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低分子化ポリフェノールの摂取が高強度間欠的運動時

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低分子化ポリフェノールの摂取が高強度間欠的運動時
北海道体育学研究
4
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1
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研究ノート
低分子化ポリフェノールの摂取が高強度間欠的運動時の
酸化ストレスおよび、血清総抗酸化能に与える影響
塚 本 ( 日 下 部 ) 未 来1 神 林
勲2 北 舘 健 太 郎3
飯 嶋 孝 行4 木 本 理 可 5 武 田 秀 勝6
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1 札幌市南区南沢 5条
1丁目 1
1
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. 北海道教育大学岩見沢校スポーツ教育課程
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2 岩見沢市緑が丘2
3
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1
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. 株式会社アミノアップ化学
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9 札幌市清田区真栄3
6
3
番地3
2
ハイテクヒル真栄
4
. 札幌市立札苗中学校
干0
0
7
0
8
0
7 札幌市東区東苗穂 7条 1丁目 1
1
5
. 旭川工業高等専門学校
干0
7
1
8
1
4
2 旭川市春光台2
2
1
6
6
. 札幌医科大学保健医療学部
干0
6
0
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5
5
6 札幌市中央区南
連絡先
塚本未来
1条西 1
7
丁目
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塚本未来,神林勲.北舘健太郎,飯嶋孝行,木本理可,武田秀勝
響を検討することを目的とする.オリゴノールは,オリ
ゴマー・ポリフェノールの略で,ライチ果実由来の高分
緒 言
子のポリフエノールポリマーを低分子化させた,世界初
ヒトは呼吸によって常に酸素を体内に取り込み,そ
の低分子化ポリフェノールである.主な特徴は,従来の
の後の代謝過程において反応性の高い活性酸素種
ポリフエノールよりも生体吸収性が優れていることにあ
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;以下ROS) が生成される.
ROSは,酸素代謝以外においても,タバコ,紫外線,
放射線,激しい運動によっても生成され,老化や病気,
疲労などの原因であることが知られている.
生体内で生成される ROSには,スーパーオキシド
(
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以下 0
2
)
. 過酸化水素,一重項酸素,ヒ
る.これまでの検証により,オリゴノールとライチ果
実ポリフェノール 100mgを成人ボランティアにそれぞ
れ摂取させたところ,血中のポリフエノール濃度は,ラ
イチ果実由来ポリフェノールよりもオリゴノールの方
が摂取後 4時間まで高く.オリゴノールの生体利用性
が示されている(若命. 2
0
0
7
)
. ヒト第 l相安全性試験
ドロキシルラジカル等があり,多くの ROSは 02-に
においても,血圧.血液生化学検査に異常は認められ
由来する(大野ら. 2
0
0
0
)
. また,体内にはいくつか
ず,食品としての安全性が確認されている(1日当たり
の 02-の生成源があり.ミトコンドリアでは電子伝
600mgまで).また,陸上競技選手を対象に,オリゴノー
ル (200mg/day) を2
6日間摂取させたところ,疲労感.
達系.細胞質ではキサンチンオキシダーゼ系,好中球
疲労回復が顕著に改善していることが報告されている
ではニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
(
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る(増田ら. 2
0
0
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)
. ROSは生体内において.脂質過酸
(Ohnoe
tal
.
.
2
0
0
8
)
. さらに,腹囲85cm以上,血中脂質
に 1つ以上の異常値を持つ成人ボランティアにオリゴ
ノール (200mg/day) を1
0週間摂取させると,腹部CT
化,酵素不活性. DNA
損傷等を広い範囲で引き起こす
スキャンにおいて皮下脂肪面積および内臓脂肪面積が減
といわれている (
B
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.
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9
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)
. 一方で,生体
少した (
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) と報告されており,オ
内にはROSを消去または除去するための抗酸化能が備
リゴノールの機能性が多様な場面で期待できると考えら
わっている.スーパーオキシドジスムターゼ,グルタチ
れる.付加価値の高い製品開発が求められている中,製
オンペルオキシダーゼ,カタラーゼ等の抗酸化酵素や,
品の機能性を科学的検証に基づいてデータを取得し.し
ビタミンCやビタミン E
.
尿酸等の非酵素的な抗酸化物質
かも,ヒト介入試験などによるデータの蓄積が重要であ
がこの抗酸化能を担っている.生体内の恒常性維持には
る.
NADPH) オキシダーゼ系の過程において 02-が生成す
そこで,本研究では. 2週間のオリゴノール摂取が高
ROS生成と抗酸化能とのバランスが重要であり. ROS
生成が抗酸化能の能力を上回ると,種々の疾病の誘発・
促進など,生体に負の影響をもたらす.この状態を酸化
ストレスという. ROS生成は酸素消費量に比例する(大
野ら. 2
0
0
0
) ため,運動時に酸化ストレスを増大させる
と報告する先行研究も少なくない (
Margonise
tal
.
.
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強度運動負荷時における酸化ストレス指標および抗酸化
指標の面から検討した.
方 法
1.被検者
0
0
3
)
. よって,運動誘発性酸化ストレスから生
e
taし 2
体を防御するためには. ROSを速やかに消去しなけれ
ばならない.
被検者は,運動部活動に所属する男子大学生 1
8名(年
齢1
9
.
9:
!
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.
3歳.身長 1
7
5
.
3土1.1cm. 体重6
7
.
9:
!
:1
.
1
k
g
. BMI2
2.
1:
!
:0
.
3kg/m2) であった.実験に先立ち,
近年.生体内の抗酸化能を向上させることを目的と
全員に本研究の趣旨および安全性について十分な説明を
し,ビタミンC
やE
. ポリフェノール等の抗酸化物質を
行い,自主的な参加を同意書により得た.なお,被検者
多く含んだ食品やサプリメントが積極的に摂取されるよ
は全員非喫煙者であった.
うになってきた.とくに,サプリメントの有効性は広く
評価されており,日常生活やスポーツの場面において用
2
. 実験の概要
いられている.抗酸化物質の lつであるポリフェノール
は,植物の葉や花,茎などに含まれる苦味・渋味成分で
漸増負荷運動により.各被検者の最大酸素摂取量
(V02max) を測定し,さらに身体組成,最大パワー
を測定した.各被検者を身体特性. V02maxお よ び
平均パワーが均等になるように,オリゴノール摂取
群 (
O
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lgroup;以下0群)と,プラセボ摂取群
(
P
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;以下P群)の 2群に分けた.なお,本
研究は二重盲検法を用いた. 2週間のサプリメント摂
取後,自転車エルゴメーターによる高強度間欠的運動
を課し,運動前 (
B
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e
).運動終了直後 (
0h
) およ
び 1時間後 (
1h
) に採血と採尿を行った (
0hは採血
あり,抗酸化活性,動脈硬化抑制,コレステロール,血
糖値上昇の抑制,抗アレルギーなどの機能を有している
(吉川ら. 2
0
0
4
)
. ポリフエノールの機能性は. i
nv
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において強力な種々の作用を示すものの,ポリフェノー
ル自体が高分子であるため,生体吸収が低く. i
nv
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での効果は期待されるほど高くない.本研究では,低分
子化ポリフエノール [
O
l
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l (オリゴノール: (株)
アミノアップ化学社製)]摂取における運動負荷時の影
L
内
低分子化ポリフェノールの摂取が高強度間欠的運動時の酸化ストレスおよび抗酸化能に与える影響
のみ実施).なお,本研究では酸化ストレス指標として
・ヒドロキシー2
'
・デオキシグアノシン (
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原中8
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プラスタン(l5
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血 清 ヘ キ サ ノ イ ル リ ジ ン (Nε-(Hexanoy
以下HEL) 濃度,血清酸化低比重リボタンパク(low
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o
p
r
o
t
e
i
n
;以下LDL) 濃度および血清カルポ
ニル化タンパク (
p
r
o
t
e
i
nc
a
r
b
o
n
y
l
;以下PC)濃度を.抗
酸化指標として血清 0
2
-消去能,血清アルコキシルラ
a
l
k
o
x
y
lr
a
d
i
c
a
l
;
以下・ RO) 消去能および血清
ジカル (
尿酸値を測定した.また.食事は生体内の酸化ストレス
0
る水分(市販のミネラルウォーター)を運動終了から 3
分以内に摂取させた.
4
. サプリメント接取
0群にはオリゴノール(1日 2
0
0mg) を
, P群にはプ
ラセボ(環状デキストリン,麦芽エキス,微粒酸化ケイ
0
0mg) を 2週間摂取させた.本研
素の混合物, 1日2
究は.それぞれ粉末カプセルを使用した.摂取に際して
オリゴノールの効果に影響を及ぼすと考えられるビタミ
ン剤,滋養強壮剤,漢方製剤,総合感官薬などの併用を
避けるよう被検者に指示した.
や抗酸化システムに影響を与える要因であるため.運動
当日の朝食から実験終了時までの飲食は,検者が準備し
5
. 呼気ガス分析
た同ーのものを被検者全員に摂取させた.さらに,運動
前日から実験終了時まで.運動と飲酒を行わないよう指
漸増負荷運動中および高強度間欠的運動中の呼吸循
p
t
a
k
e
;;以下 V02
,
)
環器系指標酸素摂取量 (Oxygenu
示した.
二酸化炭素摂取量 (
C
0
2p
r
o
d
u
c
t
i
o
n;以下VC02
),換
V
e
n
t
i
l
a
t
i
o
n;以下 VE), お よ び 呼 吸 交 換 比
気量 (
3
. 運動プロトコール
1)漸増負荷運動
・
3
0
0
S
)
自動呼気ガス分析装置(ミナト医科学社製, AE
運動は自転車エルゴメーター (COMBI
社製)を用い
5
.
8:
t1
.
2"C,湿度4
8
.
5土 3
.
4%の実験室にお
て,室温2
を用いて,安静時から運動終了まで b
r
e
a
t
h
b
y
b
r
e
a
t
h
法によって行った.測定されたデータを 8呼吸毎に移動
いて行った.被検者には,体重と体脂肪率を測定させ,
5
秒毎に単純平均したものを分析に用い
平均し.さらに 1
0
分間行わ
ストレッチ運動などウォーミングアップを約2
せた.被検者は,自転車エルゴメーターに乗り,サドル
た.得られた VOzのうち,ウォームアップ時から運動
(
R
e
s
p
i
r
a
t
o
r
yexchanger
a
t
i
o;以下RER) の測定は,
終了時までの V02の総量を総酸素摂取量とした.また,
に,足とペダルをテープで固定した.その後,エルゴ
社
呼気ガス分析と同時に,スポーツ心拍数計 (POLAR
H
e
a
r
tr
a
t
e
;以下HR) を
製 RS400TM) により心拍数 (
メーター上で 4分間の安静状態を保持した後, 3分間.
連続的に 1
5
秒毎に測定した.得られた心拍数のうち,最
6
0w
a
t
t
sの負荷でメトロノームのリズムにあわせた毎
0回転 (
6
0rpm)のペダリング運動を行った.その後,
分6
6
0rpmを維持した状態で,毎分3
0w
a
t
t
s
増加するラン
も高い値を最高心拍数とした.
の高さを調節し,運動中足がペダルから外れないよう
プ負荷法により疲労図鑑に至るまでの漸増負荷運動を実
0rpm
以上でペダ
施した.なお,疲労図鑑の判断は, 5
リングできなくなった時点とした.
2
) 高強度間欠的運動
6
. 採尿および採血
a
s
e
l
i
n
eおよび 1hの 2度 行 っ た 運 動 終 了
採原は B
後から 1時間後の採尿までの聞は安静座位とし,運動
による水分の損失を補うため.市販のミネラルウォー
ターを運動による体重の減少分摂らせた.採血は,
B
a
s
e
l
i
n
e,0hおよび 1hの 3度,翼付静注針(テルモ
Powermax)を用いて,
運動は自転車エルゴメーター (
社製)を用いて,肘静脈より行った.採取した血液は,
室温2
7
.
2:
t0
.
2"C,湿度5
9
.
6:
t1
.
3%の実験室において
3
0分間, 3
7"cで温浴の後, 3
5
0
0rpm,0"
c
で1
0分間遠
行った.被検者は,体重,体脂肪率を測定し,ウォーム
心分離を施し,血清の抽出に供した.分注した血清サン
アップとしてのストレッチ.自転車エルゴメーターを用
0
0wattの負荷での 1
0
分間のペダリング運動を
いた, 1
0"cで凍結保存した.
プルは分析時までー 8
行った.自転車エルゴメーターの椅子の高さとハンドル
の位置を調節した後,靴とペダルを粘着性のテープによ
7
. 酪化ストレス指標の測定
り固定し,呼気ガス分析用のガスマスクを装着した.被
検者は,自転車エルゴメーター上で 3分間安静状態を保
O
.
0
8kpの
持した後,高強度間欠的運動として,体重 X
3
負荷で 7秒間の全力ペダリング運動,無負荷の状態で 5
秒間, 6
0rpmを維持したペダリング運動を lセットと
0セット行わせた.各セットにおいて全力ペ
し.それを 2
ダリング時の 7秒間の平均パワーを記録し,体重あたり
の相対値を分析に用いた.運動の前後には衣服を着用し
ない状態で,体重の測定を行い.体重の減少量に相当す
1)尿中 8-0HdGレベルの測定
凍結させた尿サンプルを常温で解凍した後,遠心分離
7
0
0
,久保田商事株式会社製)
機(パーソナル冷却遠心機2
0
0
0rpmで 5分間遠心分離を行った.そして,
を用い, 2
・
OHdGレベルの分析に
沈殿物を除いた上澄みを原中 8
用いた.
尿中 8-0HdG濃度の分析は.酵素結合免疫測定法
(
E
n
z
y
m
e
l
i
n
k
e
dimmunosorbenta
s
s
a
y
;
以 下ELISA)
法による測定キット (New8-0HdGCheck
,日本老化
2ウェルのマイク
制御研究所)を用いて行った. 8X 1
-3-
塚本未来,神林勲,北舘健太郎.飯嶋孝行,木本理可,武田秀勝
ロプレートのそれぞれのウェルに調整した尿サンプルと
再構成した第一抗体を 50μlずつ分注し,マイクロプ
i
c
r
o
レートインキユベーター(旭テクノグラス社製. M
p
l
a
t
ei
n
c
u
b
a
t
o
rM
P
I
I
0
0
) 内にて3
7"
c
で 1時間反応さ
せた.反応終了後,ウェルの反応液を捨て,洗浄液で 3
回洗浄を行った.そして,第二抗体を 100μl加え,再
7"
c
で 1時間反応させた. 3
回の洗浄の後,発色剤を
び3
100μl加え,遮光した状態で 1
5
分間反応させ,反応停
液をキットでの測定に用いた.
8X 1
2ウェルのマイクロプレートのそれぞれのウエ
ルに標準液またはサンプルを 50μl分注した.その後,
l次抗体試薬を全てのウェルに 50μl加え. 4-7"
C
で1
5
時間インキュベートを行った.反応終了後,洗浄液
を用い .3回洗浄を行った後.2次抗体試薬を全てのウエ
ルに 100μl分注し,室温で 1時間インキュベーション
止液を加えた.吸光度の測定にはマイクロプレートリー
を行った.反応終了後. 3回洗浄を行い,発色試薬を
5
分間反応させ
全ウエルに 100μl分注し暗所室温にて 1
B
i
oRad
社製)を使用した.測定キットに含まれ
ダー (
・
OHdG標準液 (
S
t
a
n
d
a
r
d8
・
OHdGs
o
l
u
t
i
o
n
)
ている 8
5
0nmにおける吸
マイクロプレートリーダーを用い. 4
を用いて .
8
・
OHdG濃度と吸光度の標準曲線を作成した.
光度を測定した.標準液を用いて,血清 HEL濃度と吸
この標準曲線を用い.各原サンプルの吸光度により尿中
光度の標準曲線を作成した.この標準曲線を用い,各血
8-0HdG濃度を定量した.本研究での尿中 8-0HdGレ
ベルは,尿中 8-0HdG濃度に原量を乗じ,被検者の体
清サンプルの吸光度より血清 HEL濃度を定量した.
重および前回排措時からの経過時間で除したものを用い
た.
4
) 血清酸化 LDL濃度の測定
血清酸化 LDL濃度の分析は. ELISA法による測定
キット(酸化 LDL測定キット,日本老化制御研究所社
2
) 原中 F2-I
s
o
P
sレベルの測定
製)を用いて行った.冷凍した血清サンプルを常温で解
凍結させた原サンプルを常温で解凍した後,遠心分離
機(パーソナル冷却遠心機2
7
0
0
.久保田商事株式会社製)
凍した後. 8x1
2ウェルのマイクロプレートのそれぞ
れのウェルに洗冷液を用い 5回洗浄を行った後,それ
0
0
0rpmで 5分間遠心分離を行った.そして
を用い. 2
2
品o
Psレベルの分析に
沈殿物を除いた上澄みを尿中 F
用いた.
ぞれのウェルにサンプルまたは,標準液を 100μl分注
た.反応終了後,反応停止液 100μlを全ウェルに加え,
し,室温で 4時間振とうした.その後.洗浄液により
5回洗浄し.全てのウェルに希釈済みコンジュケート
原中イソプラスタン濃度の分析には. ELISA法に
i
t
.日
よる測定キット(尿中イソプラスタン ELISAK
応終了後,洗浄液で 5回洗浄し. TMB試薬を全ウェル
試薬を 100μl分注し,室温にて 1時間振とうした.反
2ウェル
本老化制御研究所)を用いて行った. 8 X 1
5- 2
5
分インキュベー
に100μl分注し,室温暗所で 1
のマイクロプレートのそれぞれのウェルに標準液また
ションを行った.その後,反応停止液を全てのウェルに
は,調整した原サンプルを 100μlずつ分注した.その
標識・ 1
5
品o
p
r
o
s
t
a
n
e
F
2
1試薬
後,全てのウェルに HRP
50μl分注し,反応を停止させ,マイクロプレートリー
5
0nmにおける吸光度を測定した.標準
ダーを用い. 4
液を用いて,サンプル中の酸化 LDL濃度と吸光度の標
を1
0
0
μ
lずつ分注し,室温で 2時間インキュペートし
た.反応終了後,ウェルの反応液を捨て.洗浄液で 3回
洗浄を行った.そして,発色試薬を各ウェルに 200μl
ずつ分注し. 1
5
分間のインキュベーションを行った後,
全てのウェルに反応停止液を加えた.吸光度の測定には,
準曲線を作成した.この標準曲線を用い,各サンプルの
濃度を定量した.
吸光度より血清酸化LDL
B
i
oRad
社製)を使用した.
マイクロプレートリーダー (
5
)血清 PC濃度の測定
血清 P
C濃度の分析は.測定キット(カルボニル化蛋
標準液を用いて,尿中イソプラスタン濃度と吸光度の標
白測定キット,日本老化制御研究所社製)を用いて行っ
準曲線(検量線)を作成した.この標準曲線を用い,各
た.冷凍した血清サンプルを常温で解凍した後. 8x
原サンプルの吸光度より尿中イソプラスタン濃度を定量
1
2ウェルのマイクロプレートのそれぞれのウェルにサン
プルまたは.標準液を 200μl分注し. 3
7"
C
で 2時間イ
した.本研究での原中イソプラスタンレベルは,尿中イ
ソプラスタン濃度に原量を乗じ,被検者の体重および前
回排尿時からの経過時間で除したものを用いた.
ンキュベーションを行った.反応終了後,洗浄液により
5回洗浄し,全てのウェルに希釈済みブロッキング試
0
分間インキュベー
薬を 250μl分注した後,室温にて3
3
) 血清 HEL濃度の測定
血清 HEL濃度の分析は. ELISA法による測定キッ
ションを行った.反応終了後,洗浄液で 5回洗浄し,ビ
オチン標識.抗 DNP抗体を全ウェルに 200μl分注した
ト(ヘキサノイルリジン測定キット,日本老化制御研究
所社製)を用いて行った.冷凍した血清を常温で解凍
後.
3
7"
c
で 1時間インキュベーションを行った.さらに.
反応終了後,洗浄液により 5回洗浄し.希釈済み HRP
した後,血清のタンパク質分解処理のため,サンプル
300μlに対し調整した前処理用酵素試薬 60μlを混合
標識・ストレプトアピジンを全てのウェルに 200μI分注
し.室温で 1時間インキュベーションを行った.反応終
了後,洗浄液を用い. 5回洗浄し,発色液を各ウェルに,
200μl分注した後,室温にて 5分間反応させた.その後,
3
7"
c
で1
5
時間インキュベーションを行った.その後,
し.
0
0
0Dの限外滞過フィルタを通過させ,漉
分画分子量 1
-4-
低分子化ポリフエノールの摂取が高強度間欠的運動時の酸化ストレスおよび抗酸化能に与える影響
反応停止液を全てのウェルに 100μl分注し,反応を停
止させ,マイクロプレートリーダーを用い, 4
5
0nmに
おける吸光度を測定した.標準液を用いて,サンプル中
の PC濃度と吸光度の標準曲線を作成した.この標準曲
線を用い,各サンプルの吸光度より血清PC
濃度を定量
した.
8
. 抗酸化指標の測定
1)血清総抗酸化能の測定
02-消去能および・ RO消去能の分析は,既報 (
K
o
h
r
i
,
.
l2
0
0
9
) に若干の修正を加えて, ESR (
JES-REIX
,
e
ta
日本電子株式会社製)を用いたスピントラップ法にて実
には,スピントラップ剤 CYPMPO(
2
・
C
5
,
5
-Dim
e
t
h
y
l
2
・
[
1,
3
,
2
]dioxaphosphinan・
2
・
yl
)2
・
m
e
t
h
y
l
3
,
4
・
oxo-2λ5
d
i
h
y
d
r
o
2
H
p
y
r
r
o
l
e
l・
o
x
i
d
e
,
CYP)と抗酸化物質 (AOx)
が,単位濃度あたりで反応した 0
2-および .RO濃度の
比率を以下の式(1)で算出し(式参照; (
1
0:Control
s
i
g
n
a
lで,全ての 02-または .RO発生量に対応,1:
抗酸化物質存在下での ESR
信号,1
0-1:抗酸化物質
が消去した 0
2ーまたは .RO量
)
)
, [
m
m
o
l
/
lT
o
r
o
l
x
e
q
u
i
v
a
l
e
n
t
] に換算して求めた.
[
(
[
0
-1
) /I] / [
(AOx) / (
C
Y
P
)
] …(1)
2
) 血清原酸値の測定
血清原酸値の測定は,ウリカーゼ POD法を用いて外
施した.前処理した混合液に光ファイパ一式可視光照
射装置 (RUVF
・
2
0
3
SR.ラジカルリサーチ社製)にて
可視光を照射することにより 0
2-および .ROを発生さ
注分析を行った.
せ信号を検出し (
C
o
n
t
r
o
ls
i
g
n
a
l),一方では同じ系に
9
. 統計処理
測定結果は,全て平均値±標準誤差 (
mean :
tSE)
血清を添加した際の 0
2-および .ROの信号を検出した
(Serums
i
g
n
a
l).なお,トラップ剤には, CYPMPO (
2
・
(
5,
5
・
D
im
e
t
h
y
l
2
・
oxo・
2λ5
・
[
I,
3
,
2
Jdioxaphosphinan・
2
・
yl
)
・2
・
m
e
t
h
y
l
3
,
4
・
d
i
h
y
d
r
o
2
H
p
y
π
o
l
e
l
o
x
i
d
e
)を用いた.
血清 0
2-消去能の測定は, C
o
n
t
r
o
ls
i
g
n
a
lとしてリ
ボフラピン (20μM) を 5μ1,EDTA (
5
0mM) を
10μ1,CYPMPO (
10
0mM) を 10μ1, リン酸緩衝液
(
P
h
o
s
p
h
a
t
eb
u
f
f
e
r
e
d;P
B
)(
10
0mM) を 75μl加え.
Serums
i
g
n
a
lとしてリポフラピン (20μM) を 5μ,
1
EDTA (
5
0mM) を 10μ1,CYPMPO (
10
0mM) を
10μ1,PB (
10
0mM) を 4
5
μ 1,リン酸緩衝生理食塩
水 (
P
h
o
s
p
h
a
t
eb
u
f
f
e
r
e
ds
a
l
i
n
e
;PBS (一))にて 1
0
倍
希釈した血清試料 30μlを加え,それぞれをよく混和
した後,シリンジ付きディスポ偏平セルで 100μlの混
合被を吸い上げ,それを ESRにセットし,信号を検出
した.
血清 .RO消去能の測定には, C
o
n
t
r
o
ls
i
g
n
a
lとして
AAPH (
2
.
2
'
・
a
z
o
b
i
s(
a
m
i
d
i
n
o
p
r
o
p
a
n
e
)d
i
h
y
d
r
o
c
h
l
o
r
i
d
e
)
0
μ,
1 CYPMPO (
10
0mM) を 10μ1,
(
1
0mM) を 1
PB (
10
0mM) を 80μl加え, Serums
i
g
n
a
lとして
AAPH (
10mM) を 10μ,
1 CYPMPO (
10
0mM)
を 10μ1, PB (
10
0mM) を 50μ1, PBS (ー)に
て1
0
倍希釈した血清サンプル 30μlを加え,それぞ
で表した.変数の経時的変化については, S
t
a
tViewを
用いた反復測定分散分析を行い,有意差が認められた場
合は適宜 B
o
n
f
e
r
r
o
n
i法にて P
o
s
t
h
o
c多重比較を行っ
た.また,群聞に有意差が認められた場合は,適宜対応
のない t
検定を行った.危険率は.すべて 5 %未満で有
意とした.
結 果
1.漸増負荷運動
漸増負荷運動の継続時間 (
m
i
n
),最大運動負荷 (
w
a
t
t
s
)
および V02max(m
l
/k
g
/
m
i
n
) は,それぞれ O群 1
0
.
15
:
t0
.
2
3
,3
3
3:
t1
0,5
3
.
0:
t3
,
1
. P群で 1
0
.
3
6:
t0
.
2
3
,
3
4
5:
t1
2,5
3
.
5:
t3
.
5
であった.また,最大心拍数 (
bpm)
とRER
が,それぞれ O群で 1
9
2
.
8:
t2
,
4
. 1
.
2
7:
t0
.
0
2,
P群で 1
9
2
.
8:
t2
ム1.
2
7:
t0
.
0
2であることから.各被
検者は疲労困館に達したと考えられる.
2
. 高強度間欠的運動時の呼吸循環器系指標と体重の変化
両群における平均 V02, %V02max
,VC02,VE
,
で 100μlの混合液を吸い上げ,それを ESRにセッ
RERおよび HRについて T
a
b
l
e2に示した.運動全体
の V02(
F
i
g
.1)において, 0群は P群と比較して,有
意(
p
<
.
O
Ol)に高値を示した.運動後の体重の変化 (
k
g
)
は
, 0群でー 0
.
5
6:
t0
.
0
5
,P群において一 0
.
6
3:
t0
.
0
9
トした. ESRの測定条件は,いずれも Sweepw
idth
であり,ほぽ同様の減少量であった.なお,最後までこ
:
t7
.
5mT
,SweepTime= 2min
,G
ain = 2
.
5
X1
0
0,M
o
d
u
l
a
t
i
o
nWidth= 1
.0 X 0
.
1mT
,Time
constant = 0
.
3s
e
c, CenterF
i
e
l
d= 3
3
6
.
2 mT,
Power= 6mW,Frequency = 9
.
4
3GHzで行った.
また,血清 0
2-および .RO消去能には,前述したぞれ
ぞれの系に標準物質である T
r
o
l
o
x(
ω
6
h
y
d
r
o
x
y
ε
2
ふ
t
e
t
r
,悶
amethylchroman
ト
.
之
2
c
伺a
r
巾
b
o
x
y
l
i
ca
c
i
d
)(
5
0μ
t
L
.M) を
添加した 0
2-および .RO信号 (
T
r
o
l
o
xs
i
g
n
al)を評価
基準として用いた.血清 0
2-および .RO消去能の評価
ぎきれなかった被検者がいたこと,また自動呼気ガス分
れをよく混和した後,シリンジ付きディスポ偏平セル
=
析装置の不具合で測定できなかったため, P群のうち 3
人のデータを除外した.
3
. 酸化ストレス指標
血清酸化 LDL濃度 (
T
a
b
l
e3
) はB
a
s
e
l
i
n
e
,0hおよ
び 1hにおいて, P群と比較して O群で有意 (
p
<
.
0
5
)
に低値を示した.しかしながら,経時的変化は認められ
なかった.尿中 8-0HdGレベル (
T
a
b
l
e3
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e,0h
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tSE
において, P群と比較して O 群で有意 (p<.
0
5
) に高
化能指標を向上させ,高強度間欠的運動時の酸化ストレ
値を示し, 1hでは P群 と 比 較 し て O 群 で 高 い 傾 向
スを軽減できるのではないかと考えられたが,抗酸化指
(p<.
0
8
) を示した.また,両群ともに B
a
s
e
l
i
n
eと比較
して 1hにおいて有意 (p<.
0
01)に高値を示したが,
B
a
s
e
l
i
n
eの値を 1としたときの 1hの変化率において,
標においては群聞に有意差はみられなかった.抗酸化指
両群に有意な差は認められなかった.その他の酸化スト
欠的運動のような全力ペダリング運動とローパワーでの
標である血清尿酸値は,両群ともに B
a
s
e
l
i
n
eと o
hに
p
<
.
O
O
I
) した.高強度間
比較して 1hにおいて増加 (
レス指標 (
T
a
b
l
e3
) において,群間差や経時的な変化
ペダリング運動の繰り返しは,活動筋肉の脱酸素化や再
を示さなかった.
酸素化を引き起こし,虚血-再濯流と同様の状態であっ
たと考えられる (
G
r
o
u
s
s
a
r
de
ta
,
.
l 2
0
0
3
)
. 虚血や激し
4
. 抗酸化指標
い運動時には,キサンチンオキシダーゼ系が活性化して
消去能 (
T
a
b
l
e4
) において,群間差は認
血 清 'RO
S
u
z
u
k
ie
ta
,
.
l 2
0
0
6
)
原酸生成が増大する.先行研究 (
められなかった.また,両群ともに B
a
s
e
l
i
n
eに比較し
においても,激運動後の尿酸値の増加が示されている.
てo
hと 1hで有意 (p<訓)に高値を示した.血清尿
以上のことから,高強度間欠的運動は再瀧流に伴うキサ
酸値 (
T
a
b
l
e4
) は 1hにおいて, P群と比較して O群
ンチンオキシダーゼ系の活性化が 1hにおける血清原酸
0
8
) を示したものの,有意な差は認め
で高い傾向 (p<.
値を増加させたと考えられる.これまでの報告で,血清
a
s
e
l
i
n
eおよび
られなかった.また,両群ともに B
oh
尿酸値の増加は血清総抗酸化能を増加させることが示さ
と比較して 1hで有意 (p<.
0
01)に高値を示した.血
B
e
n
z
i
ee
ta
,
.
l 1
9
9
6
) が,血清総抗酸化指標
れている (
2
-消去能 (
T
a
b
l
e4
) は,群間差や経時的な変化を
清0
である O
i
-および 'RO消去能に群問差がなく,経時的
示さなかった.
変化では, 'RO
消去能のみにおいて運動後に有意な高値
T
a
b
l
e4
)
. 本結果より,血清総抗酸化指標は,
を示した (
考
iーに対
ラジカル種によって異なる消去作用を示した.O
察
して特異的に反応する抗酸化酵素のスーパーオキシドジ
運動時の疲労や運動後の筋肉痛などは,運動にと
スムターゼは,運動中の変動が少なく, 'RO
消去に関与
もなう酸化ストレスの増大に関係していることから
する種々の抗酸化物質が主に動員されたと考えられる.
(
N
i
k
o
l
a
i
d
i
se
ta
,
.
l2
0
0
8
),全てのアスリートにおいて
運動時の ROS生成をすみやかに軽減することが重要で
個々の抗酸化物質は,抗酸化ネットワークを反映するた
ある.本研究では,オリゴノール経口摂取によって抗酸
化しない,もしくは減少する抗酸化物質の影響も推察さ
-7
め,血清原酸値のように増加するものだけではなく,変
塚本未来,神林勲,北舘健太郎,飯嶋孝行,木本理可,武田秀勝
れる.著者らの研究室では,これまでの検証において,
と認識され始めており (Gomez
・
Cabrerae
ta
,
.
l2
0
0
5
),
i
nv
i
t
r
oにおいてオリゴノール自体の高い抗酸化能を評
価しており,また,日常安静時におけるオリゴノール摂
取時のラジカル消去能(総抗酸化能)は,摂取前と比較
して.摂取後に高い傾向を示すことを明らかにしている
(いずれも未報告データ). ESRを用いる抗酸化能評価
は,特異的に ROS消去能を測定できる唯一の手法であ
るが,ラジカル種の違いによる抗酸化能評価の検討は少
ない.著者らは,同様の運動負荷時に,ラジカル種によっ
て異なる消去能を示すことを明らかにしている(日下部
0
0
9
) が,本結果より,抗酸化物質摂取時の影響は
ら
, 2
明らかにすることはできなった.今後は.血中の抗酸化
物質の濃度とラジカル消去能を合わせて抗酸化指標を評
価すると新しい知見が得られるかもしれない.
T
a
b
l
e3
)
酸化ストレス指標である血清酸化 LDL濃度 (
は
, B
a
s
e
l
i
n
e
,0hおよび 1hにおいて P群と比較して,
O群で有意 (
p
<
.
0
5
) に低値を示した.通常, LDLは
LDL受容体を通して肝臓に取り込まれるが,酸化 LDL
はスカベンジャー受容体を通してマクロファージに取り
込まれる. LDLを多量に取り込んだマクロファージは
抱抹化し,血管内皮細胞障害,アテローム性動脈硬化を
引き起こすと考えられている.本研究の結果より,水溶
性の抗酸化物質であるオリゴノールは,血中においてコ
レステロールの輸送を担う LDLの酸化を軽減に何らか
の関与があると推察されるが,オリゴノール摂取前の値
からの比較ができないために,決定的な結果には至らな
ROSのホルミシス理論として提唱されている (Radak
0
0
5
)
. よって,本研究で示された 8OHdGレベ
e
ta
l2
ルの程度は,オリゴノール経口摂取によって安静時のエ
ネルギーの代謝が冗進され,血流改善によって,血中
u
t
),尿中に
の 8OHdGが洗い出されたため (washo
より多く排池された可能性も否定できない.オリゴノー
ル摂取が原中 8OHdGレベルへの何らかの生体機構が
作用したと考えられるが,その詳細については.今後検
・
句
・
・
討の余地がある.
ROSの生成は V02に比例するため運動時には酸化
0
0
3
),本
ストレスを増大させる可能性があり(野口, 2
研究においても O群では酸化ストレスが糟大すること
, 0群において 3名
が予想された.運動全体の V02は
の欠損値があるものの, P群と比較して O群で高値を
F
i
g
.1).本研究では O 群は運動全体の
示している (
V02が高値を示しているにもかかわらず, 0hや 1hに
おける O 群と P群の酸化ストレス指標に有意な差は
認められなかった(血清酸化 LDL濃度は除く).との
2週間のオリゴノール摂取より,運動中の
V02増加に伴って増大する脂肪やタンパク質の酸化損
傷の軽減が推察されるが,詳細なメカニズムまでは明ら
かにするととはできなかった.
ととから,
まとめ
本研究では, 2週間のオリゴノール経口摂取が抗酸化
かった.
2
・I
S
o
P
sレベ
その他の酸化ストレス指標では,原中 F
能を向上させ,運動時の酸化ストレスを軽減できるかど
ル,血清 HEL濃度および血清 PC濃度において,群問
T
a
b
l
e3
)
. こ
差や経時的な変化は認められなかった (
うかを,高強度間欠的運動前後の酸化ストレス指標およ
び抗酸化指標から検討することを目的とした.被検者は
れまでの先行研究において,脂質過酸化指標は,運動後
大学で運動部に所属し,日常定期的に運動を行っている
C
l
o
s
ee
ta
,
.
l
早期に変化しないことが報告されている (
2
0
0
4;Goldfarbe
ta
,
.
l 2
0
0
5
;Cannone
ta
,
.
l 1
9
9
0
;
,
.
l 2
0
0
0
:
2
0
0
3
)
.N
i
k
o
l
a
i
d
i
sら (
2
0
0
7
)は
,
Sachecke
ta
女性を対象とした等速性収縮運動によって,運動終了 2
-4日後に血柴 PC濃度が運動前と比較して有意に高値
を示したことを報告している.乙のように,酸化ストレ
ス指標には一時的な変動を示す指標と長期的な変動を示
す指標があると考えられる.したがって,本研究におい
ても 1h以降に酸化ストレス指標の経時的な変化や群
間差が認められたかもしれない.原中 8-0HdGレベル
(
T
a
b
l
e3
) は,両群ともに B
a
s
e
l
i
n
eに比較して 1hで
p
<
.
O
O1)に高値を示し,これまでの我々の研
有意 (
0
0
4
) と一致した.また,
究室の研究結果(神林ら, 2
B
a
s
e
l
i
n
eにおける原中 8-0HdGレベルは, P群と比較
p
<
0
.
0
5
) を示した.尿
して O群において有意に高値 (
中8
・
OHdGレベルが高い乙とは,種々の疾病のリスク
と関係があることから,好ましい状態であるとは言えな
い.しかしながら,低すぎても好まし状況ではないと
いう考えもある.低濃度の ROS生成は,シグナル伝達
の役割を担い.抗酸化酵素の発現にとって重要である
健常な男子学生 1
8名であり,オリゴノールを摂取する群
(0群) 9名,オリゴノールを摂取しない対照群 (
P
群)
9名に分けられた.主な結果は以下の通りである.
l)は,両群ともに
1.血清酸化 LDL濃 度 (ng/m
B
a
e
l
i
n
eに比較して運動後の変化は認められなかった
a
s
e
l
i
n
e
,0h, 1h において, P 群 の 7
0
8
.
7土
が
, B
2
5
0
.
9,8
4
7
.
7:
t3
3
6
.
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. 原中 8-0HdGレベル (ml/kg/min) については,
両群ともに B
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.
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. 血 清 原 酸 値 (mg/dl)については.両群ともに
B
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.
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に高値を示した.また,血清総抗酸化能において,群間
差は認められなかった.
このように, 2週間のオリゴノール経口摂取は,血清
総抗酸化能に対して効果を示さなかったものの.酸化ス
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低分子化ポリフェノールの摂取が高強度間欠的運動時の酸化ストレスおよび抗酸化能に与える影響
トレス指標の軽減に関与する可能性が示唆された.
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