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(57)【特許請求の範囲】 【請求項1】 不死化ヒトケラチノサイト細胞系統で
JP 3557172 B2 2004.8.25 (57) 【 特 許 請 求 の 範 囲 】 【請求項１】 不死化ヒトケラチノサイト細胞系統であって、該細胞系統が第８染色体において余分な長 いアームの同位染色体を有することを例外として、４６の正常染色体組を含んでなり、該 細胞系統がＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２１９１であることを特徴とする前記不死化ヒトケラチ ノサイト細胞系統。 【請求項２】 異種遺伝子によりトランスフェクションされた請求項１の不死化ヒトケラチノサイト細胞 。 【請求項３】 10 導入遺伝子がマーカー遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載の細胞系統。 【請求項４】 細胞が単層培養培地またはバイオフィルム中にあることを特徴とする請求項１に記載の細 胞系統。 【請求項５】 細胞が器官型培養培地にあることを特徴とする請求項１に記載の細胞系統。 【請求項６】 マーカー遺伝子がグリーン蛍光タンパク質をコード化することを特徴とする請求項３に記 載の細胞系統。 【請求項７】 20 (2) JP 3557172 B2 2004.8.25 テスト用腫瘍細胞修飾剤の効果を測定する方法であって、 ａ）培養培地が悪性扁平上皮細胞と自然発生的不死化ヒトケラチノサイトとを含んでなり 、この培養培地が再構築表皮を形成する、ヒト重層扁平上皮細胞培養培地を得る工程、 ｂ）テスト用腫瘍細胞治療剤により表皮を処置する工程、および、 ｃ）表皮内の悪性細胞を評価する工程、 を含んでなり、前記ケラチノサイトがＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２１９１であることを特徴と する前記方法。 【請求項８】 悪性細胞が遺伝子工学的に標識化されていることを特徴とする請求項７に記載の方法。 【請求項９】 10 遺伝子マーカーがグリーン蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項８に記載の方法 。 【請求項１０】 悪性細胞増殖の測定が蛍光活性化細胞分取によるものであることを特徴とする請求項９に 記載の方法。 【請求項１１】 ヒトケラチノサイトが遺伝子工学的に標識化されることを特徴とする請求項７に記載の方 法。 【請求項１２】 マーカーがグリーン蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。 20 【請求項１３】 工程（ｃ）の評価が細胞増殖に関するものであることを特徴とする請求項７に記載の方法 。 【請求項１４】 工程（ｃ）の評価が細胞サイズまたは形状に関するものであることを特徴とする請求項７ に記載の方法。 【請求項１５】 悪性細胞が個々の患者組織から分離されていることを特徴とする請求項７に記載の方法。 【請求項１６】 不死化ヒトケラチノサイトとヒト扁平細胞がん（ＳＣＣ）細胞の組み合わせを含んでなり 30 、該ケラチノサイトがＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２１９１であることを特徴とする器官型培養 培地。 【請求項１７】 ＳＣＣ細胞がＳＣＣ１３ｙ細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の培養培地。 【請求項１８】 ＳＣＣ細胞がグリーン蛍光タンパク質をコード化する遺伝子によりトランスフェクション されることを特徴とする請求項１６に記載の培養培地。 【請求項１９】 ＳＣＣ細胞が個々の患者組織から分離されたものであることを特徴とする請求項１６に記 載の培養培地。 40 【請求項２０】 コラーゲンと線維芽細胞の基底層からさらに含んでなる請求項１６に記載の培養培地。 【請求項２１】 ヒト毒性に関するテスト化合物を評価する方法であって、 ａ）請求項１に記載の細胞系統に対してテスト化合物を曝露する工程、および、 ｂ）該細胞系統上で該化合物の効果を評価する工程、 を含んでなる方法。 【発明の詳細な説明】 【０００１】 （関連出願の相互参照） 50 (3) JP 3557172 B2 2004.8.25 適用できず。 【０００２】 （連邦政府により援助された研究開発に関する陳述） 本発明は、以下の機関により支給された、合衆国政府の援助のもとでなされた：国立衛生 研究所（ＮＩＨ）からの許可番号第ＡＲ４０２８４号。合衆国は本発明において所定の権 利を有する。 【０００３】 （発明の背景） ヒトケラチノサイト 重層扁平上皮から分離されるヒトケラチノサイトはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で容 10 易に培養することができる（リー（Ｌｅｉｇｈ）ら、１９９４に総説）。培養されたケラ チノサイトは初期継代で容易に複製され、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で扁平分化のある 特徴を示す大量の細胞を発生する。培養された正常ヒトケラチノサイトがマウスに移植さ れる場合、表皮組織構造はある期間にわたり秩序立ってされる（ブライトクルッツ（Ｂｒ ｅｉｔｋｒｅｕｔｚ）ら、１９９７）。移植手順と以後のモニタリングに関して皮膚が利 用し易いことと相俟ってヒトケラチノサイトの培養と移植の容易さがあるので、この体性 細胞型は治療用遺伝子デリバリーに関しては魅力的なものになっている。しかし末端分化 の開始によって、ケラチノサイトでの導入遺伝子発現は、使用されている遺伝子発現の方 策にはかかわらず、常に喪失している。いくつかの報告が、遺伝子工学的に処理されたヒ トケラチノサイトは全厚表皮を再現することができ、したがって、幹細胞様の特性を備え 20 た細胞が移植された細胞集団のなかに存在したことを示している（コエート（Ｃｈｏａｔ ｅ）とカバーリ（Ｋｈａｖａｒｉ）、１９９７；コエートら、１９９６；ジェラール（Ｇ ｅｒｒａｒｄ）ら、１９９３；ガーリック（Ｇａｒｌｉｃｋ）ら、１９９１；グリーンハ ーフ（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ）ら、１９９４；ボーゲル（Ｖｏｇｅｌ）、１９９３；フェ ンジブス（Ｆｅｎｊｖｅｓ）、１９９４）。 【０００４】 重層扁平上皮から誘導したヒト細胞を利用するインビトロ組織培養測定（アッセイ） 正常インビボ組織のコンテクストを維持する付着細胞の単層培養培地を使用したインビト ロ測定は、ヒト組織に関しては存在しない。動物モデルは、ヒト組織治療の反応に関わり があるプロセスのうちのいくつかを模倣する能力を有している。しかし、動物の体系は腫 30 瘍増殖の定性的および客観的評点にのみ相応しい。従来、簡単なインビトロ増殖測定には プラスチック組織培養皿上でげっ歯類あるいはヒト細胞系統の単層培養培地が使用されて きた。コロニーの規模あるいは細胞数が放射線治療後のがん細胞の生存と増殖の程度を推 測するために評価される。このアプローチの主な欠点は、それではその腫瘍細胞環境内で 何らの付着あるいはパラクリン増殖因子シグナルが説明されないことである。このため、 正常周囲細胞が存在しない場合の腫瘍細胞の増殖についての研究は、腫瘍細胞のインビボ 増殖特性を正確には反映していないことがある。 【０００５】 例えば、ヒトの頭部と頸部（Ｈ＆Ｎ）腫瘍については、毎年アメリカ合衆国では４３，０ ００人の患者で、また、世界中では７５０，０００人以上の患者で診断が下されている。 40 原発性腫瘍の部位の近くでの腫瘍再発は、治療の失敗とこれらの患者の死亡の圧倒的な原 因となっているにもかかわらず、治療後の腫瘍再増殖に寄与している分子イベントについ てはほとんど何も分かっていない。臨床および放射線生物学的には、腫瘍の増殖率は放射 線曝露を原因とする創傷後に実際には増加していることがある（ホール，イー．ジェイ． （Ｈａｌｌ，Ｅ．Ｊ．）、１９８８；ペテレイ，ディー．ジー．（Ｐｅｔｅｒｅｉｔ，Ｄ ．Ｇ．）ら、１９９５）。創傷環境が強い腫瘍増殖シグナルを供給していることが示唆さ れている（ハドウ，エー．（Ｈａｄｄｏｗ，Ａ．）、１９７２）。例えば、創傷床に存在 する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）糖タンパク質は、正常組織再生に必要となる強い増殖 刺激因子を供給するおよび／または隔離する。これらの観察から、失敗したがん治療の後 に腫瘍がはじめに発生するおよび／または再増殖するという組織のコンテクストは、腫瘍 50 (4) JP 3557172 B2 2004.8.25 増殖には有意な影響を与える場合があることが明確なものになった。 【０００６】 細胞生物学に関する当業技術で必要なものは、正常染色体組に近いものを備えた自然発生 的の不死化ヒトケラチノサイト細胞であり、またインビトロ組織測定におけるこの不死化 細胞系統を使用するための方法である。 【０００７】 （発明の要約） １つの実施態様では、本発明は１つの不死化ヒトケラチノサイト細胞系統であり、その細 胞系統は第８染色体の長いアーム上の同位染色体外因子を例外として４６の正常染色体組 を含んでなる。１つのとくに利点のある実施態様では、細胞系統はＡＴＣＣ ＣＲＬ １ 10 ２１９１である。 【０００８】 もう１つの実施態様では、本発明は異種遺伝子によりトランスフェクションされたトラン スジェニック不死化ヒトケラチノサイト細胞系統である。この遺伝子はマーカー遺伝子で ありうるし、もっとも好適にはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。 【０００９】 本発明はまた、悪性扁平上皮細胞、好適にはヒト重層扁平がん細胞（ＳＣＣ）を含んでな る、また自然発生的不死化ヒトケラチノサイトを含んでなる、ヒト重層扁平上皮細胞培養 培地を得ることにより、テスト腫瘍細胞治療剤の効果を測定する方法でもある。この培養 培地はその後に、再構築される表皮のなかに形成される。その後、テスト腫瘍細胞治療剤 20 により表皮を治療することができ、また表皮内のＳＣＣの増殖を評価することができる。 【００１０】 本発明の利点は、不死化ケラチノサイト細胞系統が提供されることである。 【００１１】 本発明のほかの目的、特徴および利点は、本明細書、特許請求の範囲および図面を概観し た後、明らかになることであろう。 【００１２】 （発明の簡単な説明） Ａ．不死化ヒトケラチノサイト細胞系統 幹細胞様の特性を備えたヒトケラチノサイトは外因性遺伝子の安定したトランスフェクシ 30 ョンの最適標的である。安定トランスフェクタントは細胞のなかに外因性ＤＮＡが導入さ れ、ホスト染色体のなかに組み込まれた時作製される。その後の娘細胞は、導入遺伝子の 遺伝子産物を発現させ、またその後の世代を通してその発現が無制限に遺伝する場合には 、安定したものとなる。遺伝子療法適用に関しては、関心の対象である形質導入遺伝子の 発現を維持しながら、組織代謝回転の複数サイクルにわたって全厚表皮を再生する能力を 備えた幹細胞様ケラチノサイトを使用することが必須である。 【００１３】 １つの実施態様では、本発明は、細胞型特異的増殖の所要量を保持し、分化マーカーを発 現させ、また安定的にトランスフェクションすることができる、自然発生的不死化ヒトケ ラチノサイト細胞系統、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬである。ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬは、ブタペ 40 スト条約に定められた条件にしたがって、米国、バージニア州２０１１０−２２０９、マ ナサス市、ユニバーシティー ボウレバード １０８０１にあるアメリカ タイプ カル チャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ）に、受入番号ＣＲＬ−１２１９１の下に１９９６年９月２０日に寄託された。 【００１４】 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトは、腫瘍発生性のものではなく、また器官型培養に おいて扁平分化を受ける。器官型培養は、真皮に類似し、また空気培地インターフェイス に曝される基質上で、ケラチノサイトが増殖する培養培地である（リーとワット（Ｗａｔ ｔ）、１９９４）。 【００１５】 50 (5) JP 3557172 B2 2004.8.25 われわれは、このヒトケラチノサイト細胞系統が、高い効率と長期上皮導入遺伝子発現を 維持することができる長期寿命の表皮始原細胞の１つの資源として役に立つことを構想し ている。ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトは、重層扁平上皮における増殖と分化に関 する研究のための１つの重要な新しい細胞試薬を代表するものである。 【００１６】 もう１つの実施態様では、本発明は不死化ヒトケラチノサイト細胞系統であって、好適に は、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ、好適にはＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２１９１であり、少なくとも １つの導入遺伝子を含んでなる。以下の例は、トランスジェニック細胞系統を作り出す好 適な方法を示している。分子生物学に関する当業者には多くのほかの方法が明らかなこと であろう。われわれは、ひとつの方法を開発したが、それによって、トランスフェクショ 10 ンされたＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトが、ＧＦＰの発現をベースにして同定され 、また形態学とＧＦＰの発現の程度をベースにして選択され、また、細胞プレトランスフ ェクションの最高度のもの、天然状態／質を保存するなどを行う。この技術はＦ４１８、 メトトレキセート、ヒグロマイシン−Ｂ、アミノプテリン、マイコフェノール酸、ゼオシ ンなどの標準化学試薬により優位選択可能なマーカーをベースにした選択による潜在的な 形質変更圧力を避けている。 【００１７】 われわれは、単層細胞培養培地による器官型培養の形成、ヒトあるいは研究動物に短期お よび／または長期移植のための適当なヒト組織遺伝子工学産物、また、例えば、経静脈的 に患者に途切れることなく投与される遺伝子産物を製造する機械の一部としてのバイオフ 20 ィルム成分として、さまざまな用途で、不死化ヒトケラチノサイト細胞系統の使用方法を 人々が望むことを構想している。 【００１８】 Ｂ．モデル器官型システムとしてＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬの使用法 上述のように、本発明の細胞系統は正常ヒト重層扁平上皮の組織構造を再生するという実 質的な利点を有する。このモデルはヒト腫瘍増殖の測定方法として適している。組織様環 境内で悪性ヒト上皮細胞増殖を完全に再構築することにより、腫瘍細胞増殖特性は生理学 的に関連あるコンテクストでモニターすることができる。 【００１９】 さらに、各個々の腫瘍細胞が、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのマーカータンパ 30 ク質を発現させるために、遺伝子工学的に処理することができるので、定量的なエンドポ イントをモニターすることができる（以下の例には、マーカー遺伝子によりＢＣ−１−Ｅ Ｐ／ＳＬをトランスフェクションする好適な方法が示されている）。このモデルシステム は、重層扁平上皮がんの治療に使用される薬物あるいは剤のスクリーニングのための技術 的進歩を代表するものである。例証となるがんには、頭部と頸部、皮膚、口腔粘膜、子宮 頸部、気管のがんが含まれる。 【００２０】 したがって、本発明は、腫瘍細胞増殖と再増殖の比率を測定するために設計されたヒト重 層扁平上皮モデルシステムである（略図的に示されている例の図６を参照）。 【００２１】 40 １つの実施態様では、そのモデルシステムは、遺伝子工学的に標識化されたヒト扁平細胞 がん（ＳＣＣ）と非標識化自然発生的不死化ヒトケラチノサイト、ＢＣ−１−ＥＰ／ＳＬ の器官型混合培養培地から成る。ＳＣＣ細胞の増殖特性を比較することで、その細胞が再 生可能な環境のコンテクストを提供するので、ＢＣ−１−ＥＰ／ＳＬケラチノサイト系統 は、このモデルシステムにおいては非常に重要な構成要素である。すべての正常ケラチノ サイトの特性を保持している、すなわち、末端分化、アポトーシス、非腫瘍形成特性が残 っているので、ＢＣ−１−ＥＰ／ＳＬ不死化細胞系統には非常に利点がある。 【００２２】 以下の例には、再構築された表皮を作り出す好適な方法が開示されている。手短に言うと 、ＢＣ−１−ＥＰ／ＳＬ とＳＣＣ細胞は正常ヒト線維芽細胞を含むコラーゲン基剤上に 50 (6) JP 3557172 B2 2004.8.25 接種される。混合培養は、ＢＣ−１−ＥＰ／ＳＬケラチノサイトの標準的な数のもので、 標識化されたＳＣＣのさまざまな希釈液に接種される。 【００２３】 本発明のインビトロでの腫瘍／正常組織モデルはまた、腫瘍進行と再増殖を司る分子メカ ニズムの実験において助けとなる。この同じモデルもまた、腫瘍再増殖を遅らせることが できる潜在能力のある静細胞因子と特異的腫瘍選択性を備えた化学的予防剤を同定するの に使用することができる。例えば、再構成された器官型培養培地は、例えば、物理的（例 えば、Ｘ線照射）あるいは化学的／生物学的剤（すなわち、化学療法剤、静細胞因子剤） などさまざまな腫瘍細胞修飾剤により処理することができ、また、好適にはＧＦＰ標識を 使用してＳＣＣ細胞の（再）増殖の程度あるいは欠如を定量化して、その培養培地はモニ 10 ターすることができる。このように、ＢＣ−１−ＥＰ／ＳＬモデルシステムは、頭部と頸 部、皮膚、口腔粘膜、子宮頸部、気管およびほかの上皮のがんのための治癒的治療を受け るがん患者のための抗増殖剤、あるいは全般的に、新規な、新しい抗がん対策の同定と開 発に寄与することになるであろう。 【００２４】 腫瘍細胞増殖は以下のように、もっとも都合よくモニターすることが可能である。すなわ ち、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の数に対する腫瘍細胞の総数と比率が、ＧＦＰ蛍光をベー スにしたフローサイトメトリー技術を使用してもっとも都合よくモニターすることができ る。腫瘍細胞量とその局在化は、共焦点顕微鏡によりもっとも都合よくモニターされる。 細胞間相互作用は免疫染色とインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成技術を使用 20 して組織学的切片でもっとも都合よくモニターされる。 【００２５】 ＧＦＰの哺乳動物への導入は、インビトロと動物モデル系に利用されることが増加してい る。今日まで、ＧＦＰの発現により哺乳動物の細胞増殖が改変されたことを記述している 報告はまだない。これらのモデルは、予想されたようにモデルが行動するという事実から は、ＧＦＰ発現がとくに害はなく、またしたがって理想的なマーカータンパク質であるこ とが示唆される。本研究において観察されたものからはまた、ＧＦＰのヒト扁平細胞がん 細胞系統、ＳＣＣ１３ｙのなかへの導入は、顕著な生物学的エンドポイントの上では効果 がないことが確かめられている。その結果から、これらの実験においては、ＧＦＰ発現は 研究された細胞型の増殖および分化特性には干渉しないことを示唆している以前の諸研究 30 を支持していることが観察された。ＧＦＰ発現の安定性は、ある期間にわたってマーカー としてＧＦＰを使用するモデルの成功に非常に重要であるもう１つの変数である。われわ れの実験における観察では、ＧＦＰ発現は少なくとも１つの悪性細胞系統であるＳＣＣ１ ３ｙでは安定していることが示唆されている。遺伝子マーカー法のほかの諸方法、例えば 、酵素活性および／または培養装置は、同じ培養サンプルの反復測定を可能にするもので あると考えられる。 【００２６】 異常および正常ヒトケラチノサイトの混合培養が最近、エー．ジャバヘリアン（Ａ．Ｊａ ｖａｈｅｒｉａｎ）と共同研究者により報告されている（ジャバヘリアン，エー．ら、１ ９９８）。この研究では、遺伝子工学を使用した不死化されたケラチノサイト細胞（Ｈａ 40 Ｃａｔ）が器官型培養培地のなかで増殖される。不死ではあるが、これらの細胞は腫瘍形 成性ではなく、すなわち、ヌードマウスでは悪性腫瘍を形成することができ、またしたが って、一般的に悪性細胞の顕示することはない。ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞系統は実際の 患者の腫瘍から誘導されたものであり、また腫瘍発生性のものであるため、悪性腫瘍の根 絶を目的とする諸研究にはより適切なものであろう。 【００２７】 器官型混合培養モデルは、製薬およびバイオテクノロジー産業により直面される非常に重 要な少なくとも３つの問題には有用であろう。すなわち、（１）腫瘍再増殖の新規な静細 胞因子阻害剤に関するスクリーニングをいかに行うか、（２）治療の前の化学療法あるい は放射線療法に対して患者特異的な応答反応をいかに判定するか、（３）新規な、生物学 50 (7) JP 3557172 B2 2004.8.25 的治療剤をいかに開発するかである。腫瘍細胞を直接的に標的とする伝統的な細胞毒性剤 とは異なり、腫瘍増殖の静細胞因子阻害剤は、個々の腫瘍あるいはその微環境を標的とす ると考えられる。細胞毒性剤の主な目的は腫瘍細胞を殺傷することであり、一方、静細胞 因子阻害剤の目的は、腫瘍増殖拡大を遅らせるあるいは停止させることであり、必ずしも それを殺傷することではないという理由から主にこの差違は生じる。理論的には、これは 、細胞の増殖に直接干渉することにより（例えば、細胞周期阻害剤）、あるいは腫瘍増殖 に関してより支持的ではないものに周囲の正常組織を仕向けることを、周囲の正常組織で 間接的に改変を行うことにより（例えば、創傷再生シグナルの阻害）、達成できる。 【００２８】 新規の抗腫瘍の方策は、腫瘍および正常組織応答反応のインビトロでの機能は再構築され 10 たヒト組織において直接測定することができるので、器官型腫瘍／正常組織混合培養培地 を使用して同定することが可能である。ヒト腫瘍細胞の単層培養培地の増殖をベースにし た現行のインビトロでの測定方法では、正常組織機能を必要とせず、また悪性細胞の微環 境の影響を考慮に入れていないので、この点に関しては失敗する。腫瘍微環境を理解する ことは、進行性悪性特性をまだ発症する場合に、腫瘍の発生開始を予防することに焦点を 当てている化学的予防剤の同定ではとくに重要なことであると思われる。通常の細胞毒性 あるいは外科的療法を生き延びる悪性細胞の再増殖の予防にはこれはまた重要なことであ ろう。さらに、器官型腫瘍／正常組織混合培養による静細胞因子剤はまた、臨床的放射線 療法に同時使用するのには有用であろう。この場合は、治療の間に腫瘍の増殖を遅らせる 静細胞因子剤の能力は、腫瘍を除去する際に非常に重要であり、また通常の治療に付随す 20 る炎症により生じる合併症を減衰させることであろう。 【００２９】 器官型腫瘍／正常組織混合培養培地モデルにおける腫瘍再増殖をモニターすることはまた 、治療応答性および治癒率に関する治療前の患者特異的情報を提供するのにも有用であろ う。現行の諸測定法は、単層培養培地におけるヒト腫瘍のインビトロでの増殖と実際の患 者の腫瘍応答反応には弱い相関関係のみが見られる。もっと強い相関関係が、インビトロ モデル内で正常組織コンテクストを含めることにより達成することができると考えられる 。 【００３０】 ほかの適用法は、患者の治療に直接的に影響を及ぼす潜在能力を備えたさらに予後の、お 30 よび／または生物学的材料を提供する可能性がある。例えば、腫瘍生検から得られる細胞 は、ＧＦＰ標識化ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞とともに混合培養することができ、本出願に おいてはそれを「反転培養培地」と定義する。反転培養培地モデルは、インシトゥでの腫 瘍微環境をほぼ同じように模している再生可能な培養環境を提供し、また個々の患者の腫 瘍細胞の測定法を可能にすることであろう。特異的な治療法は、実際の患者の治療が開始 される前に、培養培地のなかにある生検で得られた腫瘍サンプルでその後にテストするこ とができる。このように、治療はテストの応答反応をベースにして各患者に対して個々に テーラーメイドされることが可能である。 【００３１】 器官型腫瘍／正常組織「反転」混合培養培地モデルの重要な１つの特性は、その患者に特 40 異的な腫瘍微環境を近くまで模倣することが可能であることである。免疫療法などの生物 学的治療の何らかの新規な形態の開発には非常に利点があることであろう。免疫療法の目 的は、その患者自身の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞溶 解Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）、あるいはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）をインビトロで用意し、 またその後にこれらの活性化された細胞を、腫瘍を標的とし、また根絶するために、その 患者に戻すことである。現行のインビトロでの培養は、免疫エフェクター細胞の用意を行 う器官型培養ほどは有効ではないと考えられる。免疫エフェクター細胞の活性化の欠如に 対する１つの潜在的な理由は、適切な腫瘍特異的抗原（ＴＳＡｓ）を有効ではなく、およ び／または成功しないような体裁にしてしまうことである。器官型腫瘍／正常組織「反転 」混合培養モデルは、この問題を取り除くことができる。というのは、このモデルは、イ 50 (8) JP 3557172 B2 2004.8.25 ンシトゥでの腫瘍微環境を正確に再構築するからであり、ＴＳＡｓはさらに器官型培養培 地で発現し、またしたがって、免疫エフェクター細胞に対してより高い確率でよりよい機 会が提供されると考えられるからである。 【００３２】 Ｂ．他の諸実施態様 １．適当な上皮組織の修復および／または支持のための生体組織産物における普遍的なド ナー表皮細胞型としての使用法。適用の１つの例は、静脈脚潰瘍であるが、米合衆国では 約百万人が、また全世界では３百万人が罹患している。また、糖尿病性潰瘍や圧迫潰瘍（ 床ずれ）などのほかの潰瘍状態には全世界ではおよそ１千万人が罹っている。ＢＣ−１− Ｅｐ／ＳＬケラチノサイト細胞系統はまた、広範囲の臨床適用、例えば、急性熱傷範囲、 10 皮膚科的外科手術により創傷、ドナー部位創傷（他所で使用されるように皮膚が採取され た後の範囲）に使用することができる。 【００３３】 ２．使用法には、クリーム、ローション、液体、スプレー形態に適用される治療用、美容 医療用、美容用の皮膚用製品の製薬製剤で使用される薬剤の開発とテストが含まれる。細 胞は、こうした剤の毒性、潜在能力、効能をテストするため、ヒトケラチノサイトという 堅実なソースを提供する。細胞はこれらの測定法のための単層培養培地で、あるいは器官 型培養で使用することができる。器官型培養培地は、組織構造、分化、細胞の重複培養と 増殖、障壁機能、組織強度についての剤の効果を開発しまた測定するのに使用することが できる。 20 【００３４】 ３．使用法には、ウイルスに対抗するワクチンを製造することができるように、ヒトパピ ローマウイルスなどの生物学的剤の培養のためのリシピエント細胞が含まれている。その 細胞系統はまた、抗ウイルス薬物や剤を開発し、またテストするのに使用することができ る。６０以上の異なるタイプのヒトパピローマウイルスが、女性の子宮頸部がんや男性の 陰茎がんの発症に緊密な関連性がある性器いぼやウイルス病変を含む、いぼをヒトにおい て作り出している。ヒトパピローマウイルスは、ヒト集団において広範にみられる小さな 二本鎖ＤＮＡウイルスである。それらは完全に上皮親和性のものであり、また、解剖学的 部位の範囲から言うと、皮膚あるいは粘膜皮膚にしか感染しない。ヒトパピローマウイル スは、分化を行っているヒト上皮細胞でのみ複製する。 30 【００３５】 例 １．自然発生的不死化近二倍体ヒトケラチノサイト細胞系統、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬにお ける正常増殖と分化 Ａ．材料と方法 細胞培養 正常ケラチノサイト（ＢＣ−１−Ｅｐ）は、ヒト新生児包皮から分離された。ケラチノサ イト培養培地は、アレン−ホフマン（Ａｌｌｅｎ−ｈｏｆｆｍａｎｎ）とラインバルト（ Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）（１９８４）により説明されているように、マイトマイシンＣ処理 スイスマウス３Ｔ３線維芽細胞の存在下で単一細胞懸濁液の分割量を塗布することにより 40 確立された。標準的ケラチノサイト培養培地は、２．５％仔ウシ血清（ＦＣＳ）、０．４ μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（ＨＣ）、８．４ｎｇ／ｍｌコレラ毒素（ＣＴ）、５μｇ／ ｍｌインスリン（Ｉｎｓ）、２４μｇ／ｍｌアデニン（Ａｄｅ）、１０ｎｇ／ｍｌ上皮増 殖因子（ＥＧＦ）、１００単位ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｐ／ Ｓ）により補足したハム（Ｈａｍ）のＦ１２：ダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥ） 、（３：１、０．６６ｍＭカルシウム）である。この細胞は支持細胞付きの１００ｍｍ 組織培養皿上で３ｘ１０ ５ ２ 細胞で週毎に継代培養された。形質転換細胞、ＢＣ−１−Ｅｐ ／ＳＬ（同時発生的系統）が継代１６で現れた。継代５５でＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞が テストされ、マイコプラズマに関しては陰性であった（ウィスコンシン州衛生研究所（Ｗ ｉｎｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｔａｔｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ）、マ 50 (9) JP 3557172 B2 2004.8.25 ジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）市、ウィスコンシン州）。組換えヒトＥＧＦは、Ｒ＋Ｄシステ ムから得られた。形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−（１）はヒト血小板から精製された。 【００３６】 染色体分析 指数増殖期における細胞は、５０ｎｇ／ｍｌコルセミドにより分裂中期で停止され、その 後にトリプシン処理され、またフラスコから定液量を取り、遠心分離にかけた。培地とト リプシン除去後、その細胞は２０分間低浸透圧の７５ｍＭ ＫＣｌ溶液に懸濁され、３： １メタノール／酢酸で３回固定され、またガラススライドの上に滴下された。スライドは ２週間熟成され、軽くトリプシン処理され、ギムザ法で染色された（シーブライト（Ｓｅ ａｂｒｉｇｈｔ）、１９７１）。各サンプルにおいて、染色体同一性と染色体異常が、写 10 真の分析と、相同染色体のバンド間比較のために少なくとも２つの核型の切断によりよく 拡散したＧバンド分裂中期において測定された。 【００３７】 ＤＮＡフィンガープリント ＤＮＡはキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＱＩＡａｍｐ血液キット（キアゲン社、サンタクラリ タ市（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ）、カリフォルニア州）を使用してケラチノサイトか ら分離された。ＤＮＡフィンガープリント分析には、ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ（フルオレセン トエスティーアールシステム（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＳＴＲ Ｓｙｓｔｅｍ））を製 造業者によって推奨されたプロトコルにより使用した。１２のプライマー対が３つの四重 式（ＣＴＴｖ、ＦＦＦＬ、ＧａｍｍａＳＴＲ）に分割された。各四重式は鋳型としてＤＮ 20 Ａの２５ｎｇを使用して別々の反応で増幅された。増幅はパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋ ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）９７００熱循環器（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ）社、ノーワーク市（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット州）で行われた。ＰＣＲ産物は、 ＢＲＬ配列決定装置（ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、 ゲティスバーグ市（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）の４２ｃｍｘ３３ｃ ｍｘ０．４ｍｍポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけられた。ゲルはその後、日立 （Ｈｉｔａｃｈｉ）ＦＭＢＩＯ ＩＩ蛍光スキャナー上でスキャンされた。 【００３８】 無胸腺症マウスにおけるＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の増殖 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は、腫瘍を形成することができるかどうかを判定するため、ヌ ード無胸腺症マウスに注入された。１００μｌハムのＦ１２のなかに入れた５ｘ１０ ６ 30 細 胞の懸濁液が６匹のヌードマウスの側腹部に皮下的に注入された。陰性対照として、親Ｂ Ｃ−１−Ｅｐ６（細胞が、３ｘ１０ として、ＳＣＣ４細胞が３ｘ１０ ６ ６ 細胞／１００μｌ Ｆ１２で注入された。陽性対照 細胞／１００μｌ Ｆ１２で注入された。マウスの体 重が計られ、また腫瘍は２６日後に測定された。 【００３９】 半固形培地における懸濁 懸濁研究に関しては、前全面生長（プレコンフルエント）培養培地は、培養皿から０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トリプシンにより取り除かれ、いかなる残留トリプシンも不活 性化するために、血清含有培地のなかで洗浄された。短時間遠心分離（３分間４４０ｘｇ 40 ）の後、細胞は、サデクおよびアレン−ホフマン（Ｓａｄｅｋ ａｎｄ Ａｌｌｅｎ−Ｈ ｏｆｆｍａｎｎ）（サデク，シー．エム．とビー．エル．アレン−ホフマン、１９９４） のなかで説明されているように、３部のハムのＦ−１２プラス１部のＤＭＥに１．６８％ メチルセルロース（４，０００センチポアズ、フィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉ ｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、フェアローン（Ｆａｉｒｌａｗｎ）市、ニュージ ャージー州）を加えて作られた半固形に、１ｘ１０ ６ 細胞／ｍｌで再懸濁された。細胞は 無血清培地により繰り返し希釈することにより懸濁液から回収され、また遠心分離にかけ られた（１０分間４４０ｘｇ）。リン酸緩衝生理食塩水（０．１３７ Ｍ ＮａＣｌ；２ ．７ｍＭ ＫＣｌ；８．１ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４ ；１．４ｍＭ ＫＨ２ ＰＯ４ ；ｐＨ７． ２）（ＰＢＳ）による１回の洗浄後、ＣＥ形成に関する測定を行うため、ＰＢＳ（ｐＨ７ 50 (10) JP 3557172 B2 2004.8.25 ．２）において再懸濁されるか、あるいはＤＮＡ断片化を測定するため、ＳＬＳ緩衝液（ ５０ｍＭトリス；１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；０．５％（ｗ／ｖ）ラウロイルサル コシンナトリウム）のなかで洗浄されるかのいずれかが行われた。対照は、３部のハムの Ｆ−１２プラス１部のＤＭＥのなかで同様の回数処理された付着ケラチノサイトから成る 。 【００４０】 ノーザン分析法 細胞は、３Ｔ３支持細胞層上にある標準的ケラチノサイト培養培地で増殖された。この支 持細胞層はＰＢＳのなかで０．０２％ ＥＤＴＡによりＲＮＡ分離の２４時間前に取り除 かれた。ポリＡ ＋ ＲＮＡは、以前に説明されているように（サデクとアレン−ホフマン 、１９９４）、指数的増殖細胞から分離された。ポリＡ ＋ 10 ＲＮＡは、ホルムアルデヒド を含有する１．２％アガロースゲルのなかで電気泳動にかけられ、また、ゼータプローブ 膜（バイオ−ラドラボラトリー社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、リッ チモンド市（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）にエレクトロブロッティングが行 われた。その膜はプレハイブリッド化され、またその後に、供給者により推奨されている とおりに無作為プライマー［ ３ ２ Ｐ］−ｄＣＴＰ−標識化ｃＤＮＡプローブの存在下でハ イブリッド化された。検出用に使用されたｃＤＮＡプローブには、ラットグリセルアルデ ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ｐＧＰＤＮ５（フォート（Ｆｏｒｔ）ら、１９８５ ）、サルＴＧＦ−β１（シャープルズ（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）ら、１９８７）、ＥＧＦ受容 体（ウー（Ｘｕ）ら、１９８４）、マウスケラチン１４（デニス・ループ（Ｄｅｎｎｉｓ 20 Ｒｏｏｐ）氏から贈呈）、ＴＧＦ−α（クドロー（Ｋｕｄｌｏｗ）ら、１９８８）、ヒ トｃ−ｍｙｃの８３０−ｂｐ ５’断片（ミヤモト（Ｍｉｙａｍｏｔｏ）ら、１９８９） が含まれる。 【００４１】 角化エンベロープ（ＣＥ）形成 ケラチノサイトは、培養板から取り除かれ、また前に説明したように懸濁液から回収され た。各処理から得た細胞はカウントされ、また１％ ＳＤＳ ２０ｍＭジチオトレイトー ルを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）における１０ ６ 細胞／ｍｌで再懸濁された。サンプル は水槽で５分間煮沸され、それから室温まで冷却された。ＤＮアーゼ（０．５μｇ／ｍｌ ）が加えられ、またＣＥが血球計を使用してカウントされた。ＣＥ形成は入力細胞のパー 30 センテージとして計算された。 【００４２】 ヌクレオソームＤＮＡ断片化の分析 ＤＮＡは分離され、また前に説明したように標識化された（サシュセンマイヤー（Ｓａｃ ｈｓｅｎｍｅｉｅｒ）とアレン−ホフマン、１９９６）。手短に言うと、２．５ｘ１０ ６ 細胞が５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０と０．５％（ｗ／ｖ）ラウロイ ルサルコシンナトリウム５００μｌのなかで洗浄された。溶解産物は、フェノール：クロ ロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ：ｖ：ｖ）で抽出され、またエタ ノール沈降が行われた。ＤＮＡは２０μｌ ＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０のなかで分解され、 また２６０ｎｍで吸光することにより定量化された。完全なものと断片化されたＤＮＡは 40 、ティリー（Ｔｉｌｌｙ）とフーシェ（Ｈｓｕｅｈ）（１９９３）により説明されている 、末端ジデオキシヌクレオチドエキソトランスフェラーゼを使用して［α ３ ２ Ｐ］−ｄｄ ＡＴＰにより３’末端標識化された。各標識化サンプルの半分が１．５％アガロースゲル 上に充填され、また電気泳動される。ゲルはＳＥ １２００ Ｅａｓｙ Ｂｒｅｅｚｅ（ ホッファサイエンティフィック（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、サンフラン シスコ市、カリフォルニア州）を使用して熱により乾燥され、またコダックバイオマック ス（Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘ）ＭＲフィルムに露光された。 【００４３】 器官型培養培地の形成 器官型培養培地は以前に説明されているように増殖された（エヌ．パレントー（Ｎ．Ｐａ 50 (11) JP 3557172 B2 2004.8.25 ｒｅｎｔｅａｕ）、１９９４）。コラーゲンラフトは、正常ヒト新生児線維芽細胞ＣＩ− １−Ｆを、１０％ＦＣＳ＋Ｆ１２＋ペニシリン／ストレプトマイシンのなかに入れたＩ型 コラーゲンと混合することにより形成された。ラフトは５日間収縮するに任せた。親細胞 、ＢＣ−１−Ｅｐ（５°）とＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ（３８°）細胞は、１．８８ｍＭカル シウムを含有する５０μｌ ２％ ＦＣＳ＋３Ｆ１２：１ＤＭＥ＋ＨＣ＋Ａｄｅ＋Ｉｎｓ ＋ＣＴ＋Ｐ／Ｓのなかの３．５ｘ１０ ５ 細胞でラフト上に塗布された。細胞は追加して１ ３ｍｌの培地（０日目）を加える前に２時間結合するのに任せた。１日目と２日目に、細 胞は再供給された。４日目には、細胞は綿パッド付きの空気インターフェイスまで持ち上 げられ、角化培地（１．８８ｍＭカルシウムを含有する２％ ＦＣＳ＋３Ｆ１２：１ＤＭ Ｅ＋ＨＣ＋Ａｄｅ＋Ｉｎｓ＋ＣＴ＋Ｐ／Ｓ）に切り換えられた。細胞は３日毎に角化培地 10 を供給された。１５日目には、ラフトは、０．１ Ｍ カコジル酸塩緩衝液のなかに入れ た３％グルタルアルデヒドと１％パラホルムアルデヒド（室温でｐＨ７．４、３時間）で 新鮮に作成された変法のカルノフスキー（Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ）固定液により固定された 。その培養培地を取り除く前に、固定液が角化層が流出するのを防ぐためにラフトの一番 上にある細胞にやさしく加えられた。引き続いて、培養培地は吸引され、また培養培地の 穴は固定液で満たされた。ラフトは半分に切断され、半分は光学顕微鏡用に処理され、ま たもう半分は電子顕微鏡用に処理された。 【００４４】 組織切片 固定されたラフトは、ウィスコンシン州マジソン市にある大学病院の外科病理学教室でパ 20 ラフィンのなかに包埋されて切片化され、またヘマトキシリンと、エオジンにより染色さ れた。染色された切片は検討され、また３５ｍｍカメラを装備しているオリンパス（Ｏｌ ｙｍｐｕｓ）ＩＸ−７０顕微鏡を使用して写真を撮影された。 【００４５】 電子顕微鏡 固定培養培地は０．１ Ｍカコジレート緩衝液、ｐＨ７．４により３回洗浄された。解剖 顕微鏡下で、小刀が、プラスチック挿入からラフト培養培地を支えているポリエステルメ ッシュを切り離すのに使用された。ラフトは小刀でおよそ２ｍｍｘ４ｍｍの小片に切断さ れ、緩衝液のなかに一夜保存された。４℃にて１％四酸化オスミウムにより再固定後、ケ ラチノサイトは、２％水性酢酸ウラニルにより１時間一体染色される前に、０．１ Ｍマ 30 レイン酸、ｐＨ６．５で各１５分間４回洗浄された。蒸留水で洗浄後、ケラチノサイトは エタノール濃度を増加させて、１００％プロピレンオキシドで脱水し、１：１プロピレン オキシド：エポネートで一夜浸透させた。ラフトは、ダイアモンドナイフを装備したライ シャートＥ３超薄切片作製器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｅ３ ｕｌｔｒａ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）上で直角に切断することができるように、新鮮なエポネートの平ら な包埋型のなかに包埋され、また方向が揃えられた。薄切片はクエン酸鉛により染色され 、また７５ｋＶで運転される日立Ｈ−７０００電子顕微鏡（日立、サンホセ市（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）、カリフォルニア州）で調べられた。 【００４６】 トランスフェクション細胞培養 40 トランスフェクションの実験に関しては、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞が、１００ｍｍ皿に マイトマイシンＣ処理されたスイスマウス３Ｔ３線維芽細胞上に３ｘ１０ ５ 細胞の密度で 塗布された。細胞は付着するのに４８時間が与えられ、その度に３Ｔ３層が０．５ｍＭ ＥＤＴＡにより取り除かれた。細胞はＤＭＥにより２回洗浄され、また血清含有培地が加 えられた。細胞は２４時間後にトランスフェクションされた。 【００４７】 プラスミドＤＮＡ プラスミドＤＮＡはエンドトキシン遊離マキシプレップキット（Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉ ｔ）（キアゲン社）により作製された。ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎがＸｍｎＩを使用し て線形化された。ｐｃＤＮＡ３ ｎｅｏとｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０（インビトロゲン（ 50 (12) JP 3557172 B2 2004.8.25 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）がＢｇｌＩＩ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）を使用して 線形化された。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現は、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒ ｎとｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０プラスミドの両方で構成的に活性であるＣＭＶプロモータ ーにより推進される。 【００４８】 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞のトランスフェクションのための最適条件の決定 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞継代３０°∼４０°がポリカチオン性脂質ＧｅｎｅＦＥＣＴＯ Ｒ（ベンノバ（ＶｅｎｎＮｏｖａ）社）を使用してトランスフェクションされた。トラン スフェクション混合物は、各１００ｍｍ皿に５００μｌ無菌逆浸透水に２０∼３３μｇ線 形化プラスミドＤＮＡを加えることにより作製される。ＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲの異なる量 10 が、１：２から１：４まで変化するＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲに対する総量ＤＮＡの割合によ り加えられる。トランスフェクション混合物はやさしく渦巻き状に攪拌し、また室温にて １５分間インキュベートされた。培地はＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞から取り除かれ、プレ ートはＤＭＥで２回洗浄され、またＤＭＥの５ｍｌが再供給された。トランスフェクショ ン混合物は滴下様に各プレートに加えられ、また細胞は５％ ＣＯ２ 下で３７℃で５時間 インキュベートされた。その培地は取り除かれ、また細胞はＤＭＥで２回洗浄され、また 血清含有培地により再供給された。細胞は、トランスフェクション後２４時間で、分析前 にトランスフェクションが成功裡に行われたことを検査するために、ＩＸ−７０反転蛍光 顕微鏡（オリンパス社）あるいは蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により検討された。 【００４９】 20 最適一過性トランスフェクション効率 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞継代３０°∼４０°がポリカチオン性脂質ＧｅｎｅＦＥＣＴＯ Ｒ（ベンノバ社）を使用してトランスフェクションされた。トランスフェクション混合物 は、細胞の各１００ｍｍプレートに５００μｌ無菌逆浸透水に１５μｇの線形化ｐＧｒｅ ｅｎＬａｎｔｅｒｎと５μｇのｐｃＤＮＡ３ｎｅｏ（２０μｇ総量ＤＮＡ）を加えること により作製される。ＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲがその後に、総量ＤＮＡの３倍（ＤＮＡのＧｅ ｎｅＦＥＣＴＯＲに対する比率が１：３）加えられる。トランスフェクション混合物はや さしく渦巻き状に攪拌し、また室温にて１５分間インキュベートされた。培地はＢＣ−１ −Ｅｐ／ＳＬ細胞から取り除かれ、プレートはＤＭＥで２回洗浄され、またＤＭＥの５ｍ ｌが再供給された。トランスフェクション混合物は滴下様に各プレートに加えられ、また 30 細胞は５％ ＣＯ２ 下で３７℃で５時間インキュベートされた。その培地は取り除かれ、 また細胞はＤＭＥで２回洗浄され、またケラチノサイト培地により再供給された。細胞は 前述にように検討された。 【００５０】 フローサイトメトリー トランスフェクション後２４時間で、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は培養培地から０．５ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、０．１％トリプシンにより取り除かれた。短時間の遠心分離（５分間４４ ０ｘｇ）の後、細胞は、２ｘ１０ ６ 細胞／ｍｌで血清含有培地に再懸濁された。この細胞 懸濁液の５００μｌが４２μｍメッシュ（テトコ（Ｔｅｔｋｏ）社）により濾過され、ま た分析の直前に５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により染色された。トランスフ 40 ェクションされたＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は、４８８ｎｍに調整されたレーザーを装備 したＦＡＣＳｃａｎあるいはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒベンチトップフローサイトメータ（ ともにベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）社製）かのいずれ かで分析された。一万件のイベントが得られ、またＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ベ クトンディッキンソン社）を使用して分析され、また分析は、ＰＩ染色をベースにして生 存イベントのみに限定された。細胞生存率と一過性トランスフェクション効率データが得 られた。 【００５１】 細胞分取 われわれは、安定したＧＦＰ発現ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞を得るために、以下のプロト 50 (13) JP 3557172 B2 2004.8.25 コルを使用した。トランスフェクション後２４時間で、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は培養 培地から０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トリプシンにより取り除かれた。短時間の遠心 分離（５分間４４０ｘｇ）の後、細胞は、血清含有培地に５∼７ｘ１０ ６ 細胞／ｍｌの密 度で再懸濁された。この懸濁液はその後に、４２μｍ無菌メッシュ（テトコ社）により濾 過された。分析の直前に細胞は５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムにより染色された。トラ ンスフェクションされたＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は、４８８ｎｍに調整された干渉性ア ルゴンレーザーを装備したＦＡＣＳｔａｒ（ベクトンディッキンソン社）上で分取された 。トランスフェクション効率データはＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ベクトンディッ キンソン社）により得られた。細胞は２０００／秒の割合で分取され、またサンプルは分 取後、生存率とＧＦＰ発現を検査するために回収された。 10 【００５２】 コロニー形成効率 コロニー形成効率（ＣＦＥ）は１０００件のイベントをマイトマイシンＣ処理スイスマウ ス３Ｔ３線維芽細胞の存在下で二重６０ｍｍプレート上に塗布することにより得られた。 １週間後、１０％ホルマリンのなかで１０分間固定され、水道水で洗浄され、またメチレ ンブルーで一夜染色された。コロニーはカウントされ、また、最終的なＣＦＥを得るため に塗布されたイベントの数に分けられた。計算されたＣＦＥに基づいて、形成されたコロ ニーの総数が、イベントの数にＣＦＥを乗算することにより得られた。ＧＦＰ発現コロニ ーは、ＧＦＰ短帯域パスフィルターを備えたＩＸ−７０反転蛍光顕微鏡を使用して分取後 １０∼１２日でカウントされた。ＧＦＰ発現コロニーの数は、安定したＧＦＰ発現コロニ 20 ー形成効率を得るために、形成されたコロニーの総数により除算された。 【００５３】 安定ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎトランスフェクションされたＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞 の分離と同定 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は、前述のように、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎによりトラン スフェクションされ、また蛍光に基づいて分取された。細胞分取直後に、ＧＦＰ陽性 Ｂ Ｃ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は培養培地に再度加えられた。細胞は１００ｍｍ皿当たり２∼３ ｘ１０ ４ 細胞という低い密度でマイトマイシンＣ処理スイスマウス３Ｔ３線維芽細胞上に 塗布された。細胞は隔日に、ＧＦＰ短帯域パスフィルターを備えたＩＸ−７０反転蛍光顕 微鏡（オリンパス）を使用してモニターされた。非ＧＦＰ発現コロニーが削り取られて取 30 り除かれ、また安定したＧＦＰ発現コロニーは拡張するのに任せた。ＧＦＰ発現コロニー が１０００細胞あるいはそれ以上の推定密度にまで増殖されたときに、リングクローニン グにより分離され、またリングマイトマイシンＣ処理３Ｔ３の６０ｍｍプレート上に塗布 され、拡張された。 【００５４】 安定ｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０トランスフェクションされたＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の 分離と同定 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞はｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０の２０μｇを使用してトランスフ ェクションされ、またＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲ（ベンノバ社）に対してＤＮＡの比率が１： ４であった。トランスフェクション後２４時間で、細胞は０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ ％トリプシンにより取り除かれ、細胞は、血清含有培地に２ｘ１０ 再懸濁された。３ｘ１０ ６ ６ 40 細胞／ｍｌの密度で 細胞が、マイトマイシンＣ処理スイスマウス３Ｔ３線維芽細胞 を加えた２つの１００ｍｍプレート上に再塗布された。継代培養後４８時間で、ＧＦＰ陽 性細胞が５日間、２５０μｇ／ｍｌゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）（インビトロゲン社）によ り選択された。安定ＧＦＰ発現ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は無菌細胞分取器を使用して精 製され、また前述のように拡張された。 【００５５】 トランスフェクションされた器官型培養培地の組織学的分析 継代４３（でＧＦＰ発現ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は３ｘ１０ ５ 細胞／コラーゲンラフト の密度で塗布され、１６日間器官型培養培地で増殖された。ラフト培養培地はパラフィン 50 (14) JP 3557172 B2 2004.8.25 に包埋される前に４％パラホルムアルデヒドで少なくとも１時間で固定された。ウィンス コンシン大学マジソン校（ＵＷ−Ｍａｄｉｓｏｎ）の外科病理学教室（Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）で５μｍ切片が切断され、代わりの切片がヘマトキシリンとエオ ジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された。非Ｈ＆Ｅ切片は再び脱水され、１５分間、５μｇ／ｍ ｌヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染料（３３２５８）により染色され、Ｃｙｔｏｓｅａｌ取 付け培地（ステファンズサイエンティフィック社（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃ））を使用して脱水し、取付けられた。切片は二重ＦＩＴＣ−ヘキストフィルタを装 備したＩＸ−７０反転蛍光顕微鏡（オリンパス）を使用して検討され、また写真が撮影さ れた。 【００５６】 10 共焦点顕微鏡によるＧＦＰ発現の分析 継代４３°でＧＦＰ発現ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は３ｘ１０ ５ 細胞／コラーゲンラフト の密度で塗布され、１６日間器官型培養培地で増殖された。ラフト培養培地は４％パラホ ルムアルデヒド−ＰＢＳで一夜で固定され、また４℃にて０．１ Ｍグリシン−ＰＢＳ溶 液のなかで１時間洗浄された。ラフト全体が取付けられ、ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓ ｈｉｅｌｄ）取付け培地（ベクターラボ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）社）を使用してカバ ーガラス培養され、ゴムセメントにより密封された。ＧＦＰ発現は４８８ｎｍで励起し、 また５００∼５３０ｎｍ帯域パスフィルタで検出する共焦点レーザースキャニング顕微鏡 （ニコンダイアフォト２００（Ｎｉｃｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００））を使用して分析 された。画像は上部の角化層で開始して１０μｍ間隔で撮られた。顕微鏡は、ウィンスコ 20 ンシン大学マジソン校のダブリュー．エム．ケック（Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ）神経画像研究所 に所在している。 【００５７】 Ｂ．結果 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統の分離 細胞はトリプシン処理により新生児包皮から分離された。ケラチノサイトは、０．６６ｍ Ｍカルシウムを含有する標準的なケラチノサイト増殖培地において、マイトマイシンＣ処 理スイスマウス３Ｔ３支持細胞層上にその細胞の懸濁液の分割量を塗布することにより培 養が開始された。線維芽細胞は、１０％仔ウシ血清により補われているハムのＦ−１２培 地を含有する組織培養プレート上の細胞懸濁液の分割量を塗布することにより培養が開始 30 された。 【００５８】 およそ９日後、ケラチノサイトを示す株ＢＣ−１−Ｅｐの初代培養培地は凍結保存され、 支持細胞層上で継代培養された。線維芽細胞培養培地は全面生長近くまで増殖され、また 凍結保存された。初期継代では、ＢＣ−１−Ｅｐ細胞は培養された正常ヒトケラチノサイ トには非定型である形態学的あるいは増殖の特性は何も示さなかった。培養されたＢＣ− １−Ｅｐ細胞は、プログラムされている細胞死の特徴だけではなく、層化も示した。 【００５９】 重複培養されたものの寿命を測定するため、ＢＣ−１−Ｅｐ細胞は１００ｍｍ皿当たり３ ｘ１０ ５ 細胞の密度で標準的なケラチノサイト増殖培地で老化期にまで連続して継代培養 40 された。継代１５までに、集団のなかのほとんどのケラチノサイトは、大きくて、扁平な 細胞をみせる無数の不稔性コロニーの存在によって判断されるように老化をみせていた。 【００６０】 しかし、継代１６で、小さな細胞のサイズをみせるケラチノサイトが明らかになった。継 代１７までに、小さなサイズのケラチノサイトが、培養培地に存在し、また大きくはない 老化ケラチノサイトが明らかになった。危機を生き延びた小さなケラチノサイトの結果的 に生じた集団は、形態学的には均一であるようにみえ、また細胞間付着や明らかな鱗屑産 生を含めた定型のケラチノサイト特性を示すケラチノサイトのコロニーを作り出していた 。 【００６１】 50 (15) JP 3557172 B2 2004.8.25 老化現象を生き延びたケラチノサイトは、１００ｍｍ皿当たり３ｘ１０ ５ の密度で５９継 代の間、連続して継代培養され、その細胞が不死に到達したことを示した。元々の老化集 団から出現したケラチノサイトは、ＢＣ−１−Ｅｐ／自然発生的系統（ＢＣ−１−Ｅｐ／ ＳＬ）と呼ばれる。 【００６２】 細胞発生学的分析とＤＮＡフィンガープリント 染色体分析が、継代３の親ＢＣ−１−Ｅｐ細胞と継代３１と５４のＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ 細胞について行われた。親ＢＣ−１−Ｅｐ細胞は第４６ＸＹの正常染色体組を有している 。継代３１では、すべてのＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞が第８染色体の長いアームの同位染 色体外因子が原因となって第４７染色体を含んでいた（図１）。ほかの全体的な染色体異 10 常あるいはマーカー染色体は検出されなかった。継代５４では、細胞には第８同位染色体 が含まれていたが、しかし、第１染色体の長いアームの付加的な同位染色体と、マーカー 染色体は、集団の小分画に存在していた（付録１の表１）。ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は プロウイルスＨＩＶ ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングが行われ、また陰性であ ることが見出された。ＨＩＶプロウイルスの領域は酵素的に増幅され、放射能標識ＨＩＶ −１特異的ＤＮＡプローブにハイブリッド化され、また増幅されたＤＮＡはサイズにより 分けられ、またアガロースゲル電気泳動法とオートラジオグラフィを使用して視覚化され た。ポリメラーゼチェン反応産物はサイズまた公知のＨＩＶ−１陽性および陰性対照に対 する特異性により比較された。ＨＰＶ１６と３１ウイルス配列の存在はサザン分析により 評価され、１つも検出されなかった。 20 【００６３】 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統とＢＣ−１−Ｅｐケラチノサイトに関するＤＮＡフィンガ ープリントはすべて１２の遺伝子座で同一である。無作為確率により親ＢＣ−１−Ｅｐ ＤＮＡフィンガープリントを有するＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統の確率は４ｘ１０ ６ − １ である。ＥＤ−１−Ｅｐ、ＳＣＣ４、ＳＣＣ１３ｙに対するＤＮＡフィンガープリント はＢＣ−１−Ｅｐパターンとは異なる。われわれのＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統のＤＮ Ａフィンガープリント分析から得られるデータでは、それは親ＢＣ−１−Ｅｐ細胞に起因 していることが証明されている。このデータはまた、ほかのヒトから分離されたケラチノ サイト、ＥＤ−１−Ｅｐ、ＳＣＣ４、ＳＣＣ１３ｙは、ＢＣ−１−Ｅｐ細胞あるいはほか のそれぞれとは関連がないことを示している。ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬのＤＮＡフィンガー 30 プリントデータからは、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統を同定する明白な方法が提示され る。 【００６４】 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトは無胸腺症ヌードマウスでは腫瘍形成性のものでは ない 親ＢＣ−１−Ｅｐケラチノサイトと不死ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイト細胞系統の 腫瘍形成性を判定するために、細胞が無胸腺症ヌードマウスの側腹部に注入された。ヒト 扁平細胞がん細胞系統、ＳＣＣ４が、ヌードマウスにおける腫瘍産生に関する陽性対照と して使用された。各動物が一方の側腹部にＳＣＣ４の注入を受け、また反対側の側腹部で 親ＢＣ−１−ＥｐケラチノサイトあるいはＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞かのいずれかを受け 40 るように、サンプルの注入は計画された。この注入計画により、腫瘍産生における動物間 でのバラツキが取り除かれ、またマウスが腫瘍形成細胞の激しい増殖を支えることが確か められた。親ＢＣ−１−Ｅｐケラチノサイト（継代６）もＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞（継 代３５）もヌードマウスでは腫瘍を産生することはなかった。腫瘍形成性テストの結果は 付録１の表２に示す。 【００６５】 インビトロでの増殖特性 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトは非腫瘍形成性であり、また、マイトマイシンＣ処 理３Ｔ３支持細胞の存在下では標準的ケラチノサイト増殖培地での培養時に正常ヒトケラ チノサイトの形態学的特性を示す。ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の増殖特性をさらに評価す 50 (16) JP 3557172 B2 2004.8.25 るために、われわれはケラチノサイト増殖の公知の自律分泌調節因子の安定状態ｍＲＮＡ 値を調べた。ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統から得られるｍＲＮＡのノーザン法による分 析では、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）とｃ−ｍｙｃの値だけではなく、形質転換増殖 因子α（ＴＧＦ−α）と形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）などの自律分泌増殖因子の発 現が、同一ではないとしても、親ＢＣ−１−Ｅｐケラチノサイトとほぼ同じであることが 明らかになった。 【００６６】 われわれは次に、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の最適な増殖には、標準的なケラチノサイト 増殖培地のどちらの構成要素が必要とされるのかを判定した。上皮増殖因子（ＥＧＦ）が ない場合の継代培養は、ＥＧＦ含有対照培養培地に比較して、各継代での細胞数において 10 ６０∼９０％という結果を生じた（図１）。ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の増殖に関してＥ ＧＦへの依存は、１つの安定した特性と成っているようにみえる。継代５０でのＢＣ−１ −Ｅｐ／ＳＬ細胞は、最適増殖に関してＥＧＦへの依存を継続して示している。 【００６７】 上皮恒常性維持において重要な役割を演じているもう１つのポリペプチド増殖因子は、形 質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）である。インビトロでは、ＴＧＦ−β１は培養され た正常ヒトケラチノサイトの阻害剤の１つである（ピエンテンポール（Ｐｉｅｎｔｅｎｐ ｏｌ）ら、１９９０）が、しかし、ケラチノサイトの悪性形質転換からしばしばＴＧＦ− β１誘発増殖阻害の減衰が結果的に生じる（バスコム（Ｂａｓｃｏｍ）ら、１９８９；パ ーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）ら、１９８３；ピエンテンポールら、１９９０；ライ 20 ス（Ｒｉｃｅ）ら、１９９２）。正常親ＢＣ−１−Ｅｐケラチノサイトのように、ＴＧＦ −β１は、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統の増殖を阻害する（図３）。ＴＧＦ−β１誘発 増殖阻害は、親とＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトの両方で可逆的なものである。 【００６８】 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトのインビトロでの最適増殖に関して必要条件をさら に特徴付けるために、培養培地が２．５％仔ウシ血清、ＥＧＦ、標準的な増殖培地の個々 の構成要素により補われる培地のなかで培養された。図４は、インスリンのみの追加が細 胞数において１５倍の増加を促進していることを示している。しかし、標準的なケラチノ サイト増殖培地のすべての構成要素を追加した場合には、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞数で ３０倍の増加を促進している。これらの発見からは、インビトロでの増殖に関する細胞型 30 特異的な必要条件をＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統が保持していたことが示されている。 【００６９】 インビトロでの分化特性 われわれは次に、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞が、表面培養と器官型培養の両方で正常な分 化を行うことができるのかどうかを研究調査した。われわれは、扁平分化、角化エンベロ ープ（ＣＥ）の形成のマーカーをモニターした。培養されたヒトケラチノサイトでは、Ｃ Ｅ集合体の初期段階は、被膜シスタチン−ａと他のタンパク質から成る未成熟角化エンベ ロープの形成という結果を生じるが、それが成熟角化エンベロープのもっとも内側の第３ のものを代表している。われわれは、親細胞とＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトにお けるＣＥ形成を調べた（付録の表３）。付着細胞あるいはＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統 40 のいずれかからケラチノサイトの２％未満がＣＥを産生する。この発見は、活発に増殖す る、全面成長までは到っていない集密度のケラチノサイトは、５パーセント未満のＣＥし か産生しないことを示すわれわれの以前の研究と一致している（ハインズ（Ｈｉｎｅｓ） とアレン−ホフマン）。分化するよう誘発されるときに、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞がＣ Ｅを産生することができるのかどうかを判定するために、細胞が表面培養培地から取り除 かれ、メチルセルロースにより半固形に作製された培地のなかに２４時間の間減濁液に置 かれる。ケラチンの分化発現（ドロズドフ（Ｄｒｏｚｄｏｆｆ）とプレジャー（Ｐｌｅｄ ｇｅｒ）、１９９３）とＣＥ形成（グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、１９７７）を含む末端分化 の多くの態様は、ケラチノサイト細胞間および細胞−下層付着の喪失により、インビトロ で引き金を引かれる。われわれは、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトが、多くのＣＥ 50 (17) JP 3557172 B2 2004.8.25 を、親ケラチノサイトよりも通常多くのＣＥを産生したことを見出した（付録１の表３） 。これらの発見からは、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトが、この細胞型特異的分化 構造を作製する能力においては欠陥はないことが示されている。 【００７０】 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞には付着の喪失後にアポトーシスが起こる。 われわれは次にＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトが、アポトーシスを受けるかどうか を、ＤＮＡのヌクレオソーム切断を測定することにより判定した。オリゴヌクレオソーム 断片への特異的ＤＮＡ切断はアポトーシスの１つの特徴である（アーレンズ（Ａｒｅｎｄ ｓ）ら、１９９０；ウィリー（Ｗｙｌｌｉｅ）、１９８０）。今日までに研究されたすべ ての種のケラチノサイトは、インビボとインビトロの両方でアポトーシスを受けることが 10 できる。表皮ケラチノサイトは、その分化経路の一部として、脱核し、また代謝活性を喪 失するように運命付けられている。多くの対応するものが、ケラチノサイト末端分化とア ポトーシスの間に存在している。われわれは、懸濁後にヌクレオソーム切断を受ける親と ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトの能力を評価した。正常培養ヒトケラチノサイトは 、半固形培地における懸濁により細胞間と細胞−下層接触が奪われるときに、アポトーシ スの形態学的および生物化学的特徴の両方を示す。２４時間の間無血清、付加物無しの培 地で増殖された親あるいはＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統から得られる付着、前全面生長 （プレコンフルエンス）ケラチノサイトは、検出可能なＤＮＡ断片はみせなかった。同様 に、同一時間の間、半固形、無血清、付加無しの培地により処理された付着細胞は、ヌク レオソーム断片化は示さなかった。半固形培地で懸濁されるとき、親とＢＣ−１−Ｅｐ／ 20 ＳＬケラチノサイトの両方ともＤＮＡ断片化を示した。これらの発見は、付着の喪失によ り分化が誘発された正常ヒトケラチノサイトはそのＤＮＡを断片化することを示す、われ われの研究所から得られた以前の研究と一致する（ハインズとアレン−ホフマン、１９９ ６ａ，ｂ；サシュセンマイヤーら、１９９６）。まとめると、これらのデータからは、Ｂ Ｃ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトは、分化することができ、また細胞型特異的シグナル に正常に応答し、アポトーシスを受けることが示されている。 【００７１】 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の器官型培養は正常扁平分化を示す ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトが正常な扁平分化を受けることができることを確か めるために、その細胞を器官型培養培地で培養した。培地下にプラスチック下層上で培養 30 されたケラチノサイトの分化は、増殖と制限された分化を促進する。とくにヒトケラチノ サイトは全面生長となり、重層上皮に似ている複数層シートに層化させ、それらを産生す る。しかし、光学および電子顕微鏡により、組織培養において形成された複数層シートの 構造と完全なヒトの皮膚の間には驚くべき相違があることが分かった。器官型培養はイン ビボ様条件下でケラチノサイトを培養する技術である。すなわち、正常機能の下層、真皮 線維芽細胞に埋め込まれている原線維性コラーゲンに付着している細胞は、その細胞が空 気に曝されている上部シートおよびコラーゲンゲルによる拡散によってもたらされる栄養 の勾配にもっとも近い、増殖している基底細胞とともに増殖することができる。これらの 条件下で、正確な組織構造が形成される。 【００７２】 40 われわれは、器官型培養培地で増殖する親細胞ＢＣ−１−Ｅｐ ５°とその細胞系統ＢＣ −１−Ｅｐ／ＳＬ ３８°の両方を比較した。正常分化表皮のいくつかの特性が明らかに なった。親細胞とＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統の両方において、立方体様基底細胞の単 層が、表皮と真皮等価物の接合点に位置を占めている。円形の形態と細胞質に対する高い 核の比率がケラチノサイトの活発な分裂増殖を示す。正常ヒト表皮においては、基底細胞 が分裂すると、組織の分化している層のなかに上方に向かって移動するよう娘細胞をその 基底細胞が誘発する。その娘細胞はサイズにおいて増大し、また平坦および扁平になる。 最終的には、これらの細胞は脱核し、また角化、ケラチン化した構造を形成する。この正 常分化のプロセスは、ＢＣ−１−Ｅｐ親細胞とＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の両方の上部細 胞において明らかである。平坦化した扁平細胞の外見は、基底細胞の上に位置するケラチ 50 (18) JP 3557172 B2 2004.8.25 ノサイトの上部層において明らかであり、また、層化が起こったことを示している。その 組織の一番上の部分（ＡとＢ）には、脱核した鱗屑が培養培地の一番上から剥がれている のが示されている。今日まで、われわれは、器官型培養培地で増殖する親ＢＣ−１−Ｅｐ ケラチノサイトとＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイト細胞系統の間の分化における何ら かの組織学的相違を、光学顕微鏡下のレベルでは観察したことがなかった。 【００７３】 われわれの組織学的観察を確かめるため、ＢＣ−１−Ｅｐ ６°とＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ ３８°を電子顕微鏡を使用して分析した。より高い倍率により、われわれはラフト培養 培地における正常分化のさらに詳細な特徴のある構造を観察することができた。顕微鏡写 真を調べることにより、われわれは、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞が器官型培養培地では正 10 常な層化を蒙ることが納得できた。これは、親ＢＣ−１−Ｅｐ細胞にみられたこととほぼ 同じであった（データは図示せず）。われわれはまた、基底層にある半接着斑の形成に気 づいた。これは、またその細胞系統が正常ヒト表皮にみられる構造を形成することができ ることを示唆している。半接着斑は、基底層へのケラチノサイトの接着を増加させ、また 一体化とその組織の強度を維持するのを助ける特殊化した構造のものである。光学顕微鏡 のレベルおよび電子顕微鏡のデータは、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統が器官型培養培地 では正常に層化し、また分化することができることを示している。 【００７４】 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統の最適一過性トランスフェクション効率 われわれは、トランスフェクションのマーカーとして、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ 20 ）に関する遺伝子を含んでいるプラスミド、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎを使用する選択 を行った。ＧＦＰは天然で蛍光を発する、紫外線に曝すと容易にみられるクラゲを形作る 非毒性タンパク質である。さらに、いくつかの実験には、Ｇ４１８の存在下で細胞の増殖 を可能にするネオマイシン抵抗性に関する遺伝子を含んでいる、もう１つのプラスミドで あるｐｃＤＮＡ３ｎｅｏとのｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎとのコ−トランスフェクション が含まれる。しかし、選択方法としてのＧ４１８の使用は、ケラチノサイトに対してきわ めて毒性がある可能性があり、また、陽性にトランスフェクションされた細胞をうっかり して殺傷してしまうことがある。われわれは、ＧＦＰ発現をベースにして無菌的に細胞を 分取することは、陽性トランスフェクタントを選択する近道を提供し、また現在入手が可 能なもっとも毒性が少ない選択方法であると考えている。 30 【００７５】 このシステムにおけるトランスフェクションの最適化を考慮するためのパラメータが多く あった。われわれは、最大のトランスフェクション効率を得るためにこれらを３つのもっ とも重要不可欠なものに絞り込んだ。これらのパラメータには、細胞集密度、ＤＮＡの総 量（濃度）、トランスフェクション試薬に対するＤＮＡの比率（ＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲ） が含まれる。トランスフェクションは、設定されたパラメータを使用して完了し、また細 胞は次の日に、ＧＦＰ発現の存在に関して反転蛍光顕微鏡により分析される。さらに、フ ローサイトメトリーが生存率とＧＦＰ陽性細胞についての情報を得るために使用される。 【００７６】 細胞集密度は、最大トランスフェクション効率を得るには非常に重要なものであるように 40 みえる。さまざまなレベルの集密度でＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は、２０∼２５μｇのＤ ＮＡの範囲でトランスフェクションされ、その後フローサイトメトリーで２４時間分析さ れた。いくつかの実験から得た一過性トランスフェクション効率では、５∼７ｘ１０ ５ 細胞／ １００ｍｍ皿という低い集密度が（∼３０％集密度）が１０∼１９．５％の範囲 のもっとも高いトランスフェクション効率を生むことを示唆している。２∼４ｘ１０ ６ 細 胞／１００ｍｍ皿（∼７０％集密度）という高い集密度で完了したトランスフェクション は１∼３％という非常に低い一過性トランスフェクション効率を生んだ（図５）。 【００７７】 最適ＤＮＡ密度はまた、２０∼３３μｇの範囲のｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎとｐｃＤＮ Ａ３ｎｅｏの総量を使用してテストが行われた。ほかのすべてのパラメータは定常に保た 50 (19) JP 3557172 B2 2004.8.25 れた。われわれは、総量ＤＮＡの値が高ければ高いほど一過性トランスフェクション効率 が良くなるのではないことを発見した。われわれのデータからは、２０μｇのＤＮＡ総量 はＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞のトランスフェクションには最適であり、３．７９∼１３． ６４％という範囲のトランスフェクション効率を結果的に生むことが示唆されている（付 録１の表４）（細胞集密度は実験間のトランスフェクション効率におけるバラツキを説明 するためにこの表のなかに含められている）。われわれは、ＤＮＡの量がさらに大きくな ると、それが細胞に対する毒性を増大させる原因になることを観察した（フローサイトメ トリー、データは図示せず）。 【００７８】 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞のトランスフェクションを最適化する際の第３のパラメータは 10 、トランスフェクション試薬に対するＤＮＡの比率であった。ＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲに対 するＤＮＡのいくつかの異なる比率（それには１：２、１：３、１：４が含まれる）が研 究調査された。三重の実験から回収された一過性トランスフェクション効率は、３部のＧ ｅｎｅＦＥＣＴＯＲに対して１部のＤＮＡの比率（１：３）が、１０∼１９．５％の範囲 のトランスフェクション効率を伴い、最適であることが示されている（付録１の表５）（ 細胞集密度は実験間のトランスフェクション効率におけるバラツキを説明するために含め られている）。われわれは、３０％（５∼７ｘ１０ ５ 細胞／ １００ｍｍ皿）という細胞 集密度、２０μｇのＤＮＡ総量、ＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲに対するＤＮＡの比率１：３が、 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統における最適な一過性トランスフェクション効率のための 条件であると結論付けた。 20 【００７９】 安定ＧＦＰトランスフェクションＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の同定と分離 一過性トランスフェクション効率に関する最適化条件を使用して、われわれは成功裡に、 安定ＧＦＰ発現ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞を分離し、また得た。安定発現はホスト細胞の 染色体のなかにＧＦＰ遺伝子を組み込むことにより定義される。一過性にトランスフェク ションされたＧＦＰ陽性細胞の初期の観察からは、もっとも高いＧＦＰ発現を有し、もっ とも輝度の高い細胞は、表面培養倍値に再塗布するときに、あまりに分化しすぎているた めにコロニー形成能力を維持することができないのではないかという問題があった。これ をテストするために、細胞がトランスフェクションされ、また、もっとも輝度が低いもの からもっとも輝度の高いものまでのＧＦＰ発現の蛍光強度に基づいて無菌的に分取された 30 。細胞分取から得られたＧＦＰ陽性細胞は塗布され、また安定コロニーが検出され、また 分取後１０∼１２日後にカウントされた。これらのコロニーにおけるＧＦＰ発現のバラツ キは特に記されるべきものである。分化細胞が大きいほど、ＧＦＰ発現では輝度が高くな るようにみえる。安定した、ＧＦＰ陽性コロニー形成効率（ＣＦＥ）は前述されているよ うに計算された。３つの別々の細胞分取実験が完了され、また安定ＧＦＰ陽性細胞のパー センテージが、３．２％、４．７％、５．６４％であると計算された。これらの実験の１ つを示すサンプル表が示されている（付録１の表６）。三重実験で得られたデータでは、 もっとも高いＧＦＰ蛍光強度を有する細胞は、より低いＧＦＰ蛍光強度のものよりもコロ ニー形成効率が低いようにみえることが示唆されている。ＧＦＰ陽性ＣＦＥにより、われ われは、安定的にトランスフェクションされたコロニーの妥当な数を得るために、塗布す 40 る必要があるＧＦＰ陽性細胞の数を推定することが可能となった。 【００８０】 無菌細胞分取の結果として、われわれは安定ＧＦＰ発現ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞のいく つかのクローン系統を分離し、また拡大することができた。ｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０と ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎの両方のベクターから得たＧＦＰを発現させる系統は、細胞 形態学における明らかな変化あるいはＧＦＰ発現における減少なしに連続して継代培養し た。 【００８１】 グリーン蛍光タンパク質を発現させるＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトの安定トラン スフェクタントは、器官型培養培地では正常な層化を示す 50 (20) JP 3557172 B2 2004.8.25 正常組織構造を再創造するように安定的にトランスフェクションされるＧＦＰ陽性ＢＣ− １−Ｅｐ／ＳＬ細胞の能力をテストするために、われわれはこれらの細胞を器官型培養培 地に塗布した。培養培地のこのタイプでは、三次元微環境で可能なかぎり完全な皮膚の特 徴の多くのものを表示することが細胞には可能である。この手順は、三重にして繰り返さ れ、また結果生じた組織は共焦点顕微鏡だけではなく、蛍光顕微鏡により組織学的に分析 された（データは図示せず）。 安定的にトランスフェクションされた細胞は、トランス フェクションされていないＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ対照と同様に分化すると考えられる。両 方の培養培地とも、光学顕微鏡のレベルで気が付く組織学的相違がなく同じような細胞層 化を示している。興味深いことに、ＧＦＰの外見は培養培地の分化した上部層でもっとも 蛍光強度が高い。われわれは、蛍光と共焦点顕微鏡の両方によりこの発現パターンを観察 10 した。ＧＦＰ強度における相違は細胞層に蓄積されたタンパク質の量のバラツキの結果で はないかと考えられる。代替的には、ＧＦＰ発現を促進するＣＭＶプロモーターは、その 細胞がさらに分化した状態に達するまでは活性にはならないことが考えられる。 【００８２】 ２．ヒト扁平細胞がんの増殖をモデルにして作製するため、器官型培養培地システムのな かで自然発生的に不死化したヒトケラチノサイトＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬの使用法 Ａ．材料と方法 細胞成分の説明 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞系統は、正常ケラチノサイト増殖と分化特性を保持している自 然発生的に不死化したヒトケラチノサイト細胞系統である。これは、新生児包皮サンプル 20 から得た初代ケラチノサイトの増殖のための標準的な方法を使用して分離された。ケラチ ノサイト培養は、アレン−ホフマンとラインバルトにより説明されているように、マイト マイシンＣ処理スイスマウス３Ｔ３線維芽細胞の存在下で、単一細胞懸濁液の分割量を塗 布することにより確立された（ラインバルト，ジェー．ジー．ら、１９８１）。 【００８３】 ＭＷ−１−Ｆ線維芽細胞は、正常ヒト新生児から分離され、また新生児包皮のトリプシン 解離のための標準的な方法に従って培養された。その培養は１０％仔ウシ血清を補足した ハムのＦ−１２培地を含む組織培養プレート上にある、解離された細胞懸濁液の分割量を 塗布することで開始された。線維芽細胞培養培地の第２世代またそれに続く継代が、以下 に説明されているように、器官型培養モデルの非表皮成分の一部として使用される。 30 【００８４】 ＳＳＣ１３ｙ細胞系統は、器官型混合培養モデルの開発のための原型Ｈ＆Ｎ悪性細胞系統 として役に立つ。ＳＣＣ１３ｙはＳＣＣ１３細胞系統から継代培養された。ＳＣＣ１３は 放射線療法後に再発した顔の表皮の腫瘍から誘導される（ラインバルト，ジェー．ジー． ら、１９８１）。コラーゲナーゼ解離プロトコルは、腫瘍の外科的生検から得られる単一 細胞懸濁液を作製するのに使用された。細胞懸濁液は初代培養の分離と拡張を可能にする マイトマイシンＣ ３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層上に塗布された。ＳＣＣ１３細胞系統は 培養培地における連続継代培養により確立され、またそれが誘導された腫瘍の異数体核型 が保持された。ＳＣＣ１３ｙは、メチルセルローズ懸濁液後に分化する制限された能力を 保持しているが、それは正常ケラチノサイトにおける一定の分化マーカーと構造の発現を 40 促進する１つの技術である。しかし、ＳＣＣ１３ｙはヌード（無胸腺症）マウスにおいて は腫瘍形成性である。 【００８５】 細胞培養 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は標準ケラチノサイト増殖培地で増殖された。標準ケラチノサ イト培養培地は、２．５％胎児クローンＩＩ（ＦＣＩＩ−はＨｙｃｌｏｎｅから得られる 仔ウシ血清の代替物である）、０．４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（ＨＣ）、８．４ｎｇ ／ｍｌコレラ毒素（ＣＴ）、５μｇ／ｍｌインスリン（Ｉｎｓ）、２４μｇ／ｍｌアデニ ン（Ａｄｅ）、１０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（ＥＧＦ）、１００単位ペニシリン、１００ μｇ／ｍｌストレプトマイシン（１％ Ｐ／Ｓ）により補足したハムのＦ１２：ダルベッ 50 (21) JP 3557172 B2 2004.8.25 コの変法イーグル培地（ＤＭＥ）、（３：１、０．６６ｍＭカルシウム）の混合物である 。細胞はマイトシンＣ不活性化スイスマウス３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層により、１００ ｍｍ ２ 組織培養皿上の３ｘ１０ ５ 細胞で、週間隔で継代培養される。 【００８６】 ＭＷ−１−Ｆ線維芽細胞株は１０％仔ウシ血清により補われたＤＭＥのなかで維持され、 また、１００ｍｍ ２ 組織培養皿の上で週毎に継代培養される。 【００８７】 ＳＣＣ１３ｙ細胞系統株はＳＣＣ培地で維持される（０．４μｇ／ｍｌ ＨＣ、１％スト レプトマイシン（Ｐ／Ｓ）により補足したＤＭＥ）。細胞は、マイトマイシンＣ不活性化 スイスマウス３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層により１００ｍｍ ２ 組織培養皿の上で週毎に継 10 代培養される。 【００８８】 器官型培養の形成 器官型培養は前述のように増殖された（パレントー，エヌ．、１９９４）。この手順は変 更が加えられたもので、再構築された表皮／真皮皮膚等価物内の腫瘍病巣の増殖を可能に している（図２）。コラーゲン基剤は正常ヒト新生児線維芽細胞、ＭＷ−１−Ｆ（５°） をＩ型コラーゲンと、１０％ ＦＣＩＩ＋Ｆ−１２＋ペニシリン／ストレプトマイシンの なかで混合することにより形成された。このコラーゲン基剤は５日間収縮するに任せた。 ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ（３１°）細胞は、０．２％ ＦＣＳ＋１．８８ｍＭカルシウムを 含有する３Ｆ１２：１ＤＭＥ＋ＨＣ＋Ａｄｅ＋Ｉｎｓ＋ＣＴ＋Ｐ／Ｓの５０μｌのなかに 入れた３．５ｘ１０ ５ 20 細胞でコラーゲン基剤上に塗布された。ケラチノサイトと悪性細胞 を層化させる混合培養に関しては、ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞が、塗布前に、３ｘ１０ ５ 個のＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞に対して５００、５０００、１０，０００個のＳＣＣ１３ ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞の割合で、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞と混合された（図１）。細胞は追加 の１３ｍｌの培地を加える前に２時間付着させるに任せた（０日目）。１日目と２日目に は、細胞には再度供給が行われた。４日目には、細胞は綿パッド付きの空気培地インター フェイスまで持ち上げられ、また、角化培地（１．８８ｍＭカルシウムを含有する２％ ＦＣＳ＋３Ｆ１２：１ＤＭＥ＋ＨＣ＋Ａｄｅ＋Ｉｎｓ＋ＣＴ＋Ｐ／Ｓ）に切り換えた。細 胞は３日毎に角化培地が供給された。１５日目には、培地は取り除かれ、また器官型培養 培地は４％パラホルムアルデヒドにより一夜固定され、また０．１ Ｍグリシンを加えた 30 ＰＢＳのなかに保存された。 【００８９】 ＧＦＰ発現ベクターとＳＣＣ１３ｙのトランスフェクション 市販されていて入手可能なヒト化グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ベクターである ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ（ライフテクノロジー社、ゲティスバーグ市、メリーランド 州）がＳＣＣ１３ｙ細胞系統を遺伝子工学的に標識化するのに使用された。ＧＦＰの発現 は、安定的にトランスフェクションされたＳＣＣ１３ｙ細胞のなかにＧＦＰが蓄積される よう構成的活性ヒトサイトメガロウイルスプロモーターにより制御される。プラスミドＤ ＮＡは、エンドトキシン遊離マキシプレップキット（キアゲン社）を使用してベクター形 質転換細菌株か作製された。 40 【００９０】 トランスフェクション実験に関しては、ＳＣＣ１３ｙ（継代６０）細胞が、６穴プレート のなかに入れたマイトマイシンＣ処理スイスマウス３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層上に１ｘ １０ ５ 細胞の密度で塗布された。ＳＣＣ１３ｙ細胞には、３Ｔ３層が０．５ｍＭ ＥＤＴ Ａにより取り除かれた時点で、接着するように２４時間が与えられた。ＳＣＣ１３ｙ細胞 はＤＭＥにより２回洗浄され、そして血清含有培地が加えられた。細胞は２４時間後にト ランスフェクションされた。 ＳＣＣ１３ｙ細胞（６０）は、ポリカチオン性脂質ＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲ（ベンノバ社） を使用してトランスフェクションされた。本明細書では、ＧＦＰをトランスフェクション された細胞は、ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ として呼称されることとする。継代１０は、トラン 50 (22) JP 3557172 B2 2004.8.25 スフェクション後の第１継代である。トランスフェクション混合物は、６穴プレートの各 穴に対して２００μｌの補足していなかったＤＭＥにｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎの１０ ｍｇを加えることにより作製された。ＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲの３０μｇがＤＮＡ溶液に加 えられ、最終的にＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲに対するＤＮＡの比率が１：３で、また総量が４ ００μｌとなった。トランスフェクション混合物はやさしく渦巻き状に攪拌され、また室 温で暗所に１５分間温置された。培地はＳＣＣ１３ｙ培養培地から取り除かれ、プレート はリン酸塩遊離ＤＭＥにより２回洗浄され、また、リン酸塩遊離、未補足ＤＭＥの２ｍｌ により再度供給が行われた。トランスフェクション混合物が滴下様に各プレートに加えら れ、また細胞は５％ ＣＯ２ インキュベータのなかで３７℃にて３時間インキュベートさ れ、３０分後とに振とうした。その培地は取り除かれ、また細胞はＤＭＥにより２回洗浄 10 され、またＳＣＣ培地により再度供給が行われた（抗生物質は加えない）。２４時間後、 培地は抗生物質を補ったＳＣＣ培地に取り替えられた。 【００９１】 フローサイトメトリーによる検出とＧＦＰ発現の定量化 ＳＣＣ１３ｙ細胞は０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．１％トリプシンにより、トランスフェク ション後２４時間で培養培地から除去された。細胞は、遠心分離（５分間４４０ｘｇ）に より回収され、また２ｘ１０ ６ 細胞／ｍｌの細胞密度で血清含有培地に再懸濁され、また ５ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により染色された。この５００μｌの細胞懸濁 液は、凝集塊を除去するための分析の直前に４２μｍメッシュ（テトコ社）により濾過さ れた。トランスフェクションされたＳＣＣ１３ｙ細胞は、４８８ｎｍレーザーを装備した 20 ＦＡＣＳｃａｎか、あるいはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒベンチトップフローサイトメータ（ ともにベクトンディッキンソン社製）かのいずれかの上で分析された。１万件のイベント が得られ、またＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ベクトンディッキンソン社）を使用し て分析された。ＰＩ染色され、非生存細胞は分析から除外された。一過性トランスフェク ション効率あるいはＳＣＣ１３ｙ 生存ＳＣＣ１３ｙ ＋ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ のパーセンテージが、生存細胞の総数のうちの 細胞のパーセンテージとして計算された。ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ 集団中経時的なＧＦＰ発現の安定性を測定する実験では、ＧＦＰ発現細胞のパーセンテ ージが４週間間隔で測定された。 【００９２】 安定ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞の分離と同定 30 トランスフェクション後、一過性にトランスフェクションされたＳＣＣ１３ｙ細胞は、１ ００ｍｍ ２ 組織培養皿上で連続して継代培養された。１週間の拡張後、これらの細胞は再 び、１５０ｍｍ ２ 組織培養皿上で継代培養され、また１週間追加して増殖することができ た。これにより、一過性トランスフェクタントにおけるＧＦＰ発現の喪失だけではなく、 安定トランスフェクタントの拡張が可能になった。細胞は０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．１ ％トリプシンを使用して除去された。遠心分離（５分間４４０ｘｇ）後、細胞は５ｍｇ／ ｍｌＰＩを加えた５ｘ１０ ６ 細胞／ｍｌという密度で血清含有培地のなかに再懸濁された 。この懸濁はその後、４２μｍ無菌メッシュ（テトコ社）により、細胞分取直前に濾過さ れた。トランスフェクションされたＳＣＣ１３ｙ細胞が、干渉性アルゴン４８８ｎｍレー ザーを装備したＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（ベクトンディッキンソン社）上で分取された 40 。細胞は２０００／秒の速度で分取され、またサンプルは、生存率とＧＦＰ発現をチェッ クするために、細胞分取後に回収された。非生存細胞は回収されなかった。 【００９３】 細胞分取の直後に、ＳＣＣ１３ｙ （典型的には１∼３ｘ１０ ４ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞培養が再開された。得られたすべての細胞 ）は、マイトマイシンＣ処理スイスマウス３Ｔ３線維芽細胞 支持細胞層を加えた１００ｍｍ ２ 皿上に塗布された。細胞は、ＧＦＰ短帯域パスフィルタ を備えたＩＸ−７０反転蛍光顕微鏡（オリンパス社）を使用して隔日にモニターされた。 非ＧＦＰ発現コロニーは、その皿からコロニーを削りとることにより除去された。安定Ｇ ＦＰ発現コロニーには再び供給が行われ、また、拡張が可能となった。ＧＦＰ発現コロニ ーが１０００細胞あるいはそれ以上の推定密度にまで増殖したときには、細胞はマイトマ 50 (23) JP 3557172 B2 2004.8.25 イシンＣ処理３Ｔ３支持細胞層を加えた１００ｍｍ 集団におけるＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ ２ 皿上に塗布され、また拡張された。 細胞のベースラインパーセンテージが、上述のように 、フローサイトメトリーにより確定された。 【００９４】 連続継代培養によるＳＣＣ１３ｙ ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞の安定性 細胞は以下の条件下で標準的ＳＣＣ培地で増殖された。すべての細 胞は、マイトマイシンＣ不活性化３Ｔ３支持細胞層を加えた６穴プレートの３穴で三重に 増殖された。６日目毎に、各培養培地は、０．１％トリプシンにより回収され、また１ｘ １０ ５ 細胞が支持細胞層を加えた６穴プレートの新しい穴に回された。培地は週に２回変 えられた。４週間間隔で、サンプルが、２ｘ１０ ６ 細胞／ｍｌ懸濁され、また上述のよう 10 に、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について分析が行われた。 【００９５】 ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ のインビトロでの増殖 増殖プロフィールはマイトマイシンＣ処理マウス３Ｔ３支持細胞層を加えずに６穴組織培 養プレートの重複培養穴に１ｘ１０ ５ 細胞を塗布することにより測定された。各サンプル に対する重複培養穴は１日で回収され、また血球計カウントにより細胞総数が測定された 。平均細胞数については、標準ＡＮＯＶＡ統計分析法を使用してＳＣＣ１３ｙ対照（非ト ランスフェクション）とＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ の間の相違に関してテストした。 Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞の増殖 【００９６】 無胸腺症マウスにおけるＳＣＣ１３ｙ 20 腫瘍異種間移植として増殖するＧＦＰ発現ＳＣＣ１３ｙ細胞の能力が、補足されなかった ＤＭＥの５∼１０ｘ１０ ６ 細胞／１００μｌの無胸腺症ヌード（ｎｕ／ｎｕ）、３∼４週 齢、雌マウス（ハーラン−スプラグ−ダーレイ（Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗ ｌｅｙ）社）のなかに注入することにより測定された。各動物は、トランスフェクション されていないＳＣＣ１３ｙとＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ のそれぞれ１つは背部に、１つの腹部 に皮下注入により接種された。各場所で注入された細胞タイプは、代替マウスでは切り換 えた。各細胞系統に関して１つのテストを行った総数８匹のマウスが調べられた。すべて のマウスが公の動物研究施設に収容され、また実験技術とプロトコルが再検討され、ウィ ンスコンシン大学マジソン校の保健科学動物保護委員会により承認された。 【００９７】 ＳＣＣ１３ｙ 30 Ｇ Ｆ Ｐ ＋ クローン形成細胞生存率 コロニー形成効率（ＣＦＥ）は、マイトマイシンＣ処理マウス３Ｔ３支持細胞層を含む重 複培養６穴プレートに指数増殖培養培地から細胞密度のある範囲を塗布することにより測 定された。標準ＳＣＣプレートでおよそ２週間増殖後、１０％ホルマリンのなかで１０分 間固定され、水道水で洗浄され、またメチレンブルーで一夜染色された。∼５０細胞のコ ロニーがカウントされた。ＣＦＥが［（カウントされたコロニー数）／（接種された細胞 数）］ｘ１００％として計算された。平均ＣＦＥが重複培養に関して測定され、またトラ ンスフェクションされていないＳＣＣ１３ｙ対照とＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ の間の相違に関 して、標準ＡＮＯＶＡ統計分析法を使用してテストされた。 【００９８】 ＳＣＣ１３ｙ 40 Ｇ Ｆ Ｐ ＋ の放射線照射生存率 ＳＣＣ１３ｙとＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞についての放射線照射生存率が、０、１、３、 ６、１０Ｇｙ線量で重複培養指数増殖培養培地を照射することにより測定された。培養培 地は２５ｍｍ 度で １ ３ ７ ２ 組織培養フラスコのなかに維持され、また５．８６Ｇｙ／分の現行線量速 Ｃｓ放射性ボックスにより照射されたときにはフラスコ当たり１−２ｘ１０ ６ 細胞総数を有していた。照射後、細胞はトリプシン処理され、カウントされ、希釈され、 また、コロニー増殖の検出が可能になる細胞密度の範囲にわたってマイトマイシンＣ処理 ３Ｔ３支持細胞層上の３−５∼６０ｍｍ ２ 皿に塗布された。コロニー形成効率は上述のよ うに測定された。平均ＣＦＥが重複培養に関して測定され、またトランスフェクションさ れていないＳＣＣ１３ｙ対照とＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ の間の相違に関して、標準ＡＮＯＶ 50 (24) JP 3557172 B2 2004.8.25 Ａ統計分析法を使用してテストされた。 【００９９】 トランスフェクションされた器官型培養培地の組織学的分析 継代９（でＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞が、５００、５０００、１００，０００細胞／コラ ーゲン基剤という密度で塗布され、１６日間器官型共培養培地で増殖された。器官型培養 培地はパラフィンに包埋される前に４％パラホルムアルデヒドで一夜固定された。切片（ ５μｍ）は切断され、代替切片が取付けられ、また、ウィンスコンシン大学マジソン校病 院の外科病理学教室（マジソン市ウィンスコンシン州）によって、ヘマトキシリンとエオ ジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された。非Ｈ＆Ｅ切片は再び水和化され、５ｍｇ／ｍｌヘキス ト染料（３３２５８）により１５分間染色され、脱水され、またサイトシール（Ｃｙｔｏ 10 ｓｅａｌ）取付け培地（ステファンサイエンティフィック（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｓｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ）社）を使用して取付けられた。切片は、二重ＦＩＴＣ−ヘキストフィルタ （４７０ｎｍ±２０と５２５ｎｍ±帯域パス）を装備したＩＸ−７０反転蛍光顕微鏡（オ リンパス社）を使用して検討された。 【０１００】 共焦点顕微鏡によるＧＦＰ発現の分析 継代９（でＧＦＰ発現ＳＣＣ１３ｙ細胞が５００細胞／コラーゲンラフトの密度で塗布さ れ、また上述のように、１６日間器官型培養培地で増殖された。器官型培養培地は４％パ ラホルムアルデヒド−ＰＢＳで一夜固定され、また＞１時間、４℃にて０．１ Ｍグリシ ン−ＰＢＳ溶液で洗浄された。培養培地が取付けられ、ベクタシールド取付け培地（ベク 20 ターラボ社）を使用してカバーガラスをかぶせ、またゴムセメントにより密封された。Ｇ ＦＰ発現が、４８８ｎｍの励起波長と５００∼５３０ｎｍ帯域パスフィルタによる検知力 を備えた共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ニコンダイアフォト２００）を使用して分 析された。画像は上部の角化層で開始しておよそ１μｍ間隔で撮られた（ウィンスコンシ ン大学マジソン校のダブリュー．エム．ケック神経撮像研究所（Ｎｅｕｒａｌ Ｉｍａｇ ｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））。 【０１０１】 Ｂ．結果 ＳＣＣ１３ｙのトランスフェクションの効率 この実験セットの１つの目的は、ＳＣＣ１３ｙのトランスフェクション効率を最適化する 30 ことであった。一過性トランスフェクションは、トランスフェクション後４８時間内に起 こるトランスフェクションされた構築物の陽性発現として定義される。トランスフェクシ ョン効率についての効果に関する主に３つの変数があり、それらの変数が調べられた。す なわち、ＤＮＡの濃度、ＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲの濃度、細胞密度である。付録１の表７に 、フローメトリーにより測定されたトランスフェクション後のＧＦＰ細胞の観察されたパ ーセンテージが要約されている。２１．４％という最適ＳＣＣ１３ｙトランスフェクショ ン効率は、ＤＮＡ：ＧｅｎｅＦＥＣＴＯＲの比率１：２を使用して入力ＤＮＡ１０μｇで 観察された。トランスフェクションに関する最適細胞密度は、細胞が指数増殖期にみられ たが、しかし、それは培養培地が全面生長に達する以前の時点であった。非生存細胞は陽 性トランスフェクタントである場合もあるが、これらの細胞は、フローサイトメトリーソ 40 フトウエアによりこの集団をゲートで制御することにより分析から除外された。すべての 実験では、観察された死亡細胞の総数は分析された細胞の総数に対しては相対的に小さい ものであった（＜８％）。 【０１０２】 ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 集団の分離 上述の最適一過性トランスフェクション条件を使用して、指数増殖ＳＣＣ１３ｙが、ｐＧ ｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ ＧＦＰプラスミドによりトランスフェクションされ、また安定 ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞が分離された。安定トランスフェクションは、連続継代培養の ４週間未満ではない期間の間の陽性ＧＦＰ発現として定義される。一過性にトランスフェ クションされた細胞のＧＦＰ発現は、フローサイトメトリーヒストグラム上でおよそ２ロ 50 (25) JP 3557172 B2 2004.8.25 グの範囲にわたって変化しており、またトランスフェクション細胞の総集団の４％を示し た。分取された細胞の塗布後、個々のＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ コロニーがコロニー内（およ びそれらの間）での発現のさまざまな値を有することが観察されたが、しかし、混合ＧＦ Ｐ ＋ ／ＧＦＰ Ｆ Ｐ ＋ − コロニーは稀にしか観察されなかった。第３継代までに、ＳＣＣ１３ｙ Ｇ 集団分取後の分取後検査では、細胞のおよそ８５％でＧＦＰ発現したことが示され た。 【０１０３】 ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ トランスフェクタントにおける安定ＧＦＰ発現 継代７におけるＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ のプールされた集団は、非ＧＦＰ発現ＳＣＣ１３ｙ で検出された自己蛍光背景よりもおよそ１ログ大きなＧＦＰ発現のベースライン値を示し 10 ている。 【０１０４】 集団におけるＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞のパーセンテージは、ＦＡＣＳ分析ソフトウエア を使用し、９０％であることが分かった。これは、上で論議された初期継代での分取後に 見つかったＧＦＰ Ｐ ＋ ＋ 細胞のパーセンテージ（８５％）によく匹敵する。ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ 細胞は、可変性、非トランスフェクションＳＣＣ１３ｙ細胞で検出されたもっとも高 いＧＦＰシグナルよりも大きなＧＦＰシグナルを有するすべてのイベントとして定義され た。蛍光顕微鏡を使用した視覚的な観察では、もしあるとしても、この集団には非ＧＦＰ 発現ＳＣＣ１３ｙはほとんど存在しないことが確かめられている。 【０１０５】 20 もう１つの実験セットでは、ＳＣＣ１３ｙにおけるＧＦＰ発現は、長い期間にわたって安 定していることが示されている。安定ＳＣＣ１３ｙ れたＧＦＰ発現のヒストグラムは、ＧＦＰ ＋ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ の分離後に継代１２で決定さ （８５％）のパーセンテージではほとんど変 化がなく、またＧＦＰシグナルは、非ＧＦＰ発現対照よりもおよそ１ログ大きいままであ った。蛍光顕微鏡により、視覚的に、細胞の１００％が緑色にみえることが確認された。 【０１０６】 ＧＦＰ発現によってインビトロでのＳＣＣ１３ｙ増殖は影響を受けない 次に、ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞のインビトロでの増殖が、ＧＦＰ発現がＳＣＣ１３ｙ増 殖に影響を与えたかどうかを判定するために調べられた。ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞と非 トランスフェクションＳＣＣ１３ｙ細胞はほぼ同じ増殖速度で増殖し、また、インビトロ 30 での増殖の６日後にほぼ同じ細胞総数に達した。さらに、両方の細胞系統で、指数的な、 急速な増殖期の後に続く遅い増殖の典型的な開始遅滞期を示した。 【０１０７】 ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ は腫瘍形成性のまま残る ＳＣＣ１３ｙ細胞系統は悪性であり、またヌードマウスで腫瘍を形成する。ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞は、外因性ＧＦＰ発現が腫瘍異種間移植を形成するＳＣＣ１３ｙ細胞の能力 を変えるかどうかを判定するために調べられた。両方の細胞系統で注入された８匹のマウ スについては、各マウスが注入後第１週内に観察できる腫瘍を産生した。さらに、いずれ の腫瘍も退縮したものはなかった（８週間までモニターした）。各腫瘍は必ずしも同じ速 度で増殖したわけではないが、これらの実験は続けられて、すべての腫瘍が週単位をベー 40 スにしてサイズが増加した。 【０１０８】 ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ の非改変放射線照射応答反応 ＳＣＣ１３ｙ細胞系統の放射線照射応答反応がよく特徴付けられている（ペテレイト，デ ィー．ジー．ら、１９９４）。６Ｇｙの放射線線量では、指数増殖細胞のおよそ９９％（ ２ログ）を殺傷し、１０Ｇｙではおよそ９９．９％（３ログ）を殺傷する。同じ線量範囲 のＧＦＰ発現ＳＣＣ１３ｙ細胞についての同様な実験では、ほぼ同じ結果を生んでいる。 また、このクローン形成生存測定で測定されたＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ コロニーの形態学は 、非トランスフェクションＳＣＣ１３ｙ細胞とほぼ同じである。コロニーは、２週間以上 にわたる測定期間でコロニー規模あるいは細胞密度において何らの相違も示さなかった。 50 (26) JP 3557172 B2 2004.8.25 これらの観察で、ＳＣＣ１３ｙ放射線感受性へのＧＦＰ発現の効果の欠如が確かめられて いる。 【０１０９】 ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ の共培養はＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイトの正常層化を改変 しない ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は、器官型培養では完全に分化した皮膚を形成することを前に 示している ７ 。この機能的に正常な組織に悪性細胞型を導入することによって、正常な扁 平分化を示すＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬの能力を改変するようにはみえない。ＢＣ−１−Ｅｐ ／ＳＬとＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞の共培養の増殖を観察することにより、重層上皮にほ ぼ同じである複数層のシートが同定されている。このＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は継続し 10 て正常に分化する表皮のいくつかの特性を示している。基底細胞は、表皮と真皮等価物の 接合点に位置を占めている立方体様細胞の単層を形成しているのが観察される。円形の形 態および細胞質に対する高い核の比率が、ケラチノサイトが活発な分裂集団であることを 示している。細胞が平坦になり、また扁平に成り、またその組織の上部層で核を失いなが ら、皮膚表面に向かって上の方に移動していく細胞における正常分化は明らかである。 【０１１０】 器官型培養ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ とＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ重層上皮における３−Ｄ腫瘍病 巣の同定 悪性ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞系統が、優勢な非悪性ケラチノサイト培養培地で腫瘍病巣 を形成することができるかどうかを判定するために、さまざまな数から成るＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞が器官型ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイト培養培地に接種された。ＳＣ Ｃ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 20 細胞は３００，０００ ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞毎に５００、５００ ０、１００，０００細胞が実験の開始時に塗布された。培養の２週間後、すべての実験群 で、ＧＦＰ ＋ 細胞の増殖する腫瘍病巣が形成された。ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 細胞のもっと も高い濃度（３００，０００個のＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞に対して１００，０００個の ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 見えたＧＦＰ ＋ 細胞）により、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の増殖を圧倒するように 細胞の連続シートが作り出された。三次元での器官型培養培地を調べるこ とを可能にする共焦点顕微鏡により、ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の器官型培養培地により 形成される正常組織様構造内で増殖する個々のＳＣＣ１３ｙ の形成が確かめられた。ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 腫瘍病巣のいくつか 病巣は、球状の形状をした塊で優勢に増殖 し、また病巣当たり５０個細胞未満が含まれていた。興味深いことに、ＳＣＣ１３ｙ Ｐ ＋ 30 Ｇ Ｆ 細胞病巣がＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ（緑色ではない）共培養細胞により中断されること なく増殖し、すなわち、病巣のすべてのＧＦＰ ＋ 細胞は互いに隣接しているように見えた 。これらの観察により、ＳＣＣ１３ｙ悪性細胞は遺伝子工学的に作られたヒト組織内で混 合培養することが可能であり、また、ＧＦＰ発現が非常に小さなヒト腫瘍病巣であっても 同定し、また視覚化するのに使用することができる効率的な標識化方法であることが確か められている。 【０１１１】 （参考文献） 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１４．ハドウ，エー．，「分子修復、創傷治癒と発がん：腫瘍産生は過剰治癒の可能性が あるか」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｐａｉｒ， ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ， ａｎ ｄ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａ ｐｏｓｓ ｉｂｌｅ ｏｖｅｒｈｅａｌｉｎｇ？），Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：１８１ −２３４，１９７２。 １５．ホール，イー．ジェー．，『放射線科医のための放射線生物学』（Ｉｎ Ｒａｄｉ ｏｂｉｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔ），第３版，ジェー．ビー ．リピンコット社（Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）刊のなかの「放射 50 (28) JP 3557172 B2 2004.8.25 線療法における時間、線量、分割照射」（Ｔｉｍｅ， Ｄｏｓｅ，ａｎｄ Ｆｒａｃｔｉ ｏｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ），ｐｐ．２３９−２６０，フィラデ ルフィア，１９８９。 １６．ハインズ，エム．ディー．ら，「ケラチノサイト増殖因子は培養ヒトケラチノサイ トにおける角化エンベロープ形成とヌクレオソーム断片化を阻害する」（Ｋｅｒａｔｉｎ ｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ ｅ ｎｖｅｌｏｐｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ ｆｒａｇｅｍ ｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６２４５−６２５１，１９９６。 １７．ジャバヘリアン，エー．ら，「正常ケラチノサイト重層上皮における新生物進行の 10 初期ステージを抑制する」（Ｎｏｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｓｕｐｐｒｅ ｓｓ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｎｅｏｐｌａｓｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８ ：２２００−２２０８，１９９８。 １８．クドロー，ジェー．イー．ら，「哺乳動物の脳における形質転換増殖因子α」（Ｔ ｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａ ｌｉａｎ ｂｒａｉｎ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：３８８０−３８８３，１９ ８９。 １９．リー，アイ．エム．，ビー．レイン（Ｂ．Ｌａｎｅ），エフ．エム．ワット編『ケ ラチノサイトハンドブック』（Ｔｈｅ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ） 20 ，ケンブリッジ大学出版局（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ） 刊のなかのリー，アイ．エム．とエフ．エム．ワットの執筆部分「ヒト表皮ケラチノサイ トの培養」（Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒ ａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ），ケンブリッジ，英国，１９９４． ２０．ミヤモト，シー．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：７ ２３２−７２３６，１９８５。 ２１．『ケラチノサイトの諸方法』（Ｉｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ）のなかのパレントー，エヌ．執筆部分「皮膚等価物」（Ｓｋｉｎ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎ ｔｓ），１９９４。 ２２．ペテレイト，ディー．ジー．ら，「急速に分裂する頭部と頸部腫瘍のための放射線 30 療法による結合ポリアミン除去：改善移動領域制御に関する方策」（Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒ ａｐｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄｌｙ ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｔ ｕｍｏｒｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎ ａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏ ｌ．，Ｐｈｙｓ．２８：８９１−８９８，１９９４。 ２３．ペテレイト，ディー．ジー．ら，「子宮頸部がんにおける治療延長の悪影響」（Ｔ ｈｅ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｌｏｎｇａｔ ｉｏｎ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ｂｉｏ ｌ．Ｐｈｙｓ．３２：１３０１−１３０７，１９９５． 40 ２４．ピエテンポール，ジェー．エー．（Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ，Ｊ．Ａ．）ら，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３７５８−３７６２，１９９０。 ２５．ラインバルト，ジェー．ジー．ら，「ヒト扁平細胞がんから培養された、基質と線 維芽細胞支持を必要とする腫瘍形成性ケラチノサイト系統」（Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｌｉｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ａｎｃｈｏｒａｇｅ ａ ｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｓｕｐｐｏｒｔ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａ ｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４１ ：１６５７−１６６３，１９８１。 ２６．サシュセンマイヤー，ケー．エフ．ら，「形質転換増殖因子β１は接着喪失後のヒ トケラチノサイトにおけるヌクレオソーム断片化を阻害する」（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎ 50 (29) JP 3557172 B2 2004.8.25 ｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β１ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ ｆｒａｇｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｆｏ ｌｌｏｗｉｎｇ ｌｏｓｓ ｏｆ ａｄｈｅｓｉｏｎ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７ １：５−８，１９９６。 ２７．サデク，シー．エム．とビー．エル．アレン−ホフマン，「シトクロームＰ４５０ ＩＡ１は生体異物がない正常ヒトケラチノサイトに急速に誘導される：ＣＹＰＩＡ１発現 に対する１つの新規な懸濁仲介メカニズム」（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ＩＡ１ ｉｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔ ｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ 10 ＣＹＰＩＡ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６０６ ７−１６０７４，１９９４。 ２８．シャープルズ，ケー．ら，ＤＮＡ６：２３９−２４４，１９８７． ２９．ボーゲル，ジェー．，「ケラチノサイト遺伝子療法」（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ），Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２９（１１）：１４７ ８−１４８３，１９９３。 ３０．ウー，ワイ．ら，「ヒト表皮増殖因子受容体ｃＤＮＡはＡ４３１癌腫細胞における 過剰産生されたさまざまなＲＮＡに相同性である」（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃＤＮＡｉｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ＲＮＡｓ ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ａ４ 20 ３１ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ），Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８０６−８１０，１ ９８４。 【０１１２】 補足Ｉ 【０１１３】 【表１】 【０１１４】 【表２】 30 (30) JP 3557172 B2 2004.8.25 10 20 【０１１５】 30 【表３】 40 50 (31) JP 3557172 B2 2004.8.25 【０１１６】 【表４】 10 20 【０１１７】 【表５】 30 【０１１８】 【表６】 40 (32) JP 3557172 B2 2004.8.25 10 20 【０１１９】 【表７】 30 【図面の簡単な説明】 【図１】ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の染色体分析である。核型分析が継代３１でＢＣ−１ −Ｅｐ／ＳＬ細胞上で行われた。細胞には、第８染色体の長いアームの同位染色体外因子 40 があるため、４７染色体が含まれていた。染色体外因子、ｉ（８ｑ）は、正常男性核型を 示した親ケラチノサイト（ＢＣ−１−Ｅｐ継代３）ではみられない。 【図２】ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の連続継代培養について表皮増殖因子（ＥＧＦ）に対 する所要量を示す。ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞は標準培地＋／−１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦの なかで連続継代培養された。細胞はＥＦＧなしではほとんど増殖しなかった。 【図３】形質転換増殖因子β−１（ＴＧＦβ−１）がＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬケラチノサイ トの増殖を阻害することを示す。親細胞であるＢＣ−１Ｅｐ（６°）とＢＣ−１−Ｅｐ／ ＳＬ（２８°）はＥＧＦあるいは３Ｔ３支持細胞層を含まない標準培地に塗布された。細 胞は、ＥＧＦを含まない標準培地で∼２０％集密度であったときに＋／−５ｎｇ／ｍｌＴ ＧＦ −β１で処理された。細胞は３∼５日後にカウントされた。ＴＧＦ−β１処理の効 50 (33) JP 3557172 B2 2004.8.25 果は対照のパーセンテージとして示した。 【図４】ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞の増殖因子所要量を示す。継代３１でのＢＣ−１−Ｅ ｐ／ＳＬ細胞は、２．５％ ＦＣＳ＋３Ｆ１２：１ＤＭＥ＋１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦを補足 して増殖因子は追加せず（−ＧＦ）、０．４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（ＨＣ）、８． ４ｎｇ／ｍｌコレラ毒素（ＣＴ）、２４μｇ／ｍｌアデニン（Ａｄｅ）、５μｇ／ｍｌイ ンスリン（Ｉｎｓ）、あるいはすべての増殖因子（＋ＧＦ）において増殖された。細胞増 殖は各増殖因子のみの存在下で増加したが、しかし最適増殖はすべての増殖因子の存在下 で達成された。 【図５】増加した細胞集密度（コンフルエンス）がＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞における一 過性トランスフェクション効率を下げることを示す。ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ細胞はＧｅｎ 10 ｅＦＥＣＴＯＲ（ベンノバ（ＶｅｎｎＮｏｖａ）社）を使用してＧＦＰ含有プラスミドｐ ＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）とｐｃＤＮＡ３ ｎｅｏ（インビ トロゲン社）によりトランスフェクションされた。線形化されたｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅ ｒｎ １５∼２０μｇとｐｃＤＮＡ３ｎｅｏ ５∼６．７μｇが使用された。細胞数は血 球計を使用してトリプシン処理とケラチノサイトのカウントにより得られた。低密度は６ ∼７．５ｘ１０ ５ 細胞／１００ｍｍ皿として定義された。高密度は、３∼４ｘ１０ ６ 細胞 ／１００ｍｍ皿として定義された。トランスフェクション効率は蛍光標示式細胞分取器（ ＦＡＣＳ）を使用して得られた。グラフの各棒グラフは単一実験を表わしている。 【図６Ａ】皮膚と器官型ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ ／ ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ培養培地の断面略 図である。図６Ａは皮膚に存在する複数層の略図である。図６Ｂは示されているように３ 20 つの構成要素から基本的に構成される腫瘍／正常組織モデルの略図である。基底層はコラ ーゲンと線維芽細胞から構成される真皮等価物である。この層の上にあるのは、ＢＣ−１ −Ｅｐ／ＳＬ上皮細胞（陰影部）を分化させることにより形成された再構築された表皮で ある。この表皮等価物内にはＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 腫瘍（陰影をつけていない部分）病巣 である。 【図６Ｂ】皮膚と器官型ＳＣＣ１３ｙ Ｇ Ｆ Ｐ ＋ ／ ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ培養培地の断面略 図である。図６Ａは皮膚に存在する複数層の略図である。図６Ｂは示されているように３ つの構成要素から基本的に構成される腫瘍／正常組織モデルの略図である。基底層はコラ ーゲンと線維芽細胞から構成される真皮等価物である。この層の上にあるのは、ＢＣ−１ −Ｅｐ／ＳＬ上皮細胞（陰影部）を分化させることにより形成された再構築された表皮で ある。この表皮等価物内にはＳＣＣ１３ｙ である。 Ｇ Ｆ Ｐ ＋ 腫瘍（陰影をつけていない部分）病巣 30 (34) 【図１】 【図２】 【図３】 【図４】 【図６Ａ】 【図６Ｂ】 【図５】 JP 3557172 B2 2004.8.25 (35) JP 3557172 B2 2004.8.25 フロントページの続き 7 (51)Int.Cl. Ｃ１２Ｑ ＦＩ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 アレン−ホフマン， リン アメリカ合衆国 ウイスコンシン ５３７１１ マデイソン カウンセル クレスト ロード ３ ９０５ (72)発明者 シュロッサー， サンドラ ジェー アメリカ合衆国 ウイスコンシン ５３５７５ オレゴン トムソン ランド １４５ (72)発明者 ピッカート， ミカエル エー アメリカ合衆国 ウイスコンシン ５３７０３ マデイソン イースト ギルマン ストリート ♯３０４ １２２ 審査官 長井 啓子 (56)参考文献 欧州特許出願公開第００８５１０２８（ＥＰ，Ａ１） Crook T. et al., Oncogene. vol.5, pp.619-622 (1990) Gilles C. et al., Int.J.Cancer, vol.53, pp.872-879 (1993) Boukamp P. et al. J.Cell Biol., vol.106, pp.761-771 (1988) 7 (58)調査した分野(Int.Cl. ，ＤＢ名) C12N 5/10 BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN)