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バイオジェン・アイデック・ジャパン株式会社
タイサブリ点滴静注 300 mg 第 2 部（モジュール 2）：CTD の概要（サマリー） 2.4 非臨床試験の概括評価 バイオジェン・アイデック・ジャパン株式会社 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 目次 1. 非臨床試験計画の概略 ................................................................................... 8 1.1 非臨床試験で使用された原薬のプロファイル.................................................... 10 2. 薬理試験 ...................................................................................................... 14 2.1 リンパ球輸送（トラフィッキング）における α4 インテグリンの役割 ............. 14 2.2 多発性硬化症（MS）におけるリンパ球の役割 .................................................. 15 2.3 In vitro 効力を裏付ける試験 ................................................................................ 16 2.3.1 反応特異性 ......................................................................................................... 16 2.3.2 In vitro における α4 インテグリンの飽和度 ........................................................ 16 2.3.3 種特異性 ............................................................................................................ 17 2.3.4 In vitro 薬理作用.................................................................................................. 17 2.3.5 多発性硬化症（MS）における α4 インテグリン発現レベル ............................. 18 2.4 In vivo 薬理試験 ................................................................................................... 18 2.4.1 In vivo 薬力学効果 .............................................................................................. 19 2.4.2 多発性硬化症（MS）モデルにおける in vivo リンパ球浸潤に及ぼす効果 ......... 19 2.5 副次的薬理試験 .................................................................................................. 20 2.5.1 免疫系に対する作用........................................................................................... 20 2.6 安全性薬理試験 .................................................................................................. 22 2.6.1 心血管系安全性薬理試験 ................................................................................... 22 2.6.2 進行性多巣性白質脳症（PML） ........................................................................ 23 2.6.3 薬物相互作用 ..................................................................................................... 24 3. 薬物動態試験 ............................................................................................... 24 3.1 吸収 .................................................................................................................... 24 3.1.1 単回投与薬物動態試験の総括 ............................................................................ 25 3.1.2 反復投与薬物動態試験の総括 ............................................................................ 26 3.1.3 血清中濃度推移に関する特記 ............................................................................ 27 3.2 分布 .................................................................................................................... 28 3.3 代謝 .................................................................................................................... 28 3.4 排泄 .................................................................................................................... 28 4. 毒性試験 ...................................................................................................... 28 2 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 4.1 組織交差反応性試験 ........................................................................................... 28 4.2 溶血活性及び血液適合性試験 ............................................................................. 29 4.3 In vivo 毒性試験 ................................................................................................... 29 4.3.1 単回投与毒性試験 .............................................................................................. 29 4.3.2 反復投与毒性試験 .............................................................................................. 29 4.3.3 生殖発生毒性試験 .............................................................................................. 32 4.4 遺伝毒性試験 ...................................................................................................... 39 4.5 がん原性試験 ...................................................................................................... 39 4.5.1 免疫調節/免疫抑制剤のがん原性試験................................................................. 40 4.5.2 その他のがん原性/発がん性モデル .................................................................... 41 4.5.3 ナタリズマブ処理後のヒト腫瘍細胞の増殖応答 ................................................ 41 4.5.4 In vivo 異種移植片がん原性試験 ......................................................................... 42 4.6 その他の毒性試験 ............................................................................................... 42 4.7 臨床試験及び毒性試験における曝露量の比較.................................................... 44 5. 総括及び結論 ............................................................................................... 49 6. 参考文献 ...................................................................................................... 53 3 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 表目次 表 1 表 2 非臨床試験で使用された原薬のプロファイル ............................... 11 ナタリズマブ単回静脈内投与後の薬物動態パラメーター（平均値） ......................................................................................................... 25 表 3 ナタリズマブ反復投与後の最終投与における薬物動態パラメーター （平均値 ± 標準偏差） ................................................................... 27 表 4 各反復投与非臨床毒性試験における薬物動態パラメーター及び臨床 試験との比較（平均値） ................................................................. 45 表 5 非臨床毒性試験の安全域 ................................................................. 47 図目次 図 1 白血球の血管内皮細胞への接着における α4 インテグリンと LFA-1 イ ンテグリンの役割を示す概略図 ....................................................... 15 図 2 末梢血リンパ球におけるナタリズマブの飽和度 ............................. 17 4 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 略語・略号一覧 略号 略していない表現 BBB BLQ CD CD CD20 CD3 CD4+ CD49 CD54 CD8+ CDMS CDR CFA 英語 antibody-dependent cellular cytotoxicity area under the concentration-time curve area under the concentration-time curve from time zero to time t area under the concentration-time curve from time zero to infinity blood brain barrier below the limit of quantitation crohn disease cluster of differentiation cluster of differentiation 20 cluster of differentiation 3 cluster of differentiation 4+ cluster of differentiation 49 cluster of differentiation 54 cluster of differentiation 8+ clinically definite MS complementarity determining region Complete Freund’s adjuvant cGMP Current Good Manufacturing Practices CIS CL Cmax CMV CPE ECG ELISA F FACS Fc FcγRIII FcRn FDA FN GCP GD clinically isolated syndrome systemic clearance maximum drug concentration Cytomegalovirus cytopathic effect Committee for Proprietary Medicinal Products cerebrospinal fluid common technical document deoxyribonucleic acid experimental autoimmune encephalomyelitis electrocardiogram enzyme-linked immunosorbent assay female fluorescent activated cell sorting Fc Fc gamma receptor III neonatal Fc receptor U.S. Food and Drug Administration fibronectin Good Clinical Practice gestational day GLP Good Laboratory Practice ADCC AUC AUC0-t AUC0-inf CPMP CSF CTD DNA EAE 5 日本語 抗体依存性細胞毒性 血清中濃度時間曲線下面積 0 時間から t 時間までの濃度-時間曲線 下面積 0 時間から無限大時間まで外挿した濃 度-時間曲線下面積 血液脳関門 定量限界未満 クローン病 ― CD20 CD3 CD4+ CD49 CD54 CD8+ 臨床的に確実な MS 相補性決定領域 完全フロインドアジュバント 米医薬品適正製造基準（安全な医薬品 製造のための作業管理、技術管理、品 質管理の基準） ―（最初のエピソードからなる症候群） 全身クリアランス 最高血中濃度 サイトメガロウイルス 細胞変性効果 欧州医薬品委員会 脳脊髄液 コモン・テクニカル・ドキュメント デオキシリボ核酸 実験的自己免疫性脳脊髄炎 心電図 酵素結合免疫吸着法、ELISA 法 雌 フローサイトメトリー 抗体 Fc 領域 Fcγ受容体 III 胎児性 Fc 受容体 米国食品医薬品局 フィブロネクチン 医薬品の臨床試験の実施の基準 妊娠日 医薬品の安全性に関する非臨床試験の 実施の基準 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 略号 HUVEC IBD IC ICAM-1 ICH IFN Ig IHC IL IL-12Rβ2 IM IND IV JCV KLH, LFA-1 M MadCAM-1 MRI MS NA ND NK OECD PBMC PD PHA PK PML PND rhS9 SCID SIV SV t1/2 TBD 略していない表現 英語 human umbilical vein endothelial cells inflammatory bowel disease Intracardiac intercellular adhesion molecule-1 International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use interferon immunoglobulin immunehistochemical interleukin interleukin-12 receptorβ2 intramuscular investigational new drug intravenous JC virus keyhole limpet hemocyanin lymphocyte function-associated antigen-1: male mucosal vascular addressin cell adhesion molecule-1 magnetic resonance imaging multiple sclerosis not available not determined natural killer 日本語 ヒト臍帯静脈内皮細胞 炎症性腸疾患 心臓内 ― 日米 EU 医薬品規制調和国際会議 インターフェロン 免疫グロブリン 免疫組織化学 インターロイキン インターロイキン-12 受容体 β2 筋肉内 米国における治験許可申請 静脈内 JC ウイルス キーホールリンペットヘモシアニン ―（α1β2 インテグリン） 雄 ― 磁気共鳴画像法 多発性硬化症 該当せず 測定せず ナチュラルキラー 経済協力開発機構（ヨーロッパ、北米 Organization for Economic Co-operation 等の先進国によって、国際経済全般に and Development ついて協議することを目的とした国際 機関。） peripheral blood mononuclear cells 末梢血単核球 pharmacodynamics 薬力学 フィトヘマグルチニン（T リンパ球分 phytohemagglutinin 裂促進因子） pharmacokinetics 薬物動態 progressive multifocal 進行性多巣性白質脳症 leukoencephalopathy post natal day 出生後日数 recombinant human遺伝子組換えヒト S9 ヒト肝組織薬物代謝酵素画分 severe combined immunodeficiency 重症複合型免疫不全 simian immuno-deficient virus サル免疫不全ウイルス simian vacuolating virus シミアンウイルス terminal elimination half life 消失半減期 to be determined 未定 6 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 略号 Th TK tk TNF VCAM-1 VLA-1 VLA-4 WSRC 略していない表現 英語 helper T cell toxicokinetics thymidine kinase tumor necrosis factor vascular cell adhesion molecule-1 very late activation antigen-1 very late activation antigen-4 7 日本語 ヘルパーT 細胞 トキシコキネティクス チミジンキナーゼ 腫瘍壊死因子 ― ― ―（α4β1 インテグリン） ― 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 1. 非臨床試験計画の概略 ナタリズマブは、遺伝子組換えヒト化抗 α4 インテグリン IgG4 抗体で、NS0 マウス骨髄 腫細胞を用いて作製し、分子量は 149,000 である。IgG4 アイソタイプは、IgG1 のような抗 体分子が有する作用を避ける目的で選択された。ナタリズマブは、α4β1 及び α4β7 インテグ リンの α4（CD49d）サブユニットに結合する。α4β1 インテグリンは、VLA-4 としても知ら れ、通常好中球以外の単核球、好塩基球及び好酸球表面に高レベルに発現している（Bochner et al, 1991）。ナタリズマブは α4β1 インテグリンと VCAM-1 及びフィブロネクチン（FN） との相互作用を阻害する。α4β7 インテグリンも単核球細胞表面に発現し、ナタリズマブは α4β7 インテグリンと MadCAM-1 との相互作用を阻害する。両インテグリンは、白血球の血 管内皮細胞への接着に関与し、他のインテグリンとともに、リンパ球が血管内皮細胞を通 過し、実質組織に移動（トラフィッキング）する過程に関与する。ナタリズマブは、進行 性かつ変性性の中枢神経系疾患である多発性硬化症（MS）の治療を対象として開発が進め られている。 MS は、炎症性疾患で、中枢神経系における脱髄巣を特徴とし、様々な程度の軸索障害を 伴う。これら軸索障害は、活性化 T リンパ球が血液脳関門（BBB）を通過して脳実質組織 に移動することにより開始され、血管内皮細胞の活性化、さらなるリンパ球及び単球の動 員、炎症性サイトカインの放出などの一連の炎症反応を引き起こし、脱髄に至ると考えら れている（Ffrench-Constant, 1994）。リンパ球の BBB 通過には VCAM-1 と α4β1 インテグリ ンとの相互作用が必要であり、ナタリズマブによってこの相互作用が阻害される結果、活 性化リンパ球の実質細胞への輸送（トラフィッキング）が阻害されることがナタリズマブ の MS において推定される作用機序である。 ナタリズマブの推奨用量・用法は、MS 患者への 300 mg 固定用量の月 1 回反復静脈内投 与である。 ナタリズマブの非臨床試験は、生物学的製剤の開発に関する ICH ガイドラインの S6(R) ガイドライン「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」及び M3(R2) ガイドライン「医薬品の臨床試験及び製造販売承認申請のための非臨床安全性試験の実施 についてのガイダンス」を遵守して実施された（後述する 3 試験は例外）。FDA（米国食 品医薬品局）、OECD（経済協力開発機構）及び日本における非臨床に関する ICH ガイドラ インを遵守し、臨床用原薬を用いてすべてのピボタルな非臨床試験を実施した。 ナタリズマブの非臨床安全性試験は、非ヒト霊長類、イヌ及びモルモットを用いて行わ れた。完全長配列ヒト化モノクローナル抗体であるナタリズマブは、通常の抗体製剤と異 なり広範な動物種と交差反応性を示し、げっ歯類を用いて多くの生物学的製剤において実 施されている非臨床安全性試験より頑健性の確保を可能にした。ナタリズマブはヒト、ア カゲザル、イヌ、ブタ、モルモット及びフェレットリンパ球に同様の結合親和性で結合す 8 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg るが、マーモセット、ウサギ、ハムスター、ラット、マウス又はスナネズミリンパ球には 結合しない。主要な非臨床安全性評価モデルとしてカニクイザルが選択され、薬理学的評 価モデル及び生殖発生毒性の補足としてモルモットが選択された。心血管系安全性薬理試 験はイヌを用いて評価した。 開発初期においては、ナタリズマブと薬理活性を示さない動物種であるマウスを用いて 14 日間亜急性毒性試験を行い、マウスリンパ球を用いて in vitro 試験を実施した。これらの 試験結果については、ICH S6 ガイドラインに準拠した生物製剤の安全性評価法とは不整合 であることから非臨床試験概要には記載しない。 薬理活性は、in vitro においてナタリズマブがリンパ球との結合性を示した動物種を用い た in vivo において血中白血球数が増加することから示されている。 ウイルス潜伏期間、感染、免疫機能及び宿主抵抗性に関する非臨床モデルにおける生物 学的及び免疫学的因子に及ぼすナタリズマブ及び α4 インテグリン阻害の影響を検討するた め、多数の非臨床試験を実施した。具体的には、ヒト JC ウイルス（JCV）及び進行性多巣 性白質脳症（PML）に関連した非臨床モデルがいくつか検討され、実験的自己免疫性脳脊 髄炎（EAE）の急性及び慢性動物モデルにおいて α4 インテグリン阻害の短期的及び長期的 影響を探索する実験が実施された。 ナタリズマブは長期投与が想定されることから、カニクイザルを用いて 6 ヵ月毒性試験 を実施した。ナタリズマブがげっ歯類において薬理活性を示さないことから、標準的な長 期がん原性試験は不適切である。そのため、代替的アプローチとして、in vitro における α4 インテグリン発現ヒト腫瘍細胞株の増殖能に対するナタリズマブの影響、及び in vivo にお いて α4 インテグリン発現ヒト腫瘍細胞株を異種移植したモデルにおける腫瘍増殖・転移に 対する影響を評価する試験がデザインされた。ナタリズマブは、妊娠可能な年齢の女性に 使用される可能性があることから、すべての生殖発生毒性試験が検討された。カニクイザ ルモデルは、催奇形性及び発生への影響に関する評価に用いられ、他方、モルモットは、 第 2 の動物種として催奇形性及び雌雄生殖能への影響に関する評価に用いられた。6 ヵ月毒 性試験は、小児への適応を裏付けるために幼若カニクイザルを用いて実施された。MS 患者 における臨床試験は、成人において実施された。 ナタリズマブが免疫調節物質であることから、免疫機能に対するナタリズマブの影響の 検討は、一部の反復投与毒性試験並びに独立した in vitro 及び in vivo における免疫毒性試験 に組み込まれた。末梢血リンパ球のフェノタイピングは、カニクイザルを用いた 4 試験：1 ヵ月毒性試験 2 試験、6 ヵ月毒性試験及び胎児及び母動物を用いた胚・胎児発生への影響に 関する試験において実施された。細胞機能〔ナチュラルキラー（NK）細胞活性及び T/B 細 胞の細胞増殖反応〕の測定は、カニクイザルを用いた 1 ヵ月毒性試験及び胚・胎児発生へ の影響に関する試験において実施された。さらにすべての試験において、リンパ組織の標 9 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 準的な組織学的検査に加え、リンパ組織における T/B 細胞分布に関する免疫組織学的検討 を、1 ヵ月毒性試験及びカニクイザルを用いた胚・胎児発生への影響に関する試験において 実施した。カニクイザルを用いた T 細胞依存性抗原に対する液性免疫応答に対するナタリ ズマブの影響を 6 週間毒性試験において評価した。ナタリズマブの回復性試験は、また、7 週間以上の期間において評価された。総じてこれらの試験は、現行の免疫毒性試験に関す るガイドライン〔欧州医薬品委員会（CPMP）の反復投与毒性試験ガイドライン、米国食品 医薬品局（FDA）の新薬の免疫毒性評価ガイドライン〕に準拠している。 薬物動態評価は、ナタリズマブの in vivo 体内動態及び免疫原性を明らかにする目的で、 非臨床試験プログラムの一環として実施された。トキシコキネティクスは、反復投与及び 生殖発生毒性試験に、曝露量と安全係数を検討する目的で組み込まれた。 総括すると、非臨床試験結果から、MS 患者における推奨用量・用法でのナタリズマブの 長期使用が支持されるが、非臨床試験プログラムのデザイン上の問題点は以下のとおりで あった。 1. In vivo における抗原特異的な免疫応答試験の限界：NK 細胞活性及び T/B 細胞増殖反 応が評価されたが、in vivo における抗原特異的な液性及び細胞性免疫応答に対する 影響については、現時点までの非臨床試験プログラムにおいて明らかにされなかっ た。 2. ナタリズマブに対する抗体応答による安全係数検討の限界 以上の問題点については、非臨床試験に関する概要文に詳細を記載する。 1.1 非臨床試験で使用された原薬のプロファイル 非臨床試験において、表 1 に示した第 III 相臨床試験で使用された原薬及び市販製剤用の 原薬の品質を評価した。非臨床試験では、 製剤が用いられた。 10 原薬又は原薬を 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 表 1 非臨床試験で使用された原薬のプロファイル 社における 原薬ロット番号 社における 製剤ロット番号 M3.2.S.2.6.1 に記 載されている番号 製造場所及び 製造スケール 非臨床試験番号 非臨床試験の種類 WSRC940911 AL077 AL105 AL089 AL109 PC028 AL107 AL106 PC001 PC002 AM001 AM002 AL301 AL300 AL302 723-012-98 反復投与毒性試験（28 日間） 単回投与薬物動態試験 反復投与毒性試験（14 日間） 単回投与毒性試験 単回投与薬物動態試験 In Vitro 免疫応答 単回投与毒性試験 反復投与毒性試験（28 日間） 交差反応性 交差反応性 遺伝毒性試験 遺伝毒性試験 単回投与毒性試験 単回投与薬物動態試験 生殖発生毒性試験 単回投与薬物動態試験 200 L AL301 単回投与毒性試験 200 L AL302 生殖発生毒性試験 200 L 同等性/同質性 723-004-98 単回投与薬物動態試験 200 L 200 L 200 L 310-1-A N/A 2000 L 2000 L 11 723-004-98 723-013-98 309-025-00 309-011-00 309-012-00 効力を裏付ける試験（動物モデ ル） 単回投与薬物動態試験 反復投与毒性試験（6 ヵ月） 生殖発生毒性試験 反復投与毒性試験（6 ヵ月） 生殖発生毒性試験 臨床試験（試験番 号） 標準物質：研究用 グレード 第I相 (AN100226-101) 第 II 相 (MS201) 第 II 相 (MS200, MS201, ) CD201, 第 II 相 (MS202) N/A 第 II 相(CD202) 第 III 相(CD251) 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 表 1 非臨床試験で使用された原薬のプロファイル（続き） 社における 社における M3.2.S.2.6.1 に記 製造場所及び 原薬ロット番号 製剤ロット番号 載されている番号 製造スケール - 非臨床試験番号 非臨床試験の種類 2000 L 309-003-01 309-001-03 単回投与薬物動態試験 薬理試験 臨床試験（試験番 号） 第 III 相(CD301, CD251) 2000 L 309-010-01 反復投与薬物動態試験（2 ヵ月） 第 III 相(CD301) 2000 L 309-033-01 309-010-01 309-009-01 309-008-01 309-007-01 309-005-02 生殖発生毒性試験 反復投与薬物動態試験（2 ヵ月） 生殖発生毒性試験 生殖発生毒性試験 生殖発生毒性試験 生殖発生毒性試験 N/A 2000 L 309-028-02 生殖発生毒性試験 309-003-01 P00002-02-01 PD03-09 P00002-02-05 P00002-03-03 P00002-03-01 P00002-03-01 P00002-03-04 P00002-03-01 P00002-03-04 単回投与薬物動態試験 単回投与薬物動態試験 薬物動態試験 がん原性試験 がん原性試験 がん原性試験 がん原性試験 がん原性試験 がん原性試験 がん原性試験 Biogen 2000 L Biogen 2000 L Biogen 2000 L Biogen 2000 L (Biogen) N/A N/A：該当せず 12 Biogen 15,000 L P00002-02-01 単回投与薬物動態試験 第 I 相(C-1805), 第 III 相(CD351, CD352, CD303) N/A 第 III 相(C1801, C1802) 第 III 相(C1801, C1802) 第 I 相(C1805、 C1806), 第 III 相(CD351, C1803) 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 市販用スケール製剤ロットの製造には、15,000 L スケールで製造された原薬が用いられた。ナ タリズマブの市販製剤の製剤処方は、第 III 相臨床試験で使用された製剤処方と同一である。本製 剤処方はすべてのピボタルな生殖発生毒性試験及びがん原性試験において使用された。原薬の 200 L から 2000 L スケールへのスケールアップは、雌カニクイザルを用いた比較試験（試験番号 723-004-98）で、Cmax 及び AUC において生物学的同等性が示され、同等性が確認された。さらに、 原薬の 200 L から 2000 L スケールへのスケールアップは、モルモット EAE モデルを用いた効力を 裏付ける試験において、2000 L スケールの 3 mg/kg の活性が研究用グレードのナタリズマブ（試 験番号 AL078）及びマウス親モノクローナル抗体（試験番号 PB554）を用いた先行試験結果と同 等であることが確認された。 カニクイザルの薬物動態試験は、製造場所の から Biogen への変更（試験番号 309-003-01） 及び 2000 L から市販用スケール（15,000 L）へのスケールアップ（試験番号 P00002-02-01）にお ける同等性の評価のために実施された。2 つの試験において、それぞれ比較物質が同等であるこ とが示された。 抗ヒト α4 インテグリンマウス親モノクローナル抗体（AN100226m）は、主要薬理試験数種（試 験番号 PC032、試験番号 PB554、試験番号 PB555 及び試験番号 AL078）において用いられ、ナ タリズマブと同じ相補性決定領域（CDR）配列をもつ。AN100226m はヒト化され、ナタリズマブ が作製された。 In vitro 薬理試験において、市販用原薬（BG00002-B）は、α4β1 及び α4β7 インテグリンのそれ ぞれのリガンドへの結合を阻害した[M3.2.S.3.1.2]。ナタリズマブの Fc 領域の活性は IgG4 抗体サ ブクラスの活性に一致し、FcγRIII（Fcγ受容体 III）への結合及び補体結合活性は認められなかっ た。In vitro のヒト末梢血単核球において、ナタリズマブによる抗体依存性細胞毒性（ADCC）反 応が認められたが、成熟動物を用いた in vivo 毒性試験においては、ADCC 活性は認められなかっ た。 ナタリズマブは無血清培地を用いて産生され、通常用いられるクロマトグラフィー工程によっ て精製された。原薬及び製剤のいずれも、cGMP を遵守して製造された。すべての製造品は 95% 以上の純度であった。すべての製剤に用いられた添加物は、臨床用グレードで安全性の懸念を引 き起こさないものであった。 13 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 2. 薬理試験 2.1 リンパ球輸送（トラフィッキング）におけるα4 インテグリンの役割 インテグリンは、広範な生理的及び病的状態において、細胞間及び細胞と細胞間マトリックス との相互作用を仲介する、ヘテロ二量体の膜貫通型糖タンパク質である。インテグリンは発生、 造血及び免疫応答などの生物学的過程を調節する二方向性のシグナル伝達を媒介する。インテグ リンは、α 及び β サブユニットからなり、各々のサブユニットには、大きな細胞外ドメイン、短 い膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインがある。18 種類の α サブユニットと 8 種類の β サブユニッ トが結合して 24 種類の異なるインテグリンを形成する。リガンドの結合特異性は、αβ の組合せ によって規定される。 α4 インテグリン（CD49d）は、2 種類のインテグリン α4β1 及び α4β7 のサブユニットである。α4β1 インテグリンは VLA-4 としても知られ、ほとんどの単核球、好酸球及び好塩基球の細胞表面に高 レベルに発現している。VLA-4 は、静止状態にあるほとんどのリンパ球、好酸球、単球、好塩基 球（Wagner and Muller, 1998）及びナチュラルキラー（NK）細胞（Allavena et al, 1991）に発現し ている。末梢血好中球細胞表面の α4 インテグリンの発現レベルは低いが（Johnston and Kubes, 1999）、α4 インテグリンは炎症部位に好中球を補充する役割を担っている（Henderson et al, 2001）。 α4 インテグリンはまた、マスト細胞にも発現しており、組織特異的なホーミングにおいて重要な 役割を担っている（Gurish et al, 2001）。 α4 インテグリンの発現レベルは、リンパ球の活性化と関連している。α4β1 及び α4 β7 の両イン テグリンは、静止状態のほとんどのナイーブ CD4+又は CD8+T リンパ球に中等度のレベルで発現 し、活性化に伴って発現レベルが増加する。活性化に伴い、α4β1 又は α4β7 インテグリンのいず れかの発現がアップレギュレートされるが、両者ともアップレギュレートされるのではない （Wagner and Muller, 1998）。α4β1 及び α4β7 インテグリンはまた、静止状態のほとんどの末梢血 B 細胞にも恒常的に発現しているが、リンパ組織在住 B 細胞にはわずかに発現しているか又は発 現していない（Postigo et al, 1993）。T リンパ球と同様に、B 細胞でも活性化に伴い、α4 インテグ リンの発現レベルが増加する（Postigo et al, 1993）。α4β1 インテグリンはまた、造血前駆細胞に も発現し（Wagner and Muller, 1998）、成熟期の正常なホメオスタシスの維持に重要な役割を果た している（Arroyo et al, 1996）。α4β1 インテグリンは、他の細胞系にも発現し、心臓、平滑筋、骨 格筋及び胚形成時の神経堤に発現している（Sheppard et al, 1994）。α4 インテグリンは、様々な組 織に発現しているが、心臓にのみ、発生に関与している。α4 インテグリンは胎盤絨毛膜にも発現 しており、VCAM-1 は尿膜に発現していることから、胎盤の発達にも関与している可能性がある （Yang et al, 1995）。 ナタリズマブは、α4β1 インテグリン（VLA-4）と VCAM-1 及びフィブロネクチン（FN）との 相互作用を阻害する。α4β7 インテグリンもまた白血球に発現し、ナタリズマブは α4β7 インテグ リンと MadCAM-1 との相互作用を阻害する。両 α4 インテグリンは白血球と血管内皮細胞との強 い結合に関与し、他のインテグリンとともに、リンパ球の血管内皮細胞及び高内皮細静脈内皮細 14 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 胞通過、並びに脳、腸管粘膜組織（Baron et al., 1993; Vajkoczy et al., 2001; Engelhardt, 2008）又はリ ンパ節等の実質組織へのリンパ球の移動に関与する（Miyasaka and Tanaka, 2004）（図 1）。 図 1 白血球の血管内皮細胞への接着におけるα4 インテグリンとLFA-1 インテグリンの役割を示 す概略図 リンパ球 α4β1 α4β1 α4β1 ナタリズマブ 血管内皮細胞 VLA-4（α4β1 インテグリン）は、in vitro 系において、T リンパ球の VCAM-1 への付着、ローリング及 び安定した結合を媒介し（Alon et al, 1995）、同様に VCAM-1 も血管内皮細胞における T リンパ球の ローリングや結合を仲介する（Luscinskas et al, 1994）。 ICAM-1：CD54、LFA-1：α1β2 インテグリン、VLA-4：α4β1インテグリン 2.2 多発性硬化症（MS）におけるリンパ球の役割 中枢神経系において、アストロサイトは、血管内皮細胞と密接に関わり、血液脳関門（BBB） に不可欠な細胞である。ヒトアストロサイトは VCAM-1 を発現しており、この発現は IFN-γなど のサイトカインによって調節されている（Rosenman et al, 1995）。VLA-4（α4β1 インテグリン） は、ヒト脳周皮細胞に発現しており、T リンパ球の接着に関与している。T リンパ球の脳毛細血 管内皮細胞及び周皮細胞への接着及びその後の脳実質への遊出における VLA-4 が重要な役割を担 っていることが示されている（Verbeek et al, 1995）。リンパ球の BBB 通過を伴う遊出は、MS の 開始及びその後の病理変化に不可欠である局所における炎症カスケードの引き金となると考えら れている（Martin et al, 2001）。このモデルの裏付けとして、中枢神経系の脱髄及び軸索切断領域 は活動性炎症領域にも存在している（Trapp et al, 1998）。 15 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 2.3 In vitro効力を裏付ける試験 2.3.1 反応特異性 記載箇所：参考[M4.2.1.1-1] PC032、参考[M4.2.1.1-3] 309-002-04 ナタリズマブの α4 インテグリンに対する反応特異性は、ヒト化前のナタリズマブのマウス親抗 体である AN100226m を用いた 2 つの in vitro 試験で検討された（試験番号 PC032 及び試験番号 309-002-04）。α4 インテグリンに対する特異性は、α4 及びその他のインテグリンを発現している 細胞に対する AN100226m の結合を比較することにより確認された。1 つの試験（試験番号 PC032） では、他の抗 α4 インテグリン抗体（HP2/1）と結合性の比較も行った。AN100226m 抗体は α4 イ ンテグリンを発現している細胞には結合したが、α9、α5、β1 又は β5 インテグリンを発現してい る細胞には結合しなかった。α9 インテグリンは、α4 インテグリンと最も高い相同性をもつ（Palmer et al, 1993）が、ナタリズマブの親抗体は交差反応性を示さず、抗体の α4 インテグリンに対する 特異性が裏付けられた。組織交差反応性試験の結果からは、α4 サブユニットを含むインテグリン の分布と一致した結合であることが示された。 2.3.2 In vitroにおけるα4 インテグリンの飽和度 記載箇所：[M5.3.1.4] CST02-017 In vitro において、ヒト末梢血リンパ球細胞表面に発現する α4 インテグリンにおけるナタリズ マブの飽和度をフローサイトメトリー（FACS）解析により検討した。試験結果より、明らかにナ タリズマブは、約 5 µg/mL の低濃度で細胞表面の α4 インテグリンを飽和することが示された。臨 床用量である 300 mg では、最大血中濃度が 100 µg/mL となる。これら試験結果は、試験番号 CST02-017 及び図 2 に記載した。 16 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 図 2 末梢血リンパ球におけるナタリズマブの飽和度 Data source：[M5.3.1.4] CST02-017-Figure 4.1.4-1 末梢血リンパ球細胞表面に発現しているVLA-4に対するナタリズマブの飽和度をFACSにより解析し た。健康成人の末梢血から分離された末梢血リンパ球を用い、in vitroにおいてナタリズマブ濃度を漸 増させながらインキュベートした。細胞表面上でのナタリズマブの結合は、蛍光標識抗IgG4抗体を用 いたFACSにより解析し、データは平均蛍光強度で示した。ナタリズマブは、末梢血リンパ球表面に結 合し、5 µg/mLを超える濃度で細胞表面を飽和した。 2.3.3 種特異性 記載箇所：参考[M4.2.1.1-1] PC032、参考[M4.2.1.1-5] 309-001-03、[M4.2.1.1-4] PC100 ナタリズマブは、ヒト抗原に対するモノクローナル抗体としては非常に広範囲な種交差反応性 を示した。ナタリズマブは全血を用いた検討において、ヒト、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、 ブタ、モルモット及びフェレットとは反応したが、マーモセット、ウサギ、ハムスター、ラット、 マウス又はスナネズミとは反応しなかった（試験番号 PC032）。他の、例えば Rituxan™、Xolair™、 Raptiva™及び Herceptin™のようなヒト抗原に対する完全長配列のモノクローナル抗体の種交差反 応性は、ヒト及び非ヒト霊長類のみに限定されている（Champe et al, 1995、Klein and Dybdal, 2003、 Maloney, 1999、Presta et al, 1993）。ナタリズマブのリンパ球への結合親和性は、ヒトを含む交差 反応性のある動物種間で同等であった（Kd：0.04～0.07 µg/mL）。末梢血リンパ球における α4 イ ンテグリンの発現レベルは、ヒトを含む他の動物種よりカニクイザルにおいて全体的に高かった （約 50%）（試験番号 309-001-03）が、ヒト検体の個体差は少なくとも 2 倍以上であった（試験 番号 PC100）。 2.3.4 In vitro薬理作用 記載箇所：[M4.2.1.1-1] PC032 ナタリズマブのマウス親抗体（AN100226m）の in vitro における薬理作用は、ラット実験的自 17 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデル及び TNFα で活性化したラット脳より採取した血管内皮細胞、 ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）又はヒト VCAM-1 遺伝子をトランスフェクトしたマウス線維 芽細胞等の様々な細胞に対するヒト細胞（Jurkat、Ramos 又はヒト単球細胞株）の接着の阻害活性 により検討された。細胞株間の阻害率はほぼ類似しており、87～99％の範囲であったが、各試験 において用いられた AN100226m 濃度は報告されていない。 2.3.5 多発性硬化症（MS）におけるα4 インテグリン発現レベル 記載箇所：[M4.2.1.1-4] PC100 MS 患者から採取された末梢血リンパ球の α4 インテグリン発現レベルとナタリズマブの結合親 和性は、同試験内で行われた健康成人の値と同様であった（試験番号 PC100）。18 例の MS 患者 のうち 1 例において、10 例の健康成人の値より約 33%高い発現レベルを示したが、これは両群に おける検体数に起因する可能性又は MS 患者において発現レベルが増加している可能性がある。 最近の論文によれば、末梢血及び脳脊髄液（CSF）の T リンパ球及び単球における LFA-1 及び VLA-4 の発現量は、MS 患者において著しく増加していることが報告されている（Correale and Bassani Molinas Mde, 2003）。加えて、臨床的に確実な MS と診断された患者（CDMS）においては、clinically isolated syndrome（CIS）と診断された患者と比較して明らかに高レベルの両分子が発現している、 と報告されている（Correale and Bassani Molinas Mde, 2003）。VLA-5 の末梢血リンパ球上におけ る発現は、インターフェロン β 治療を受けている MS 患者においては抑制されていることが報告 されている（Calabresi et al, 1997、Muraro et al, 2000）。以上、実施した小規模の比較試験では発現 量が異なることを示唆できなかったが、MS 患者リンパ球における α4 インテグリン発現量が増加 していることが報告されている。このことは、MS におけるナタリズマブの推定される作用機序 がリンパ球接着阻害作用であることと一致する。 2.4 In vivo薬理試験 記載箇所：[M4.2.1.1-8] AL078、参考[M4.2.1.1-7] PB555 1、参考[M4.2.1.1-6] PB554 2 動物における有効性検討試験のすべてに用いられた多発性硬化症（MS）疾患モデルは、モルモ ットを用いた実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルであった。完全フロインドアジュバント （CFA）に懸濁した中枢神経系ホモジネートでモルモットを免疫した。この疾患モデルは、ヒト MS の病理及び症状に類似したモルモット脳における脱髄及びリンパ球の浸潤、並びに進行性麻 痺を生じる。この疾患モデルでは、疾患症状は、免疫後 9～10 日目と急速に発現し、15 日目前後 にピークが認められる。 ナタリズマブ又はそのマウス親抗体は、疾患誘導期に投与した場合、臨床症状発現を遅延し、 Kent SJ, Karlik SJ, Rice GP, et al. A monoclonal antibody to α4 integrin reverses the MR-detectable signs of experimental allergic encephalomyelitis in the guinea pig. J Magn Reson Imaging 1995; 5(59): 535-540. 2 Kent SJ, Karlik SJ, Cannon C, et al. A monoclonal antibody to α4 integrin suppresses and reverses active experimental allergic encephalomyelitis. J Neuroimmunol 1995; 58(1): 1-10. 1 18 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 臨床症状発現後 1～4 日目に投与した場合、臨床症状を改善する効果を示した。効果は用量依存的 で、0.3 mg/kg 以下では認められないが、1 mg/kg においては部分活性（疾患の改善のみ）が認め られ、3 mg/kg においては最大活性が認められた（試験番号 AL078）。効果は臨床スコア（麻痺状 態の測定）の減少を伴い、体重減少の不完全又は完全な抑制を示した。これらの改善効果は疾患 病理の改善を伴い、別の試験において、磁気共鳴画像法（MRI）解析における浮腫及び炎症の減 少（試験番号 PB555）及び脱髄の減少又は消失（試験番号 PB554）を認めた。推定される作用機 序を支持するものとして、ナタリズマブは T リンパ球の脳内及び脊髄への浸潤を顕著に抑制し（試 験番号 AL078）、この現象はマウス親抗体においても認められた（試験番号 PB554）。さらに、 マウス親抗体においては、血液脳関門（BBB）通過の増加を抑制した（試験番号 PB555）。 効果の経時変化は、試験間で類似しており、臨床スコアの改善は早期に認められ（投与開始約 1 日以内）、ナタリズマブ（又はマウス親抗体）の効力は、最終投与後 3 日で減少し始めた。最 大活性（3 mg/kg 投与時）は、投与開始後 1 日目の血清中濃度と関連性があり、12 µg/mL で認め られた（試験番号 AL078）。 2.4.1 In vivo薬力学効果 ナタリズマブの投与は血中白血球数の約 2 倍の増加を引き起こし、これは主にリンパ球数の増 加によるものであった（[M2.6.2.2.10]-表 8 参照）。使用したすべての動物種において、ナタリズ マブ約 1～5 µg/mL 以上の血清中濃度で白血球数の増加が認められたが、認められた増加は可逆的 で、ナタリズマブ濃度がこの値を下回ると正常範囲に復帰した。モルモットでは、霊長類より少 ない増加量を示したが、これはおそらく動物種によって末梢血及び組織中におけるリンパ球数比 が異なることを反映しているものと思われる。 これらの増加は、リンパ球が血管内皮細胞を通過してリンパ球の組織への遊出が阻害された結 果として血中のリンパ球数が増加したことによるもので、げっ歯類においては、α4 インテグリン に対する抗体を投与すると脾臓の辺縁帯由来の B 細胞が末梢血中に増加した（Lu and Cyster, 2002）。 投与に関連した白血球数の増加は、ナタリズマブの臨床における効果のみならず、LFA-1 のよう な他のインテグリンに対する抗体においても認められた。LFA-1（α1β2）インテグリンに対する 抗体の投与でも、ヒト（Papp et al, 2001）においてげっ歯類（Leach et al, 2002）同様、白血球の組 織への輸送（トラフィッキング）が阻害され、ナタリズマブと同程度に血中白血球数が増加した。 LFA-1 ノックアウトマウスでも、対照として用いた野生マウスの白血球数の約 2 倍の増加が認め られた（Berlin-Rufenach et al, 1999）。 2.4.2 多発性硬化症（MS）モデルにおけるin vivoリンパ球浸潤に及ぼす効果 記載箇所： [M4.2.1.1-10] RRCT-6、[M4.2.1.1-11] RRCT-8 実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）のラット及びマウスモデルは、急性経過をたどり、臨床的 異常（四肢麻痺）、免疫細胞の中枢神経系への一過性の浸潤及び変動はあるがおおむね限られた 量の活動性の脱髄が現れたのち、疾患誘発後 2～3 週以内に自然に消失する。EAE の急性ラット 19 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg モデルを用いた短期間の α4 インテグリン遮断試験では、ナタリズマブ単独投与及び他の免疫抑制 薬又は免疫調節薬との併用投与による中枢神経系への免疫細胞の移動及び α4 インテグリン遮断 の影響を解析した（試験番号 RRCT-6、試験番号 RRCT-8）。これらのデータは、これらの異なる 薬物投与における中枢神経系での免疫細胞による監視を間接的に測定するものである。 これらの急性ラット試験（試験番号 RRCT-6、試験番号 RRCT-8）の目的は、多発性硬化症（MS） のモデルであるラット EAE において、リンパ球遊出に対する遺伝子組換えラット IFN-β（MS の 治療に使用される免疫調節サイトカイン）及び抗体 GG5/3〔マウス抗ラット α4 インテグリン抗体 （ナタリズマブのホモログ）〕の単独投与及びこれらの併用投与の影響を比較することであった。 この試験系は中枢神経系における自己免疫性炎症疾患の急性自然回復モデルであるラット EAE モデルを使用したものであり、このモデルにおける臨床的麻痺は、免疫細胞が脊髄に移動して浮 腫が生じるために起こる。その結果、プラセボ投与動物に比べて抗 α4 インテグリン抗体 GG5/3 は、脊髄及び脳への同系脾臓細胞の遊出を有意に抑制し、疾患の重篤度を有意に改善することが 示された。遺伝子組換えラット IFN-β の単独投与では、脊髄及び脳への免疫細胞の遊出は有意に 抑制されず、EAE 臨床症状転帰に対する効果に影響が認められなかった。IFN-β + 抗体 GG5/3 併 用投与では、臨床症状重症度に対して抗体 GG5/3 単独投与と比較した付加効果は認められず、脊 髄及び脳へのリンパ球の遊出の抑制は（有意でないが）わずかに増加した。 2.5 副次的薬理試験 2.5.1 免疫系に対する作用 記載箇所：[M4.2.3.2-3]AL106、[M4.2.3.2-6] P00002-01-01、[M4.2.3.2-5] 309-011-00、[M4.2.3.5.2-4] 309-012-00、[M4.2.3.5.3-1] 309-033-01、[M5.3.1.2.2] C1806 ナタリズマブの免疫機能に対する影響は、カニクイザルを用いた in vitro 及び ex vivo モデルに よって評価された。 In vitro では、ナタリズマブは高用量（100 µg/ml）まで、幼若化反応、サイトカイン刺激、ナチ ュラルキラー（NK）活性又は T 細胞細胞障害活性を含む免疫機能測定に影響しなかった。 免疫学的影響の in vivo での評価は、in vivo 毒性試験のほとんどに組み込まれている一般的な検 査（血球数等の血液検査、組織学的検査、リンパ組織重量）に加え、末梢血細胞のフェノタイピ ング、細胞機能及びリンパ組織におけるリンパ球の分布等の評価も行った。末梢血リンパ球のフ ェノタイピングは、2 つの 1 ヵ月試験（試験番号 AL106 及び P00002-0101）、6 ヵ月試験（試験 番号 309-011-00）及び胚・胎児発生への影響に関する試験（試験番号 309-012-00）の 4 つのカニ クイザルの試験において評価された。最大 60 mg/kg までの投与量においてナタリズマブは、成熟 動物においては、B 細胞、T 細胞及び T 細胞サブセットの相対比に関して投与に関連した変化を 示さなかったが、白血球全体数の増加と一致したリンパ球の絶対数の増加が認められた。ナタリ ズマブを幼若サルに対して最大 60 mg/kg までの投与量で 6 ヵ月間投与すると、B 細胞数の T 細胞 数に対する相対的な増加傾向が認められた。この変化は、本試験において認められた白血球増加 20 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg に関連した T 細胞の増加以上の B 細胞絶対数増加により生じた。カニクイザルを用いた 28 日間 の静脈内投与試験（試験番号 AL106）では、ナタリズマブは 30 mg/kg の投与量まで、ex vivo に おけるマイトジェン又は自然免疫機能（NK 活性の測定）に対する T 細胞及び B 細胞応答には影 響を及ぼさなかった。1 ヵ月試験において、最大 60 mg/kg までの投与量で脾臓、胸腺及び腸間膜 リンパ節における CD3 及び CD20 発現細胞の分布を免疫組織学的に評価したところ（試験番号 P00002-01-01）、T 細胞と B 細胞においてこれらの組織で予想される分布と一致した。脾臓及び リンパ節における T 細胞及び B 細胞の増加は、これらの組織の組織学的検査において認められた 過形成と一致した。唯一、投与に関連して認められたリンパ組織におけるリンパ球分布の変化は、 胚・胎児発生への影響に関する試験において胎児に認められた（試験番号 309-012-00）。10 mg/kg 以上の投与量で、腸間膜リンパ節における T 細胞及び B 細胞の減少及び、脾臓、胸腺並びに肝臓 において B 細胞数の減少が認められた。これらの変化は、組織学的に観察された胸腺萎縮及び脾 臓における髄外造血反応の増加及び肝臓における髄外造血反応の減少と同時に生じた。 ナタリズマブが in vivo において免疫機能応答を制御する重要な役割を担っている可能性は、文 献的にも今回の試験結果からも示されなかった。しかしながら、in vivo における T 細胞依存性抗 原に対する免疫応答の評価は、最も優れた多目的機能測定法の一つと考えられており（Dean et al, 2001）、成熟カニクイザルにおいては実施されていないが、生殖発生毒性試験における出生児の 評価に含まれた（試験番号 309-033-01）。ナタリズマブを投与された母動物から生まれた新生児 において１次及び 2 次免疫応答に影響は認められなかった。 α4 サブユニットを有するインテグリンは、主に細胞接着機能を有する。ナタリズマブ投与に関 連した免疫機能に対する影響が認められなかったことは、機能が限定的であることと一致する。 しかしながら、VLA-4 が T 細胞共刺激因子として機能している可能性があるという報告（van Seventer et al, 1998）があり、VLA-4 は Th 細胞に発現が確認されており、VCAM-1 は濾胞樹状細 胞に発現が確認されている。したがって、ナタリズマブは T 細胞依存性抗原に対する免疫応答に 影響を及ぼし、その結果、T 細胞共刺激機能を阻害する可能性がある。リンパ球分布、リンパ球 比率の変化又は成熟動物における NK 機能にナタリズマブ投与に関連した変化が認められないこ とから、T 細胞依存性抗原に対する免疫応答に関する評価データの欠損は、試験プログラム全体 に影響を及ぼす問題とは考えられない。そのため、現在のガイドラインでは、さらなる免疫機能 試験は必要でないとされている〔米国における治験許可申請（IND）における米国食品医薬品局 （FDA）免疫毒性評価、2002、及び欧州医薬品委員会（CPMP）ガイドライン：反復投与毒性試験 に関するガイドライン、2000〕。投与に関連した感染症又はリンパ球増殖型の腫瘍の増加のよう な免疫抑制を示唆する証拠は、いずれの試験においても認められていない。本テーマに関する多 発性硬化症（MS）患者における臨床経験は M2.7.4.2.1 及び M2.7.4.2.2 に記載されている。 カニクイザル及びアカゲザルを用いた反復投与試験の多くにおいて、ナタリズマブ投与群で脾 臓重量の統計学的に有意な増加が認められた。さらに、必ずしも統計学的に有意ではないがすべ ての試験において、増加例は数例ずつ認められた。幼若カニクイザルを用いた 6 ヵ月試験（試験 番号 309-011-00）及びアカゲザル（試験番号 P0002-01-01）を用いた 1 ヵ月試験において脾臓重 21 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 量の統計学的に有意な増加が認められた。平均体重又は相対器官重量の投与群/対照群比において 約 2 倍の増加が、臨床用量と同程度の投与量（試験番号 C1806）において認められた。脾臓の組 織学的変化は、ナタリズマブ又は他の抗原に対する免疫応答と一致した濾胞過形成だけであった が、これのみでは、脾臓重量変化の原因としては不十分であった。T 細胞及び B 細胞の脾臓にお ける分布は（試験番号 P0002-01-01）、ナタリズマブ投与によって変化しなかった。一般毒性試験 において、ナタリズマブ投与による他のリンパ系器官の器官重量に変化は認められなかった。こ れ（脾臓重量の増加）はナタリズマブの投与に関連した薬理効果である可能性があり、おそらく 本抗体の主作用に関連しているものと考えられる。脾臓重量の増加は二次的に、ナタリズマブの 投与に関連した白血球数の増加を示し、リンパ球数の増加は脾臓赤色髄に見られるようであった。 ヒトにおいて心拍出量の約 3～5%は脾臓に供給されている（Llende et al, 1986）。標識リンパ球を ラットに静脈内投与すると、脾臓赤色髄に高濃度の細胞が留まる（Willführ et al, 1990）。ヒトに おいては、交換可能な B 細胞プールの 10～15%及び T 細胞プールの約 25%は脾臓に存在すると概 算されている（Christensen et al, 1978）。ナタリズマブ投与による白血球数の 2 倍の増加は、脾赤 色髄における細胞数の増加を導くと思われる。加えて、いくつかの試験からも、げっ歯類の α4 及 び LFA-1 インテグリン（α1β2 インテグリン）は、脾臓におけるリンパ球の輸送（出入）に関する 機能を有することが示唆されている。白血球数及び脾臓重量の増加はまた、マウスへの LFA-1 に 対する抗体投与（Raptiva™の代替品）（Mounho et al, 2003、Leach et al, 2002）、LFA-1 ノックア ウトマウス（Berlin-Rufenach et al, 1999）及び ICAM-1 アンチセンスオリゴヌクレオチド投与マウ ス（Bennett et al, 1997）においても認められた。α4β7 及び LFA-1 の両インテグリンは、リンパ球 の脾臓での分布（Lu and Cyster, 2002、Papayannopoulou et al, 2001）だけでなく、リンパ球の脾臓 内への輸送においても重要で重複する役割を担っている（Lo et al, 2003）。したがって、脾臓重量 の増加は、リンパ球輸送の変化による脾臓内外におけるリンパ球数のバランスの変化の結果であ る可能性や、血中の白血球増加による赤脾髄における細胞数の増加の結果である可能性がある。 2.6 安全性薬理試験 2.6.1 心血管系安全性薬理試験 記載箇所：[M4.2.1.3-1] AL107 ナタリズマブ投与における心血管系機能に対する影響は、ビーグル犬を用いた独立した試験に おいて評価され（試験番号 AL107）、カニクイザルを用いた反復投与 2 試験、及びアカゲザルに おける薬物相互作用試験においても確認された。結果として、心血管系に対する影響について 3 種の動物種を用いて最大 60 mg/kg までの投与量及び 6 ヵ月間で評価した。イヌを用いた試験にお いては、心電図検査（6 誘導）、平均心拍出量、1 回排出量及び全末梢血管抵抗を評価した。心電 図は循環器専門家によって定性的に解析された。全身性及び肺動脈圧、収縮期及び拡張期血圧、 全身性及び平均肺動脈血圧、心拍数、収縮期ピーク左心室血圧、左心室収縮及び拡張の最大速度 及び収縮指数について、心電図の連続モニタリングを行った。投与に関連した可能性のある変化 はイヌを用いた試験においてのみ認められ、3 mg/kg のナタリズマブを投与したイヌ 1 匹に、全身 22 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 性及び左心室血圧、左心室収縮指数、平均心拍数及び 1 回拍出量の一過性の減少、心拍数、肺動 脈圧、全末梢血管抵抗の増加が認められた。加えて同様の投与に関連した可能性のある変化が 30 mg/kg 投与群 3 匹中 2 匹に認められ、全身性及び左心室血圧、左心室収縮指数及び平均心拍出量 の減少が認められた。30 mg/kg 投与群 3 匹中 2 匹にはまた、肺動脈圧、全末梢血管抵抗及び 1 回 排出量のわずかな変化のみならず、心拍数の変動が認められた。これらの変化は一時的なもので、 霊長類においては 6 ヵ月間投与まで心血管系に意義のある変化は認められず、ヒトにおいてナタ リズマブが心血管系に影響を及ぼす可能性はほとんどないと考えられた。 2.6.2 進行性多巣性白質脳症（PML） 記載箇所：参考[M4.2.1.3-3] 309-026-06、参考[M4.2.3.7.7-10] 309-002-oTOX、参考 [M4.2.1.3-2]309-027-06 進行性多巣性白質脳症（PML）の直接的な動物モデル、すなわち JC ウイルス（JCV）感染後に 起こるアストロサイト/オリゴデンドロサイトの誘導に関連した疾患を起こす、ヒト以外の動物種 における JCV 感染の報告はない。非ヒト霊長類及びげっ歯類において PML の疾患モデルを作成 する努力が広範になされてきたが、おそらくこのウイルスの種特異性が極めて高いため、努力は まだ実を結んでいない。一方、シミアンウイルス 40（SV40）によって病理的に類似した疾患を非 ヒト霊長類に誘発することは可能である（Holmberg et al, 1977、Horvath et al, 1992）が、これら 2 種類のウイルス間には生物学的に重要な相違点が存在する。このような SV40 モデル系を PML の 代替として使用することの妥当性について、特に注意すべき点や懸念される点は以下のとおりで ある。 • 宿主細胞受容体及び核への移行方法が異なる。 • SV40 では JCV と異なり、疾患と関連する組織親和性が発現する前にウイルスゲノム再編成 が起こらない。JCV の場合、調節領域のゲノム再編成と疾患との間に強い関連性がある（Seth et al, 2003）。 • （JCV にとっての HIV のように）動物に対して免疫抑制作用を有し SV40 遺伝子の転写を活 性化するサル免疫不全ウイルス（SIV）を第 2 のウイルスとして使用することは、被験物質が 第一のウイルス SV40 に及ぼす影響の解釈が複雑になり、MS 患者にその解釈を外挿すること が困難になる。 以上の生物学的相違点及び複雑化要因、この系の再現性が不明であること、SV40 に感染したこ とのない非ヒト霊長類を多く入手できないこと、並びに SIV 感染を利用することから、PML のリ スク評価にこの系を利用することの妥当性は不明である。したがって、PML の病原体に対して直 接、ナタリズマブ（又はその他の免疫抑制薬/免疫調節薬）の影響を検討することは不可能である。 しかしながら、以下に示す in vivo げっ歯類試験系及び in vitro 試験系から、リスク評価に関連す る可能性のある情報が得られた。 JCV の生態に対するナタリズマブの影響を調べるため、複数の in vitro 実験が実施された。例え 23 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg ば、JCV は、5HT2A セロトニン受容体及び 2,6-シアル酸に結合することによって宿主細胞に感染す ることが報告されている。ナタリズマブ単独投与及びナタリズマブと Avonex®〔インターフェロ ン β-1a（IFNβ-1a）〕の併用投与は、細胞表面における 5HT2A セロトニン受容体及び 2,6-シアル酸 のいずれの発現も変化させなかった（試験番号 309-026-06, 試験番号 309-002-oTOX）。JCV ゲノ ムの初期領域の転写が、多数のサイトカインによって調節されている可能性を示す文献報告があ る。したがって中枢神経系中のサイトカインプロファイルの変化がアストロサイト及びオリゴデ ンドロサイトにおける JCV 複製の増加を招き、PML の発症を引き起こす可能性があり得る。初代 培養ヒト皮質グリア細胞に JCV を感染させ、（IFNβ-1a を含む）ある種のサイトカイン又は（ナ タリズマブを含む）抗体がこの細胞中の JCV の複製に影響する可能性について検討した（試験番 号 309¬027-06）。その結果、IFNβ-1a もナタリズマブも対照に比べて JCV 複製を変化させなかっ たことから、これらの薬物の投与が PML 発現の原因となる可能性は認められなかった。 2.6.3 薬物相互作用 記載箇所：[M4.2.3.2-6] P00002-01-01 アカゲザルを用いた 4 週間試験では、ナタリズマブと、米国において 120,000 人を上回る多発 性 硬 化 症 （MS ） 患 者に 投 与 さ れた Avonex® と の 相 互 作用 に つ い て検 討 さ れ た（ 試 験 番 号 P00002-01-01）。アカゲザルは非ヒト霊長類で唯一 Avonex®が生物学的有効性を示す動物種である ことから試験に用いた。本試験においては、30 mg/kg 又は 60 mg/kg のナタリズマブを 30 µg の Avonex®とともに 4 週間投与した。それぞれ単独投与した場合と併用投与した場合の作用は同様で あり、臨床評価において、Avonex®との併用は、安全に使用可能であることが示唆されたである。 3. 薬物動態試験 3.1 吸収 モルモット及びカニクイザルを用いて、ナタリズマブの単回及び反復投与試験を実施した。ま た、がん原性試験の投与方法を最適化する目的で、マウスを用いて薬物動態試験を実施した。本 項の薬物動態データは、薬物動態試験及び毒性試験結果を解析した。これらの試験の用量範囲は、 臨床用量及び毒性試験に用いられた用量範囲にわたる体内動態を十分に特徴付けている。血清中 ナタリズマブ濃度及び抗ナタリズマブ抗体の定量には ELISA 法を用いた。いずれの動物種におい ても、ナタリズマブの定量下限は 0.25 µg/mL、抗ナタリズマブ抗体の定量下限は 0.5 µg/mL であ った。ナタリズマブの存在は抗ナタリズマブ抗体の検出を阻害する可能性があり、抗体を検出す る ELISA 法において、血清中に抗ナタリズマブ抗体濃度の 2 倍を超える濃度のナタリズマブが共 存すると、抗体の検出に阻害が生じることが試験結果により確認された。試験法はいずれも承認 申請の要件を満たすものであると考えられた。薬物動態パラメーターの計算には、 、若しくは しくは （ （ 社、 社、 、 、 ）、又は 、若 ）を用いた。血清中濃度に関するデータは非コンパー トメントモデルにより解析した。濃度が定量限界未満（BLQ）であった場合、解析時には 0 とし 24 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg て扱った。算術平均、相乗平均及び標準偏差の計算などの統計解析には （ 社、 、 ）を用いた。 3.1.1 単回投与薬物動態試験の総括 記載箇所：[M2.6.4.3.1]、[M2.6.4.3.2]、[M2.6.4.3.4] ナタリズマブ単回投与の薬物動態試験は、マウス、モルモット及びカニクイザルを用いて 0.3 mg/kg～30 mg/kg の用量範囲で評価され、表 2 に結果を要約した。いずれの動物種においても、 ナタリズマブの血清中濃度は投与量の増加に伴って上昇した。モルモット及びカニクイザルに対 する静脈内及び心臓内投与による用量設定試験では、全身クリアランス（CL）が用量の増加に伴 って減少し、これに伴い AUC には用量比を超える増加が認められ、消失半減期（t1/2）は用量の 増加に伴って延長した。薬物動態の性差はいずれの動物種においても認められなかった。 表 2 ナタリズマブ単回静脈内投与後の薬物動態パラメーター（平均値） 用量 投与 Cmax AUC0-inf CL t1/2 （µg/mL） （µg*hr/mL） （mL/hr/kg） （hr） （mg/kg） 経路 10 IV 170 11728 0.853 77 ヌードマウス1 10 IP 91 10482 NA 97 1 27±4 366±101 2.93±0.87 19±5 モルモット2 3 IC 70±9 1503±406 2.11±0.47 37±8 8 154±29 9408±3165 0.90±0.30 73±24 0.3 8±2 66±29 5.07±1.36 8±4 3 カニクイザル 3 IV 124±35 2537±628 1.25±0.36 58±24 30 1630±551 93490±62120 0.43±0.19 74±23 Data source：1 [M2.6.4.3.1] PD03-09-表1、1 [M4.2.2.2-1] PD03-09-Table 1、2 [M2.6.4.3.2] AL077-表3、2 [M4.2.2.2-2] AL077-Table 8、3 [M2.6.4.3.4] AL109-表9、3 [M4.2.2.2-4] AL109-Table 2 IV：静脈内、IP：腹腔内、IC：心臓内 動物種 マウス及びモルモットを用いた試験では、血清を用いた抗ナタリズマブ抗体の検出は行わなか った。抗ナタリズマブ抗体は、3 mg/kg のナタリズマブを静脈内投与されたカニクイザルにおいて、 投与後 14 日から 17 日にかけて検出された。一般的に抗ナタリズマブ抗体の出現は、血中からナ タリズマブが急速に減少することと関連していた。カニクイザルの免疫原性に性差はみられなか った。 本製剤の開発過程において生じた製剤組成及び製造スケールの変更について比較するため、単 回投与薬物動態試験は複数回実施された。実施した比較試験では、薬物動態（PK）パラメーター に統計学的有意差は認められず、モルモット実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおいて、 最小有効用量における有効性の変化は認められなかったことから、製剤組成及び製造工程の変更 によりナタリズマブの PK に変化は生じないという結論が裏付けられた。 マウスにおける腹腔内投与後のナタリズマブのバイオアベイラビリティは、約 89%であった。 バイオアベイラビリティで調整した CL 及び t1/2 は静脈内投与で得られたデータと矛盾するもので 25 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg はなかった。 3.1.2 反復投与薬物動態試験の総括 記載箇所：[M2.6.4.9]、[M2.6.4.3.3] 309-010-01、[M4.2.2.2-3] 309-010-01、[M4.2.3.2-4] 723-013-98、 [M4.2.3.2-5] 309-011-00、[M4.2.3.5.3-1] 309-033-01、[M4.2.3.5.2-4] 309-012-00 、[M4.2.3.2-6] P00002-01-01 ナタリズマブ反復投与の薬物動態（PK）について、マウス、モルモット、カニクイザル及びア カゲザルを用いて 0.06～60 mg/kg の用量範囲で評価した。いずれの動物種においても、ナタリズ マブの血清中濃度は投与量の増加に伴って上昇した。モルモットに対する曝露量は変動が大きか った。この変動性のため、群間での投与量の区別がつかなかった。カニクイザルの PK パラメー ターについては、投与 2 回目以降、抗ナタリズマブ抗体が出現したため、信頼性のある測定値は 初回投与後にしか得られなかった。幼若カニクイザルにおける消失半減期（t1/2）は成熟カニクイ ザルの 2 倍であった。ナタリズマブの経胎盤移行及び胎児曝露については、モルモット及びカニ クイザルにおいて用量 10 mg/kg 以上で確認された。分娩時まで 30 mg/kg のナタリズマブを隔日投 与したカニクイザル母動物から生まれた新生児の平均血清中ナタリズマブ濃度は、およそ出生後 （PND）28 で平均 434 µg/mL であった。モルモットにおいて、妊娠日（GD）4～GD30 にわたっ てナタリズマブを投与した母動物の GD30 の胎児全血清プールから約 0.006 の胎児/母動物比でナ タリズマブが検出された。カニクイザルについては、GD20～GD70 にわたって投与した後、GD100 で帝王切開を実施した。カニクイザルにおけるナタリズマブの平均胎児/母動物比は 10 mg/kg 群で 0.18 及び 30 mg/kg 群で 0.35 であった。ナタリズマブに対する抗体は胎児にも分布が認められ、平 均胎児/母動物比は 3 mg/kg 群で 0.40、10 mg/kg 群で 0.37 であった（30 mg/kg 群では抗体は検出さ れなかった）。GD20 から分娩まで 30 mg/kg のナタリズマブを投与した母動物の PND28 の新生児 においてナタリズマブが検出された。GD20 から 30 mg/kg を投与した群におけるナタリズマブの 平均新生児/母動物比は 1.30 であった。本群の母動物 12 例のうち 4 例では、PND28 に母乳におい て低レベルのナタリズマブが検出された。この母動物の母乳/血清比は 0.003 であった。その他の 母動物の母乳においてはナタリズマブは陰性で、ナタリズマブは母乳中にほとんど又は全く移行 しないことが示唆された。 アカゲザルにおけるナタリズマブの血清中濃度プロファイルはカニクイザルとほぼ同様であり、 IFNβ-1a 併用による影響は認められなかった。PK データにおける性差はいずれの動物種において も認められなかった。 反復投与後のマウス血清では、抗ナタリズマブ抗体の検出を分析していない。モルモットにお いては、3 mg/kg 群及び 10 mg/kg 群で抗ナタリズマブ抗体が検出された。3 mg/kg 群において抗体 により、約半数の動物におけるナタリズマブ曝露量は測定不能レベルとなった。カニクイザルを 用いた 6 ヵ月間反復投与毒性試験では、全投与群において抗ナタリズマブ抗体が 1 例以上から検 出された。抗体が検出された例では種々の程度でナタリズマブ曝露量の低減が認められた。30 mg/kg 以上の投与群では投与動物の多くで、おおむね投与期間を通して曝露が維持されていた。 26 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg カニクイザルを用いた生殖発生毒性試験では、10 mg/kg 以上の投与群において投与期間を通して 母動物の曝露が維持されていた。また、抗ナタリズマブ抗体には胎盤通過能も認められた。抗体 陽性であった母動物の胎児の臍帯血からは抗ナタリズマブ抗体が検出された。カニクイザル及び アカゲザルの免疫原性に性差及び種差は認められなかった。反復投与の PK パラメーター測定結 果を表 3 に要約する。 表 3 ナタリズマブ反復投与後の最終投与における薬物動態パラメーター（平均値 ± 標準偏差） 動物種 用量（mg/kg） 投与 経路 Cmax （µg/mL） 52±32 679±202 1806±360 21±18 306±131 1246±703 98±53 421±293 1559±438 NA NA 396±270 1320±674 66±126 553±557 2261±617 AUCc （µg*hr/mL） 1419±1297 23272±7659 61047±13912 411±566 5947±2252 40436±23136 2896±1832 14766±11073 61003±16728 NA NA 27346±42770 93901±162337 NA NA NA CL t1/2 （mL/hr/kg） （hr） NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA 18.7±15.9 51.3±82.1 11.4±8.9 38.3±64.8 NA NA NA NA NA NA 3 10 IV 30 3 雌モルモッ 10 IV ト（妊娠早 期）a, 2 30 3 雌モルモッ 10 IV ト（妊娠後 期）b, 3 30 3 10 成熟カニク IV イザル4 30 60 10 幼若カニク 30 IV イザル5 60 30 4122±1452 妊娠カニク (GD20~GD70) IV NA NA NA イザル6 30 6220±3212 (GD20~分娩) 10 2605±1825 NA NA NA 妊娠カニク IV イザル7 30 5171±4629 NA NA NA 30 468±202 NA NA NA アカゲザル IV 8 60 1358±431 NA NA NA 1,2,3,4,5,7 1,2,3 1 Data source： [M2.6.4.9]-表46、 [M2.6.4.3.3] 309-010-01-表6、 [M4.2.2.2-3] 309-010-01-Attachment III-Table 5、2[M4.2.2.2-3] 309-01-01- Attachment III-Table 2、3[M4.2.2.2-3] 309-010-01- Attachment III-Table 4、4[M4.2.3.2-4] 723-013-98-Attachment III-Table 3B、5[M4.2.3.2-5] 309-011-00-Attachment II-Table 2、 6 [M4.2.3.5.3-1] 309-033-01-Attachment III-Table 6.1-3, Table 6.1-4、7[M4.2.3.5.2-4] 309-012-00-Attachment II-Table 2、8[M4.2.3.2-6] P00002-01-01-Appendices G-Table 2 a 妊娠早期 = 試験開始時GD4 b 妊娠後期 = 試験開始時GD30 c AUC値は、モルモットではAUC0-48h、成熟カニクイザルではAUC0-infを用いた。 NA：該当せず、IV：静脈内、GD：妊娠日 雄モルモッ ト1 3.1.3 血清中濃度推移に関する特記 反復投与毒性試験における第一の問題は、ナタリズマブ曝露の維持に対する抗ナタリズマブ抗 体の影響である。モルモットを用いた試験では、3 mg/kg 群では曝露維持は不十分で、毒性学的エ ンドポイントの評価が可能であったのは 10 mg/kg 群及び 30 mg/kg 群のみであった。成熟カニクイ 27 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg ザルを用いた 6 ヵ月間反復投与毒性試験では、抗ナタリズマブ抗体によりクリアランスが急速に 促進されたために、3 mg/kg 及び 10 mg/kg 用量での曝露が無効となり、30 mg/kg 群及び 60 mg/kg 群では投与例の約半数で曝露の低減が生じた。幼若カニクイザルを用いた毒性試験の 10 mg/kg 群 及び 30 mg/kg 群において同様の曝露プロファイルが観察された。カニクイザルを用いた生殖発生 毒性試験では、10 mg/kg 以上の投与群において投与期間中、母体の曝露が維持されていた。これ らのデータについては、本試験の毒性学的所見を解釈する際並びにナタリズマブの安全な使用条 件を設定する際に考慮しなければならない。 3.2 分布 「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」〔医食審発 0323 第 1 号、平成 24 年 3 月 23 日/ICH S6 (R)〕に基づき、分布に関する試験は実施しなかった。α4 インテグリンに 対するナタリズマブの組織交差性を介した分布については毒性試験の[M2.6.6.8]を参照。胎児移行 性及び乳汁への移行性については[M2.6.4.4]及び本項 3.1.2 を参照。 3.3 代謝 「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」〔医食審発 0323 第 1 号、平成 24 年 3 月 23 日/ICH S6 (R)〕に基づき、代謝に関する試験は実施しなかった。ナタリズマブは IgG4 クラスの抗体タンパク質であるため、生体内では低分子ペプチドやアミノ酸へと分解されるもの と考えられる。これらの経路は一般に理解されているため、ナタリズマブに固有の試験は不要で ある。 3.4 排泄 「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」〔医食審発 0323 第 1 号、平成 24 年 3 月 23 日/ICH S6 (R)〕に基づき、排泄に関する試験は実施しなかった。ナタリズマブのタン パク質分解により形成される遊離アミノ酸は、通常の中間代謝、生合成過程を経て、排泄される。 これらの経路は一般に理解されているため、ナタリズマブの排泄に関する試験は不要である。 4. 毒性試験 4.1 組織交差反応性試験 記載箇所：[M4.2.3.7.7-3] PC001、[M4.2.3.7.7-4] PC002、[M4.2.3.7.7-2] IM342、[M4.2.3.7.7-1] IM050 組織交差反応性は、独立した 4 試験において、ヒト組織〔胎児期組織、周産期組織、成人組織 及び少数の多発性硬化症（MS）患者組織〕、カニクイザル組織（胎児期組織及び成熟期組織）、 アカゲザル組織（胎児期組織）及びモルモット心臓組織を用いた評価（試験番号 PC001、試験番 号 PC002 及び試験番号 IM342）、及び追加試験として、ヒト組織パネルに対するマウス親モノク ローナル抗体を用いた組織交差反応性の評価（試験番号 IM050）を行った。予想外の交差反応性 は認められず、組織に対する全ての結合が既知の α4 インテグリンの発現と一致していた。 28 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 4.2 溶血活性及び血液適合性試験 ナタリズマブの全血中での溶血能、並びに血漿タンパク質に対する沈殿性及び凝集性を評価す るための正式な in vitro 試験は実施しなかった。しかしながら、カニクイザルを用いた単回及び反 復投与毒性試験では、血液適合性の問題を示唆するような臨床病理パラメーターの変化は認めら れなかった。さらに、臨床試験の安全性データからも血液適合性の問題は確認されなかった。 4.3 In vivo毒性試験 4.3.1 単回投与毒性試験 記載箇所：[M4.2.3.1-2] AL089 生物学的に活性を有する動物種に対して、臨床投与経路を用いたナタリズマブの急性毒性試験 は実施しなかった。初期の試験では、Hartley 系モルモットにナタリズマブを単回心臓内投与 （126.9 mg/kg）して評価を行った（試験番号 AL089）。モルモットを用いた場合、静脈内に大量 を投与することは容易ではないことから、投与量を可能な限り多くする目的で心臓内投与を用い た。ナタリズマブの投与に関連した作用は認められなかったものの、投与経路に起因する瀕死例 及び死亡例が評価の交絡因子となった。その後実施した、適切な投与経路である静脈内投与を用 いた霊長類における反復投与試験で、一般毒性の観点からのナタリズマブの投与に関連した影響 について検討した。 4.3.2 反復投与毒性試験 記載箇所：参考[M4.2.3.2-2] WSRC 940911、[M4.2.3.2-3] AL106、[M4.2.3.2-4] 723-013-98、 [M4.2.3.2-5] 309-011-00、[M4.2.3.2-6] P00002-01-01 カニクイザルを用いて、1 ヵ月間反復投与毒性試験を 2 試験、6 ヵ月間反復投与毒性試験を 2 試験（成熟及び幼若動物）実施した。1 ヵ月間の試験では、ナタリズマブを隔日で静脈内投与し、 6 ヵ月間の試験ではナタリズマブを週 1 回静脈内投与した。トキシコキネティクス（TK）の解析 結果から、より少ない投与頻度でも十分な曝露が維持されることが示唆された。ナタリズマブの 投与に関連した所見は各試験間でおおむね一致しており、末梢血白血球数及び脾臓重量の増加等 が認められた（幼若動物を用いた試験においてのみ、末梢血有核赤血球の増加が認められた）。 これらの変化はナタリズマブ消失後には回復した。回復試験期間は、1 ヵ月間の試験では 4 週間、 6 ヵ月間の試験では成熟動物で 6 週間、幼若動物で 17 週間であった。初期の試験から後期にかけ て所見の観察頻度が増加する傾向にあったが、これはおそらく群の大きさが大きくなり、投与期 間が長くなったことによるものと考えられた。 予備試験として実施された用量設定試験（試験番号 WSRC 940911）では、カニクイザルにナタ リズマブを最大 30 mg/kg の投与量で 1 ヵ月間隔日投与した。ナタリズマブ投与に関連して、3 mg/kg 以上の投与群において白血球数が全投与期間を通して 2 倍まで上昇したが、4 週間後には回復し た。この変化は、α4 インテグリンとそのリガンドとの相互作用が阻害された結果、白血球の血管 29 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 外への遊出の阻止及びリンパ球の血中への移行が生じたためと考えられる。後者については、α4 インテグリンに対する抗体を投与したマウスにおいて、B 細胞数が脾臓辺縁帯では減少し、末梢 血中では増加したという報告に一致する（Lu and Cyster, 2002）。α4β1 及び LFA-1 インテグリンと もに、血液細胞の遊出の調節だけでなく、末梢リンパ組織における細胞分布の調節に役割を担っ ていることが示されている（Papayannopoulou et al, 2001）。当該変化は別のインテグリンである LFA-1 に対するモノクローナル抗体 RaptivaTM を投与した試験の結果と一致する。このモノクロー ナル抗体に関しては、ヒト（Papp et al, 2001）及びサロゲート抗体を用いたマウスの試験で白血球 数の倍増が認められている。脾臓重量（絶対及び相対重量）の増加は投与終了時に剖検した高用 量群の 1 例において認められた。本変化については、より一貫して本変化が認められた次の試験 において詳述する。 より規模の大きい 1 ヵ月間毒性試験（試験番号 AL106）では、カニクイザル（雄 15 匹、雌 15 匹）にナタリズマブを 0.3 mg/kg から 30 mg/kg の用量で隔日で静脈内投与した。本試験の結果、 3 mg/kg 以上の投与群において約 3 倍の白血球数の増加が認められたが、投与に関連した変化は本 変化に限られた。リンパ球数の増加には血清中ナタリズマブ濃度（1～5 µg/mL 以上）との関連が 認められ、4 週間の回復試験期間後に回復した。抗ナタリズマブ抗体も血清中ナタリズマブ濃度 の減少に一致して認められ、認められたリンパ球数の増加も回復した。0.3 mg/kg 群から 30 mg/kg 群で網状赤血球数の増加（最大でプラセボ群の 2 倍）が散見された。本変化については、α4 イン テグリンが造血に関与していることが知られていることから（Hamamura et al, 1996）、ナタリズ マブの投与に関連した変化であると考えられる。3 mg/kg 以上の投与群において、脾臓重量（絶対 及び相対重量）の増加傾向が認められたが、血中からのナタリズマブ消失後に回復した。30 mg/kg 投与群の脾臓に濾胞過形成の投与に関連した軽度な増加が認められた。全般的に、カニクイザル に対し、最大 30 mg/kg 用量のナタリズマブの 1 ヵ月間の静脈内投与はおおむね良好な忍容性を示 した。ナタリズマブの薬理活性は白血球数及び脾臓重量の増加から裏付けられた。抗ナタリズマ ブ抗体の出現によりナタリズマブへの曝露が低減した動物も認められたが、総じて、安全性を検 討するために設定された全投与群において、群単位では十分な曝露量が得られていた。 週 1 回の静脈内投与の 6 ヵ月間の試験（試験番号 723-013-98）では、カニクイザルは 3 mg/kg から 60 mg/kg の用量でナタリズマブを投与された。本試験における一般状態の変化としては、20 回目から 23 回目の投与後に 2 例で認められた一過性の infusion reaction 3 件に限られ（60 mg/kg 群 及び 3 mg/kg 群）、以後の投与では再発しなかった。投与 7 週目及び 8 週目に 10 mg/kg 群の雌 1 例において、傾眠及び粘膜蒼白を特徴とした、ナタリズマブに対する明らかな液性免疫反応が認 められた。補体が枯渇していたこと、用いた溶媒に対しては免疫反応が認められなかったこと及 び投与動物に抗ナタリズマブ抗体の出現が十分な濃度で認められたことから、上記液性免疫反応 が裏付けられた。10 mg/kg 以上の投与群では白血球数が約 2 倍に増加したことから、ナタリズマ ブが薬理活性を示したことは明らかであった。本変化は主にリンパ球の増加に関連するものであ ったが、単球及び好酸球の増加を伴う例も認められた。α4 インテグリンはこれらの細胞のすべて に発現する（Wagner and Muller, 1998）。白血球数の増加には、血清中ナタリズマブ濃度（1～5 µg/mL 以上）との関連が認められた。その後の測定時点で 3 mg/kg 群に認められた白血球数の軽微な変 30 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 化は、抗ナタリズマブ抗体の出現に伴う血清中濃度の減少によるものと考えられた。血清中濃度 は抗ナタリズマブ抗体の出現の影響を受けていた。抗体出現率は 30 mg/kg 群（60%）よりも用量 の低い 3 mg/kg 群及び 10 mg/kg 群（100%）の方が高かった。抗体 ELISA 法の測定系に、血清中 に抗ナタリズマブ抗体濃度の 2 倍を超える濃度でナタリズマブが存在する場合、干渉が起こるこ とが示されている。高用量群に抗体出現率が低かったことは、高濃度のナタリズマブが本測定系 に干渉を起こした可能性がある。高用量群において、抗ナタリズマブ抗体により、ナタリズマブ の相対曝露量が累積 AUC 換算でヒトにおける曝露量の 3 倍にまで減少している例もあった。しか し、3 分の 2 の動物では累積 AUC が、ヒトへの曝露で予測される 30 倍以上であったことから、 総じて、十分な曝露量が得られていた。 前述したように、ナタリズマブの薬理活性と一致した 60 mg/kg 群における脾臓重量の可逆的な 増加が認められた。投与終了時又は回復試験期間後に剖検したナタリズマブ投与群において軽微 から軽度の濾胞過形成が低発現率で認められたが、肉眼的所見と関連のないナタリズマブに対す る免疫応答に関連した変化と考えられた。認められた脾臓の濾胞過形成では脾臓重量の増加の原 因として十分ではないと考えられる。さらに、抗ナタリズマブ抗体に関連した糸球体腎炎が投与 終了後に剖検した動物 4 例（10 mg/kg 群及び 30 mg/kg 群）で認められた。試験中、5 例全例で抗 体価の上昇及び補体活性化の徴候が認められたことから、認められた糸球体腎炎は免疫複合体の 形成及び沈着に対する二次応答と考えられた。全般的に、最大 60 mg/kg 用量のナタリズマブの 6 ヵ月間の投与に対し、総じて良好な忍容性が認められた。薬理活性は白血球数及び脾臓重量の増 加により特徴付けられたが、いずれも有害な変化ではないと考えられる。10 mg/kg 群及び 30 mg/kg 群で認められた免疫介在性反応（明らかな全身性の液性免疫反応及び糸球体腎炎）が本試験にお ける最も重要な有害な変化であった。しかしながら、ナタリズマブはヒト化抗体であることから、 ヒト患者において同様の免疫介在性反応が起こる可能性は低いと考えられる。これまでの臨床試 験結果では、ナタリズマブ投与に関連した免疫介在性反応の発現率は低い。 幼若カニクイザルを用いた週 1 回の静脈内投与による 6 ヵ月間反復投与毒性試験（試験番号 309-011-00）では、10 mg/kg から 60 mg/kg の用量のナタリズマブを投与した。60 mg/kg 群で infusion reaction が 1 例に認められた。補体活性化による免疫複合体の出現が認められ、本例の抗ナタリズ マブ抗体濃度は高値を示した。一般状態については、その他の毒性徴候を示唆する変化は投与期 間、回復試験期間いずれにおいても認められなかった。30 mg/kg 群及び 60 mg/kg 群において、白 血球数及びリンパ球数の最大 4 倍の増加が認められ、血清中ナタリズマブ濃度（1～5 µg/mL 以上） との関連も認められた。10 mg/kg 以上の群で有核赤血球（NRBC）の可逆的な増加（総赤血球数 の約 0.4%）が認められたが、これらの細胞の形態は正常であり、他の赤血球パラメーターに変化 は認められなかった。α4β1 インテグリンは造血、特に胎児において重要な役割を担う（Hamamura et al, 1996）。また、抗 α4 インテグリン抗体の投与により、胎児期肝臓及び成熟期骨髄中のコロ ニー形成細胞の接着が減少し、骨髄基質における造血前駆細胞の停留及び増殖に変化を来たすこ とが示されている（Roy and Verfaillie, 1999）。このような幼若動物における NRBC の軽度な増加 は、NRBC 表面の α4β1 インテグリンが阻害され、この未熟な赤血球のごく一部が血液成分中に放 出された結果であると考えられる。血液成分中でのこのような NRBC のわずかな増加は、形態が 31 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 正常であること、可逆的であること、並びにその他の血液パラメーター及び動物の全身には明ら かに有害な影響が認められないことからも、毒性学的に重要な変化ではないことが示唆される。 ナタリズマブに対する抗体出現率は、10 mg/kg 群では 100%、30 mg/kg 群では 50%及び 60 mg/kg 群では 10%であった。これにより、ほとんどの抗体陽性動物においてナタリズマブの曝露量が減 少したが、完全には曝露は除去されなかった。高用量群 10 例のうち 1 例でのみ投与 85 日目以降 に曝露が認められなかった。ナタリズマブの薬理活性と一致して、全投与群の一部の動物に脾臓 重量の増加が認められた。濾胞の肥大及び過形成も脾臓に認められたが、これはナタリズマブに 対する免疫反応による可能性があると考えられた。ナタリズマブを最大 60 mg/kg で 6 ヵ月間投与 した幼若カニクイザルにおいて、重要な有害な影響は認められなかった。ナタリズマブの薬理活 性を示唆する変化が全投与群で認められ、先行したカニクイザルの反復投与毒性試験の結果と一 致した。これらの変化として白血球数の増加及び脾臓重量の軽度な増加が認められた。また、幼 若動物では、NRBC のわずかな増加を特徴とする赤血球生成におけるナタリズマブの薬理学的作 用が認められたが、明らかに有害な影響を及ぼすものではなかった。薬理活性は 10 mg/kg 以上の 用量で認められ、60 mg/kg 以下の用量において明らかな毒性学的変化は認められなかった。 アカゲザルにおいても、Avonex®（30 µg、筋肉内投与）の併用又は非併用において、30 mg/kg、 又は 60 mg/kg の用量でナタリズマブの週 1 回 4 週間反復投与による毒性を評価した（試験番号 P00002-01-01）。カニクイザルと異なりアカゲザルは、ナタリズマブ及び Avonex®の両者に薬理学 的反応を示す。予想される薬理学的作用に関連した白血球数の増加が両投与群で認められた。さ らに、単球数、好酸球数及び好塩基球数にも増加が認められた。本試験でも、これらの末梢血の 変化には、ナタリズマブの血清中濃度（1～5 µg/mL 以上）との関連が認められた。末梢血スメア 検査において、網状赤血球数及び NRBC の増加、並びに赤血球の不同血球症及び多染性赤血球症 も認められた。赤血球におけるこれらの変化は、毒性学的に意義があるとは考えられなかったが、 ナタリズマブの薬理学的作用と関連する可能性が最も高いと考えられた。脾臓重量の増加が認め られたが、17 週間の回復試験期間後には認められなかった。脾臓及びリンパ節でリンパ過形成が 認められた。本試験では、免疫組織化学検査によってリンパ系器官における T 細胞と B 細胞の分 布は正常であることが新たに示された。このことから、ナタリズマブの投与によって、リンパ球 の遊出は影響を受けるものの、主要なリンパ球集団の分布には異常を起こさないと考えられた。 本試験では、いずれの用量でも両薬の薬理効果の相互作用を示す証拠は認められなかった。ナタ リズマブの薬理活性と関連する変化は、用量及びタイプの点において、カニクイザルを用いた先 行試験の結果と一致した。 4.3.3 生殖発生毒性試験 記載箇所：[M4.2.3.5.1-4] 309-008-01、[M4.2.3.5.2-2] 309-028-02 生殖発生毒性の評価に際しては、ナタリズマブに薬理活性を示すモルモット及びカニクイザル の 2 種を動物モデルとして用いた。モルモットは、雄及び雌の受胎能に対する影響の評価に用い られ、器官形成に対する影響を検討する第 2 の動物種とされた。カニクイザルは、器官形成及び 新生児期の発育に対する影響を検討するために用いた。公表論文のレビュー及びナタリズマブの 32 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 作用機序に関する考察より、生殖発生/胎児発生の過程において α4 インテグリン阻害による影響 を受ける可能性がある段階は明らかで、特筆すべきは、受精、胎盤形成、胚着床、造血及び心臓 発生の過程である（Wagner and Muller, 1998、Yang et al, 1995）。 モルモットについては、生殖発生毒性試験モデルとして用いられることは多くないため、背景 データが限られてしまう。しかし、この目的で用いられることが多い動物種にはナタリズマブは 活性を示さず、また、非ヒト霊長類では受胎能に対する影響について行える評価が限られるため、 行った一連の試験は、発生能又は生殖能に関するナタリズマブ投与の影響を検討する目的におい て合理的な研究方法である。雌モルモットの性周期を観察又は腟スメア検査で確認することも、 性周期の同調も不可能であることから、本動物モデルを用いることについては実際的な問題があ る。したがって、モルモットを用いた生殖毒性試験のうち 2 試験では、すでに妊娠が成立してい る動物の妊娠末期にナタリズマブの投与を開始し、分娩後発情期に交配を行って、次の妊娠期に ナタリズマブの投与の影響を評価する際に高い妊娠率を確保できるようにした。その結果、この 2 試験（試験番号 309-008-01 及び試験番号 309-028-02）における投与期間は、すでに成立してい た妊娠期の妊娠日（GD）30 から次の妊娠期の GD30 までとなった。 以下に示すように、生殖発生毒性試験プログラムにおいてモルモットの妊娠率の低下、霊長類 におけるナタリズマブ投与群での流産率の明らかな増加、並びに雌の受胎能試験で交配に用いら れた後にナタリズマブの直接投与を受けた雄モルモットに死亡例が認められたことなど、複数の 問題点がさらに特定されたが、妊娠率及び流産率の増加は、霊長類及びモルモットを用いた追加 試験では再現性が認められなかった。 4.3.3.1 受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 記載箇所：[M4.2.3.5.1-2] 309-007-01、参考[M4.2.3.5.1-3] 309-005-02、[M4.2.3.5.3-1] 309-033-01、 [M4.2.3.5.1-4] 309-008-01、参考[M4.2.3.5.1-1] 309-025-00、[M4.2.3.5.2-1] 309-009-01 モルモットを用いた雄の授胎能試験（試験番号 309-007-01）では、最大 30 mg/kg の隔日静脈内 投与により、精子の運動性、精子数、非投与雌を妊娠させる能力などの授胎能に関連した評価項 目に、ナタリズマブの投与に関連した影響は認められなかった。本試験デザインでは雄に対して 適切な曝露期間を設定した。ナタリズマブの薬理活性は全投与群において白血球数の増加から裏 付けられた。本試験結果は、α4 インテグリンの発現が精子の前駆細胞に認められないこと（Schaller et al, 1993、Shinohara et al, 1999）と一貫性がある。α4 インテグリンの発現は精巣上体通過後の精 子でのみ認められ（Glander et al, 1994、Trübner et al, 1997）、授精能のない精子と比較して授精能 を有する精子に発現レベルが高い（Glander et al, 1996）。 本試験の初回実施時には、以下に示すように、雌の受胎能試験において未投与だった雄を用い たが、ナタリズマブ投与後に多数の雄が死亡した。そこで次に未使用動物を使って、雄の授胎能 試験を再実施した。その後実施されたメカニスティック試験（試験番号 309-005-02）の結果から、 前述の雄モルモットの死亡は、ナタリズマブを投与した雌と同居させた雄に検出可能なレベルの 抗ナタリズマブ抗体が発現することと関連していることが示された。抗ヒスタミン薬をあらかじ 33 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg め投与しておくと、症状発現までの時間が延長し、ナタリズマブ投与後の死亡率が低下した。雌 の受胎能試験で同居させた雄のナタリズマブ曝露経路は不明であるが、誤投与、交尾時、若しく は身づくろい時の曝露、又は投与した雌と接触した床敷からの間接曝露などが可能性として考え られる。本試験における誤投与を示唆する記録はなく、また、10 mg/kg 及び 30 mg/kg を投与した 雌と同居させた雄全例及び 3 mg/kg を投与した雌と同居させた雄の数例に抗体発現が認められた ことから、本試験に用いた雄の全動物で少なくとも 1 回ずつ誤投与が起こったという可能性はほ とんどないと考えられる。これらの雄モルモットにおいて死亡例が発生したことから、用いた原 薬ロットの免疫原性が他のロットよりも高い懸念及びナタリズマブの間歇投与は臨床上の安全性 リスクを有する懸念が考えられる。前者については、これらの試験で用いた原薬は同時に実施さ れていた霊長類を用いた発生試験（試験番号 309-033-01）でも用いられており、その試験で用い られ、投与されたサル 52 匹には過敏性反応又はアナフィラキシー様症状が認められなかったこと から、原因として可能性は低いと考えられる。臨床上のリスクについては、モルモットは異種タ ンパク質による免疫後にアナフィラキシー反応を非常に起こしやすいことがよく知られているこ とから、ヒトにおけるナタリズマブの間欠投与の安全性評価については、臨床試験において評価 されることが最も適切である。 モルモットを用いた雌の受胎能試験（試験番号 309-008-01）では、ナタリズマブの投与により、 30 mg/kg 群で妊娠率に約 50%の有意な低下（30 mg/kg 群の妊娠率 29.6%に対して、0、3 及び 10 mg/kg 群の妊娠率はそれぞれ、63.3、66.7 及び 66.7%）が認められた。30 mg/kg 群に認められた妊娠率の 低下は、他群と比較して着床動物数が約半分（30 mg/kg 群の着床数 8 に対して、0、3 及び 10 mg/kg 群の着床数はそれぞれ、19、19 及び 18）であったことによるものであった。また、用量に依存し て生存出生児数は減少し、死亡出生児数は増加する傾向にあった。死亡した出生児の死因は特定 されず、出生から生後 14 日までの死亡率についてはナタリズマブ投与群とプラセボ投与群の間で 有意差は認められなかった。ナタリズマブ投与群では、用量に関係なく、母動物 8 例が死亡、又 は瀕死状態となって切迫剖検された（3 mg/kg 群で 2 例、10 mg/kg 群及び 30 mg/kg 群で各 3 例）。 出生後（PND）20 に死亡した 1 例を除き、全死亡例は分娩予定日の 1 週間以内に認められた〔妊 娠日（GD）62～PND7〕。これらの死亡例の死亡時期は分娩と関連していると考えられる。また、 プラセボ対照群で死亡例が認められないことから、投与に関連した影響であることが示唆される が、他の試験におけるプラセボ投与群の分娩時死亡率と同程度であった（試験番号 309-025-00 及 び試験番号 309-009-01）。モルモットを用いた生殖発生毒性試験全体の試験結果を鑑みると、こ れらの死亡例がナタリズマブの投与に関連している可能性は低いことが示唆される。妊娠期間、 胎児の性比、体重及び外部異常などの関連パラメーターにその他の異常は認められなかった。ナ タリズマブの薬理活性は全投与群で白血球数の増加から裏付けられた。10 mg/kg 群の初回投与後、 又は最終投与後の曝露量は、モルモットでは迅速に消失することから臨床用量に満たなかったが、 隔日投与法とすることで、10 mg/kg 用量で臨床用量の 11 倍の累積曝露量が達成された。 妊娠率の低下は α4 インテグリンの阻害に関連するものであり、受精及び着床における α4 イン テグリンの役割を反映しているものと考えられる。α4 インテグリンは正常月経周期中に発現する （Coutifaris et al, 1998、Fazleabas et al, 1997、Lessey, 1997）。α4 インテグリンの発現は、正常月経 34 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 周期の排卵期及び分泌期中期で主に腺組織及び間質組織に認められ（Creus et al, 1998, Gonzalez et al, 1999、Tabibzadeh, 1992）、後期では低レベルに発現が認められている（Creus et al, 1998、 Tabibzadeh, 1992）。因果関係については確実には示されていないものの、後期の低下は着床期間 の終了に一致する。α4 インテグリン発現の減少などのインテグリン発現レベルの変化は、受胎能 に関して原因不明の問題を有する女性において認められている（Gonzalez et al, 1999、Sueoka et al, 1997）。これは、α4β1 インテグリンのリガンドであるがん胎児性フィブロネクチンの発現ととも に、子宮内膜の細胞外基質（マトリックス）への通過及び接着活性を有する栄養膜（トロホブラ スト）に特徴的なものである（Feinberg et al, 1991）。このことから、α4β1 インテグリン発現量が 低いか欠如している場合は着床不全が起こる可能性があると推測されている（Sueoka et al, 1997）。 α4 インテグリンは精巣上体通過後の精子に発現し（Glander et al, 1994）、卵母細胞と精子の融合 にも関与する（Fénichel and Durand-Clement, 1998、Gonzalez et al, 1999）。したがって、ナタリズ マブは、受精阻害又は栄養膜の子宮内膜への着床の阻害により妊娠率の低下を生じる可能性が考 えられる。 要約すると、雌のモルモットにおいて 30 mg/kg のナタリズマブ投与により妊娠率の有意な低下 が認められた。累積曝露量から計算して臨床用量の 11 倍に当たる 10 mg/kg 以下の薬理活性を有 する用量において、雌の受胎能に対する有害な影響との関連性は認められなかった。 4.3.3.2 胚・胎児発生への影響に関する試験 記載箇所：[M4.2.3.5.2-1] 309-009-01、[M4.2.2.2-3] 309-010-01、 [M4.2.3.5.1-4] 309-008-01、[M4. 2.3.5.2-2] 309-028-02、[M4.2.3.5.2-4] 309-012-00、[M4.2.3.5.3-1] 309-033-01 モルモット モルモットに対し、着床 2 日前〔妊娠日（GD）4〕から器官形成期の終了時（GD30）までナタ リズマブを投与した発生毒性試験（試験番号 309-009-01）では、胚・胎児発生に、投与に関連し た有害な影響は全く認められなかった。後述するカニクイザルにおける発生毒性試験とは対照的 に、いずれの組織においても組織学的変化は認められなかった。薬物動態試験（試験番号 309-010-01）から、最高用量群におけるナタリズマブの血清中濃度は、30 mg/kg 群の最終投与の AUC 換算で臨床用量の約 2 倍に達すると推測されるが、なんら影響は認められなかったことから、 投与期間又は胎児曝露が限定的であることによる可能性が考えられた。最終投与後 30 日にトキシ コキネティクス（TK）用試料を採取するという本試験デザインでは、胎児において高濃度のナタ リズマブ（0.39~1.8 µg/mL）を検出することは不可能であった。試験曝露量の範囲で評価を行うに は最適な試験デザインではなかったものの、本試験デザインによって試験動物のストレスと、そ れにより生殖発生に関する評価に支障を来たすリスクが最小限に抑えられた。 すでに成立している妊娠の GD30 から、1 回目の妊娠の分娩後の発情期に交配を行って成立さ せた妊娠の GD30 までの、長期間の曝露における毒性評価を行う追加試験を実施した。モルモッ トにおける胚・胎児発生への影響に関する試験のデータを雌の受胎能試験のデータと比較したと ころ、30 mg/kg のナタリズマブの投与では妊娠率に変化は認められなかったが（試験番号 35 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 309-009-01）、投与開始時期が約 1 ヵ月早い場合、妊娠率が有意に低下した（試験番号 309-008-01）。 このことから、着床の 2 日前に投与を開始しても、着床及び発生のごく初期段階にある胚に対し ては曝露が不十分であった可能性が示唆された。このため、心臓の発達に対する早期の影響につ いて過小評価された可能性がある。この試験は、すでに成立している妊娠の終了期から次の妊娠 まで連続して、発生に及ぼす影響を評価できるよう設定された（試験番号 309-028-02）。 雌モルモット 2 群に対し、すでに成立している妊娠の GD30 から次の妊娠の GD30 まで、ナタ リズマブ（30 mg/kg）又はプラセボを隔日静脈内投与した。各動物を最終投与後 30 日に当たる約 GD60 に安楽死させ、母動物及び胎児パラメーターを評価した。投与に関連した変化が白血球数 に認められた。主にリンパ球と単球の増加による白血球数の増加が認められた（最大 1.6 倍）。 妊娠率にはナタリズマブの投与による影響は認められなかった。外部又は内臓の奇形が新生児 4 例で認められ、いずれもナタリズマブ投与群の新生児であった。ただし、観察された奇形は各例 で異なり、大部分はモルモットを用いた他の試験で観察された変化（臍ヘルニア、左前肢過屈曲、 肺動脈拡張及び脾臓の小型化並びに腎盂拡張）であった。このことから、これらの変化は投与に 関連した影響ではないと考えられた。最終投与後 1 ヵ月のナタリズマブ平均濃度は、母動物で 31.2 ± 46.8 µg/mL、胎児で 9.1 ± 9.8 µg/mL と妥当な曝露量であった。本試験では、評価を実施する妊娠 期に先行してナタリズマブを投与したことから、ナタリズマブの投与に関連した流産誘発性、胎 児毒性及び催奇形性はないという結論が裏付けられた。ナタリズマブの受胎能試験で認められた 妊娠率への影響が再現できなかった理由は不明である。モルモットの妊娠率は変動が大きいこと が可能性として考えられるものの、モルモットの背景データには大規模なデータベースがないた め、確定はできない。これら 2 試験間で、到達した曝露量に差異があったことも考えられる。こ れらのモルモットの生殖発生毒性試験の曝露量は、主として、抗体の出現とそれに伴う急激な消 失が生じる例もあることを示したサテライト薬物動態試験によって裏付けられている。したがっ て、2 番目の試験では、雌の受胎能試験で認められたような受精又は着床における阻害を引き起 こすのに必要な曝露量を超えなかった可能性がある。当該試験では、トキシコキネティクス（TK） 用試料の採取を最終投与後 30 日である試験終了日にしか実施していないため、これらの 2 試験間 での曝露量の差を十分に確認できないと考える。 カニクイザル カニクイザルを用いて実施した発生毒性試験（試験番号 309-012-00）では、全器官形成期を通 してナタリズマブを曝露した結果、胎児において投与に関連した有意な変化が認められた。 10 mg/kg 以上の用量において、白血球数の増加、有核赤血球数（NRBC）の増加、血小板数の減 少、肝臓及び胸腺重量の減少及び脾臓重量の増加が胎児に認められた。さらに 10 mg/kg 以上の投 与群の胎児には、赤血球数、ヘマトクリット及びヘモグロビン濃度の統計学的に有意な減少又は 減少傾向、並びに軽度の貧血を伴う平均赤血球容積（MCV）及び平均赤血球ヘモグロビン量（MCH） の統計学的に有意な増加が認められた。これらの投与群における病理組織学的変化として、胸腺 の軽度萎縮、脾臓における髄外造血の増加及び肝臓における髄外造血の減少などが認められた。 腸間膜リンパ節中の T 細胞及び B 細胞数は減少し、胸腺、脾臓及び肝臓類洞における B 細胞数に 36 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg も減少が認められた。ナタリズマブを曝露した GD100 の胎児における臍帯血由来の末梢血単核球 は、10 mg/kg 以上の用量においてフィトヘマグルチニン（PHA）非刺激下で増殖が促進されたこ とから、血中の造血前駆細胞数が増加する可能性が示唆される。 3 mg/kg 群の胎児には明らかな有害な影響は認められなかったが、抗ナタリズマブ抗体の出現に よるクリアランスの増大及び曝露の減少を導いた可能性がある。3 mg/kg 群のすべての投与動物に GD52 までに抗ナタリズマブ抗体が出現し、GD36 までに半分以上（5/9）の投与動物に抗ナタリズ マブ抗体が出現した。10 mg/kg 群においては 2 匹のみ（GD44 で 1 匹及び GD80 で 1 匹）に抗ナ タリズマブ抗体が出現した。他方、30 mg/kg 群には抗体の出現は認められなかった。GD44 にお いて抗体が出現した 10 mg/kg 群のナタリズマブ総曝露量は 3 mg/kg 群と同程度であった。3 mg/kg 群の胎児で試験終了時にナタリズマブを検出できたのは 2 例のみであった。10 mg/kg 群及び 30 mg/kg 群では、1 例を除く全例で全器官形成期を通して（GD50 まで）ナタリズマブの曝露が認 められ、また、10 mg/kg 群では、2 例を除く全例で GD100 の帝王切開まで曝露が持続した。帝王 切開時（GD100）にナタリズマブの血清中濃度が測定可能であった母動物では、その胎児におい ても測定可能であった。胎児における濃度は、母動物の半分未満である例がほとんどであり、母 動物の血清中濃度の 8%から 79%までの範囲にあった。ナタリズマブの薬理学的活性は母動物及び 胎児における白血球数の増加から示された。α4 インテグリンは心外膜の発生において重要な役割 を担っており（Sengbusch et al, 2002、Yang et al, 1995）、α4 インテグリン又は VCAM-1 欠損マウ スでは心外膜及び冠状動脈の欠損などの出血を起こす心奇形を有するが（Kwee et al, 1995、Yang et al, 1995）、30 mg/kg までの用量のナタリズマブの投与を受けたカニクイザルでは、肉眼的にも病 理組織学的にも心臓に異常は認められなかった。 本試験で認められたナタリズマブによる影響は、α4 インテグリンの既知の 2 作用である、白血 球の遊出及びリンパ球の移行及び造血に対する作用によると考えられる。マウス胎児の肝臓内で、 α4β1 インテグリンは造血において重要な役割を担っている。マウス VLA-4 に対するモノクローナ ル抗体を母動物に投与すると、その新生児には著しい貧血及び赤芽球の重度の減少、並びに胎児 赤血球前駆細胞の減少が認められた（Hamamura et al, 1996）。ナタリズマブを投与した試験で認 められた貧血は、程度は軽いものの、Hamamura らの所見と一致する。α4 インテグリンは、白血 球の発生、ホーミング及び遊出に関与しており、造血系細胞に広く発現している。これらインテ グリンは胎児期及び成熟期の造血（Arroyo et al, 1996）、特に T 細胞及び B 細胞の発生に関わって いる。α4 インテグリン欠損マウスでは、腸間膜及び鼠径リンパ節ではなくパイエル板において T 細胞のホーミングが重度に阻害された。出生後では、B 細胞の発生欠損及び T 細胞数の減少が認 められた。α4 インテグリン欠損マウスとは対照的に、霊長類におけるナタリズマブの胚・胎児発 生試験では、腸間膜リンパ節において T 細胞数及び B 細胞数に影響が認められた。α4 インテグリ ンがマウスの絨毛尿膜胎盤の形成に関与すること（Downs, 2002）及び VLA-4 の阻害により絨毛 膜と尿膜の癒合に悪影響が認められること（Spence et al, 2002）が報告されているが、本試験では 胎盤形成に対しては明らかな有害な変化は認められなかった。 総じて、器官形成期におけるナタリズマブ投与は、胎児の造血及び白血球の遊出における変化 37 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg と関連した。ナタリズマブ投与により認められた変化のうち、臨床的に最も重篤な投与に関連し た変化は貧血であった。リンパ系器官における変化の意義については、免疫機能検査を含む出生 後試験（試験番号 309-033-01）において検討した。サルの胎児への影響は 10 mg/kg 以上の用量で のみ認められたが、抗ナタリズマブ抗体発現による曝露量の減少を考えると、3 mg/kg 用量は無影 響量として妥当ではない。このことは 3 mg/kg 群において白血球数の増加が認められなかったこ とからも支持される。器官形成期における用量 3 mg/kg 以上のナタリズマブ投与は、胎児に軽度 の貧血、並びに造血及びリンパ系器官における変化を引き起こす可能性があると考える必要があ る。 4.3.3.3 出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験 記載箇所：[M4.2.3.5.3-1]309-033-01、[M4.2.3.5.2-4] 309-012-00、[M4.2.3.5.2-1] 309-009-01 カニクイザルを用いた発生期及び出生後の生殖発生毒性試験（試験番号 309-033-01）を実施し た。妊娠動物（14 匹/群）に対し、器官形成期〔妊娠日（GD）20～GD70〕又は全妊娠期間を通し て（GD20～分娩）、プラセボ又はナタリズマブ（30 mg/kg）を投与した。全妊娠期間から分娩及 び出生後新生児が 12 ヵ月齢又は 18 ヵ月齢になるまで、母動物と新生児について評価を実施した。 2 投与群で流産率が予測よりも上昇した〔43%及び 29%（対照群 7%）〕。その結果、試験デザイ ンを変更して試験動物数を追加（1 群当たり 12 匹）し、1 群当たり合計 26 匹とした。追加動物に おける流産率は対照群と投与群で同等（25%）であった。本試験施設の背景データにおける流産 率は 12%から 33%であった。最初の動物群のデータでは、対照群（妊娠期間の一部の期間投与し た系で 12%、分娩まで投与した系で 15%）と比較して、妊娠期間の一部の期間曝露した系で 31%、 分娩まで曝露した系で 27%と投与群において流産率が増加していた。本試験の追加動物群、及び 霊長類（試験番号 309-012-00）又はモルモット（試験番号 309-009-01）を用いたこれまでの胚・ 胎児発生試験では、ナタリズマブの投与に関連した流産誘発性は認められなかったことから、投 与群で認められた流産率の増加は投与とは関連しない可能性がある。この可能性をさらに支持す る結果として、投与期間が最長の試験では、対照群と投与群との差が最小であった（それぞれ 15% 及び 27%）。赤血球数及びその関連パラメーターに減少は認められなかったことから、胚・胎児 発生試験で認められた軽度の貧血は、ナタリズマブの曝露を継続しても出生後まで持続しないこ とが示唆される。全妊娠期間を通して投与した母動物から生まれた新生児では出生後（PND）112 日まで統計学的に有意な血小板減少が認められたが、これより日齢が高い新生児では認められて いない。カニクイザルにおける胚・胎児発生試験（試験番号 309-012-00）の胎児においても血小 板減少が認められたことから、前述した造血における α4 インテグリンの作用に関連するナタリズ マブ投与に関連した影響である可能性が示唆される。血液学的検査結果から、ナタリズマブを分 娩まで投与した母動物から生まれた新生児では、血清中ナタリズマブ濃度の測定結果と一致した 血中のリンパ球数に増加が認められた。ナタリズマブの投与を受けた母動物から生まれた新生児 において 6 ヵ月齢で測定した結果では、血清中 IgG、IgM 及び IgA の値に影響は認められなかっ た。ナタリズマブの投与を受けた母動物から生まれた新生児の T 細胞依存性抗原であるキーホー ルリンペットヘモシアニン（KLH）に対する一次及び二次免疫応答に投与の影響は認められなか 38 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg った。剖検時の肉眼的観察又は病理組織学的検査において、対照群との差異は認められなかった。 脾臓、胸腺、肝臓、腋窩リンパ節、腸間膜リンパ節、鼠径部リンパ節、バイエル板及び扁桃腺の 免疫組織化学的検査におけるリンパ球サブセットには、B/T 細胞数、分布又はリンパ球マーカー 染色強度に関して、対照群と比べてナタリズマブを投与した母動物から生まれた新生児に変化は 認められなかった。 総じて、新生児の一般状態、生存率、発生及び免疫機能に対し、有害な作用は認められなかっ た。母動物及び新生児の体重、体重増加、一般状態、血液生化学検査又は血液凝固パラメーター 並びに母動物の摂餌量に影響は認められず、新生児の外部異常も認められなかった。 4.4 遺伝毒性試験 記載箇所：[M4.2.3.3.1-1] AM002、[M4.2.3.3.1-2] AM001 ナタリズマブはヒト化モノクローナル抗体で、一般的に遺伝毒性を示す懸念は低いと考えられ、 「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」〔医食審発 0323 第 1 号、平成 24 年 3 月 23 日/ICH S6 (R)〕に基づき、通常の遺伝毒性の評価は必要ないと判断し、in vivo の遺 伝毒性試験は実施しなかった。また、in vitro 遺伝毒性試験については、上記ガイドラインに基づ き 2 試験を実施し、1) マウスリンフォーマ（L5178Y tk+/-）前進突然変異試験（試験番号 AM002） 及び 2) ヒトリンパ球染色体異常試験（試験番号 AM001）において、ナタリズマブの遺伝毒性の 可能性を評価した。ナタリズマブはマウス α4 インテグリンに結合しないため、マウスでは薬理活 性を示さず、試験に使用する細胞の DNA に到達することもなければ直接相互に作用することもな い。したがって両マウス試験で評価可能であったのはナタリズマブの作用機序とは関連しない毒 性（例：添加物の遺伝毒性）だけである。これらの試験の結果、いずれの試験においても S9 活性 化の有無にかかわらずナタリズマブに遺伝毒性は認められず、本剤中に遺伝毒性を示す、製造工 程に関連した不純物及び添加物が存在しないことが示された。 4.5 がん原性試験 インテグリンは、腫瘍の発達、局所への浸潤及び播種のあらゆる段階で重要な役割を担ってい ると考えられている（Sanders et al, 1998、Zetter, 1993）。2001 年の米国における新規のがん症例 及びがんによる死亡症例の解析より、新規がん症例の 65%及びがん死亡症例の 59%は、結腸、肺 及び気管支、皮膚（メラノーマ）、乳房、前立腺、膀胱並びに非ホジキンリンパ腫の 7 部位（又 はタイプ）のがんにより占められている。文献によれば、α4 インテグリンの発現はメラノーマ細 胞（Albelda et al, 1990）及び各種リンパ腫（Csanaky et al, 1997、Möller et al, 1992）に認められるが、 肺（Damjanovich et al, 1992）、乳房（Koukoulis et al, 1991）、結腸及び前立腺（Paavonen et al, 1994） については認められていない。膀胱がんでの発現の有無は不明である。一般的に、ヒト原発性腫 瘍において α4 インテグリンの発現は、低いか全く認められないことから、ヒト原発性腫瘍におい て α4 インテグリンが同型細胞間接着に重要な役割を担っているとは考えにくい。 血液細胞に α4 インテグリンが発現していることから、血液悪性腫瘍における本接着分子の関与 39 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg について広範に検討されている。B 前駆細胞型白血病細胞における α4β1 インテグリンの発現は、 骨髄間質細胞への接着（Filshie et al, 1998）及びその後の破骨細胞による骨破壊（Michigami et al, 2000）に関連していることが示されている。B リンパ球性慢性白血病細胞においては、その早期 には α4β1 インテグリンの発現は低レベルであるが、進行期には高レベルの発現が認められている （Csanaky et al, 1997、Eichelmann et al, 1992、Eksioglu-Demiralp et al, 1996）。α4β7 インテグリンの 発現は、粘膜関連リンパ組織の非ホジキンリンパ腫では増加するが、その他のリンパ節及び皮膚 型の非ホジキンリンパ腫では増加しない（Drillenburg et al, 1997）。このため、これらのインテグ リンを介する組織特異的なホーミングがリンパ腫細胞播種の一端を担うと考えられている（Pals et al, 1994）。 インテグリンは転移過程にも関与している（Garofalo et al, 1995、Matsuura et al, 1996、Okahara et al, 1994）。メラノーマ細胞の転移活性は α4β1 インテグリンと VCAM-1 の相互作用によって亢進 するが（Garofalo et al, 1995、Okahara et al, 1994）、本腫瘍細胞を抗 α4β1 インテグリン抗体で前処 理すると転移が抑制されることが示されている。ヒトメラノーマ細胞及び肉腫において、非転移 変異株と比較して浸潤性変異株では、α4β1 インテグリンの発現の上昇が示されている（Albelda et al, 1990、Paavonen et al, 1994）。 ほとんどの研究結果は、α4 インテグリン発現と転移が関連することを裏付けるものであるが、 逆の関連性を示す報告もある。例えば、α4β1 インテグリンを高レベルに発現している腫瘍細胞を 注入したマウスでは、細胞間接着の促進により転移発生率の低下が認められている（Qian et al, 1994）。 総じて、これまで報告されている研究結果から、ヒトにおいて α4 インテグリンは、リンパ腫及 び骨髄腫細胞の接着、並びにメラノーマ細胞及び肉腫の転移に関与していることが示唆されてい る。したがって、ナタリズマブのような α4 インテグリン阻害剤は、ある種のがんの転移を抑制す ると考えられる。 4.5.1 免疫調節/免疫抑制剤のがん原性試験 免疫抑制剤は、免疫系による生体防御応答を阻害することから、がんのリスクを増加させる可 能性がある。このため、がん防御に重要な役割を果たしていると考えられる免疫系の構成要素に 対するナタリズマブの影響を評価することが重要となる。ナチュラルキラー（NK）細胞及び T リ ンパ球、並びにそれらの関連サイトカインが腫瘍に対する防御を担っていると考えられる。ナタ リズマブは NK 細胞の機能になんら影響を及ぼさないことが、in vitro 試験及び in vivo における 1 ヵ月間又は 6 ヵ月間投与試験において確認されている。In vitro におけるサイトカイン（IL-1β、IL-2、 IL-6、IL-10、TNFβ、IL-1α 及び TNFα）産生においてもナタリズマブの in vitro 処理による影響は 認められなかった。カニクイザルにナタリズマブを投与したところ、末梢血中（最大投与期間 6 ヵ月）及びリンパ組織中（最大投与期間 1 ヵ月）の T リンパ球（サブセットを含む）の比率は変 化しなかった。 40 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 4.5.2 その他のがん原性/発がん性モデル 記載箇所：参考[M4.2.3.4.3-1] P00002-02-05、参考[M4.2.2.2-1] PD03-09 ナタリズマブはげっ歯類の α4 インテグリンと交差反応性を示さない。このため、げっ歯類を用 いた標準的な 2 年間のがん原性試験は実施不可能であった。代替法として、機能的 α4 インテグリ ンを発現するヒト細胞由来の腫瘍細胞株を用いて、増殖又は転移に対するナタリズマブの影響を in vivo で評価した。投与に関連した免疫系の修飾によって生じる腫瘍の増殖に対するナタリズマ ブの影響については、ナタリズマブがマウスの α4 インテグリンに結合性を有しないことから、評 価ができなかった。 本試験では、公表論文に α4 インテグリンの発現が報告されている多系統のヒト腫瘍細胞株のう ち、重症複合型免疫不全（SCID）マウス及びヌードマウスの異種移植モデルでの利用が確立され ている腫瘍株及びがん人口において罹患率の多いがん種を選択的に評価した。α4 インテグリンの 発現性及び機能性について、細胞株をスクリーニングした。α4 インテグリンの発現性に関するス クリーニングでは、ビオチン化したナタリズマブを用いて、腫瘍の凍結切片の免疫組織化学（IHC） 的評価及びフローサイトメトリー（FACS）解析を行った。検出された α4 インテグリンの機能性 については、可溶性遺伝子組換えヒト VCAM-1 をコーティングしたプレートへの腫瘍細胞の接着 に対するナタリズマブの阻害活性で確認した。機能的 α4 インテグリンの発現が認められた腫瘍細 胞株については、ナタリズマブで in vitro 処理を行い、増殖性に対する陽性作用又は陰性作用につ いて評価した。α4 インテグリンの発現は 11 株で認められ、このうち 7 株で機能的 α4 インテグリ ンの発現が確認された（試験番号 P00002-02-05）。ナタリズマブを投与した免疫不全マウスに α4 インテグリン陽性のヒト腫瘍細胞株 2 株（MOLT-4 及び UACC-257）を移植して、腫瘍細胞の増 殖又は転移に対する増強効果について評価を行った。試験に MOLT-4 及び UACC-257 細胞株を選 択した根拠は、それぞれリンパ芽球性白血病及び悪性メラノーマの代表的な細胞株であるためで ある。 In vivo 試験を実施する前に、ヌードマウス及び SCID マウスを用いてナタリズマブの薬物動態 予備試験を実施した。マウスへの投与法については、ヒト腫瘍細胞上の α4 インテグリン受容体を 完全に飽和させると予測されるナタリズマブの 20 µg/mL を超える血清トラフ濃度を維持するた め、初回用量として 10 mg/kg のナタリズマブを投与した後、5 mg/kg のナタリズマブを週 2 回腹 腔内反復投与した（試験番号 PD03-09）。 4.5.3 ナタリズマブ処理後のヒト腫瘍細胞の増殖応答 本試験は、AS283（Burkitts リンパ腫）、HT29（結腸直腸腺がん）、MOLT-4（急性リンパ芽球 性白血病細胞）、UACC-62（メラノーマ細胞）及び UM-UC-3（膀胱移行上皮がん）などの機能的 α4 インテグリンを発現している細胞株に対するナタリズマブの増殖促進の有無を評価するために 実施した。細胞は、0.001 µg/mL から 100 µg/mL までのナタリズマブ濃度で 5 日間培養した後、3H 標識チミジン（3H-TdR）取り込み法により細胞増殖を評価した。本試験に用いた α4 インテグリン 発現細胞株については、ナタリズマブはいすれの細胞株に対しても増殖効果を示さなかった。 41 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 4.5.4 In vivo異種移植片がん原性試験 記載箇所：参考[M4.2.3.4.3-3] P00002-03-01、参考[M4.2.3.4.3-4] P00002-03-04 ヒト白血病細胞及びヒトメラノーマ細胞の異種移植腫瘍により、原発性腫瘍及び続発性腫瘍（切 除後）の増殖、又は転移に対するナタリズマブの影響を調べる目的で、2 試験を実施した。投与 方法については、いずれの試験でも 10 mg/kg の初回用量投与後、5 mg/kg を週 2 回投与した。本 投与方法は、ヒト腫瘍細胞上の α4 インテグリン受容体を飽和させる血清中濃度である 20 µg/mL を超える濃度を維持するために実施した薬物動態試験結果に基づき設定した。 ヒト急性リンパ芽球性白血病由来 MOLT-4 細胞株を、雌重症複合型免疫不全（SCID）マウスの 皮下に移植した（試験番号 P00002-03-01）。生理食塩液、ナタリズマブ又は IgG4（アイソタイプ 対照）のいずれかの投与は、本腫瘍細胞の異種移植前 7 日から開始して 7 週間継続、又は移植後 14 日から開始して 5 週間継続した。各対照群と比較した結果、ナタリズマブ投与群に腫瘍増殖の 増加は認められなかった。ナタリズマブ投与を腫瘍の移植前に開始した試験系では、各対照群と 比較して腫瘍の増殖速度の低下が認められ、2 例では試験終了時に腫瘍の消失が認められた。病 理組織学的検査では、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞の増殖促進及び転移を示す変化は認めら れなかった。移植 28 日目に原発性腫瘍を切除した後、ナタリズマブの投与により二次性腫瘍の増 殖が抑制された。病理組織学的検査より、ナタリズマブ投与に関連した転移の増加は認められな かった。 2 番目の試験（試験番号 P00002-03-04）では、雌ヌードマウスの皮下にヒトメラノーマ細胞 UACC-257 を移植した。生理食塩液、ナタリズマブ又は IgG4（アイソタイプ対照）のいずれかの 投与は、本腫瘍細胞の異種移植前 7 日から開始して 7 週間継続、又は移植後 14 日から開始して 4 週間継続した。移植 26 日目に生理食塩液投与群及びナタリズマブ投与群の選択された動物の原発 性腫瘍を切除した。各対照群と比較して、ナタリズマブ投与群における腫瘍増殖は、いずれの投 与開始の試験系においても同等であった。生存時のノギスによる計測及び病理組織学的検査では、 ナタリズマブ投与による原発性腫瘍切除後の腫瘍細胞の増殖促進及び転移は認められなかった。 腫瘍発現までの時間に対するナタリズマブ投与の影響は認められなかった。 要約すると、α4 インテグリンを発現するヒト白血病細胞及びヒトメラノーマ細胞の異種移植腫 瘍細胞では、その増殖及び転移に対して、ナタリズマブ投与による有害な影響は認められなかっ た。ヒト白血病細胞では、異種移植又は腫瘍の切除前にナタリズマブ投与を開始した場合、移植 された白血病細胞の増殖は抑制された。 4.6 その他の毒性試験 記載箇所： [M4.2.3.2-4] 723-013-98、[M4.2.3.2-5] 309-011-00、[M4.2.3.2-6] P00002-01-01、参考 [M4.2.3.7.7-7] 309-029-06、参考[M4.2.3.7.7-9] PD07-19、[M4.2.3.7.7-6] PD05-84、参考[M4.2.3.7.7-8] 309-015-06 カニクイザルを用いて、0、3 又は 30 mg/kg のナタリズマブの 30 分かけた静脈内投与を週 1 回 42 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 6 週間行い、T 細胞依存性抗原に対する液性免疫応答に対する影響を検討し、7 週間以上の無投与 期によるナタリズマブ投与の影響からの回復性を評価した。本試験の条件においてナタリズマブ の忍容性は良好で、予想される薬理作用に関連した主にリンパ球数の増加が認められた。抗キー ホールリンペットヘモシアニン（KLH）及び抗破傷風毒素（TT）IgM 抗体（一次応答）及び IgG 抗体（二次応答）の投与群における平均抗体価は、抗原及び抗体特異的誘導パターンを示した。 どちらの抗原に対する免疫応答にも、早期の時点で、ナタリズマブ投与に関連したばらつきが大 きいがわずかな抑制効果が認められると考えられたが、用量群内で大きな個体差があり、追加免 疫後には同様の効果が認められなかったことから、この変化の生物学的意義は不明であった。要 約すると、早期の時点で、一次免疫応答のわずかな減少が認められたが、ナタリズマブの投与期 間中又は投与中止後に投与された T 細胞依存性抗原に対する一次又は二次液性免疫応答に対して、 ナタリズマブは意義のある抑制を起こさないと考えられた。 前述したように、ヒト以外の動物種において JC ウイルス（JCV）感染及び進行性多巣性白質脳 症（PML）を誘発できる適切な動物モデルは存在しない。しかしシミアンウイルス（SV40）は免 疫不全ザルにおいて病理学的、疫学的にヒト PML とよく似た脱髄疾患を引き起こすことができる。 カニクイザル及びアカゲザルを用いた毒性試験（試験番号 723-013-98、試験番号 309-011-00、試 験番号 P00002-01-01）から得られた血清及び組織のレトロスペクティブな分析（試験番号 309-029-06）が行われ、マカク属に固有で一般的に良性なポリオーマウイルスである SV40 に変化 がナタリズマブ又はナタリズマブ + IFNβ-1a 投与後に起こるかどうか調べられた。この分析は、 一般的に、ポリオーマウイルスである JCV の再燃によって引き起こされる PML を発現した症例 を理解する目的で実施された。JCV と 69%のゲノム相同性を有する SV40 は、ヒトにおける JCV と同様にアカゲザルに自然感染して潜伏する。毒性試験から得られた血清中に含まれる抗 SV40 抗体レベルには、投与と関連した変化は認められなかった（試験番号 309-029-06）。さらにどの 動物の臓器（脳、腎臓、肺及びリンパ組織）にも、SV40 T 抗原又はウイルスキャプシドタンパク 質 VP1 の発現を示す証拠（試験番号 PD07-19）やリンパ組織におけるリンパ増殖の証拠（試験番 号 PD05-84）は認められなかった。 げっ歯類を用いて、サイトメガロウイルス（CMV）のような他の潜伏ウイルスの再活性化に対 する α4 インテグリン阻害の影響を検討する試験も行われた。しかしながら、ナタリズマブはマウ ス抗体 21/6 のヒト化抗体であり、いくつかの動物種（ヒト及びモルモットを含む）の α4 インテ グリンは認識するが、マウスやラットの α4 インテグリンは認識しないため、げっ歯類モデルをナ タリズマブの評価に使用することはできない。長期間のラット抗マウス α4 インテグリン抗体 PS/2 の投与は、正常マウスに激しい宿主応答を引き起こし、抗体 PS/2 の急速な消失及び高頻度の致死 性アナフィラキシー反応を引き起こすため不可能である。マウスにおけるこの免疫原性の問題解 決するため、次の 2 つのアプローチが検討された。 1) 抗体 PS/2 の高用量投与により、ラット抗原に対する免疫応答の問題を解決できるかどうか 検討する 2) ラット抗マウス α4 インテグリン抗体のキメラ化を検討する 43 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 高用量の抗体 PS/2 を使用する第 1 のアプローチが成功したため、キメラ抗体の特性を解明する それ以上の試験は実施されなかった。したがって抗体 PS/2 はナタリズマブと同様の特性を示し、 利用できるデータにおいて、マウス試験におけるナタリズマブの代替として適切だと考えられる。 そこでマウス CMV 再活性化宿主抵抗性モデルに抗体 PS/2 を単独投与又はマウス IFN-β と併用投 与することによって（試験番号 309-015-06）、ウイルス再活性化に対する α4 インテグリン阻害の 影響について検討した。試験番号 309-015-06 では CMV 再活性化の確率を高めるために B 細胞機 能不全マウスを使用しており、これによっても抗体 PS/2 に対する宿主抗体応答を中和する可能性 は低下された。これらの試験の結果より、α4 インテグリン阻害による CMV 再活性化がないこと が明らかになった。 4.7 臨床試験及び毒性試験における曝露量の比較 記載箇所：[M4.2.3.2-5] 309-011-00、[M4.2.3.2-4] 723-013-98、[M4.2.3.5.3-1] 309-033-01、[M4.2.2.2-3] 309-010-01、[M5.3.5.1-4] 101MS203、[M2.6.4.3.11] 309-011-00、[M2.6.4.3.10] 723-013-98、[M4.2.3.2-6] P00002-01-01、[M2.6.4.3.3] 309-010-01、[M2.6.4.3.12] 309-012-00、[M4.2.3.5.2-4] 309-012-00 非臨床毒性試験の用量（mg/kg）、Cmax 及び AUC（データが入手可能である場合）を臨床薬物 動態（PK）パラメーターと比較検討を行い、臨床上の安全域を計算した。各試験の PK パラメー ターの平均値及び投与量を表 4 に示す。表に示された動物試験における PK パラメーターは、毒 性試験（試験番号 309-011-00、試験番号 723-013-98 及び試験番号 309-033-01）の一部として得ら れたデータ、又はモルモットモデルの生殖発生毒性試験を担保するためにモルモットを用いて単 独で行った薬物動態試験（試験番号 309-010-01）から得られたデータである。単回投与臨床試験 の PK パラメーターについては、日本人を対象とした臨床試験（試験番号 101MS203）初回投与後 データに基づいている。最終投与後 AUC に基づく安全域の算出には、日本人を対象とした臨床試 験（試験番号 101MS203）から得られた平均 AUC を用いた。最終投与後 AUC に基づく安全域の 算出には、日本人を対象とした臨床試験（試験番号 101MS203）から得られた平均 AUC を用いた。 累積 AUC に基づいて安全域を算出する際には、月ごとの臨床用量 300 mg 初回投与後 AUC0-inf に 各非臨床試験の投与期間に対応する月数を乗じて臨床累積曝露量を算出した。非臨床試験の累積 曝露量は、得られた濃度時間曲線を基に台形公式を用いて算出した。安全域の結果を表 5 に示す。 44 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 表 4 各反復投与非臨床毒性試験における薬物動態パラメーター及び臨床試験との比較（平均値） 試験番号 309-011-001 723-013-982 動物種 投与期間 幼若カニクイザル 6 ヵ月 成熟カニクイザル 6 ヵ月 P00002-01-013 アカゲザル 1 ヵ月 309-010-01 雄授胎能に関するサテライ ト試験 4 雄モルモット 65 日間 309-010-01 胚・胎児発生に関するサテ ライト試験 15 妊娠初期雌モルモット 28 日間 309-010-01 胚・胎児発生及び雌受胎能 に関するサテライト試験 26 妊娠後期雌モルモット 64 日間 309-012-00 7 カニクイザル（胚・胎 児発生への影響）50 日 間 最終投与時 AUCa （μg*hr/mL） 累積 AUC （μg*hr/mL） 用量 （mg/kg） 初回投与時 Cmax （μg/mL） 初回投与時 AUCa （μg*hr/mL） 10 172±67 11340±3353 30 492±133 55264±17621 60 1168±311 143057±76479 3 48±6 1391±574 NA 6529±616 10 184±40 7444±3462 NA 31978±10729 30 690±144 36281±21406 27346 1049836±1181815 60 30 60 3 1787±355 567±60.7 1168±182.3 72±45.9 141221±47262 93901 4461260±3884654 10 172660±143870 NA 1814932±1418766 6527648±1697479 NA NA NA 1694 1419 34049 213±141.4 4458 23272 567178 30 700±391.9 17457 61047 1556794 3 53±27.1 1424 411 23044 10 292±49.8 7290 5947 131574 30 532±253.7 16804 40436 577012 3 59±34.3 1505 2896 431442 10 258±90.5 6169 14766 516124 30 629±517.1 15104 61003 3 69.5±16.8 10 750.5±373.8 30 3338.1±3764.9 45 1641053 23134±6422 NA NA 1660532±1100144 8690898±5251820 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 表 4 各反復投与非臨床毒性試験における薬物動態パラメーター及び臨床試験との比較（平均値）（続き） 動物種 投与期間 用量 （mg/kg） 初回投与時 Cmax （μg/mL） カニクイザル（出生前 及び出生後の発生並び に母動物の機能）50～ 164 日間 30 (GD20～70) 1361 30 (GD20～分 娩) 1489 固定用量で 300 mg 121 試験番号 309-033-01 8 101MS2039 ヒト 初回投与時 AUCa （μg*hr/mL） 最終投与時 AUCa （μg*hr/mL） 累積 AUC （μg*hr/mL） ND ND ND 45203d 48323b,d 45203c 271218c Data source：1[M2.6.4.3.11] 309-011-00-表31, 表32、1[M4.2.3.2-5] 309-11-00-Table 7, Table 8, and Attachment III-Table 2、2[M2.6.4.3.10] 723-013-98-表27, 表28 、 2 [M4.2.3.2-4] 723-013-98-Attachment III-Table 3A, Table 3B, Table 5、3[M4.2.3.2-6] P00002-01-01-Appendice G-Table 2、4,5,6[M2.6.4.3.3] 309-010-01-表5, 表6、 4 [M4.2.2.2-3] 309-010-01-Attachment III-Table 5、5[M4.2.2.2-3] 309-010-01- Attachment III-Table 2、6[M4.2.2.2-3] 309-010-01- Attachment III-Table 4、7[M2.6.4.3.12] 309-012-00-表35、7[M4.2.3.5.2-4] 309-012-00-Table 10, Attachment III-Table 2 and Table 4, Attachment II-Table 2、8[M4.2.3.5.3-1] 309-033-01-Attachment III-Table 6.1-3, Table 6.1-4、9[] 101MS203 Table 14 a AUC 値は、試験番号 309-011-00 及び試験番号 723-013-98 では、AUC0-inf、試験番号 309-010-01 では AUC0-48h を用いた。b ヒト AUC は反復投与によって変 化しないと推測されたため、単回投与時ヒト AUC0-inf 値を用いた。 c 値は 1 ヵ月間の臨床用量 300 mg に試験期間 6 ヵ月を乗じ、6 ヵ月累積曝露量を算出し、臨床試験の平均クリアランス値で除した。サル胚・胎児発生試験 では 2.7 を乗じた。 c 初回投与後の AUC0-inf d AUC0-inf NA：適用せず、データ不足、ND：測定せず . 46 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 表 5 非臨床毒性試験の安全域 試験番号 動物種 投与期間 無毒性量 （mg/kg） 用量 （mg/kg） 初回投与時 Cmax 安全係数 初回投与時 AUC 安全係数 10 30 60 3 10 30 60 30 60 3 10 30 3 10 30 3 10 1.4 4.1 9.6 0.4 1.5 5.7 14.8 4.7 9.7 0.6 1.8 5.8 0.4 2.4 4.4 0.5 2.1 0.4 1.7 4.4 0.04 0.2 1.1 4.4 30 5.2 309-011-00 幼若カニクイザル 6 ヵ月 試験責任者により判断 されなかった 723-013-98 成熟カニクイザル 6 ヵ月 試験責任者により判断 されなかった P00002-01-01 アカゲザル 1 ヵ月 試験責任者により判断 されなかった 309-010-01 雄授胎能サテラ イト試験 309-010-01 胚・胎児発生 1 サ テライト試験 309-010-01 胚・胎児発生 2 及 び雌受胎能サテ ライト試験 雄モルモット 65 日間 NA 妊娠初期雌モルモ ット 28 日間 NA 妊娠後期雌モルモ ット 64 日間 NA 最終投与時 AUC 安全係 数 累積 AUC 安全係数 NA NA 0.6 1.9 0.6 6.7 24.1 0.0 0.12 3.9 16.4 NA NA NA 0.05 0.14 0.5 0.04 0.2 0.5 0.05 0.2 0.03 0.5 1.3 0.0 0.12 0.8 0.06 0.3 0.4 6.3 17.2 0.5 2.9 12.8 4.8 5.7 0.5 1.3 18.2 NA 3 0.6 0.3 カニクイザル（胚・ 母動物：30、 胎児発生への影響） 10 6.2 NA NA 18.4 （胎児：3） 50 日間 30 27.6 96.11 カニクイザル（出生 30 (GD20～70) 11.2 前及び出生後の発 母動物：30、 309-033-01 ND ND ND 生並びに母動物の 新生児：30 30 (GD20～分娩) 12.3 機能）50～164 日間 安全域は臨床試験（試験番号 101MS203）から得られた以下の平均値に基づいて算出された。 初回投与後 Cmax：121 μg/mL。 初回投与後 AUC0-last：32379 μg*h/mL。動物データでは AUC0-last が報告されているため、AUC0-last が用いられた。 最終投与後 AUC0-last：48165 μg*h/mL。 累積 AUC の安全域の推定は臨床試験（試験番号 101MS203）から得られた初回投与後 AUC0-inf（45203μg*h/mL）に非臨床試験の投与期間を乗じた値に基 づいて算出された。試験番号 309-010-01 の妊娠初期の雌では、1 ヵ月間の AUC が用いられた。試験番号 309-010-01 の雄及び妊娠後期の雌、並びに試験番 号 309-012-00 の胎児毒性及び催奇形性では、2 ヵ月間の AUC（2×45203μg*h/mL）が用いられた。試験番号 309-11-00 及び 723-013-98 では、6 ヵ月間の AUC （6×45203μg*h/mL）が用いられた。 309-012-00 47 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg NA：適用せず、データ不足、ND：測定せず 48 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 5. 総括及び結論 ナタリズマブは、α4 インテグリンに結合するヒト化 IgG4 抗体であるため、α4 インテグリンを 含む α4β1 及び α4β7 インテグリンの活性を阻害する。ナタリズマブは、ヒト化モノクローナル抗 体としては非常に広範な動物種に交差反応性を示し、ヒト、カニクイザル及びアカゲザル、イヌ、 ブタ、モルモット及びフェレットのリンパ球に結合する。ナタリズマブの非臨床試験より、本抗 体の薬理活性が、α4 インテグリンと各リガンド、すなわち VCAM-1 及びフィブロネクチン（α4β1 インテグリンのリガンド）及び MadCAM-1（α4β7 インテグリンのリガンド）との相互作用を阻害 することと一致していることが確認された。これら α4 インテグリンは、リンパ球の血管内皮細胞 への接着及びその後の実質組織への遊出を媒介する。各種 α4β1 インテグリン陽性細胞の血管内皮 細胞への接着はナタリズマブにより阻害され、多発性硬化症（MS）の動物モデルを用いた in vivo 試験では、抗 α4 インテグリン抗体の投与によりリンパ球の脳内への移動が抑制され、臨床症状の 有意な改善が認められた。細胞の粘膜通過におけるナタリズマブの役割は、クローン病（CD）モ デルにおけるワタボウシタマリンを用いた試験でのナタリズマブと類似した特異性を有する抗体 の有効性によって裏付けられている（Hesterberg et al, 1996、Podolsky et al, 1993）。その他の α4 イ ンテグリンのリガンドには細胞外基質に発現するオステオポンチン及びフィブロネクチンがある （Bayless et al., 1998; Guan et al., 1990）。したがって理論上、ナタリズマブは、細胞外基質内のリ ガンドへの α4 インテグリン発現白血球の結合を阻害することにより、病巣で進行中の炎症反応を 抑制する可能性もある。 ナタリズマブの薬理試験、薬物動態試験及び毒性試験の結果は、そのリガンドである α4 インテ グリンに対する結合性と一致している。薬物動態は、Fc 領域と neonatal Fc 受容体（FcRn）及び Fcγ 受容体との関連性、並びに非特異的なタンパク質クリアランスによって影響される。ナタリ ズマブの非臨床毒性試験で認められた安全性シグナルは、霊長類及びモルモットを用いた試験で 認められた免疫介在性の過敏性反応を除いてすべて、白血球の遊出、造血及び発生過程における α4 インテグリンの既知の生物学的機能と関連するものである。 ほとんどの in vivo 試験では、ナタリズマブの薬理活性に一致して、リンパ球の遊出の変化は白 血球数及び脾臓重量の増加として認められた。投与群当たりの変化の発現率については、両パラ メーターにある程度の用量依存性が認められたものの、観察された変化の程度については、概し て用量による差異は認められなかった。これらの変化は、白血球の遊出に関与するインテグリン に対する別の抗体である、RaptivaTM（Papp et al, 2001、Leach et al, 2002、Mounho et al, 2003）にお いて認められた変化と一致する。RaptivaTM は、αLβ2（LFA-1）を阻害し、乾癬を適応症として開 発され、海外では、医薬品として承認された。ナタリズマブの薬理活性に一致した白血球数の増 加は、臨床用量で起こると推定されており、いずれも毒性学的に有害な影響を及ぼす変化ではな いと考えられる。 ヒト化タンパク質であるナタリズマブをヒト以外の動物種へ投与すると、予想どおり、ナタリ ズマブに対する免疫応答が生じる。一般的に剖検時の血中にはナタリズマブが含まれており、ナ 49 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg タリズマブが存在する測定系における抗体検出には限界があるため、試験プログラム全体の抗体 出現率を得ることは困難である。しかしながら、ウォッシュアウト期間を設けた試験系では、抗 体出現率は最大 100%となっている。抗体出現が関連する影響は、モルモット及び霊長類に認めら れた明らかな免疫介在性の過敏性反応、及び投与動物におけるナタリズマブ曝露量の減少の 2 つ の異なる生体応答として確認された。 モルモットはアナフィラキシー反応に感受性が高いことがよく知られているが、ナタリズマブ を投与された雌と同居したことのある雄に直接ナタリズマブを投与した 1 試験においてもアナフ ィラキシー反応が発現し、多くの動物が死亡した。動物種により、及び曝露間で時間をおくこと により、免疫介在性の致死が明らかに促進されたが、臨床的にナタリズマブによる過敏性反応の 可能性が高いことではない。アナフィラキシーは霊長類を用いた試験では全く認められなかった。 ナタリズマブの間欠投与の影響は、臨床試験（試験番号 CD251）において評価が行われている。 本剤の添付文書には、過敏性反応の可能性について、タンパク製剤に共通する一般的な記載を加 えるべきである。成熟動物を用いた 6 ヵ月間反復投与毒性試験では、ナタリズマブに対する免疫 反応によって、ナタリズマブを投与したカニクイザル 32 例中 3 例で免疫介在性反応が認められた。 この反応による死亡例は認められず、2 例では一過性であった。抗体陽性のカニクイザルでは糸 球体腎炎の徴候を有する例も認められたが、これらは免疫複合体の形成による二次的なものであ ると考えられた。ただし、本所見は抗体出現率と比較して頻度はかなり低かったことから、本動 物試験において糸球体腎炎は抗体出現による影響として起こりうる頻度が低いものであることが 示唆された。免疫介在性反応は臨床的にはまれである。多発性硬化症（MS）患者におけるナタリ ズマブ投与による過敏症反応である infusion reaction の総発現率は 1%未満である。有害事象とし て遅延型過敏症の報告も稀にあるが、現在までのところ糸球体腎炎の報告は全くない。 ナタリズマブの免疫原性が非臨床試験に与える最大の影響は、曝露量の減少に関するものであ る。重要な試験である成熟カニクイザルを用いた 6 ヵ月間反復投与毒性試験では、最高用量群の 一部の動物において、安全係数がヒトの曝露量のわずか 3 倍（累積 AUC 換算）にまで減少した。 しかし、多くの動物では、抗ナタリズマブ抗体の存在下であっても、累積 AUC 換算で少なくとも 30 倍の曝露量に到達しており、十分な曝露量と安全域が得られた。 ナタリズマブの生殖発生毒性試験において器官形成期の曝露によって認められた変化は、流産 率の増加、雌の受胎能の低下、胎児における貧血及び血小板数の減少、並びに胎児におけるリン パ系器官の変化であった。生殖発生毒性試験で認められた変化の多くは、受精、着床、胎児の造 血及び白血球遊出における α4 インテグリンの既知の作用と一致したものであった。ナタリズマブ 投与に関連した流産に対する影響を特定することは困難である。カニクイザルにおける発生試験 の一回目試験においてナタリズマブ投与により流産率の増加が認められたが、同一試験の二回目 試験並びに霊長類及びモルモットを用いて別途実施した胚・胎児発生試験では流産率の増加は認 められなかった。また、流産率は、当該発生試験を実施した試験施設の背景データの範囲内に収 まっていた。流産誘発性がみられなかった霊長類の胚・胎児発生試験は、別の施設で実施された ことは認識しておく必要がある。ナタリズマブが流産のリスクを増大させる可能性については、 50 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 妊娠動物に対して本薬を曝露した 2 種の動物種の 4 試験のデータより判断するのが最善であると 考えられる。4 試験のうちの 1 試験の一部でのみ流産率の増加が認められたことから、ナタリズ マブは明らかな流産誘発性は有しないとの結論が妥当であると思われる。α4 インテグリン欠損マ ウスにおいて心外膜形成における α4 インテグリンの役割とそれに関連した心奇形について報告 があるが、ナタリズマブが投与された試験では、投与に関連した催奇形性は、心奇形を含め全く 認められなかった。霊長類における胚・胎児発生試験では、胎児の貧血、血小板数の減少及びリ ンパ系器官に対する影響が認められた。カニクイザルにおいて実施した出生後発生毒性試験では、 出生後 4 ヵ月までの新生児において血小板数の減少が認められたが、血清中のナタリズマブ消失 後に回復した。血小板数の減少は、新生児よりも胎児で顕著であったが、幼若動物及び成熟動物 の血小板には全く影響が認められなかった。以上のことから、妊娠期のナタリズマブ投与による α4 インテグリンの阻害によって、幼若動物及び成熟動物では認められない発生過程の骨髄中の血 小板前駆細胞に対する可逆的な影響が生じる可能性が示唆された。ナタリズマブを投与した母動 物から生まれた新生児については、貧血所見を含め、顕著な有害な影響は認められなかった。胎 児のリンパ系器官に対するナタリズマブの影響の臨床的意義については、抗原投与を行った発生 試験において評価された。ナタリズマブの投与を受けた母動物から生まれた新生児の免疫後の一 次及び二次免疫応答に影響は認められなかった。ナタリズマブが発生過程の免疫系及び造血に影 響を及ぼす可能性があるため、妊婦、産婦及び授乳婦等へのナタリズマブ投与には注意が必要で ある。ナタリズマブ投与は、受精阻害によって受胎能の低下を招く可能性がある。モルモットに 対して受精後着床前に投与した試験では、妊娠率の低下は認められなかった。以上のことから、 妊娠を希望する女性に対しては、ナタリズマブによって受胎能が低下する可能性があることを知 らせておく必要がある。臨床試験における妊娠に関する情報は[M2.7.4.5.4]に記載した。 使用できる動物種に制約があるため、ナタリズマブのがん原性試験は実施していないが、in vitro 及び in vivo 試験のいずれにおいても α4 インテグリンを発現するヒト腫瘍細胞株の増殖促進作用 は認められなかった。非ヒト霊長類における 2 つの 6 ヵ月間反復投与毒性試験において、腫瘍の 発生及び過形成の増加は認められなかった。これらの試験結果並びにがんにおける α4 インテグリ ンの役割に関する文献をレビューした結果、ナタリズマブがヒトにおいて発がんリスクを増大さ せることは考えられなかった。 進行性多巣性白質脳症（PML）、JC ウイルス（JCV）及び可能性のある PML の動物モデルの ほか、ウイルスの潜伏、感染、免疫機能及び宿主抵抗性の動物モデルに関する文献データを広範 に調査した。これらのデータを利用して、ナタリズマブ投与に対する免疫調節の役割及び PML の 発現を解析するための試験をデザインした。これらの試験から得られたデータによって、ナタリ ズマブ単独投与又は IFN-β との併用投与による α4 インテグリン阻害が免疫機能に及ぼす影響がよ り明らかにされたが、ヒトにおける PML 発現機序や可能性をさらに明らかにすることにつながる データは得られなかった。したがってこれらのデータはナタリズマブのリスク評価プロファイル に影響することはないと判断された。 結論として、薬理試験及び毒性試験におけるカニクイザル、アカゲザル、モルモット及びイヌ 51 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg に対するナタリズマブの投与は、in vitro での結合性並びに臨床試験における投与量と薬力学的作 用（白血球数の増加）との間に関連があることが認められたことから支持された。免疫介在性の 過敏性反応を除いて、ナタリズマブ投与によって認められたすべての毒性学的に意義のある変化 （雌の受胎能の低下、胎児における貧血及び血小板数の減少、並びに器官形成期の曝露による胎 児におけるリンパ系器官の変化）は、ナタリズマブの薬理活性に関連するものである。薬理作用 として認められた白血球数の増加は、臨床用量にほぼ相当する用量で認められた。反復投与毒性 試験では重要な毒性は認められなかった。したがって、カニクイザルに対する最大 60 mg/kg 用量 での 6 ヵ月間静脈内投与試験において、ナタリズマブはおおむね良好な忍容性を示したと考えら れた。累積 AUC 換算による曝露比は少なくとも 16 倍、最終投与時 AUC 換算では 1.9 倍であった。 生殖発生毒性試験結果を除き、ナタリズマブの非臨床安全性プロファイルは非常に良好である。 以上、非臨床データは、本節に記載した状況下において適切な予防措置が講じられる場合にあっ ては、MS 患者におけるナタリズマブの使用を裏付けるものである。 52 2.4 非臨床試験の概括評価 タイサブリ点滴静注 300 mg 6. 参考文献 Albelda SM, Mette SA, Elder DE, et al. 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