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乳酸発酵と乳酸ポリマー発酵 のメタボリックケミストリー
【解説】 乳酸発酵と乳酸ポリマー発酵 のメタボリックケミストリー 松本謙一郎，ジョン・マサニ・ンドゥコ，田口精一 生物史上初めて乳酸が微生物細胞内でポリマーの形で合成さ れ た． 自 然 界 に な か っ た 乳 酸 重 合 酵 素 の 開 発 が も た ら し た ブ レ ー ク ス ル ー で あ る． こ れ を 契 機 に， 伝 統 的 な 乳 酸 発 酵 か ら 乳 酸 ポ リ マー発酵 という新しい概念が誕生す る こ と に な る． 本 稿 で は，「炭 素 モ ル 濃 度」 と い う 尺 度 を 導 入 し た「メタボリックケミストリー」の切り口から，両発酵の化 とから，使い捨てのコップや，卵パックなどとしてすで に実用化されている．ポリ乳酸の工業的生産のために は，原料となる乳酸の効率的合成が鍵となるため，代謝 工学・培養工学的手法により乳酸の生産性を高める培養 法が活発に研究されている（1）．一方，われわれの研究グ 学量論的考察を加えた．今後，メタボロミクス分野で議論す ループでは，微生物が合成した乳酸を，細胞内で直接重 るうえで一つの化学的指標を与えるであろう． 合してポリエステルを合成する新たなシステムを創成し た（2）（図 1） ．この新たなシステムでは，乳酸が CoA 体 発酵と言えば微生物，微生物と言えば発酵である．そ （ラクチル CoA）へと活性化された後，重合酵素の働き のなかの一つ乳酸発酵は，糖が分解され乳酸が合成され により乳酸ポリマーが合成される（図 2） ．本プロセス る物質変換系であり，ヨーグルトや漬物などの製造な は，微生物による乳酸発酵と化学的手法によるポリマー ど，われわれの食生活とも密着に関連している．この古 合成を一つの細胞内に集積した一体型システムだと言え くから知られる応用微生物技術の一つである乳酸発酵 る．本稿では，この新しく構築された「乳酸ポリマー発 は，近年，ポリ乳酸がバイオマス由来プラスチックとし 酵」と言うべき発酵生産系について，既存の乳酸発酵や て市場に出回るようになり，再び注目を集めている．ポ 従来の微生物ポリエステル合成系と対比して解説し，そ リ乳酸は，乳酸を化学重合させることにより得られる熱 の特性について，特に物質変換の化学量論に基づいた 可塑性ポリエステルであり，透明で硬質な性質をもつこ Metabolic Chemistry of Microbial Production of Lactic Acid and Lactate-based Polyesters Ken ichiro MATSUMOTO, John Masani NDUKO, Seiichi TAGUCHI, 北海道大学大学院工学研究院，科学技術振興機構 CREST 448 「メタボリックケミストリー」の視点から考えたい． 乳酸発酵とポリ乳酸の化学合成 乳酸は化学的には C3H6O3の組成式で表される．グル 化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013 OH O HO HO OH OH sugars glycolysis 乳酸発酵 O OH L-LDH O pyruvate 乳酸ポリマー発酵 D-LDH O O HO 図 1 ■ 乳酸ポリマーを蓄積した組換え大腸菌 細胞内に存在する顆粒が蓄積されたポリマーである． OH H2O 半分であることから，ほかの化合物の取り込みや，副産 物の生成を伴わずに，1 分子のグルコースから 2 分子の 乳酸が合成できる．原子の収支バランスが取れていると いうことは，合成の途中で炭素のロスがないことを意味 常に効率的なプロセスとなっている． C6H12O6（グルコース） → 2C3H6O3（乳酸） 乳酸を減圧して加熱すると，脱水縮合が起こり乳酸の 重合物，ポリ乳酸が得られる．しかししだいに重合と脱 重合の平衡に達し分子量が上昇しなくなるため，この方 O O S-CoA OH D-lactyl-CoA O L-lactide Sn(Oct)2 heat し，さらに，酸素の供給も必要ないため，嫌気的な条件 で合成可能である．これらの性質により，乳酸発酵は非 CoA 転移酵素 heat O O OH D-乳酸 L-乳酸 コースが解糖系を経て乳酸が合成されるまでの代謝経路 は複雑であるが，乳酸の組成式がグルコースのちょうど HO 乳酸重合酵素 CoA-SH O O O O x poly(lactic acid) (PLLA) Chemoprocess X y x Lactate-based polyesters Bioprocess 図 2 ■ 化学プロセスとバイオプロセスによる乳酸ポリマー合成 化学合成では主に L-乳酸が原料として用いられる．乳酸ポリマー 発酵では，重合酵素の立体特異性により，D-乳酸の CoA 体のみが 重合されキラルポリマーを生じる． 法では低い分子量のポリ乳酸しか得られない．そこで， 低分子量のポリ乳酸を一度環状ラクチドへと分解し，改 めて重金属触媒を用いて開環重合することにより高分子 微生物産生乳酸ポリマーの誕生 量のポリ乳酸が合成できる（3）（図 2） ．この合成の際，ピ 乳酸はもともと微生物の細胞内で合成されているの ルビン酸などのほかの有機酸が混入していると重合停止 で，それをそのまま重合できれば 1 ステップでの乳酸ポ の原因となるため，モノマーとなる乳酸は高純度に精製 リマーの合成，すなわち乳酸ポリマー発酵が可能になる されている必要がある．また，乳酸には L と D の光学異 と考えられる．しかし筆者らの知る限り，これまでに乳 性体が存在するが，光学純度が高いモノマーを用いない 酸ポリマーを生合成する生物の報告例はない．これは， とポリマーの物理的強度が出ない．このように，ポリ乳 乳酸がいわば ATP 合成のための老廃物として生成して 酸は乳酸を重合しただけの単純な構造のように見える いることを考えれば，自然なことに思われる．そこで， が，かなり手間のかかるプロセスで合成されている． ポリエステル合成系の人工的な改変により乳酸ポリマー の合成系を構築しようと考えた．ここで注目されたの が， 微 生 物 が 合 成 す る ポ リ ヒ ド ロ キ シ ア ル カ ン 酸 （PHA）と呼ばれるポリエステルである．このポリマー 化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013 449 キシロース (C5) グルコース (C6) NADP+ NADPH NADP+ NADPH 6-P-gluconate Ribulose-5-P (C6) (C5) CO 2 (C1) PP 経路 Glucose-6-P (C6) EMP 経路 Fruct o se- 6- P (C6) Fruct o se- 6- P (C6) Glyceraldehyde-3-P (C3) NADPH NADH NAD + NADP+ Pyruvate (C3) Phosphoenolpyruvate (C3) TCA回路 CO Acetyl-CoA (C2) PhaA LDH Acetoacetyl-CoA (C4) NADPH PhaB NADP+ 3HB-CoA (C4) PCT 酢酸 LA-CoA (C3) LPE P(LA-co-3HB) O x O Acetyl-P 酢酸 O O PhaC PCT Acetyl-CoA 3-hydroxybutyric acid O O NADH NAD + (C1)2 NADH NAD + NADH 乳酸(LA) (C3) (C4) Fructose-6-P (C6) Glyceraldehyde-3-P (C3) NAD + 乳酸 Xylulose-5-P (C5) y 3-hydroxybutyric acid x P(3HB) 酢酸 図 3 ■ 組換え大腸菌によるグルコー スおよびキシロースを炭素源とした 乳酸ポリマーの生合成経路 モノマー供給酵素 PhaA, PhaB ととも に通常の PHA 合成酵素（PhaC）を用 いると P（3HB）が合成され，乳酸重 合活性を獲得した PHA 合成酵素（乳 酸重合酵素：LPE）を用いると，乳 酸ポリマーも合成される．点線で示 したのは CoA 転移酵素（PCT）が触 媒 す る 推 定 上 の CoA 転 移 反 応 で あ る．LDH：乳酸脱水素酵素，PhaA： β ケトチオラーゼ，PhaB：アセトア セチル CoA リダクターゼ，PP 経路： ペントースリン酸経路，LA-CoA : ラ クチル CoA は，たとえば最も典型的なポリヒドロキシブタン酸 ている重合酵素の進化工学で作成したコレクションの一 （P（3HB） ）を例にすると，PhaA, PhaB と呼ばれる 2 つ つであった（7）．数多くの変異体を個別に調べ始めた最初 の酵素の働きにより，3HB の CoA 体である 3HB-CoA が の 5 個以内に ST/QK 変異体の乳酸重合活性が見つかっ モノマーとして合成され，次いで重合酵素により重合さ たのにはたいへん驚いた．この乳酸重合酵素の発見によ れて P （3HB）が合成される（図 3） ．この経路に基づい り，微生物細胞内での乳酸ポリマーの発酵生産が可能と て考えると，3HB-CoA と同様に，乳酸の CoA 体である なったのである（図 2） ．乳酸重合酵素の発見の経緯に ラクチル CoA が重合できれば，細胞内でポリ乳酸を合 ついては他稿で詳しく紹介しているので（8），ここでは乳 成することが可能になると期待される．このような考え 酸ポリマー合成経路の特徴を解説する． （4～6） は，実際複数の研究室で挑戦されていた ．しかし， 上述したように，天然ではポリ乳酸合成微生物はいまだ 見つかっておらず，ラクチル CoA を重合可能な重合酵 乳酸ポリマー生合成の特徴 素はなかなか見つからなかった．ところが，筆者らは 図 3 に 最 も 典 型 的 な 乳 酸（LA） ポ リ マ ー で あ る in vitro 重合系を用いて，Pseudomonas sp. 61-3 由来の P（LA-co-3HB）の生合成経路を示す．これは，同一ポリ 重合酵素の変異体がラクチル CoA を基質として認識可 マー鎖内に乳酸ユニットと 3HB ユニットが共重合され 能 で あ る こ と を 初 め て 見 い だ し た（2）． こ の 酵 素 は， たコポリマーである．乳酸を重合するためには，乳酸を S325T/Q481K の二重変異体であったことから，ST/QK ラクチル CoA へと活性化する必要がある．ラクチル 変異体と呼ばれており，乳酸重合酵素の第一号となっ CoA が Megasphaera elsdenii 由 来 の CoA 転 移 酵 素 た．この変異体は，筆者らが約 10 年間にわたり継続し （propionyl-CoA transferase ; PCT）により生成すること 450 化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013 は古くから知られていた（9）．CoA 転移酵素に，何らか の CoA 体と乳酸を加えると，CoA が転移されラクチル CoA が合成される．CoA 転移酵素を発現した大腸菌の 細胞内にラクチル CoA が生成したことは，細胞抽出液 の 分 析 に よ り 確 認 で き る（2）． し か し， こ の 際 に 何 が CoA 供与体になっているのかを知ることはできない． 大腸菌にはアセチル CoA が比較的高濃度で存在してい ることが報告されていることから，アセチル CoA が CoA 供与体ではないかと推測されるが，直接的な証拠 は得られていない． 次に，ラクチル CoA が乳酸重合酵素により重合され て乳酸ポリマーとなるのだが，ここで，非常に重要な条 件として，供給される乳酸モノマーは D 体である必要が ある．これは，乳酸重合酵素（さらに言えば，これまで に知られているすべての PHA 合成酵素）が厳密な D 体 特異性をもっているためである（10, 11）．通常大量に工業 図 4 ■ 大腸菌により合成された P （3HB）（左上） ，乳酸ポリマー P（LA- -3HB） （右上）と化学合成ポリ乳酸（左下） ．P （LA-3HB）は軟質で引っ張ると伸長することができる（右下） 生産されている乳酸は L-乳酸であるので，乳酸ポリマー を生合成するためには，大腸菌のような D-乳酸生産菌を 酵より複雑になる．乳酸ポリマー発酵は，乳酸発酵と以 用いるか，あるいは D-乳酸の合成経路を導入する必要が 下の点で異なっている． ある．この性質により，得られる乳酸ポリマーは非常に ・乳酸ポリマー P （LA-co-3HB）の合成には，3HB-CoA 厳密な D-乳酸ポリマーになる．化学的に重合させる場合 でも，原料となるのは乳酸菌が合成した L-乳酸（または D-乳酸）なのであるが，重合の過程でのラセミ化が完全 を供給する必要がある． ・おそらく CoA 供与体として，アセチル CoA の供給も 必要である． には回避できないため，通常数 % の光学異性体が含ま ・上記の事情により，乳酸発酵は嫌気条件下で促進され れてしまう．微生物合成ではそのような問題がなく，精 るのに対し，P（LA-co-3HB）の合成は好気条件で促進 密なキラルポリマーが合成できる．さらに，L-乳酸に比 べて高価（市場価格で L-乳酸の 10 倍以上）な D-乳酸ポリ マーが得られることも，メリットの一つである． される． ・ポリマーが菌体内に蓄積されるため，菌体増殖が必 要． 乳酸ポリマーが生合成されるための 2 つ目の要請とし 本生産系の特徴の一つは，ある程度の好気的条件下で て，3HB-CoA が第二の基質として供給される必要があ 乳酸を合成する必要があることである．過去の研究にお る．興味深いことに，3HB-CoA が全く供給されない条 いて，ピルビン酸からギ酸およびアセチル CoA を合成 件にすると，乳酸が生成しているにもかかわらず乳酸ポ するピルビン酸‒ギ酸リアーゼ（PFL）を欠損した大腸 リマーは合成されず，一方，3HB-CoA の存在下では， 菌は，競合経路が遮断されることに加え，乳酸脱水素酵 共重合体 P （LA-co-3HB）が合成される．このことから， 素（LDH）の活性が増大し，好気的な培養条件下でも乳 乳酸重合酵素は，ラクチル CoA を単独で重合すること 酸を合成することが知られていた（12）．筆者らは，Keio ができないと考えられる（10）．図 4 には，この代謝経路 Collection に含まれる pflA遺伝子変異株を利用して，乳 を用いて合成された P（LA-co-3HB）を示している．こ 酸ポリマーの合成を行った．その結果，遺伝子構築など のポリマーの性質はモノマー組成によって変化するが， に用いられる JM109 株と比較して，乳酸ポリマーの合 たとえば 30 mol% 程度の乳酸ユニットを含む P（LA-co- 成量および，ポリマー中の乳酸分率が向上することがわ 3HB）は，半透明のフィルムに加工でき，ポリ乳酸とは かった．そこで，以降の実験は pflA 欠損変異株を用い 異なり軟質である程度の伸張性をもつ．したがって，微 て行うこととした． 生物産生乳酸ポリマーは，単に化学合成ポリ乳酸のプロ セス変換にとどまらず，新たな材料の生産系としての可 能性も有していると言える． 上述した性質により，P （LA-co-3HB）の合成は乳酸発 化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013 ポリマー合成の化学量論 では，乳酸ポリマー発酵が，物質変換系として考えた 451 glucose 3 2 glucose O2 図 5 ■ 乳酸ポリマー生合成の炭素収 支 P(LA-co-3HB) lactic acid CO2 H2O 例 と し て グ ル コ ー ス2分 子 か ら P（LA-co-3HB）各 1 ユニットと乳酸 1 分子が生成した場合の収支を示す． 共重合体のように組成式の異なる複 数の分子が合成される場合は，生成 物の重量やモル数よりも炭素原子の 数を指標にしたほうが物質収支を理 解しやすい．構造は模式的なもので， 結合距離や角度は正確ではない． 際に乳酸発酵とどのように違うのかを考えてみよう．こ 減少していくということは，補足できていないカーボン こで，ポリマー生合成中の炭素源の消費と，ポリマーお フローがあるということである．炭素の減少が大きい期 よび副生成物の生成量を比較するために， 「炭素モル濃 間が菌体の対数増殖期と一致しているので，おそらく糖 度」という指標を導入する．これは，化合物中に含まれ の一部が増殖に使用されたと考えられる．このように， る炭素原子の数に相当する．たとえば，乳酸は 3 つの炭 炭素量をモニターすると，糖源がどの化合物に変換され 素原子を含むので 1 モルの乳酸は 3 炭素モルである．こ ているか把握することができる．ちなみに，水素原子の のような尺度を導入するメリットは，複数の化合物が関 数に着目すると，グルコース 1 分子から 1 分子の 3HB ユ 与する系全体の効率（物質収支）を，酸化還元の程度な ニットと 2 分子の CO2が合成されるため，反応前後で水 どに依存せず一元的に表示できることである（図 5） ． 素原子が余ってしまう．これはすなわち，グルコースか まず最初に，乳酸ポリマー合成の基礎となる P （3HB） ら P（3HB）を合成すると還元力が余ることを意味して の合成について検討する．実際の培養結果を図 6A に示 いる．この余剰の水素原子を処理して解糖系が活発に進 す．本条件では，20 g/L のグルコースを加えているの むためには，酸素と結合して水を作る必要がある．した で，667 mol/L の炭素が存在すると考える．経時的に培 がって，グルコースを炭素源とした P （3HB）の合成は 地および菌体をサンプリングし，細胞内に蓄積された 好気的な条件で効率よく進むことになる． P（3HB）と培地中に残存するグルコース濃度と，分泌さ れた乳酸，酢酸の濃度を測定して積み重ねる．図 6A で は，培養中期に少量の乳酸が合成され，その後再吸収さ C6H12O6（グルコース） ＋ 3 O → C 4H6O2 2 2 （3HB ユニット） ＋ 2CO2＋ 3H 2O れていることがわかる．ここで忘れてはならないのはピ ルビン酸（C3）からアセチル CoA（C2, CoA 部分を除 く）が合成される際に遊離される CO2である（図 3）． 3HB ユニット 1 分子当たり CO2が 2 分子発生するはずな P（LA- -3HB）合成のメタボリックケミストリー 次に，CoA 転移酵素を発現させて乳酸ポリマーを合 ので，3HB の半分に相当する炭素モル濃度を加算する． 成した際の物質変換を同様に測定する（13）（図 6C）．今度 図 6 の透明な枠は，このように計算された CO2の量であ は赤色で示したポリマー中の乳酸ユニットの蓄積がグラ る（実際の測定値ではない）．青色で示す P （3HB）の炭 フに含まれている．本条件では，培養の初期に一部の炭 素量だけを見ると，原料の糖の酸素量に比べて目減りし 素源が別の経路に流れるが，その後はほとんど炭素量の ているように見えるが，この CO2の放出を考慮すると， 合計が変動せず，グルコースがポリマーまたは有機酸に 実際にはそこそこの炭素収率で P （3HB）が合成されて 定量的に変換されていることがわかる．このグラフで目 いることがわかる．それでも，経時的に炭素量の合計が を引くのは，オレンジ色で表示した 3-ヒドロキシブタン 452 化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013 図 6 ■ グルコースおよびキシロースを炭素源とした P（3HB）および P （LA-co-3HB）生合成の炭素変換 各データは，ポリマー合成系遺伝子群を導入した組換え大腸菌を培養し，経時的にモニターしたものである．図中のバーの長さは，培地中 およびポリマー中の各化合物の炭素原子の量を表している．各図のバルーンは，大腸菌で発現しているポリマー合成系の酵素群を示す． A : P（3HB）生産，B‒D : P（LA-co-3HB）生産．酢酸の量はごくわずかのため，図中ではほとんど見えない． 化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013 453 酸（3HB）の生成である．これはポリマー中のモノマー このことから，仮にアセチル CoA が CoA 供与体であっ ユニットではなく，3-ヒドロキシブタン酸が培地中に分 たとしても，CoA 転移酵素により遊離された酢酸は細 泌されていることを意味する．この現象は CoA 転移酵 胞内でアセチル CoA へとリサイクルされていることが 素（PCT）の働きにより説明できる．3HB-CoA が CoA 示唆される．このことは，炭素収率の観点から好都合で 供与体となり PCT によって何らかの有機酸に CoA が移 ある． されると 3HB が生成しうる（14）．図 3 には可能性の一つ として酢酸に CoA 転移される経路を示している．CoA の受容体は複数ありうるが，何が受容体になっているの 乳酸分率向上のための改良型乳酸重合酵素 かを知るのは簡単ではない．PCT の基質特異性に基づ 次に，乳酸分率のさらなる向上のために，乳酸重合酵 いて考えれば，乳酸も CoA 受容体になりえるが，3HB 素の改良に着手した．乳酸重合酵素は，野生型の酵素に が合成される培養後期には乳酸も乳酸ポリマーも合成さ ST と QK の 2 つの変異を加え，高活性化すると同時にラ れていないことから，乳酸が受容体になっている可能性 クチル CoA の重合活性を獲得したものである．われわ は低いと推定される．一方，酢酸からアセチル CoA が れの研究グループでは，過去に別の重合酵素の進化工学 生成する場合は，アセチル CoA から 3HB が生成するた 的 改 変（15） で 見 い だ さ れ た 活 性 向 上 効 果 が あ る 変 異 め，代謝経路が回転しうる．なぜこの条件で 3HB が生 （F392S）を，乳酸重合酵素に組み合わせた三重変異体 産されるのかは明らかではないが，3HB が分泌される を作成した（16）．この新たな乳酸重合酵素（ST/FS/QK） のは培養後期であり，この段階ではポリマー蓄積率が上 を用いて P（LA-co-3HB）を合成すると，ポリマー中の 昇していないことから，何らかの理由で細胞内のポリ 乳酸分率を向上させることができることを見いだした． マー蓄積が停止し，重合しきれないモノマーが細胞外に 漏れでていると解釈できる． ポリマーとして蓄積された乳酸と 3HB ユニットと， では，この改良型乳酸重合酵素を用いた P （LA-co3HB）生産を，同様にモニターするとどのような違いが 生じるだろうか？ 図 6E にはその培養結果を示す（13）． 培 地 中 に 存 在 す る 3HB の 合 計 に 相 当 す る 炭 素 量 は， 一見して乳酸ユニットの蓄積率が増大していることがわ P （3HB）を生産した場合よりも多い．上述したように， かる．3HB ユニットの蓄積量は逆に減少しているが， 乳酸の合成には，3HB の合成のような CO2の遊離を伴 ポリマーと残留した糖の炭素量を合計すると ST/QK を わないので，その分炭素収率が高くなると考えられる． 用いた系よりも高くなっている．これは，前に述べた理 たとえば，例として，乳酸分率が 67 mol%（つまり乳酸 由で CO2の放出を伴う 3HB の合成から，乳酸の合成へ ユ ニ ッ ト 2 個 に 対 し て 3HB ユ ニ ッ ト 1 個 を 含 む） の とシフトした結果，炭素収率が向上したことに対応す P（LA-co-3HB）の物質収支は以下のようになる． る．実際，CO2の放出分を含めた炭素量は ST/QK と比 ＋ 3 O2→ C 3H4O2 C6H12O6（グルコース） 4 1 （乳酸ユニット）＋ C4H6O2（3HB ユニット） 2 ＋ CO2＋ 5 H2O 2 較して大きく変化していない．このことから，P （LAco-3HB）の生産では，乳酸分率が高いほうが，炭素収率 が高くなるという関係があることがわかる．この調子で いくと，乳酸分率をもっと上昇させれば，さらに高い炭 素収率で乳酸ポリマーが合成できそうに見える．しか し，前述したように，3HB-CoA の供給は乳酸ポリマー 前述した P （3HB）の合成と比較すると，CO2の発生 の生合成に必須であり，3HB-CoA 供給系を弱いものに が少なくなる分，全体の炭素収率が上昇する．ただし， 置き換えると（乳酸分率は向上できるが）ポリマーの合 乳酸からラクチル CoA への活性化に，おそらくアセチ 成量が極端に低下してしまう（17）．したがって，生産性 ル CoA が CoA 供与体として必要とされることは注意す を維持しつつさらに乳酸分率を上げるためには，何か別 る必要がある．なぜこのことが重要なのかというと，図 の工夫が必要だった． 3 に示すように CoA 転移酵素がアセチル CoA を CoA 供 与体としてラクチル CoA を合成したとすると，合成し たラクチル CoA と等モルの酢酸を遊離するはずだから キシロースの乳酸ポリマー合成における有効性 である．しかし実際には，培地中に分泌された酢酸量は 筆者らは乳酸ポリマー生産の炭素源としてキシロース 重合された乳酸ユニットと比較して非常に少量で，また に着目した．キシロースは植物組織を構成するセルロー ほかに乳酸の重合量に匹敵する有機酸が検出されない． ス，ヘミセルロース，リグニンのうち，ヘミセルロース 454 化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013 の主要構成成分であり，木質系草本系バイオマスの糖化 能が高い（あるいは低い）ことは，必ずしも NADPH の によって得られる（18）．近年，非可食バイオマスの産業 細胞内濃度が高い（あるいは低い）ことを意味しない． 利用が活発になり，注目されている炭素源である．既往 実際筆者らは，ポリマー合成中の大腸菌の NADPH/ の研究により，乳酸発酵の炭素源としてキシロースを使 NADP ＋レベルを測定したが，グルコース・キシロー 用すると，ほぼ理論収率に近い生産性を示すことが知ら スを炭素源とした培養において，大きな違いはなかっ れている．一方，P （3HB）の生産においては，キシロー た（13）．このことから，細胞内の NADPH のレベルはあ スを炭素源とできることが古くから報告されていたもの る一定の値に制御されているが，酸化還元反応を仲介す （19） の ，その生産性はグルコースに劣っていたため，そ る回数には差が生じると考えられる．逆に言うと，ポリ の後あまり注目されることはなかった．われわれは，こ マーを分析することにより，間接的に NADPH などの補 の乳酸の生産性が高く P （3HB）の生産性が低いという 因子の回転数を知ることができると言える．つまり，ポ 性質に着目した．P（3HB）の生産性が低いのであれば， リ マ ー 中 の 乳 酸 ユ ニ ッ ト が 1 分 子 生 成 す る こ と は， その分の炭素源が乳酸ユニットに振り向けられる可能性 NADH が 1 分子消費されたことを意味し，また同様に， が考えられた． 3HB ユニットが 1 分子生成することは，NADPH が 1 分 では，実際にキシロースを炭素源として P（3HB）お 子消費されたことを意味する．したがって，キシロース よび乳酸ポリマーを合成した結果を図 6B, D, F に示す を炭素源とした方がグルコースを用いた培養と比較し （20 g/L のグルコースと 20 g/L のキシロースは，糖のモ て，結果的にポリマー生産系における NADPH の回転数 ル数は異なるが，炭素のモル数はどちらも 667 mM であ が減少し，逆に NADH の回転数が増加したと推定でき （13） る） ．まず，P （3HB）の合成では，過去に報告されて る． いたとおり，グルコースと比較するとキシロースからの P（3HB）の生産性が低かった（図 6B） ．次に P （LA-co3HB）を合成すると，期待どおり，グルコース培養と比 おわりに 較して，乳酸ユニットの蓄積量が増加し，逆に 3HB ユ 乳酸ポリマー発酵は，再生可能なバイオマスを一段階 ニットの合成量は低下した（図 6D）．さらに，この効果 の発酵プロセスで乳酸ポリマーへと変換する．合成され は ST/FS/QK 変異体と組み合わせることにより相乗効 たポリマーは，非常に高い光学純度をもち，プラスチッ 果が得られ，その結果，ポリマーとして蓄積された炭素 ク材料として利用できる．本発酵系は，ラクチル CoA の総量はグルコースより低いものの，ポリマー中の乳酸 への活性化，ほかのモノマー基質との共重合など，さま 分率は最大で 60 mol% に達した．この結果は，これまで ざまな因子がかかわり合う複雑な代謝経路となる．今 ポリマー生産には不利だと考えられていたキシロース 後，メタボローム解析的な手法により測定される細胞内 が，乳酸ポリマーの合成にはむしろ有利に働くことを示 の代謝中間体の情報を組み合わせれば，本合成系に関す している． る理解がさらに深まるだろう．炭素収率だけに着目する なぜグルコースとキシロースの間にこのような違いが と，乳酸分率が高いほうが理論収率は向上するが，材料 生じるのであろうか？ おそらく主要なファクターの一 の観点から見ると，これら分率の異なる共重合体はそれ つとなっているのが，解糖系によって得られる還元力の ぞれ異なる物性を示すことから，モノマー組成が制御さ 違いである．グルコースはペントースリン酸経路（PP れたさまざまなポリマーを合成し，その材料特性を知る 経 路） に 入 る こ と により，炭素を一つ失う見 返 り に ことが必要である．このシステムをうまくコントロール NADPH を 1 分 子 生 成 で き る（図 3） ．NADPH は PhaB し，組成の制御と生産性を両立させるためには，どのよ の補因子となるので，NADPH が効率的に合成できるこ うな代謝経路および酵素を用いればよいか，それを探索 とは，P （3HB）の合成にとって重要であると考えられ するのも今後の重要検討課題である． る．一方，キシロースは PP 経路で NADPH を合成する 謝辞：電子顕微鏡写真を提供頂いた明治大学農学研究科，若林愛子氏， 佐藤道夫博士，前田理久博士に感謝申し上げます．本研究の一部は， JST・CREST 研究領域「二酸化炭素資源化を目指した植物の物質生産力 強化と生産物活用のための基盤技術の創出」の支援により行われました． ことができない．そのため 3HB の合成が不利になり， その分乳酸の合成に振り向けられると考えられる．ま た，NADPH をほかの経路で賄う必要があり，たとえ ば，TCA サイクルに入って NADPH を生成したと考え ると，その分の炭素源が失われ，トータルの炭素収率が 低くなることと符合する．ただし，NADPH などの合成 化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013 455 文献 1） M. 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Lee : Bioprocess Eng., 18, 397（1998） . 456 プロフィル 松 本 謙 一 郎（Ken ichiro MATSUMOTO） ＜略歴＞ 1997 年東京大学工学部化学生命 工学科卒業／2002 年同大学大学院工学系 研究科化学生命工学専攻修了／2002 年理 化学研究所博士研究員／2003 年同基礎科 学特別研究員／2005 年東京理科大学基礎 工学部助手／2007 年北海道大学工学部助 教／2012 年同大学准教授．同年より科学 技術振興機構さきがけ研究者（兼任） ，現 在に至る＜研究テーマと抱負＞大学におけ る研究・教育活動と家族サービスの両立 ＜趣味＞生物システムを利用した合成化学 ジョン・マサニ・ンドゥコ（John Masani NDUKO） ＜ 略 歴 ＞ 2005 年 Egarton 大 学 食品科学技術学部（ケニア）卒業／2008 年より国費留学生として北海道大学大学院 総合化学院博士前期・後期課程に在籍，現 在に至る＜研究テーマと抱負＞乳酸ベース ポリマーの微生物合成．将来の夢はケニア で教授になること＜趣味＞サッカー，旅行 田口 精一（Seiichi TAGUCHI） ＜略歴＞ 1989 年東京大学大学院工学系研 究科工業化学専攻博士課程 2 年中退，工 学 博 士（1991 年 取 得（東 大））／1989 年 東京理科大学基礎工学部生物工学科助 手／1999 年 理 化 学 研 究 所 高 分 子 化 学 研 究 室 先 任 研 究 員／2002 年 明 治 大 学 農 学 部 農 芸 化 学 科 助 教 授／2004 年 北 海 道 大 学大学院工学研究院教授（理化学研究所 バイオマス工学研究プログラム客員主管 研 究 員 兼 任）／2012 年 科 学 技 術 振 興 機 構 の CREST 研 究 員 代 表 ＜ 研 究 テ ー マ と 抱 負＞微生物プラットフォームを利用した 新規有用物質生産，自然免疫分子（抗菌 ペ プ チ ド） の 作 用 機 構 と 応 用 展 開 ＜ 趣 味＞自転車での遠出，駄洒落 化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013