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JP 2012-508689 A 2012.4.12 10 (57)【要約】
JP 2012-508689 A 2012.4.12 (57)【要約】 【課題】本発明は、イワヤツデ抽出物およびそれから分離したアセリフィル酸Ａと３−オ キソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸を含む抗菌用薬学組成物に関する。 【解決手段】本発明は、イワヤツデ抽出物およびそれから分離したアセリフィル酸Ａと３ −オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸を含む抗菌用薬学組成物に関する。本発 明によるイワヤツデ抽出物およびそれから分離したアセリフィル酸Ａと３−オキソ−１２ −オレアネン−２７−オイック酸は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、メチシ リン耐性黄色ブドウ球菌(Methicillin-resistant S. aureus)、キノロン耐性黄色ブドウ 球菌(Quinolone-resistant S. aureus)、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinet obacter calcoaceticus)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、枯草菌(Bac illus subtilis)またはストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、に きび菌(Propionibacterium acnes)に対して、強力な抗菌活性を示すことにより、病原性 細菌、耐性菌、虫歯誘発菌およびにきび誘発菌の予防または、治療に有用に使用され得る 。 10 (2) JP 2012-508689 A 2012.4.12 【特許請求の範囲】 【請求項１】 イワヤツデ抽出物(Aceriphyllum rossii extract)を含む抗菌用薬学組成物。 【請求項２】 前記イワヤツデ抽出物は、イワヤツデ根抽出物であることを特徴とする請求項１に記載 の抗菌用薬学組成物。 【請求項３】 前記イワヤツデ抽出物は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、メチシリン耐性 黄色ブドウ球菌(Methicillin-resistant S. aureus)、キノロン耐性黄色ブドウ球菌(Quin olone-resistant S. aureus)、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter c 10 alcoaceticus)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、枯草菌(Bacillus sub tilis)およびストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、にきび菌(Pro pionibacterium acnes)から構成される群より選択される一つ以上の微生物に対して抗菌 活性を示すことを特徴とする請求項１に記載の抗菌用薬学組成物。 【請求項４】 アセリフィル酸Ａ(aceriphyllic acid A)または３−オキソ−１２−オレアネン−２７ −オイック酸(3-oxo-12-oleanen-27-oic acid)を含む抗菌用薬学組成物。 【請求項５】 前記アセリフィル酸Ａまたは３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、イ ワヤツデ根から抽出分離して得たものであることを特徴とする請求項４に記載の抗菌用薬 20 学組成物。 【請求項６】 前記アセリフィル酸Ａまたは３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、黄 色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Methicillin-re sistant S. aureus)、キノロン耐性黄色ブドウ球菌(Quinolone-resistant S. aureus)、 アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、ミクロコッカ ス・ルテウス(Micrococcus luteus)、枯草菌(Bacillus subtilis)およびストレプトコッ カス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、にきび菌(Propionibacterium acnes)から 構成される群より選択される一つ以上の微生物に対して抗菌活性を示すことを特徴とする 請求項４に記載の抗菌用薬学組成物。 30 【請求項７】 イワヤツデ抽出物を含む口腔用組成物。 【請求項８】 アセリフィル酸Ａ(aceriphyllic acid A)または３−オキソ−１２−オレアネン−２７ −オイック酸(3-oxo-12-oleanen-27-oic acid)を含む口腔用組成物。 【請求項９】 前記アセリフィル酸Ａまたは３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、イ ワヤツデ根から抽出分離して得たものであることを特徴とする請求項８に記載の口腔用組 成物。 【請求項１０】 40 請求項７または、請求項８の組成物を含む口腔衛生用品。 【請求項１１】 前記口腔衛生用品は、歯磨き粉、口腔用洗浄剤および口腔用清浄剤から構成されるもの である請求項１０に記載の口腔衛生用品。 【請求項１２】 イワヤツデ抽出物を含む抗にきび剤組成物。 【請求項１３】 アセリフィル酸Ａ(aceriphyllic acid A)または３−オキソ−１２−オレアネン−２７ −オイック酸(3-oxo-12-oleanen-27-oic acid)を含む抗にきび剤組成物。 【請求項１４】 50 (3) JP 2012-508689 A 2012.4.12 前記アセリフィル酸Ａまたは３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、イ ワヤツデから抽出分離して得たものであることを特徴とする請求項１３に記載の抗にきび 剤組成物。 【請求項１５】 イワヤツデ抽出物を含むにきび改善化粧料組成物。 【請求項１６】 アセリフィル酸Ａ(aceriphyllic acid A)または３−オキソ−１２−オレアネン−２７ −オイック酸(3-oxo-12-oleanen-27-oic acid)を含むにきび改善化粧料組成物。 【請求項１７】 前記アセリフィル酸Ａまたは３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、イ 10 ワヤツデから抽出分離して得たものであることを特徴とする請求項１６に記載のにきび改 善化粧料組成物。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 本発明は、イワヤツデ抽出物(Aceriphyllum rossii extract)およびそれから分離した 活性成分を含む抗菌性薬学組成物に関する。 【背景技術】 【０００２】 病原性微生物による直接あるいは間接的な被害は、経済、環境、医学的に多くの問題を 20 引き起こさせている。食品産業における食品流通過程中の腐敗による損失、農産業におけ る農作物に対する過量の化学殺虫剤の使用による人体の有害性および環境汚染、抗生剤の 呉濫用による抗生剤耐性菌株の出現など社会全般において多くの問題を引き起こさせてい る。 【０００３】 人体感染の最もありふれている原因菌である黄色ブドウ球菌の最後の治療剤として知ら れているバンコマイシンに高度の耐性を見せるブドウ球菌(vancomycin-resistant staphy lococcus aureus，VRSA)が、２００２年アメリカ疾病予防管理センター(Centers for Dis ease Control)で世界最初に報告されることによって、いわゆるスーパーバクテリアの拡 散の可能性が非常に高まっている。これは、バンコマイシンによってのみ治療になるメチ 30 シリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant s. aureus，MRSA)が１９７０年代か ら問題視された以後、１９８８8年バンコマイシンに耐性を見せる腸球菌(vancomycin res istant enterococcus，VRE)がヨーロッパで初めて発見され、１９９０年後半には日本、 アメリカ、フランス、韓国で報告されたバンコマイシンに耐性を見せる黄色ブドウ球菌(v ancomycin intermediate-resistant s. aureus，VISA)が発生しながら、全世界的な危機 に浮び上がった抗生剤耐性の新しい例として耐性問題がどれくらい深刻なのかを見せてお り、新しい抗生剤開発が至急に要求されている(Pfeltz, R. F. and Wilkinson, B. J. 20 04. The escalating challenge of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. Drug targets-infect. Disord. 4: 273-294.; Levy, S. B. and Marshall, B. 2004. Ant ibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nature Med. 1 40 0: 122-129.)。 【０００４】 現在の使用されている大部分の抗生剤は、化学的な合成によって製造されたものであっ て、高いコストが所要され、副作用を誘発するなどの多くの限界を有する。したがって、 最近では、天然物から新しい抗菌物質を分離しようとする研究が活発に進行している。天 然物から新しい抗菌物質を分離するためには、抗菌スペクトルが広範囲であり、長期間投 与しても副作用の無しで安全でなければならないという点などを考慮しなければならない 。 【０００５】 一方、一般的に口腔疾患は、口腔に生きている各種細菌などによって発生する。 これ 50 (4) JP 2012-508689 A 2012.4.12 らの細菌は、虫歯を発生させる細菌と歯ぐき疾患を誘発させる細菌に区分することができ る、代表的に虫歯誘発菌であるストレプトコッカス・ミュータン (S. mutans)菌と歯周疾 患誘発菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス(P. gingivalis)が挙げられる。このよ うな口腔菌を除去するために、各種消毒剤などが口腔用製品に多く使用されてきた。口腔 用製品に使用される消毒剤には、塩化セチルピリジニウム、塩化ヘキサルコニウム、塩化 ベンザルコニウム、塩化デカリニウム、クロルヘキシジン、トリクロサン、チモール、イ ソプロピルメチルフェノール、アルキルジアミノエチルグリシン塩酸塩などの原料、天然 抽出成分であるポリフェノール類、銀成分などがある。最近では、自然抽出物に対する関 心が増加しながら各種植物に対する研究が活発に進行しており、口腔への効果などが知ら れながら多くの植物抽出物などが口腔疾患予防などに係わった口腔用組成物に応用されて 10 いる。 【０００６】 にきびは、顔、首、胸、背中などの皮膚表面に炎症を引き起こす皮膚疾患である。主に 若い人で発生するが、その原因は、ホルモンの不均衡、細菌感染、ストレス、食品、化粧 品など様々である。特に、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes )が主なにきび菌である。この菌は、皮膚表面に存在して皮脂腺や毛穴に炎症を誘発する 。この菌は、リパーゼ(lipase)を分泌して皮脂を脂肪酸に分解するが、この脂肪酸が強力 ににきびを誘発させる。この脂肪酸は、毛嚢(hair follicle)を刺激してにきびが初期症 状である面皰(comedo)を形成する。面皰は、皮脂腺の出口が塞がって生じた小さい皮脂嚢 をいう。また、にきび細菌は、白血球化学媒介伝達物質(leukocyte chemotatic factors) 20 を分泌して白血球を毛嚢に浸透するようにする。この白血球は、毛嚢を刺激して結局、破 壊する。したがって、プロピオニバクテリウム・アクネスは、炎症誘発物質を分泌してに きびを引き起こす菌として知られている。にきびの治療剤としては、炎症を抑制したり抗 細菌物質が使用されている。例えば、トリクロサン、過酸化ベンジール、アゼライン酸、 レチノイド、テトラサイクリン、エリスロマイシン、マクロライド、クリンダマイシンが 使用されている。しかし、これらの抗生剤は、副作用を引き起こす。過酸化ベンジールと レチノイドは、多量使用されると、皮膚乾燥症(xerosis cutis)と皮膚刺激(skin irritat ion)を引き起こし、テトラサイクリン、エリスロマイシン、マクロライド、クリンダマイ シンは、長期間使用時、耐性菌出現、組織損傷、免疫過敏性(immunohypersensitivity)を 引き起こす。特に、トリクロサンは、光に曝された時に環境ホルモンに変形されて深刻な 30 環境汚染を引き起こす。したがって、副作用がなく、強力な抗菌活性を示す物質が必要で ある。 【０００７】 一方、イワヤツデ(岩八手、Aceriphyllum rossi)は、バラ目ユキノシタ科の双子葉植物 に属する高さが１０∼３０ｃｍである多年生草本でムクデニア（mukdenia)またはサクシ フラガ(Saxifraga)とも呼ばれる。葉が紅葉の葉と類似しており、岩地に生えて石紅葉と も呼ばれる。イワヤツデの花、手の平形の葉は、縁が５∼７個で深く分かれ、鋸歯があり 、表面は光沢が出る。特に、幼い葉は食用する。イワヤツデは、強心と利尿作用の効能が あるので、心悸亢進、小便不利に一日１０∼１５ｇを水で煎じて服用する。民間では、根 をセキショウの代用で使用することもある。イワヤツデの有効性分としては、トリテルペ 40 ン化合物とフラボノイド化合物が含まれている。トリテルペン化合物は、癌細胞(K562，H L-60)に対する細胞毒性とＡＣＡＴ除害活性が知られており、フラボノイド系化合物は、 抗酸化活性が報告されている(Han et al., Arch Pharm Res 27:390-395，2004)。 【０００８】 前記したように、イワヤツデに対して様々な薬理活性が報告されているが、まだイワヤ ツデの抗菌活性に対する報告および研究は全くない状態である。 【発明の概要】 【発明が解決しようとする課題】 【０００９】 本発明の目的は、イワヤツデ抽出物およびそれから分離した活性成分を含む抗菌性薬学 50 (5) JP 2012-508689 A 2012.4.12 組成物を提供することにある。 【００１０】 本発明の他の目的は、イワヤツデ抽出物およびそれから分離した活性成分を含む抗菌性 口腔用組成物を提供することにある。 【００１１】 本発明のまた他の目的は、イワヤツデ抽出物およびそれから分離した活性成分を含む抗 にきび剤組成物およびにきび改善化粧料組成物を提供することにある。 【課題を解決するための手段】 【００１２】 これに、本発明者らは、植物資源から新しい抗菌物質を探索するために、２０００種余 10 りの植物抽出物から細菌の生育阻害活性物質をスクリーニングしている中に、イワヤツデ 抽出物およびそれから分離した活性物質が病原性細菌、耐性菌、虫歯誘発菌およびにきび 誘発菌に対して強力な抗菌活性を有することを確認して本発明を完成した。 【発明を実施するための形態】 【００１３】 本発明は、イワヤツデ抽出物およびそれから分離した活性成分を含む抗菌性薬学組成物 を提供する。 【００１４】 以下、本発明に対して、詳細に説明する。 【００１５】 20 本発明によるイワヤツデ抽出物およびそれから分離した活性成分は、下記のような方法 で抽出分離して製造される。 具体的に、乾燥されたイワヤツデの根をメタノールなどの有機溶媒に加え、攪拌して有 効性分を抽出した後、減圧濃縮して有機溶媒を蒸発させてイワヤツデ根のメタノール抽出 物を得る。前記イワヤツデ根のメタノール抽出物を酢酸エチルで溶媒抽出し、酢酸エチル 層を減圧濃縮および凍結乾燥して粉末形態のイワヤツデ根の酢酸エチル抽出物を得る。前 記イワヤツデ根の酢酸エチル抽出物をクロロホルム：メタノール(１０：１)溶媒を用いて シリカゲルカラム薄層クロマトグラフィーを行って活性分画を得る。前記活性分画を再び クロロホルム：メタノール(３０：１)溶媒を用いてシリカゲルカラム薄層クロマトグラフ ィーを行って純粋な化合物１および化合物２を得る。前記化合物１および化合物２は、そ 30 れぞれアセリフィル酸Ａ(aceriphyllic acid A)および３−オキソ−１２−オレアネン− ２７−オイック酸(3-oxo-12-oleanen-27-oic acid)で同定した。 【００１６】 前記アセリフィル酸Ａおよび３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、薬 学的に許容可能な塩の形態で使用されることができ、通常の方法によって製造されるすべ ての塩、エステル誘導体、水和物および溶媒化物を含むことができる。前記の塩としては 、薬学的に許容可能な遊離酸(free acid)により形成される酸付加塩が有用である。遊離 酸としては、無機酸と有機酸を使用することができ、無機酸としては、塩酸、臭素酸、硫 酸、リン酸などを使用することができ、有機酸としては、クエン酸、酢酸、乳酸、マレイ ン酸、フマル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエ 40 ンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ガラクツロン酸、エンボン酸、グルタミン酸またはア スパラギン酸などを使用することができる。 【００１７】 本発明のアセリフィル酸Ａおよび３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は 、天然生薬材、例えば、イワヤツデから抽出分離して使用したが、化学的な合成方法で製 造するかまたは、市販される試薬を購入して使用することもできる。 【００１８】 本発明によるイワヤツデ抽出物およびそれから分離したアセリフィル酸Ａおよび３−オ キソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus )、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Methicillin-resistant S. aureus)、キノロン耐性黄 50 (6) JP 2012-508689 A 2012.4.12 色ブドウ球菌(Quinolone-resistant S. aureus)、アシネトバクター・カルコアセティカ ス(Acinetobacter calcoaceticus)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、 枯草菌(Bacillus subtilis)またはストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mu tans)、にきび菌(プロピオニバクテリウム・アクネス：Propionibacterium acnes)に対し て強力な抗菌活性を示す。したがって、本発明によるイワヤツデ抽出物およびそれから分 離したアセリフィル酸Ａおよび３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、病 原性細菌、耐性菌、虫歯誘発菌およびにきび誘発菌の予防または治療に有用に使用され得 る。 【００１９】 本発明の薬学組成物は、イワヤツデ抽出物およびそれから分離したアセリフィル酸Ａお 10 よび３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸と共に病原性細菌および耐性菌に 対して抗菌活性を有する公知の有効性分を１種以上含有することができる。 【００２０】 本発明の薬学組成物は、投与のために、前記記載した有効性分の以外に薬学的に許容可 能な担体、賦形剤または、希釈剤をさらに含むことができる。前記の担体、賦形剤または 、希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニト ール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸 、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微 結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ 安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が挙げられる。 20 【００２１】 本発明の薬学組成物は、それぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、 懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、座剤、または 滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。詳細には、剤形化する場合、通 常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または、 賦形剤を使用して調製され得る。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤 、顆粒剤、カプセル剤などを含むが、これに限定されるのではない。このような固形製剤 は、前記イワヤツデ抽出物およびそれから分離したアセリフィル酸Ａおよび３−オキソ− １２−オレアネン−２７−オイック酸に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭 酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製され得る。また、単 30 純な賦形剤の以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤なども使用され得 る。 経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを含む が、これに限定されず、よく使用される単純希釈剤である水、リキッド パラフィン以外 に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤などを添加して調製され得る 。非経口投与のための製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥 製剤および座剤を含む。非水性溶剤および懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリ エチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、オレイン酸エチルのような 注射可能なエステルなどが使用され得る。座剤の基剤としては、ウィテップゾール(witep sol)、マクロゴール、ツイーン(tween)６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン などが使用され得る。 40 【００２２】 本発明の薬学組成物は、目的とする方法に応じて、経口投与または非経口投与(例えば 、静脈内、皮下、腹腔内または、局所に適用)することができ、投与量は、患者の状態お よび体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によっ て適切に選択され得る。前記イワヤツデ抽出物およびそれから分離したアセリフィル酸Ａ および３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸の一日投与量は、１ｍｇ／ｋｇ ∼０．５ｇ／ｋｇ、好ましくは、１０ｍｇ／ｋｇ∼０．０５ｇ／ｋｇであり、必要により 一日１回∼数回に分けて投与することができる。 【００２３】 本発明の薬学組成物は、病原性細菌および耐性菌に対する予防または治療のために、単 50 (7) JP 2012-508689 A 2012.4.12 独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療および生学的反応調節剤を使用する方法と併 用して使用することができる。 【００２４】 本発明の口腔用組成物は、その剤形において、特に限定されず、具体的に歯磨き粉、口 腔用洗浄剤、口腔清浄剤などの剤形を有することができる。特に、歯磨き粉の場合には、 研磨剤、湿潤剤、起泡剤、結合剤、甘味料、ｐＨ調節剤、防腐剤、薬効成分、香料、増白 剤、色素、溶剤などを含有することができる。研磨剤としては、炭酸カルシウム、沈降シ リカ、水酸化アルミニウム、リン酸一水素カルシウム、不溶性メタリン酸ナトリウムなど があり、湿潤制としては、グリセリン、ソルビトール液、ポリエチレングリコールおよび プロピレングリコールなどを単独あるいは２種以上混合して使用する。起泡剤としては、 10 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン(硬化)ヒマシ油、グ リセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキロ ールアミド、アルキルグルコシドなどの非イオン界面活性剤や、Ｎ−アルキルジアミノエ チルグリシンなどの両イオン性界面活性剤などを単独あるいは２種以上混合して使用する 。結合剤としては、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、キサ ンタンガム、カラギーナン、アルギン酸ナトリウムなどがあり、甘味料としては、サッカ リンナトリウム、アスパルテーム、ステビオサイド、キシリトール、甘草酸(glycyrrheti nic acid)などがあり、単独あるいは２種以上混合して使用する。ｐＨ調節剤としては、 リン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、 クエン酸、酒石酸などを使用し、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキ 20 シ安息香酸プロピル、安息香酸ナトリウムを単独あるいは２種以上混合して使用する。そ の他の有効性分としては、フッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、フッ化第 一スズ、クロルヘキシジン、アラントインクロロハイドロキシアルミネート、アミノカプ ロン酸、トリクロサン、塩化セチルピリジニウム、塩化亜鉛、塩酸ピリドキシン、酢酸ト コフェロールなどを単独あるいは２種以上混合して使用し、香料としては、ペパーミント オイル、スペアミントオイル、メントール、アネトールなどを適当量混合して使用し、増 白剤としては、酸化チタン、色素としては、食用色素を、溶剤としては、精製水およびエ タノールを使用する。 【００２５】 本発明の化粧料組成物には、水溶性スキン剤、粘度と硬度調節剤、紫外線吸収剤、顔料 30 、保湿、防腐剤イワヤツデ抽出物を用いた天然美容用品添加剤組成物およびにきびに有効 な化粧品として製造され得る。 【００２６】 以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例 は、本発明をより容易に理解するために提供されるものだけであり、実施例によって本発 明の内容が限定されるのではない。 【実施例】 【００２７】 実施例１：イワヤツデ根抽出物の製造 乾燥されたイワヤツデ根の２ｋｇをメタノール４ｋｇに加え、攪拌して３時間の間に抽 40 出した。抽出液をろ過し、減圧濃縮してイワヤツデ根のメタノール抽出物を得た。前記イ ワヤツデ根のメタノール抽出物に酢酸エチル５００ｇを入れて１時間の間に溶媒抽出した 。抽出液をろ過し、減圧濃縮および凍結乾燥して粉末形態のイワヤツデ根の酢酸エチル抽 出物を得た。 【００２８】 実施例２：イワヤツデ根の抽出物から活性成分の分離 前記実施例１で得たイワヤツデ根の酢酸エチル抽出物をクロロホルム：メタノールが１ ０：１である溶媒を使用してシリカゲルカラム薄層クロマトグラフィーを行って活性分画 を得た。前記の活性分画をクロロホルム：メタノールが３０：１である溶媒を使用してシ リカゲルカラム薄層クロマトグラフィーを行って純粋な化合物１および化合物２を得た。 50 (8) JP 2012-508689 A 2012.4.12 前記の化合物１および化合物２は、物質の性状、分子量、分子式、偏光度および１３Ｃ− ＮＭＲスペクトルを測定してそれぞれアセリフィル酸Ａ(aceriphyllic acid A)および３ −オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸(3-oxo-12-oleanen-27-oic acid)で同定 した。 ＜化合物１＞アセリフィル酸Ａ 10 20 １）性状：白色粉、 ２）分子量：４７２、 ３）分子式：Ｃ３０Ｈ４８Ｏ４、 ４）偏光度(［α］Ｄ)：８４．４(ｃ １．０９，ＣＨＣｌ３）、 ５）１３Ｃ−ＮＭＲ(７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)：３６．６８（Ｃ−１）、２６．０５（ Ｃ−２）、７５．８１（Ｃ−３）、４０．１５（Ｃ−４）、４６．７２（Ｃ−５）、１８ ．０８（Ｃ−６）、３３．０（Ｃ−７）、３５．９７（Ｃ−８）、４９．４７（Ｃ−９） 、３９．６５（Ｃ−１０）、２２．９１（Ｃ−１１）、１２４．４２（Ｃ−１２）、１３ ９．８６（Ｃ−１３）、５７．０３（Ｃ−１４）、２２．４１（Ｃ−１５）、２８．１０ （Ｃ−１６）、３１．００ （Ｃ−１７）、４２．１３（Ｃ−１８）、４４．２１（Ｃ− １９）、３３．４（Ｃ−２０）、３４．２９（Ｃ−２１）、３６．８２（Ｃ−２２）、７ ０．２４ （Ｃ−２３）、１８．０８（Ｃ−２４）、１６．４５（Ｃ−２５）、１８．３ ５（Ｃ−２６）、１８１．３（Ｃ−２７）、２８．４４（Ｃ−２８）、３３．２１（Ｃ− ２９）、２４．０１（Ｃ−３０）。 ＜化合物２＞３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸 30 (9) JP 2012-508689 A 2012.4.12 10 １）性状：白色粉、 ２）分子量：４５４、 20 ３）分子式：Ｃ３０Ｈ４６Ｏ３、 ４）偏光度(［α］Ｄ)：１０６．４２(ｃ １．０９，ＣＨＣｌ３）、 ５）１３Ｃ−ＮＭＲ(７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)：３９．２（Ｃ−１）、３４．２（Ｃ− ２）、２１８．１（Ｃ−３）、４７．１（Ｃ−４）、５４．７（Ｃ−５）、１９．８（Ｃ −６）、３６．１（Ｃ−７）、４０．０（Ｃ−８）、４６．３（Ｃ−９）、３６．９（Ｃ −１０）、２３．１（Ｃ−１１）、１２５．７（Ｃ−１２）、１３８．２（Ｃ−１３）、 ５６．１（Ｃ−１４）、２２．８（Ｃ−１５）、２７．９（Ｃ−１６）、３３．０（Ｃ− １７）、４９．４（Ｃ−１８）、４４．４（Ｃ−１９）、３１．３（Ｃ−２０）、３４． ０（Ｃ−２１）、３６．７（Ｃ−２２）、２１．６（Ｃ−２３）、２７．３（Ｃ−２４） 、１６．５（Ｃ−２５）、１８．１（Ｃ−２６）、１８１．０（Ｃ−２７）、２８．５（ 30 Ｃ−２８）、 ３３．９（Ｃ−２９）、２３．８（Ｃ−３０）。 【００２９】 比較例１：イワヤツデ地上部抽出物の製造 乾燥されたイワヤツデ地上部を前記の実施例１と同様な方法で抽出してイワヤツデ地上 部の抽出物を得た。 【００３０】 実験例１：イワヤツデ抽出物およびそれから分離した活性成分の抗菌活性測定 本発明のイワヤツデ抽出物およびそれから分離した活性成分の抗菌活性を調べてみるた めに、下記のような実験を行った。 試験菌は、ミューラーヒントン培地(Mueller Hinton broth)で培養して液体培地希釈法 40 (broth microdilution)により抗菌活性を測定した。対数期中期まで培養した試験菌液を 同じ培地に１０５／ｍｌになるように菌株を合わせた後、９６ウェルプレートにウェル当 り０．２ｍｌずつ菌株した後に、前記実施例１および２、比較例１で製造した試料を２倍 数ずつ希釈して処理した。３０℃で１８時間培養して細菌の生育を６５０ｎｍで測定した 。細菌の生育を完全に阻害する化合物の最小濃度をＭＩＣと定義した。 にきび菌(Propionibacterium acnes)に対しては、ＲＣＭＩ液体培地で嫌気的条件で培 養して液体培地希釈法により抗菌活性を測定した。試験菌を液体培地で３７℃で１−２日 間前培養した。培地３ｍｌにＤＭＳＯで溶かした１５μｌの試験物質を入れて３２ｐｐｍ になるようにし、２倍数希釈して７種類の濃度に作った後、菌の濃度が１０５−６ｃｆｕ ／ｍｌになるように前培養液を添加して１−３日間培養した後に細菌の生育を調査した。 50 (10) JP 2012-508689 A 2012.4.12 イワヤツデ抽出物の抗菌活性は、黄色ブドウ球菌を対象に測定し、アセリフィル酸Ａお よび３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸の抗菌活性は、１５菌株を対象に 測定した。比較物質としては、市販の抗生剤であるトリクロサン(triclosan)、オキサシ リン(oxacillin)およびノルフロキサシン(norfloxacin)を使用した。 イワヤツデ抽出物の抗菌活性は、表１に示し、イワヤツデ抽出物、アセリフィル酸Ａお よび３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸の抗菌活性は、表２に示した。 【００３１】 【表１】 10 20 【００３２】 表１に示されたように、イワヤツデ地上部抽出物の黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣは、 ２００μｇ／ｍｌである反面、イワヤツデ根抽出物の黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣは、 ６．２５μｇ／ｍｌであって、イワヤツデ地上部抽出物よりも３２倍強い抗菌活性を示し た。また、イワヤツデ地上部抽出物とイワヤツデ根抽出物とは、メチシリン耐性黄色ブド ウ球菌(Methicillin-resistant S. aureus)、キノロン耐性黄色ブドウ球菌(Quinolone-re sistant S. aureus)においても黄色ブドウ球菌と類似している抗菌活性を示した。 【００３３】 30 (11) JP 2012-508689 A 2012.4.12 【表２】 10 20 30 40 【００３４】 表２に示されたように、イワヤツデ抽出物は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus )、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Methicillin-resistant S. aureus)、キノロン耐性黄 色ブドウ球菌(Quinolone-resistant S. aureus)に対して、４∼１６μｇ／ｍｌのＭＩＣ を示した。アセリフィル酸Ａは、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、キノ 50 (12) JP 2012-508689 A 2012.4.12 ロン耐性黄色ブドウ球菌に対して、２∼４μｇ／ｍｌのＭＩＣを示して強力な抗菌活性を 示した。 ３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸も黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性 黄色ブドウ球菌、キノロン耐性黄色ブドウ球菌に対して、２∼８μｇ／ｍｌのＭＩＣを示 してアセリフィル酸Ａと類似するか僅か弱い活性を示した。 また、アセリフィル酸Ａお よび３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、アシネトバクター・カルコア セティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus lu teus)、枯草菌(Bacillus subtilis)に対して１∼２μｇ／ｍｌのＭＩＣを示した。 【００３５】 また、イワヤツデ抽出物、アセリフィル酸Ａおよび３−オキソ−１２−オレアネン−２ 10 ７−オイック酸は、虫歯誘発菌(Streptococcus mutans)に対して、強力な抗菌活性を示し た。イワヤツデ抽出物は、８μｇ／ｍｌのＭＩＣを示し、アセリフィル酸Ａは、２∼４μ ｇ／ｍｌのＭＩＣを示し、３−オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、４μｇ ／ｍｌのＭＩＣを示して虫歯菌に強い抗菌活性を示した。 【００３６】 そして、イワヤツデ抽出物、アセリフィル酸Ａおよび３−オキソ−１２−オレアネン− ２７−オイック酸は、にきび菌(Propionibacterium acnes)に対して強力な抗菌活性を示 した。イワヤツデ抽出物は、８μｇ／ｍｌのＭＩＣを示し、アセリフィル酸Ａおよび３− オキソ−１２−オレアネン−２７−オイック酸は、２μｇ／ｍｌのＭＩＣを示してにきび 菌に対する強い抗菌活性を示した。 20 したがって、本発明のイワヤツデ抽出物、アセリフィル酸Ａおよび３−オキソ−１２− オレアネン−２７−オイック酸は、虫歯誘発菌およびにきび誘発菌を含む微生物に強力な 抗菌活性を有することが分かる。 【００３７】 下記に本発明の組成物のための製剤例を例示する。 製剤例１：散剤の製造 イワヤツデ抽出物（または、アセリフィル酸Ａ或いは３−オキソ−１２−オレアネン− ２７−オイック酸） ０．１ｇ ラクトース １．５ｇ タルク ０．５ｇ 30 前記の成分などを混合し、気密布に充填して散剤を製造した。 【００３８】 製剤例２：錠剤の製造 イワヤツデ抽出物（または、アセリフィル酸Ａ或いは３−オキソ−１２−オレアネン− ２７−オイック酸） ０．１ｇ ラクトース ７．９ｇ 結晶性セルロース １．５ｇ マグネシウムステアリン酸 ０．５ｇ 前記の成分などを混合した後、直打法(direct tableting method)で錠剤を製造した。 【００３９】 40 製剤例３：カプセル剤の製造 イワヤツデ抽出物（または、アセリフィル酸Ａ或いは３−オキソ−１２−オレアネン−２ ７−オイック酸） ０．１ｇ とうもろこし澱粉 ５ｇ カルボキシセルロース ４．９ｇ 前記の成分などを混合して粉末を製造した後、前記粉末を通常のカプセル剤の製造方法 によって硬質カプセルに充填してカプセル剤を製造した。 【００４０】 製剤例４：注射剤の製造 イワヤツデ抽出物（または、アセリフィル酸Ａ或いは３−オキソ−１２−オレアネン−２ 50 (13) JP 2012-508689 A 2012.4.12 ７−オイック酸） ０．１ｇ 注射用滅菌蒸留水 適量 ｐＨ調節剤 適量 通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当り(２ｍｌ)に前記の成分含量で製造した 。 【００４１】 製剤例５：液剤の製造 イワヤツデ抽出物（または、アセリフィル酸Ａ或いは３−オキソ−１２−オレアネン− ２７−オイック酸） ０．１ｇ 異性化糖 １０ｇ 10 マンニトール ５ｇ 精製水 適量 通常の液剤の製造方法によって精製水に各々の成分を加えて溶解させ、レモン香を適量 加えた後に前記の成分を混合した。次いで、精製水を加えて全体１００ｍｌに調節した後 、褐色瓶に充填して滅菌させて液剤を製造した。 【産業上の利用可能性】 【００４２】 本発明によるイワヤツデ抽出物およびそれから分離したアセリフィル酸Ａと３−オキソ −１２−オレアネン−２７−オイック酸は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Methicillin-resistant S. aureus)、キノロン耐性黄色 ブドウ球菌(Quinolone-resistant S. aureus)、アシネトバクター・カルコアセティカス( Acinetobacter calcoaceticus)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、枯草 菌(Bacillus subtilis)またはストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans )、にきび菌(Propionibacterium acnes)に対して、強力な抗菌活性を示した。したがって 、本発明によるイワヤツデ抽出物およびそれから分離したアセリフィル酸Ａと３−オキソ −１２−オレアネン−２７−オイック酸は、病原性細菌、耐性菌、虫歯誘発菌およびにき び誘発菌の予防または、治療に有用に使用され得る。 20 (14) JP 2012-508689 A 2012.4.12 【国際調査報告】 10 20 30 40 (15) JP 2012-508689 A 2012.4.12 10 20 30 40 (16) JP 2012-508689 A 2012.4.12 フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード（参考） Ａ６１Ｑ 11/00 (2006.01) Ａ６１Ｑ 11/00 Ａ６１Ｋ 8/63 (2006.01) Ａ６１Ｋ 8/63 Ａ６１Ｋ 31/56 (2006.01) Ａ６１Ｋ 31/56 (81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM), EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MT,NL,NO,PL,PT,RO,SE,SI,SK,T R),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY, 10 BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,K G,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT ,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW (72)発明者 キム キ・ヨン 大韓民国 ４０１−０７０ インチョン トング ソンニムドン ２バン １０トン ８０−３５ (72)発明者 ソン ミ・ジン 大韓民国 ３０５−７７３ テジョン ユソング チジョクトン バンソクマウル ３１１−５０ ４ Ｆターム(参考) 4C083 AA111 AA112 AC132 AD202 AD491 AD492 BB51 BB55 CC02 CC41 DD23 EE14 EE31 4C086 AA01 AA02 DA08 MA01 MA04 MA52 MA57 MA63 NA14 ZA90 ZB35 4C088 AB66 AC11 BA10 BA11 CA06 CA14 MA17 MA35 MA37 MA43 MA52 MA63 MA66 NA14 ZA90 ZB35 20