，Grand I
s
l
a
n
d，
NY) および 10%FBSを含む Ham'sF12培養液を用
，
感作にはさまざまなメカニズムが関与しているが (12ペ
いて継代維持された。
皮応における脱感作のメカニズムは各種の実験におい
ベータアドレナリン受容体キナーゼ 1(βARKl)に
c
y
c
l
i
cAMP(cAMP)産生量測定
cAMP産生量の測定に際しては，細胞は 2
4
w
e
l
lプ
4
レートを用いて 5x10 c
e
l
l
s
/
w
e
l
lの濃度で、播積後 2
4
よる受容体リン酸化はベータアドレナリン受容体など
の同種脱感作(川に関与する重要なメカニズムの…つで
“
ある。我々のこれまでの研究では，
ヒト宵癌細胞株
MKN45
!
にこおいで s
ARK11
はまヒス夕ミン H2受容体の
同積脱感作 l
にこ関与していることが示され t
ど
:
こ
(
α
l
ヘ
5
時間培幾された。この細胞に 1
0 1M のヒト PTH
研究により，
sARK1はベータアドレナリン受容体
のみならず， α2アドレナリン受容体 (6)， m2ムスカリ
払i
s
o
b
u
t
y
l閉
トm
e
t
h
y
l
x
a
n
t
h
i
n
e(IBMX) を含む HEPES
・・
ン受容体(17，18)
b
u
f
f
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r
dKrebs-Ringer'sb
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c
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r
b
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n
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eb
u
f
f
e
r(pH
4
) (KRBG) 緩 衝 液 を 用 い た 。 500μlの 12%
7.
c
1ω
3
4
)を3
7Cで 16
0分間投与した。この際，
0
1
O
-4
M
1
サ ブ ス タ ン ス P受容体(凶)などの
t
r
i
c
h
l
o
r
o
a
c
e
t
i
ca
c
i
d(TCA)を加えて皮応を停止し
G蛋白共役型受窓体の同種脱感作にも関与しているこ
3凹くり返した後，細胞をプレートから凹
とが明らかにされており， sARKlはG議自に共役す
凍結解凍を
る種々の受容体の共通する受窓体ニドナ…ゼである可能
0
0
μ
lの上清をとり， 2ml
のw
a
t
e
r
ω
収し遠心分離した。 5
性が考えられる。さらに，
s
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u
r
a
t
e
dd
i
e
t
h
yl
e
t
h
e
rで 3問抽出した。抽出後， この
ラット骨非細胞様細胞株
ROS17/2.8において sARK1活性が認められると
2
0
) ヒト骨芽細胞様細胞株 SaOS-2に
いう報告があり (
adioimmunoassayk
i
t
溶液中の cAMP濃度を cAMPr
K
)
C
2
32
4
) を用いて測定した。
(Amersham，U
，
おいて ßARK1 ないしごく類縁の G 蛋白共役型受~体
果たしていることも示されている則。ロドプシンなど
PTHC
13
4
)による cAMP産生の同種脱感作
1
1
O
- M ヒト PTHC
1
崎3
4
)梓在下ないし非存在下に， 5
の細胞を KRBG緩衝液中で 3
TCで 2分間培養を
x104
を含む G蛋白共役型受容体キナーゼの一つである sA
h
o
s
p
h
a
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b
u
f
f
e
r
e
ds
a
l
i
n
e (PBS)
行った。細胞を p
RK1はごく短時間にベータアドレナリン受容体のリ
で3
7Cにおいて 2分間
ン酸化を米すことが知られている(ヘしかし， βAR
IBMXおよび1O-7M ヒト PTHC
13
4
)を含む KRBG緩
K1がごく早期の PTH/PTHrP受容体の同種脱感作
7Cにおいて 2分間の培養後，
衝械にて培穫した。 3
に関与しているか否かについては解明されていない。
500μlの12%TCAを加えて反応を停止した。
キナーゼの活性化が PTH/PTHrP受容体の cAMP
産生の中期間種脱感作 (2時間以内)
0
3回洗浄した後， 1Q-4
M
0
7/2.8細 胞 に お け る PTH/
この研究では ROS 1
o
r
s
k
o
l
i
n帯在下ないし
対照群として1Q-5M f
PTHrP受容体のごく早期の受容体脱感作のメカニズ
，
こ 5x1
Q4
の細胞そ KRBG緩衝液中で 3
7Cで 2分
下l
受
ムを明らかにすることを目的とし， PTH/PTHrP
間培養を行った。細胞を PBSで3
TCにおいて 2分間，
容体のごく早期の受容体脱感作に sARK1が関与す
3回洗浄した後， 1O-4
o
r
s
M IBMXおよび1Q-5M のf
るかどうかを検討した。
k
o
l
i
nを含む KRBG緩衝液にで培養した。 3
70Cにおい
て 2分間の培養後. 5
00μlの12%TCAを加えて反応
0
法
を停止した。凍結解凍を 3回くり返した後，細胞融解
方
、濃度を上述の方法で測定した。
械に合まれる cAMP
使用試薬
Ham'sF12は ICNBiomedicals(Aurora，OH)
製，ウシ胎児血清 (
FBS)は大日本製薬(大阪)製の
phosphorothioate oligo-DNAによる ROS 17/
ものを用いた o 合成ヒト PTHC
1ω
3
4
)は P
e
p
t
i
d
e
適松子o
penr
e
a
d
i
n
gframe(ORF)
ラット sARK1
2
.
8
細胞の処理
.O
lN酢酸十 0.2%
I
n
s
t
i
t
u
t
e (大阪)より入手し， O
ウシ血清アルブミン (BSA)に溶解した。 [
3
2
P
J
α
"
上の 2
6
8“2
8
7
地基に対応する 20merの sARK1センス
0
0
0 Ci/mM) は
d
e
o
x
y
a
d
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n
i
n
et
r
i
p
h
o
s
p
h
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t
e(
3，
Amersham (Buckinghamshire，UK) 製を用いた。
を合成し， h
i
g
h
p
r
e
s
s
u
r
el
i
q
u
i
dchromatography
04
column (東亜合成，東京)にて精製した。 5X 1
のROS1
7/2.8
細胞を 2
4
w
e
l
lプレートに播種後 2
4時
間 培 養 し ， sARK1セ ン ス ま た は ア ン チ セ ン ス
細胞培養
7/2.8は
，
ラット骨芽細胞様細胞株 ROS 1
hosphorothioateoligoωDNA
またはアンチセンス p
2mM
p
h
o
s
p
h
o
r
o
t
h
i
o
a
t
eoligoωDNAを 2μMまたは 10μM
(2)
3
の濃度で 8時間毎に 2
4時間投与した。その後上述の方
さらに [
3
2
P
Jで標識したラット sARK1cDNA断片を
産生盤を測定した。
法で PTHを投与し，細胞の cAMP
2Cにで 1
6時間 h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nを行った。この
用いて 4
0
f
i
l
t
e
r membraneを0
.
2
x SSC/O.
1
%SDS 格 液 で
アンチセンス sARK1遺 伝 子 誘 導 発 現 系 の 作 製 お よ
5
0Cにで 2
0
分間， 2回洗浄した後， a
u
t
or
a
d
i
o
g
r
a
p
h
y
びROS1
7
/
2
.
8
細胞の処瑠
司会行った。さらに同じ f
i
l
t
e
rmembraneを脱 probe
0
幽
5
2
ラット sARKl cDNN
JのORF8
2
1
1
0
3境基に対応
[
3
2
P
Jで標識したうット β a
c
t
i
nprobeを用
処理後，
する 1
0
2
2
b
pの PCR断片を， t
e
t
r
a
c
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l
i
n
er
e
p
r
e
s
s
o
rが
聞
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nを 行 い ， 同 様 に 洗 浄 お よ び
いて再度 h
auto-radiographyを行った。
結合することにより遺伝子発現を抑制する t
e
t
r
a
ω
c
y
c
l
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n
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s
p
o
n
s
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tをもっ pTR日 e
x
p
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s
s
i
o
n
l
t
o，
CA)にサブクロ…
plasmidsC
C
l
o
n
t
e
c
h，PaloA
ニングした。 βARKlセンス mRNAを 発 現 し う る
i
n
s
e
r
tをもっ plasmidc
l
o
n
e CpTRE-sARKトS
)，
sARK1アンチセンス mRNAを発現しうる i
n
s
e
r
tを
統計処璃
全ての実験は 4回くり返し行った。得られたデータ
a
i
r
e
d Student
'stt
e
s
tに
はmean士SEで表示し， p
て統計学的に解析した。
もっ p
lasmidc
l
o
n
e CpTRE-sARK1~AS) を選別
のROS1
後，精製した。 3x
105
7/2.8細 胞 を 2
4時間
結
巣
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
er
e
p
r
e
s
s
o
rと h
e
r
p
e
s
培養し，大腸闘の t
simplexv
i
r
u
sのVP16p
r
o
t
e
i
nC末端部との融合蛋
ROS17/2.8
細胞における PTH
刺激による cAMP産
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
e
r
e
s
p
o
n
s
i
v
et
r
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n
s
c
r
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p
t
i
o
n
a
l
白である t
生の変化
a
c
t
i
v
a
t
o
rを発現する p
T
e
t
O
f
fplasmid C
C
l
o
n
t
e
c
h，
日OS1
7/2.8における PTH刺激による cAMP産 生
PaloA
l
t
o，CA)2.0μgをt
r
a
n
s
f
e
c
tした。 t
r
a
n
s
f
e
c
-
0…7Mヒト PTH(
1
鞠
の変化を検討するために，細胞に 1
t
i
o
nは12μgの DOSPERLiposomalT
r
a
n
s
f
e
c
t
i
o
n
Reagent C
B
o
e
h
r
i
n
g
e
r，Germany)を用いて行い，
100μg/mlの G418 CSigma，St
.Louis，MO) で
s
t
a
b
l
et
r
a
n
s
f
e
c
t
a
n
tc
l
o
n
eを選別した。選別された
ROS17/2.8T
e
t
O
f
f細胞に 1μg/mlのt
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
e
t
.Louis，MO)の 存 荘 下 ， あ る い は 非 存
CSigma，S
在下で pTRE sARK1-S，pTRE sARKI-AS，あ
3
4
)を投与した。図 1に示すように，副甲状腺ホルモ
ンの N末 端 断 片 で あ る ヒ ト PTH(
13
4
)はROS 17/
細胞の cAMP
産生を有意に上昇させた。ヒト PTH
2
.
8
(
13
4
)の刺激後 1分でその上昇が始まり， 1
0
分後には
4
最大の 2
8
6
7fmol/5X1
0 c
e
l
l
sに 議 し た 。 そ の 後
反応はわずかに低下し， 6
0
分後まで持続した口
欄
嶋
るいは対照の pTRE-Luc C
C
l
o
n
t
e
c
h，Palo A
l
t
o，
CA)を2
4時間，一過性に導入した。この系では， t
e
t
-
3000
oE乙 恥 芝 ︿υ
1
6t
r
a
n
s
c
r
i
p
t
i
o
n
a
la
c
t
i
v
a
t
o
rにより sARK1セン
スあるいはアンチセンス mRNAの発現を促進する o
コ
凶
t
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
er
e
s
p
o
n
s
i
v
eelement!こ結合させ， VP-
ωubFVA
門帥一戸
r
a
c
y
c
l
i
n
eの 非 存 在 は t
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
e r
e
p
r
e
s
s
o
rを
そ の 後 上 述 の 方 法 で PTHを 投 与 し 細 胞 融 解 液 中 の
cAMP産生最を測定した。
2000
1000
0
No
r
t
h
e
r
nb
l
o
t
法
guanidine i
s
o
t
h
i
o
c
y
a
n
a
t
e
心s
C
1
2法 を 用 い て
sARK1を誘導発現する ROS 17/2.8 T
e
t
O
f
f細 胞
o
t
a
lRNAを抽出した。この ROS17/2.8T
e
t
から t
O
f
f
細胞は 1μg/
mlt
e
t
r
a
c
y
l
i
n
eの滞在下，あるいは
0
時
酬
非存在"Fで‘ pTR
日
帰 sARK1-S，pTR
日 sARKI-AS，
あるいは対問、の pTRE
心u
cを 2
4時間，
…過性に導入
o
a
lRNA 2
0
されたものである。それぞれの細胞の t
μgを1.0%agarose-formaldehydeg
e
l
lこて電気泳
n
i
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r
o
c
e
l
l
u
l
o
s
emembrane C
S
c
h
l
e
i
c
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e
r&
S
c
h
u
e
l
l，Dassel，Germany) にt
r
a
n
s
f
e
rを行い，
動し，
4
0
20
間
60
(分)
7/2.8細胞におけるヒト PTH(
13
4
)に
図 l ROS 1
産生の時間的変化
よる cAMP
5XI04
ROS17/2.8
細胞を 2
4
w
e
l
lプレート
に播種後， l
O%FBSを加えた Ham'sF
1
2培養液
4時間培養した。 3TCPBSで2
回洗浄後，さら
で2
に1
0…4MIBMXおよび1O-7
13
4
)を
M ヒト PTHC
含む KRBG
緩衝液で種々の時間培養した。 5
0
0
μ
1
の12%TCAを加えて反応を停止し， cAMP濃度
をR
IA!こて測定した。
(3)
4
ROS1
7
/
2
.
8
細胞における PTH
刺激による cAMP産
と同様，ヒト PTH(
13
4
)による cAMP産生は再投与
生の同種脱感作
群⑫)では初回投与群(.)の約 70%であった。こ
図 2に示すように， ROS 1
7
/
2
.
8細胞にヒト PTH
れに対し
2μMまたは 10μMの濃度の βARK1ア
(
13
4
)を 2分間前投与した場合，再投与時の cAMP産
ンチセンス oligo-DNAで2
4時間処理した場合，
生が有意に抑制された。細胞内で産生された cAMP
PTH(
13
4
)による cAMP産 生 は 再 投 与 群 ⑫ ) で は
は初回投与群(・) 3
0
6
0士 3
1
4fmol/5X1
0c
e
l
l
s
初回投与群(.)のそれぞれ約82%(2μM)および約
に対し再投与群⑫) 1
7
3
3:
t
:2
0
5 fmol/5X1
0c
e
l
l
s
94% (
10μM)であった。これらの結果は， アゴニス
4
4
ヒト
であった。一方， f
o
r
s
k
o
l
i
nによる cAMP産生は初回
トであるヒト PTH(
13
4
)による cAMP産生の同種脱
投与群(圃) 2
9
1
3:
t
:3
3
2 fmol/5X1
0c
e
l
l
sに対し
感作は sARKlアンチセンス oligo-DNAで一部抑制
再投与群(協) 2
7
7
0:
t
:3
8
0 fmol/5X1
04c
e
l
l
sと
，
されたことを示している。反対に βARK1センス
cAMP産生の有為な低下は認、められなかった。
oligo-DNAは
， ヒト PTH(
13
4
)の前投与で生じる再
投与後の cAMP
産生の抑制に殆ど影響を与えなかっ
細胞におけるヒト PTH(
13
4
)刺激によ
ROS1
7
/
2
.
8
るcAMP産生の同種脱感作に対する βARK1セン
スおよび sARK1アンチセンス p
h
o
s
p
h
o
r
o
t
h
i
o
a
t
e
oligo-DNAの影響
ROS1
7
/
2
.
8
細胞におけるヒト PTH(
13
4
)刺激に
よる cAMP
産生の同種脱感作に対する sARK1の影
響を検討する目的で，細胞に βARK1センスまたは
f
こD
ROS1
7
/
2
.
8
細胞におけるヒト PTH(
13
4
)刺激によ
産生の同種脱感作に対する βARK1センス
るcAMP
またはアンチセンス mRNAの影響
ヒト P
TH(1-34)刺激による cAMP産生の同種脱感
作における sARK1の関与をさらに検討する目的で，
sARK1アンチセンス p
h
o
s
p
h
o
r
o
t
h
i
o
a
t
eo
l
i
g
o
DNAを
， 2μMまたは 10μMの濃度で 8時間毎に 2
4
ROS17/2.8Tet-Off細胞に 1μg/mlのt
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
e
の存在下あるいは非存在下で， pTRE-sARK1-S，
時間投与した。図 3に示すように， ROS 1
7
/
2
.
8細
pTRE-sARK1-AS，あるいは対照群として pTRELucを一過性に導入した。図 4に示すように，導入さ
れた p
lasmidからの mRNAの発現を抑制する t
e
t
r
a
-
4
胞を 2μMまたは 10μMの濃度の βARK1センス o
l
i
g
o
-
DNAで2
4時間処理した場合，処理なし対照群 (H20)
4000
4000
¥
a
z
d
E 百Eh
旦言。 b F X凶
3000
.
百
3000
ロ
x
、
2000
u
z
2000
u
E
1000
1000
初回控与頁持与
PTH(1'34)
2μM
制1
司持与高持与
10μM
sAAKlセンス。 I
I
g
o
・
DNA
forskolin
図 2 ヒト PTH(
13
4
)による cAMP産生の同種脱感作
4
5x10ROS1
7
/
2
.
8
細胞を1O-7M ヒト PTH
5
(
13
4
)または1O- M f
o
r
s
k
o
l
i
nの 存 在 下 ⑫ )
あるいは非存在下(・)に KRBG緩衝液にて
3TC2分間培養した。 PBSで 2回洗浄後， 1
0
-4
7
M IBMXと1O- M ヒト PTH(
13
4
)もしくは
1
0
-5Mf
o
r
s
k
o
l
i
nを含む KRBG緩衝液にて培
養した。 3TC2分間培養後， 5
00μlの12% TCA
を加えて反応を停止し， 細 胞 融 解 液 の
cAMP濃度を RIAにて測定した。.P<0.05
NS有意差なし
2μM
10μM
H
，
O
sAAK17ンチセンス ollgo.DNA
図 3 ROS1
7
/
2
.
8
細胞におけるヒト PTH(
13
4
)刺激
による cAMP
産生の同種脱感作に対する sARK1
センスまたはアンチセンス p
h
o
s
p
h
o
r
o
t
h
i
o
a
t
e
oligo-DNAの影響
5X104ROS1
7
/
2
.
8
細胞を sARK1センス
oligo-DNA，もしくは sARK1アンチセンス
oligo-DNAあ る い は 対 照 と し て の 蒸 留 水
(H20)を含む培養液で 2
4時間培養した。 PBS
で洗浄後1O-7M ヒト P
TH(1-34)の存在下(協)
もしくは非存在下(・)に KRBG緩衝液で 2
分間処理し，続いて1O-7M ヒト PTH(
13
4
)で
さらに 2分間処理した後，細胞融解液の cAMP
濃度を R
IA'
こて測定した。 '
P
<
0
.
0
5・
・P<O.Ol
NS有意差なし
(
4
)
5
4000
・
ω
W 0HX刷、色Z︿
駒
山
一
首H
-28s
3000
。
由
2000
紬
sAF
司K
l
E
恥
.
1
8
$
1000
ω
s
一
朗
円ME 唱 '
a
μ
T
一K
m
C一
T-P
明
TC(+l
T
C
(
)
pTRE-sARK1・
AS
TC(+)
f
3a
:
c
t
i
n
TC(
・
}
pTRE-Luc
図 4 ROS 1
7/2.8細 胞 に お け る ヒ ト PTH(
1ω
3
4
)
図 5 ROS1
7
/
2
.
8
T
e
t
O
f
f
細胞における βARKl誘
刺激による cAMP産生の同種脱感作に対する
sARK1センスまたはアンチセンス mRNAの
影響
5x1
04ROS 17/2.8Tet-Off細胞に lμg/
Jあるいは
ml t
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eの存在下 [TC(十 )
TC(一)
Jで. pTRE-sARK1-S，
非存在下 [
pTR日
制 sARK1-AS，あるいは pTR
E
・
心u
cを
一過性に導入した。 PBSで洗浄後1Q-7M ヒト PTH
(
1
3
4
)の存在下働)もしくは非存在下(幽)
にKRBG
緩街械で 2分間処理し、統いて 1
0
-7
13
4
)でさらに 2分間処瑚した後，
M ヒト PTH(
細胞融解液の cAMP
濃度を RIAI
こで測定した口
市く0
.
0
5本
市<0.01NS有意差なし
導発現の No
r
t
h
e
r
nb
l
o
t
法による検討
lμg/mlt
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eの存在下 [TC(十 )
J
C
la
ne1， 3お よ び 5) あ る い は 非 存 在 下
[TC(一 )
JC
lane2， 4および 6)で
， pTREβARK1-S Oane1および 2)， pTRE sAR
K1-AS C
la
n
e3および 4)，あるいは pTR日
制
Luc C
la
ne5および 6)を一過性に導入した
ROS1
7
/
2
.
8
T
e
t
O
f
f細 胞 か ら 抽 出 し た t
o
t
a
l
r
t
h
e
r
nb
l
o
t法で解析した。上段は
RNAをNo
c
t
i
nの遺
ラット sARK1の，下段はうット sa
伝子DNA断片を標識プローブとして用いた結
果を示す。
田
c
y
c
l
i
n
eの存在下 [TC(十 )
Jでは， ROS17/2.8細胞で
RNAはβARK1センスまたはアンチセンス mRNA
の PTH C1 -34) による cAMP~窓生は再投与群(閣)で
を強く発現しており，反対に mRNA告抑制するため
は初回投与群(聞)の約4
1ないし 60%であり，これら
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eの存在下にあった細胞Clane1および
にt
のp
lasmidからの mRNAの発現の抑制は，
3)では βARK1センスまたはアンチセンス mRNA
ROS
の発現はわずかに留まった。これらの結果は ROS1
7
13
4
)刺 激 に
1
7
/
2
.
8
T
e
t
O
f
f細胞におけるヒト PTH(
よる cAMP
産生の問種脱感作に影響を与えなかった。
/2.8Tet・O
f
f
細胞において mRNAの誘導発現系が良
一方，導入された p
lasmidからの mRNAの発現を促
好に機能していることを示す。
e
も
r
a
c
y
c
l
i
n
eの非存在下山 C(一)
Jでは，
進するための t
pTR払 Lucを導入された ROS1
7
/
2
.
8
T
e
t
心f
f細
ROS17/2.8細胞での PTH(
13
4
)による cAMP康生
n
e5および 6)では， t
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eの 存 在 下
胞Cla
払 βARK1-S
導入細胞の再投与群(協)で
は
， pTR
ne5)でも非存夜下Clane6) でも sARK1セン
C
la
は初回投与群(聞)の約 56%， pTRE-sARK1-AS導
スまたはアンチセンス mRNAの発現は認められなか
入細胞で約89%，また pTRE
ふu
c
導入細胞で約63%で
、
あ
った。
u
c
i
f
e
r
a
s
e
り， sARK1センス mRNAおよび対照の l
考
mRNAは同種脱感作に影響を与えなかったのに対し，
察
sARK1アンチセンス mRNAはヒト P
T
H
(
1
3
4
)刺激に
PTH!こ対する PTH/PTHrP受容体の同種脱感作
よる cAMP
産生の問種脱感作を有意に抑制した。
t
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eの非帯租により sARK1センスまたは
アンチゼンス mRNAが誘噂されていることを確認す
る目的で，
こ伴い，いくつかの興なるメカニ
についての研究の進展 l
e
p
e
n
d
e
n
tk
i
n
a
s
e
ズムが明らかにされている。 cAMPd
これらの細胞から抽出した t
o
t
a
l RNA
および cAMPには依存しないその他の機序が受容体
を No
rtherm b
l
o
t法 で 検 討 し た 。 岡 5に示すよう
脱感作に関与するとされており(Jへまた 2時間後に最
に
， pTRE-sARK1-S Oane1および 2)あるいは
r
o
t
e
i
nk
i
n
a
s
e Cの脱感作機序
大の効巣をあらわす p
pTR日
明 sARKI-AS C
la
ne3および 4) を導入され，
も存在する (26，ヘ受容体の down r
e
g
u
l
a
t
i
o
nは種々
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eの非存在下にあった日 OS17/2.8
かつ t
の受容体で脱感作の服閣となるが， PTH/PTHrP
受
T
e
t
O
f
f細胞Clane2および 4)から抽出された t
o
t
a
l
容体においてもこのメカニズムが働いていることが確
(5)
6
認されており (28，ペ異種のリガンドによる downr
e
g
-
導発現させることにより内因性の βARK1 mRNA
u
l
a
t
i
o
nのメカニズムでも PTH/PTHrP受容体の脱
感作を起こしうるとされている (30，
3
九 な か で も βAR
在状態におくと pTRE-sARK1-ASを 導 入 さ れ た
の作用の抑制を試みた。培養液を t
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eの非存
することでベータアドレナリン受容体制およびその他
ROS1
7
/
2
.
8
T
e
t
O
f
f
細胞内で sARK1アンチセンス
mRNAが誘導され， PTH(
13
4
)刺激による cAMP産
のG蛋白共役型受容体(川の同種脱感作に重要な機能を
生のごく早期の脱感作が抑制された。しかしながら，
もつことが知られている。最近の研究では， ROS1
7
/2.8
細胞においてラット sARK1 mRNAが見い出
t
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eを投与すると pTRE-βARK1-ASを導
7
/
2
.
8
T
e
t
O
f
f
細胞内で sARK1アン
入された ROS1
され，
チセンス mR~A の発現が抑制され，脱感作抑制は認
g
o
n
i
s
tが結合した受容体を特異的にリン酸化
K1はa
レチナール光受容体で、あるロドプシンをリン酸
化する βARK1
様活性がラット骨芽細胞様細胞 UMR
められなかった。また pTRE-sARK1-Sあ る い は
1
0
6
H
5で確認されている (20)。さらにヒト骨芽細胞様
細胞 S
aOS-2において sARK1ないしごく類縁の G蛋
白共役型受容体キナーゼの活 性化が PTH/PTHrP
受
産 生 の 早 期 同 種 脱 感 作 (2時間以内)
容体の cAMP
pTRE-Lucを導入された ROS1
7
/
2
.
8
T
e
t
O
f
f細胞で
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eは脱感作に影響を与えなかった。
はt
これらの結果は， βARK1アンチセンス mRNAが
ARK1の内因性mRNAの翻訳を阻止し， βARK1蛋
に重要な役割を果たしていることも報告されている(幻)O
白が減少し，そのために受容体脱感作が抑制されたこ
sARK1は3
0
分以内など早期にベータアドレナリン
受容体のリン酸化を来すことが知られているが (22)
とを示唆している。遺伝子導入された ROS1
7
/
2
.
8
T
e
t
O
f
f
細胞において sARK1センスまたはアンチセ
sARK1が数分以内などごく早期の PTH/PTHrP
ンス mRNA
が誘導されていることを確認する目的で，
受容体の同種脱感作に関与しているか否かについては
抽出された t
o
t
a
lRNAをNo
r
t
h
e
r
nb
l
o
t法で、検討し
知られていない。
た
。 pTRE-sARK1-Sあるいは pTRE-sARK1-AS
s
J
を導入し，かっ， t
e
t
r
a
c
y
c
l
i
n
eの非存在下で培養した
受容体のごく早期
今回の研究では， PTH/PTHrP
の受容体脱感作に sARK1が関与することを初めて
ROS1
7
/
2
.
8
T
e
t
O
f
f細胞では， t
o
t
a
l RNA中に，
明かにした。 PTH(
13
4
)をROS1
7
/
2
.
8細胞に投与
誘導された sARK1mRNAの発現が認められた。
すると細胞内 cAMP
産生は急速に上昇し，最初に投
これらの結果は βARK1 mRNAの誘導発現系が良
与されたリガンドを十分に洗浄除去した後 PTH(
13
4
)
好に働いていることを意味している o
を再投与すると細胞内 cAMP産生の上昇は有意に抑
ベータアドレナリン受容体にリガンドが結合すると，
制された。この結果は PTH/PTHrP受容体に同種脱
sARK1.続いて cAMP-dependentk
i
n
a
s
e(
p
r
o
t
e
i
n
k
i
n
a
s
eA)のリン酸化が起こり，それによって短時
感作が生じたことを意味するものである。これに対し，
a
d
e
n
yl
yl
c
y
c
l
a
s
eを直接活性化する f
o
r
s
k
o
l
i
nでは再
産生の抑制が認められなかった。
投与後の細胞内 cAMP
1
田3
4
) による PTH/PTHrP
これらの結果より， PTH(
間(数秒から数分)の刺激が原因となる同種脱感作が
生じることが知られている (22)0
sARK1とG蛋白の
受容体に対する cAMP産生反応の脱感作は， PTH/
srs
u
b
u
n
i
tおよび受容体からなる複合体が形成され
受容体のリン酸化が起こると，今度は受容体と G蛋
PTHrP受容体を含めて adenyl
yl
c
y
c
l
a
s
eよりも上流
白の相互作用が抑制され，細胞内情報伝達系が抑制さ
のメカニズムが原因となっていることが示唆された。
s
u
b
u
n
i
tの
れる。このメカニズムにおける G蛋白の sr-
受容体脱感作におよぼす sARK1の影響を検討す
関与は他の G蛋白共役型受容体のリン酸化においても
h
o
s
p
h
o
r
o
t
h
i
o
a
t
e
るために， sARK1アンチセンス p
e
q
u
e
s
t
r
a
認められている (33)。 さ ら に ， 受 容 体 の s
oligo-DNAにより sARK1の内因性 mRNAの翻訳
を阻止すると，ごく早期である 2分後に PTH(
13
4
)
による cAMP
産生の脱感作は抑制された。これに対
ligo-DNAは対照群と同様にこ
して sARK1センス o
t
i
o
n(細胞質への一過性の移行)もまた受容体の同種
の脱感作を抑制しなかった。これらの結果は，
sARK1アンチセンス oligo-DNAが βARK1の内因
蛋白が減少し，
性mRNAの翻訳を阻止し， βARK1
そのためにごく早期の受容体脱感作が抑制されたこと
を示唆する。
7
/
2
.
8
T
e
t
これらの結果を確認するために， ROS1
O
f
f
細胞において sARK1アンチセンス mRNAを誘
脱感作に関与すると考えられている(判。今回の研究で
e
c
o
n
d messengerである cAMPは
は，細胞内の s
PTH(
13
4
)投与後 1分で上昇したため，細胞内の情
報伝達は 1分以内に開始されていると考えられる。 β
ARK1は数秒から数分で作用するため， ごく早期の
PTH/PTHrP受容体の同種脱感作を検討する今回の
実験では， PTH(
13
4
)の初回投与と再投与の間隔を
2分とした。最終的に PTH(
13
4
)による cAMP産生
の同種脱感作は 2分で生じること， βARK1がこの
機序に関与していることが見い出された。この結果は，
(6)
7
PTH/PTHrP受容体におけるごく早期の同種脱感作
に sARK1が関与することを示唆している。 βARK
1はベータアドレナリン受容体， α2アドレナリン受容
体 (6)，m2ムスカリン受容体(陀ペヒスタミン H2受 容
体(ペサブスタンス P受容体 (19)などいくつかの G蛋白
guanyl n
u
c
l
e
o
t
i
d
e s
e
n
s
i
t
i
v
e parathyroid
hormone r
e
c
e
p
t
o
ri
nc
a
n
i
n
er
e
n
a
lc
o
r
t
e
x
.
Biochemistry2
6:1
8
7
4
1
8
7
8，1
9
8
7
PTH/PTHrP受容体も含めた G蛋白共役型受容体に
6
.S
c
h
i
p
a
n
i，E
.
， Kruse，K
.，Juppner，H
.
:A
c
o
n
s
t
i
t
u
t
i
v
e
l
ya
c
t
i
v
e mutant PTH/PTHrP
r
e
c
e
p
t
o
ri
nJa
n
s
e
n
t
y
p
e metaphyseal chondr
o
d
y
s
p
l
a
s
i
a
.S
c
i
e
n
c
e2
6
8:9
8
1
0
0，1
9
9
5
共通した受容体キナーゼである可能性が考えられる。
7
. Yoshida，Y.，Sakamoto，Y.，Yoshimine，
共役型受容体の同種脱感作にも関与しているので，
βARK1アンチセンス oligo-DNAもsARK1アンチセ
A.，Maruyama，Y.，Ikegami，N.，I
n
o
s
e，M.，
ンス mRNAも脱感作を完全には抑制し得なかったので，
Imamura，H.，Nakahara，K.，Nakagawa，M.，
sARK1はROS1
7
/
2
.
8細胞における PTH/PTHrP
Osame，M
.
: Three c
a
s
e
so
fj
u
v
e
n
i
l
eo
n
s
e
t
受容体のごく早期の受容体脱感作のメカニズムに部分
HTLVI
a
s
s
o
c
i
a
t
e
dmyelopathywithpseudo-
的に関与しているとも考えられる o このことは PTH
hypoparathyroidism.J
.Neurol
.S
c
i
.1
1
8
:1
4
5
1
4
9，1
9
9
3
/PTHrP受容体のごく早期の受容体脱感作に sAR
K1による受容体リン酸化以外のメカニズムがあるこ
i
nboneremodeling:anexpandingr
o
l
ef
o
rt
h
e
o
s
t
e
o
b
l
a
st
.A mJO
tolaryngol8:2
5
8
2
6
4，1
9
8
7
8
.S
p
i
e
g
e
l，A.M.，W
e
i
n
s
t
e
i
n，L
.
S
.，Shenker，A
.
:
Abnormalities i
nG p
r
o
t
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