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JP 2008-524992 A 2008.7.17 10 (57)【要約】 【解決手段】 微生物を
JP 2008-524992 A 2008.7.17 (57)【要約】 【解決手段】 微生物を用いて生体内変換により生体異 物化合物の代謝物を産生する方法であって、前記生体異 物化合物はシクロスポリンＩＳＡ２４７であり、界面活 性剤の混合物中、前記微生物に到達されるものである。 前記方法をスケールアップし、例えば、リアクタ中、生 体内変換により大量の代謝物を産生することができる。 本発明の方法により産生される代謝物は、治療量モニタ リングまたは薬学的応用分野の標準として、抗体産生に 利用することができる。 【選択図】 図１ 10 (2) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【特許請求の範囲】 【請求項１】 微生物中で生体異物化合物の少なくとも１つの代謝物を産生する方法であって、 （ａ）前記生体異物化合物と界面活性剤との混合物を提供する工程と、 （ｂ）前記混合物を前記微生物の培養液に添加する工程と、 （ｃ）前記代謝物が形成するのに十分な時間、前記培養液を培養する工程と を有する方法。 【請求項２】 請求項１記載の方法において、前記混合物は、前記生体異物化合物、溶媒、および前記 界面活性剤を有するものである。 10 【請求項３】 請求項２記載の方法において、前記溶媒は、アルコールである。 【請求項４】 請求項３記載の方法において、前記アルコールは、エタノールである。 【請求項５】 請求項１∼４記載のいずれかの方法において、前記溶媒は、アルコールおよびＤＭＳＯ の両方を有するものである。 【請求項６】 請求項１∼５記載のいずれかの方法において、前記微生物は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ ｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 20 ｓｅｔｏｎｉｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｔｈｙｒａｅａから 成る群から選択されるものである。 【請求項７】 請求項１∼５記載のいずれかの方法において、前記微生物は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｌｌａｅｃｈｉｎｕｌａｔａである。 【請求項８】 請求項１∼５記載のいずれかの方法において、前記微生物は、Ｎｅｒｏｓｐｏｒａ ｃ ｒａｓｓａである。 【請求項９】 請求項１∼５記載のいずれかの方法において、前記微生物は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ 30 ｓ ｓｐである。 【請求項１０】 請求項１∼９記載のいずれかの方法において、前記界面活性剤は、ＰＥＧ ４００、ヒ マシ油、ミリスチン酸イソプロピル、グリセリン、クレモホール（登録商標）、ラブラゾ ール（登録商標）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０から成る群から選択されるものである。 【請求項１１】 請求項１∼１０記載のいずれかの方法において、前記生体異物化合物は、免疫抑制剤お よび抗菌化合物から成る群から選択されるものである。 【請求項１２】 請求項１∼１１記載のいずれかの方法において、前記生体異物化合物は、シクロスポリ 40 ン化合物である。 【請求項１３】 請求項１２記載の方法において、前記シクロスポリン化合物は、ＩＳＡ２４７である。 【請求項１４】 請求項１２記載の方法において、前記シクロスポリン化合物は、シクロスポリンＡであ る。 【請求項１５】 請求項１∼１４記載のいずれかの方法において、前記代謝物は、ＩＭ１−ｄ−１、ＩＭ １−ｄ−２、ＩＭ１−ｄ−３、ＩＭ１−ｄ−４、ＩＭ１−ｃ−１、ＩＭ１−ｃ−２、ＩＭ １−ｅ−１、ＩＭ１−ｅ−２、ＩＭ１−ｅ−３、ＩＭ９、ＩＭ４、ＩＭ４ｎ、ＩＭ６、Ｉ 50 (3) JP 2008-524992 A 2008.7.17 Ｍ４６、ＩＭ６９、およびＩＭ４９から成る群から選択されるものである。 【請求項１６】 請求項１∼１５記載のいずれかの方法において、前記微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏ ｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｔｈｙｒａｅａ（ＡＴＣＣ １１６３５）である。 【請求項１７】 請求項１∼１６記載のいずれかの方法であって、この方法は、さらに、 前記培養液から前記代謝物を単離する工程を有するものである。 【請求項１８】 生体内変換系での使用に適した微生物を同定する方法であって、ａ）代謝される化合物 の構造を既知の酵素活性と比較する工程と、ｂ）前記既知の酵素活性を発現した酵素を同 10 定する工程と、ｃ）前記同定された酵素を発現した微生物を同定する工程と、ｄ）生体内 変換系に前記同定された酵素を発現した微生物を使用し、前記化合物の代謝物を作成する 工程とを有する方法。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 本発明は、化合物の代謝物の調整法、より具体的には、生体内変換によるその代謝物の 調整に関する。 【背景技術】 【０００２】 20 患者に医薬品を投与する際、患者に治療量の薬物が投与されていることを確認するため 、前記薬物の血清濃度モニタリングが必要となることが多い。これは、治療量モニタリン グ（ＴＤＭ）と呼ばれる。ＴＤＭにより、親化合物および／または１若しくはそれ以上の 前記親化合物の代謝物を測定することができる。代謝物は、前記薬物が体内から排泄され やすくなるように、酵素、一般には肝酵素が作用して薬物を分解または修飾した時に形成 される。前記親化合物が急速に代謝される場合、ＴＤＭの目的で、代謝物の濃度を測定す ることが最も都合がよいと考えられる。そのような測定には、イムノアッセイが利用され ることが多い。 【０００３】 代謝物を測定するＴＤＭアッセイがイムノアッセイの場合、そのアッセイの使用に対し 30 て所望の特異性を有する抗体を作成および／または選択するために、前記薬物、または前 記薬物の単離、精製代謝物が使用されることがある。或いは、前記精製代謝物を利用し、 前記親化合物に特異的な抗体、つまり、前記親化合物と前記親化合物の代謝物との間の最 小限の交差反応性を示す抗体を限定することもある。従って、ＴＤＭ用に抗体を産生する のに適した代謝物を一定量入手するため、単離代謝物の効率的な産生法が必要である。 【０００４】 代謝物は、ＴＤＭと関係のない使用法を有することもある。代謝物は、薬学的に重要な 活性を有することもある。例えば、代謝物は薬物動態の改善、薬理活性の上昇、または生 物学的利用能の向上など、有益な特徴を示す。親薬剤化合物の代謝物自体が、有用な治療 となることもある。例えば、Ａ７７ １７２６はレフルノミドの活性代謝物であり、ヒド 40 ロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミドはＨＩＶ治療薬ネルフィナビルの活性代謝物であり、４ −ＯＨ−タモキシフェンはタモキシフェンの活性代謝物である。前記代謝物が活性を示す 場合、大量の前記代謝物を効率的に産生する方法が求められる。或いは、１若しくはそれ 以上の前記代謝物が有毒であることもある。そのため、薬物の代謝様式、その結果生じる 代謝物、およびこれらの代謝物の活性に関する知識は、薬物の活性を理解する上で重要で ある。この情報は、薬物の承認前に必要となることもある。前記代謝物とその特徴を特定 するため、十分な量の前記代謝物を産生、単離する必要がある。 【０００５】 代謝物を産生する一つの方法は、ヒトなどの哺乳類に前記薬物を投与し、血液、尿、胆 汁などの体液を回収し、これらの体液から代謝物を抽出、精製、単離するものである。一 50 (4) JP 2008-524992 A 2008.7.17 般に、薬物から前記薬物の代謝物への変換である生体内変換は、ヒト患者の肝臓において は、肝シトクロムＰ４５０酵素群（ＣＹＰ４５０またはＰ４５０）によって達成される。 前記Ｐ４５０酵素ファミリーには、胆汁または尿中に排泄するため、化合物の溶解性を高 めるように作用する、推定７０種類程度の酵素が含まれる。生体内変換による代謝物の形 成をモニタリングするため、親化合物を標識し、前記代謝物を認識できるようにすること も可能である。代わりに、高圧液体クロマトグラフィー分離および質量スペクトル解析に よりその結果をモニタリングする場合、同様の構造を有する薬物を同時に分析することも ある。第二の親化合物の生体内変換法は、生体内変換系として全臓器、組織スライス、ま たは肝細胞などの培養細胞を用いるものである。第三の方法では、哺乳類細胞から調整さ れたミクロソームが利用されることもある。これらのアプローチでは動物の分離株を使用 10 するため、前記代謝物に望まない汚染物質が導入される危険性がある。より大量で１若し くはそれ以上の前記代謝物が求められる場合、これらの方法はスケールアップすることが 難しい。さらに、前記親化合物を代謝物に変換するため、微生物を用いた生体内変換を利 用することもある。 【０００６】 生体異物が高い親油性である、つまり大規模発酵法に用いる水性培養液に非常に溶けに くい場合は、大量の代謝物を産生することが特に困難となる可能性がある。従って、効率 的に大量な不溶性生体異物の代謝物を産生する方法が必要である。 【発明の開示】 【発明が解決しようとする課題】 20 【０００７】 本発明は、微生物を用いた生体内変換により、生体異物化合物の代謝物を産生する方法 を提供するものである。前記生体異物化合物は、界面活性剤との混合中において前記微生 物にさせることもできる。前記方法をスケールアップし、例えばリアクタで生体内変換す ることにより、大量の代謝物を産生することも可能である。本発明の方法により産生され た代謝物は、例えば治療量モニタリングまたは薬学的応用分野の標準として、抗体産生に 利用することができる。 【課題を解決するための手段】 【０００８】 従って、本発明の一観点は、微生物中の生体異物化合物の少なくとも１つの代謝産物を 30 産生する方法を提供し、この方法は、 （ａ）前記生体異物化合物と界面活性剤との混合物を提供する工程と、 （ｂ）前記混合物を前記微生物の培養液に添加する工程と、 （ｃ）前記代謝物が形成するのに十分な時間、前記培養液を培養する工程と を有する。 【０００９】 前記混合物は、前記生体異物化合物、溶媒、および前記界面活性剤を有する。前記生体 異物化合物に適切ないかなる溶媒も使用することができる。例えば、前記溶媒はエタノー ルなどのアルコールとすることもできる。前記溶媒は１以上の物質を有することもある。 いくつかの実施形態では、前記溶媒はアルコールおよびジメチルスルフォキシド（ＤＭＳ 40 Ｏ）の両方を有する。 【００１０】 前記微生物は、前記生体異物化合物を代謝することができるいかなる微生物とすること もでき、ヒトと同じ前記生体異物化合物の代謝経路を持つものが好ましい。特定の実施形 態では、前記微生物がＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔｏｎｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌ ｙｓｐｏｒａ ｅｒｔｈｙｒａｅａから成る群から選択される。前記微生物は、Ｃｕｎｎ ｉｎｇｈａｍ ｅｌｌａｅｃｈｉｎｕｌａｔａ、Ｎｅｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、ま たはＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．とすることもできる。 【００１１】 50 (5) JP 2008-524992 A 2008.7.17 前記界面活性剤はいかなる適切な界面活性剤とすることもでき、本開示の教示に基づき 、当業者が特定することができる。例えば、前記界面活性剤は、ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）４００、ヒマシ油、ミリスチン酸イソプロピル、グリセリン、クレモホール（ 登録商標）（ポリオキシヒマシ油）、ラブラゾール（登録商標）（カプリロカプロイルマ クロゴールグリセリド）、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）４０から成る群から選択するこ とができる。 【００１２】 前記生体異物化合物は、水溶液中の溶解度が低い化合物が好ましい。いくつかの実施形 態では、前記生体異物化合物が免疫抑制剤および抗菌化合物、好ましくはシクロスポリン 化合物、より好ましくはＩＳＡ２４７またはシクロスポリンＡから成る群から選択される 10 。前記代謝物は、好ましくは、ＩＭ１−ｄ−１、ＩＭ１−ｄ−２、ＩＭ１−ｄ−３、ＩＭ １−ｄ−４、ＩＭ１−ｃ−１、ＩＭ１−ｃ−２、ＩＭ１−ｅ−１、ＩＭ１−ｅ−２、ＩＭ １−ｅ−３、ＩＭ９、ＩＭ４、ＩＭ４ｎ、ＩＭ６、ＩＭ４６、ＩＭ６９、およびＩＭ４９ から成る群から選択される。 【００１３】 本発明の方法はさらに、選択的に、前記培養液から前記代謝物を単離する工程を有する ことができる。 【００１４】 本発明の別の観点では、生体内変換系での使用に適した微生物を同定する方法を提供し 、ａ）代謝される化合物の構造を既知の酵素活性と比較する工程と、ｂ）前記既知の酵素 20 活性を発現した酵素を同定する工程と、ｃ）前記同定された酵素を発現した微生物を同定 する工程と、ｄ）生体内変換系において、前記同定された酵素を発現した微生物を使用し 、前記化合物の代謝物を作成する工程とを有する。特定の実施形態では、様々な微生物の ゲノム配列を前記同定された酵素の配列と比較し、それによって前記酵素を発現した微生 物を少なくとも１種類同定することで、前記微生物を同定することができる。 【００１５】 本発明の１若しくはそれ以上の実施形態の詳細は、添付図面および以下の記述で説明さ れる。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、記述および図、および請求項から明 らかとなるであろう。 【発明を実施するための最良の形態】 30 【００１６】 本発明では、微生物を用いた生体内変換により、生体異物化合物の代謝物を産生する方 法を提供する。特に、前記生体異物化合物は、界面活性剤と混合して前記微生物に到達さ せる。前記方法をスケールアップし、例えばリアクタで生体内変換することにより、大量 の代謝物を産生することが可能である。本発明により産生された代謝物は、例えば治療量 モニタリングまたは薬学的応用分野の標準として、抗体産生に利用することができる。 【００１７】 多くの薬学的に活性な化合物は水溶液に難溶性である。例えば、シクロスポリンおよび 特定の他の免疫抑制剤（ラパマイシン、アザチオプリン、ミゾリビン、およびＦＫ５０６ （タクロリムス））は、水性環境で難溶性を示すことが知られている。本発明者らは被験 40 化合物としてシクロスポリン誘導体であるＩＳＡ２４７を用い、微生物発酵を利用して首 尾よく難溶性化合物の代謝物を調整することが可能であることを発見した。本発明をさら に詳細に説明する前に、他に指示がない限り、本出願書類で使用されている用語を以下に 定義する。 【００１８】 定義 本明細書では、「生体内変換」という用語は、生細胞、特に微生物の細胞による化合物 の代謝プロセスを指す。 【００１９】 「生体異物化合物」、または「生体異物」は、本来は微生物に存在しない化合物である 50 (6) JP 2008-524992 A 2008.7.17 。生体異物化合物は、薬学的に活性なこともある。本発明の生体異物化合物は、好ましく は、水に容易に溶けない。例えば、前記化合物の水溶性は、２５℃で１ｍｇ／ｍｌ以下、 ０．７５ｍｇ／ｍｌ以下、０．５ｍｇ／ｍｌ以下、０．２５ｍｇ／ｍｌ以下、０．１ｍｇ ／ｍｌ以下、０．０８ｍｇ／ｍｌ以下、０．０６ｍｇ／ｍｌ以下、０．０４ｍｇ／ｍｌ以 下、または０．０２ｍｇ／ｍｌ以下とすることができる。 【００２０】 「シクロスポリン化合物」は、免疫抑制作用を有するシクロスポリン、またはその誘導 体である。前記用語は、天然由来のシクロスポリン、シクロスポリンＡ∼Ｚ、ＩＳＡ２４ ７、米国特許第４，１０８，９８５号、第４，２１０，５８１号、および第４，２２０， ６４１号明細書に開示されているような合成および人工のジヒドロ−およびイソ−シクロ 10 スポリン、米国特許第４，３８４，９９６号、第４，７０３，０３３号、第４，７６４， ５０３号、第４，７７１，１２２号、第４，７９８，８２３号、第４，８８５，２７６号 、第５，５２５，５９０号、第５，６４３，８７０号、第５，７６７，０６９号明細書で 示されているような誘導体化シクロスポリン、および国際公開第ＷＯ０２０６９９０２号 、第ＷＯ０３０３３０１０号、第ＷＯ０３０３０８３４号、および第ＷＯ０４０５０６８ ７号明細書で提供されているシクロスポリン誘導体化合物を含む。 【００２１】 ＩＳＡ２４７およびその代謝物 ＩＳＡ２４７（ＩＳＡＴＸ２４７またはＩＳＡ）およびそのＩＳＡ関連ファミリーにつ いては、米国特許第６，６１３，７３９号および第６，６０５，５９３号明細書に図示さ 20 れている。シクロスポリンＡと同様、ＩＳＡ２４７はほぼ完全に疎水性アミノ酸から成る 環状ウンデカペプチドである。これらのアミノ酸の多くは、通常、哺乳類タンパク質には 認められない。図１は、ＩＳＡ２４７の構造と、この分子の環状ペプチド環を有する１１ アミノ酸残基を図示している。図のように、前記アミノ酸残基は時計回りの方向に番号が 付けてある。図１に示す通り、１１員環アミノ酸の１１アミノ酸のうち７アミノ酸がＮ− メチル化されている。残り４つのプロトン化された窒素原子はカルボニル基と分子間水素 結合を形成することができ、これがＣｓＡおよびＩＳＡ２４７のシクロスポリン骨格の硬 度に実質的に貢献している。ＣｓＡの溶解度は２５℃で約０．０４ｍｇ／ｍｌである。水 溶性が低いため、シクロスポリンＡの生物学的利用能は、ヒトに経口投与した場合で３０ ％以下であることが知られている。ＩＳＡ２４７も同様に水溶性が低い。 30 【００２２】 ＩＳＡ２４７は、サルコシン残基（３文字の略語はＳａｒであり、サルコシンはメチル 化グリシン残基であり、ＭｅＧｌｙと略されることもある）、Ｄ−およびＬ−アラニン（ Ａｌａ）残基のいずれか１つ、α−アミノ酪酸残基（Ａｂｕ）、バリン（Ｖａｌ）残基、 Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）残基、４つのＮ−メチルロイシン（ＭｅＬｅｕ）残基、 および（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４，Ｎ−ジメチル−Ｌ−トレオニン（ ＭｅＢｍｔ）と呼ばれる、シクロスポリンに特有の、アルケンを含む９炭素である、β− 水酸化アミノ酸を含む。ＩＳＡ２４７の化学名は、シクロ｛｛（Ｅ）−および（Ｚ）−（ ２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル−２−（メチルアミノ）−６，８−ノ ナジエノイル｝−Ｌ−２−アミノブチリル−Ｎ−メチル−グリシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロ 40 イシル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アラニル−Ｎ−メ チル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル｝である。そ の実験式は、Ｃ６３Ｈ１１１Ｎ１１Ｏ１２．Ｉである。分子量は約１２１４．８５である 。 【００２３】 ＩＳＡ２４７は、シス−ＩＳＡ２４７（またはＺ−ＩＳＡ２４７）およびトランス−Ｉ ＳＡ２４７（またはＥ−ＩＳＡ２４７）の２つの異性体として存在することが知られてい る。図２Ａおよび２Ｂは、ＩＳＡ２４７のトランスおよびシス体を示している。前記ＩＳ Ａ２４７化合物のシス体およびトランス体の混合物は、ＣｓＡよりも毒性が低く、強力で あることが分かった（米国特許第６，６０５，５９３号および第６，６１３，７３９号明 50 (7) JP 2008-524992 A 2008.7.17 細書を参照）。さらに、ＩＳＡ２４７は、シス体およびトランス体の混合物として、前記 混合物がトランス異性体を高比率で含む場合、ＣｓＡよりも毒性が低く、強力であること が分かった。ＩＳＡ２４７を参照した場合、ＩＳＡ２４７はシスおよびトランス異性体の 混合物であり、前記混合物は前記化合物のトランス異性体を多く含むこともあることは、 当業者が理解することとする。前記異性体化合物は混合物として存在し、シス：トランス 比は１：９９∼９９：１の範囲である。 【００２４】 ＩＳＡ２４７代謝物は以下のように記述することができる。式１の化合物であって、 【化１】 10 20 【００２５】 Ｒ１は以下の群から選択される。 【００２６】 (8) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【化２−１】 10 20 30 【００２７】 【化２−２】 40 【００２８】 式中、Ｒ２はＣＨ３およびＨから成る群から選択され、Ｒ３はＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２ およびＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＯＨから成る群から選択され、Ｒ４はＣＨ（ＣＨ３）２およ びＣ（ＣＨ３）２ＯＨから成る群から選択される。 【００２９】 前記ＩＳＡ２４７化合物のアミノ酸１で修飾されたＩＳＡ２４７代謝物の構造は、表１ 50 (9) JP 2008-524992 A 2008.7.17 に示されている。長方形の部分は、修飾されたアミノ酸１とシクロスポリン構造の環状部 分を形成するアミノ酸２∼１１であり、図１を参照のこと。表１はアミノ酸１で修飾され たＩＳＡ２４７代謝物の完全な表ではない。例えば、アミノ酸１代謝物は、５、６、７、 または８員環を含むこともできる。 【００３０】 【表１−１】 10 20 30 【００３１】 (10) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【表１−２】 10 20 30 【００３２】 (11) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【表１−３】 10 20 30 【００３３】 ＩＳＡ２４７代謝物にはＮ−脱メチル化代謝物を含み、前記Ｎ−脱メチル化は、例えば ＩＭ４ｎ（つまり、ＩＳＡ２４７ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ，Ｎ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉ ｏｎ ａｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−４）などのアミノ酸のアミド結合にある、少なくと も１つのメチル化窒素で起こる。Ｎ−脱メチル化は、アミノ酸−３（ＩＭ３ｎ）、アミノ 酸−４（ＩＭ４ｎ）、アミノ酸−６（ＩＭ６ｎ）、アミノ酸−９（ＩＭ９ｎ）、アミノ酸 −１０（ＩＭ１０ｎ）、またはアミノ酸−１１（ＩＭ１１ｎ）で起こる可能性がある。Ｉ 40 ＳＡ２４７代謝物には水酸化代謝物も含み、前記水酸化は、例えばアミノ酸４、６、９、 または１０（ＩＭ４、ＩＭ６、ＩＭ９、またはＩＭ１０）などの少なくとも１つのメチル ロイシンアミノ酸、またはバリン残基５（ＩＭ５）またはメチルバリン残基１１（ＩＭ１ １）で起こる。ＩＭ４６ではアミノ酸４および６のいずれも水酸化され、ＩＭ４９ではア ミノ酸４および９のいずれなども水酸化される。Ｎ−脱メチル化および水酸化代謝物が組 み合わされることもあり、表１に示す通り、Ｎ−脱メチル化または水酸化にアミノ酸−１ が変化した代謝物が組み合わさることもある。ＩＳＡ２４７代謝物には、ＩＳＡ２４７の 水酸化代謝物のグルクロニド、スルホニド、グリコシル化、およびリン酸化誘導体である 代謝物も含む。同時係属中で指定代理人に譲渡された米国特許出願第号（弁護士整理番号 １６５９３−００９００１、２００５年１２月１９日出願）では、ＩＳＡ２４７代謝物お 50 (12) JP 2008-524992 A 2008.7.17 よびその使用法を提供している。 【００３４】 ＩＳＡ２４７代謝物の調整法 ＩＳＡ２４７の代謝物は、まずシス：トランスＩＳＡ２４７の５０：５０混合物を投与 された被験者のヒト全血を用いて分析した（実施例１）。図３は、この被験者の全血から 単離した代謝物の代謝プロフィールを示したＨＰＬＣスキャンである。ヒト全血に有機抽 出法を用い、代謝物を抽出、乾燥、メタノールに再溶解し、質量分析と連動したクロマト グラフィー法により同定した。図３に示す通り、ヒト全血では、少なくとも３つのジオー ル代謝物、２つの水酸化代謝物、および３つのＮ−脱メチル化代謝物が検出可能であった 。 10 【００３５】 ＩＳＡ２４７代謝物を産生するため、イヌ肝ミクロソーム試料も使用した（実施例２） 。ＩＳＡ２４７代謝物はこの方法で生産可能であるが、その収率は低く、コストは高かっ た。従って、このアプローチを用いて、意味のある量のＩＳＡ２４７代謝物を得ることは 実用的ではない。 【００３６】 これまでの経験では、本発明以前に、多量のＣｓＡおよびＩＳＡ２４７の代謝物を産生 する方法として慣習的な生体内変換法が報告されていなかったが、これはおそらくこれら の化合物が親油性の性質を持つためである。理論に縛られることは望まないが、問題は、 ＩＳＡ２４７などの疎水性化合物が、培養を行い前記産生物の代謝物を処理するために用 20 いる、ろ過器、カラム、その他の器具の表面に付着する傾向を有することであると本発明 者らは考えている。また、これらの非常に高い親油性の化合物は、培養中微生物の水性環 境で溶液に溶けない。培養された微生物は、代謝するためにこれらの親油性化合物に近づ くことができない可能性がある。いくつかの観点では、微生物の増殖試料に薬物を提供す ることが、哺乳類に薬物を提供することと差がない。前記薬物の生物学的利用能を向上さ せる製剤が必要なこともある。 【００３７】 ヒトでは、シトクロムＰ４５０酵素がＣｓＡから代謝物を形成することが知られている 。シトクロムＰ４５０酵素はＩＳＡ２４７代謝物の形成にも作用することが分かってきた 。特に、シトクロムＰ４５０酵素のＣＹＰ３Ａ４は、シクロスポリンおよびＩＳＡ２４７ 30 の代謝に関与する酵素として同定された。ヒトで得られた代謝プロフィールと同様のプロ フィールを作成するため、前記生体内変換系では、微生物の活発な増殖および代謝に適し た培地と培養条件下で増殖し、ヒトシトクロムＰ４５０酵素に相当する微生物の酵素を有 する微生物を利用する必要がある。 【００３８】 生体内変換法はＳｍｉｔｈら（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９７ ４）１６１：５５１−５５８）が例示している。ＵｒｌａｃｋｅｒおよびＳｃｈｍｉｄ（ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）１３（６）：５５７−６４） は、原核生物のＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素を用いて生体内変換を行うことができる 、と指摘している。ＶｅｎｉｓｅｔｔｙおよびＣｉｄｄｉ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍ 40 ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３）４（３）：１５３−１６ ７）は、新規薬物を見つけるため、天然の薬物に微生物を応用することを提案した。 【００３９】 Ｓｅｂｅｋｉａ ｂｅｎｉｈａｎａにより、メタノールに溶解したシクロスポリンＡの ［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４シクロスポリン（ＡＭ４）および［γ−ヒドロキシ− ＭｅＬｅｕ］４［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］６シクロスポリン（ＡＭ４６）への生体 内変換は、米国特許第６，２５５，１００号明細書に開示された。しかし、ＣｓＡをヒト に投与する場合、ＴＤＭ用に産生され、モニタリングされる主な代謝物はＡＭ１（アミノ 酸−１、ＭｅＢｍｔで水酸化されたＣｓＡの代謝物）、ＡＭ９（アミノ酸９位のＭｅＬｅ ｕで水酸化された代謝物）、およびＡＭ４ｎ（アミノ酸４位のＭｅｌｅｕで脱メチル化さ 50 (13) JP 2008-524992 A 2008.7.17 れたＣｓＡ代謝物）であることに注意する必要がある（ＬｅＧａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃ ｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４）２７（１）：４３−８）。そのため、Ｓｅｂｅｋ ｉａ ｂｅｎｉｈａｎａは、ＣｓＡの哺乳類代謝プロフィールを模倣した代謝プロフィー ルを提供しない微生物を例示している。 【００４０】 本明細書では、生体内変換を利用し、ＩＳＡ２４７の代謝物を産生できることを証明す る。実施例３に示した通り、ＩＳＡ２４７および界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０ （ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）を含む混合物をＳａｃｃｈａｒｏｐ ｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｅｒａｅａに到達させることで、ヒト血液に認められるＩ ＳＡ２４７代謝物の主なカテゴリーは、すべて産生された。特に、７種類のＩＳＡ２４７ 10 代謝物が検出され、それはＩＭ４ｎ（アミノ酸４でＮ−脱メチル化されたＩＳＡ２４７代 謝物）、ＩＭ９（アミノ酸９で水酸化されたＩＳＡ２４７代謝物）、ＩＭ４（アミノ酸４ で水酸化されたＩＳＡ２４７代謝物）、ＩＭ１−ｃ−１（表１を参照）、ＩＭ１−ｄ−１ （表１）、ＩＭ１−ｄ−２（表１）、およびＩＭ１−ｄ−３（表１）であった。微生物に よって産生されるＩＳＡ２４７代謝物の種類、数、量は異なり、前記産生は培地を変更す ることで最適化することができる（実施例５）。さらに、特定の微生物では、異なる界面 活性剤または溶媒を使用することで、代謝物の量が増加するか、産生プロフィールが改善 することがある。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｅｒａｅａ を使用した場合、ＰＥＧ ４００およびグリセロールにより代謝物の産生量が多くなるが （実施例４）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０は、Ｂｅａｕｖａｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ 20 により産生される代謝物の種類をかなり増加させた（実施例６）。 【００４１】 その結果、本発明の一観点では、微生物中の生体異物化合物の少なくとも１つの代謝物 を産生する方法を提供し、この方法は、 （ａ）前記生体異物化合物と界面活性剤との混合物を提供する工程と、 （ｂ）前記混合物を前記微生物の培養液に添加する工程と、 （ｃ）前記代謝物が形成するのに十分な時間、前記培養液を培養する工程とを有する。前 記方法は、選択的に、さらに前記培養液から前記代謝物を単離する工程を有することもあ る。 【００４２】 30 本発明の特定の実施形態では、本明細書に示したような溶解性の低い化合物、特にシク ロスポリン（例えば、ＩＳＡ２４７およびＣｓＡ）、マクロライドラクトン（例えば、Ｆ Ｋ５０６）、およびトリエンマクロライド（例えば、ラパマイシン）などの免疫抑制化合 物の代謝物を大量に産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ生体内変換系を提供している。適切な生体 異物化合物については、詳細を以下に考察する。 【００４３】 さらに、親化合物−界面活性剤の混合物を増殖培地に前記微生物を含めた生物反応混合 物に添加後、前記生物反応を一時、前記親化合物が代謝される条件下で進めることができ る。前記目標時間の後、前記代謝物を前記生物反応混合物から抽出し、高圧液体クロマト グラフィーおよび質量スペクトル解析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）などのクロマトグラフィーによ 40 り分離精製する。核磁気共鳴分析を利用し、個々の代謝物が互いに単離されたことを確認 し、その構造を確認することができる。別の化学構造として確認された個々の代謝物は、 その後のアッセイで標準として使用することができる。 【００４４】 精製された代謝物は、ＴＤＭアッセイで使用されることもある。例えば、ＩＳＡ２４７ は、免疫抑制を達成し、移植臓器の拒絶反応を抑制するのに十分な量で、臓器移植患者に 投与することができる。前記患者で適切な薬物濃度が維持され、従って、移植臓器の拒絶 反応を予防するために適切な免疫抑制剤の濃度を維持していることを確認するため、時間 を置いて前記患者から採血することもある。ＩＳＡ２４７の血中濃度を測定することもあ る。さらに少なくとも１種類の代謝物の血中濃度をモニタリングし、前記患者の身体が予 50 (14) JP 2008-524992 A 2008.7.17 測可能な方法で前記薬物を代謝していることを確認することもある。前記患者の系から前 記薬物を排泄するように患者自身の代謝が機能していない場合、未代謝の活性薬物の血中 濃度が上昇し、患者の投与法に変更が必要となることもある。定量は、例えばイムノアッ セイまたはＨＰＬＣ−ＭＳにより行うことができる。同様に、ＩＳＡ２４７またはその代 謝物の１つに特異的な抗体を開発することもできる。 【００４５】 本発明のいくつかの実施形態では、エタノール中のＩＳＡ２４７をグリセロールと混合 し、次にＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｅｒａｅａを含む生体内変換 系（ＡＴＣＣ １１６３５など）に添加する。他の実施形態では、前記生体内変換系にＩ ＳＡ２４７を添加する前に、ＰＥＧ ４００をエタノール中のＩＳＡ２４７と混合する。 10 他の実施形態では、前記生体内変換系にＩＳＡ２４７を添加する前に、ヒマシ油をエタノ ール中のＩＳＡ２４７と混合する。他の実施形態では、前記生体内変換系にＩＳＡ２４７ を添加する前に、ミリスチン酸イソプロピルをエタノール中のＩＳＡ２４７と混合する。 他の実施形態では、前記生体内変換系にＩＳＡ２４７を添加する前に、クレモホール（登 録商標）をエタノール中のＩＳＡ２４７と混合する。他の実施形態では、前記生体内変換 系にＩＳＡ２４７を添加する前に、ラブラゾール（登録商標）をエタノール中のＩＳＡ２ ４７と混合する。他の実施形態では、前記生体内変換系にＩＳＡ２４７を添加する前に、 ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０をエタノール中のＩＳＡ２４７と混合する。 【００４６】 さらなる典型的な生体異物化合物 20 水溶液で溶解性が低い薬物のさらなる例には、鎮痛薬／解熱剤（例えば、アスピリン、 アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセンナトリウム、ブプレノルフィン、塩 酸プロポキシフェン、ナプシル酸プロポキシフェン、塩酸メペリジン、塩酸ヒドロモルホ ン、モルヒネ、オキシコドン、コデイン、酒石酸水素ジヒドロコデイン、ペンタゾシン、 酒石酸水素ヒドロコドン、レボルファノール、ジフルニサル、トロラミンサリチル塩、塩 酸ナルブフィン、メフェナム酸、ブトルファノール、サリチル酸コリン、ブタルビタール 、クエン酸フェニルトロキサミン、クエン酸ジフェンヒドラミン、メトトリメプラジン、 塩酸シンナメドリン、およびメプロバメート）、抗喘息薬（例えば、ケトチフェンおよび トラキサノックス）、抗生物質（例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン、クロラム フェニコール、セファロスポリン、アンピシリン、ペニシリン、テトラサイクリン、およ 30 びシプロフロキサシン）、抗うつ薬（例えば、ネフォパム、オキシペルチン、ドキセピン 、アモキサピン、トラゾドン、アミトリプチリン、マプロチリン、フェネルジン、デシプ ラミン、ノルトリプチリン、トラニルシプロミン、フルオキセチン、ドキセピン、イミプ ラミン、パモ酸イミプラミン、イソカルボキサジド、トリミプラミン、およびプロトリプ チリン）、抗糖尿病薬（例えば、ビグアニドおよびスルホニルウレア誘導体）、抗真菌薬 （例えば、グリセオフルビン、ケトコナゾール、イトラコナゾール、アンフォテリシンＢ 、ナイスタチン、およびカンジシジン）、降圧薬（例えば、プロプラノロール、プロパフ ェノン、オキシプレノロール、ニフェジピン、レセルピン、トリメタファン、フェノキシ ベンズアミド、塩酸パルジリン、デセルピジン、ジアゾキシド、グアネチジンモノサルフ ェート、ミノキシジル、レシナミン、ニトロプルシドナトリウム、インドジャボク、アル 40 サーオキシロン、およびフェントラミン）、抗炎症薬（例えば、（非ステロイド系）イン ドメタシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、ラ ミフェナゾン、ピロキシカム、（ステロイド系）コルチゾン、デキサメサゾン、フルアザ コルト、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、およびプ レドニゾン）、抗悪性腫瘍薬（例えば、シクロフォスファミド、アクチノマイシン、ブレ オマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトト レキセート、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル− ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリ ン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、パクリタキセルおよびその誘導体、ドセタキセルおよ びその誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、およびピポスルファ 50 (15) JP 2008-524992 A 2008.7.17 ン）、抗不安薬（例えば、ロラゼパム、プラゼパム、クロルジアゼポキシド、オキサゼパ ム、クロラゼプ酸二カリウム、ジアゼパム、パモ酸ヒドロキシジン、塩酸ヒドロキシジン 、アルプラゾラム、ドロペリドール、ハラゼパム、クロルメザノン、およびダントロレン ）、抗片頭痛薬（例えば、エルゴタミン、プロプラノロール、イソメテプテン・ムケート （ｉｓｏｍｅｔｈｅｐｔｅｎｅ ｍｕｃａｔｅ）、およびジクロラルフェナゾン）、鎮静 剤／睡眠薬（例えば、ペントバルビタール、ペントバルビタール、およびセコバルビツー ルなどのバルビツール酸塩、および塩酸フルラゼパム、トリアゾラム、およびミダゾラム などのベンゾジアゼピン）、抗狭心症薬（例えば、β−アドレナリン遮断薬、ニフェジピ ン、およびジルチアゼムなどのカルシウムチャネル遮断薬、およびニトログリセリン、硝 酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリトール、および四硝酸エリトリチルなどの硝酸塩 10 ）、抗精神病薬（例えば、ハロペリドール、コハク酸ロキサピン、塩酸ロキサピン、チオ リダジン、塩酸チオリダジン、チオチキセン、フルフェナジン、デカン酸フルフェナジン 、エナント酸フルフェナジン、トリフルオペラジン、クロルプロマジン、ペルフェナジン 、クエン酸リチウム、およびプロクロルペラジン）、抗不整脈薬（例えば、ブレチリウム トシレート、エスモロール、ベラパミル、オミオダロン、エンカイニド、ジゴキシン、ジ ギトキシン、メキシレチン、リン酸ジソピラミド、プロカインアミド、硫酸キニジン、グ ルコン酸キニジン、ポリガラクツロン酸キニジン、酢酸フレカイニド、トカイニド、およ びリドカイン）、抗関節炎薬（例えば、フェニルブタゾン、スリンダク、ペニシラミン、 サルサラート、ピロキシカム、アザチオプリン、インドメタシン、メクロフェナメート、 金チオリンゴ酸ナトリウム、ケトプロフェン、オーラノフィン、アウロチオグルコース、 20 およびトルメチンナトリウム）、抗痛風薬（例えば、コルヒチン、およびアロプリノール ）、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ヘパリンナトリウム、およびワルファリン・ナトリウ ム）、血栓溶解薬（例えば、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、およびアルテプラーゼ ）、抗線溶薬（例えば、アミノカプロン酸）、血液レオロジー作用薬（例えば、ペントキ シフィリン）、抗血小板薬（例えば、アスピリン）、抗けいれん薬（例えば、バルプロ酸 、ジバルプロックスナトリウム、フェニトイン、フェニトインナトリウム、クロナゼパム 、プリミドン、フェノバルビトール（ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔｏｌ）、カルバマゼピン、 アモバルビタール・ナトリウム、メトスクシミド、メタルビタール、メフォバルビタール 、メフェニトイン、フェンスクシミド、パラメタジオン、エトトイン、フェナセミド、セ コバルビトール・ナトリウム（ｓｅｃｏｂａｒｂｉｔｏｌ ｓｏｄｉｕｍ）、クロラゼプ 30 酸二カリウム、トリメタジオン）、抗パーキンソン病薬（例えば、エトスクシミド）、抗 ヒスタミン薬／かゆみ止め薬（例えば、ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、クロルフ ェニラミン、マレイン酸ブロムフェニラミン、塩酸シプロヘプタジン、テルフェナジン、 フマル酸クレマスチン、トリプロリジン、カルビノキサミン、ジフェニルピラリン、フェ ニンダミン、アザタジン、トリペレナミン、マレイン酸デキシクロルフェニラミン（ｄｅ ｘｃｈｌｏｒｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ ｍａｌｅａｔｅ）、メトジラジン、および）、抗 菌薬（例えば、硫酸アミカシン、アズトレオナム、クロラムフェニコール、パルミチン酸 クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、パルミチン酸クリンダ マイシン、リン酸クリンダマイシン、メトロニダゾール、塩酸メトロニダゾール、硫酸ゲ ンタマイシン、塩酸リンコマイシン、硫酸トブラマイシン、塩酸バンコマイシン、硫酸ポ 40 リミキシンＢ、コリスチメセートナトリウム（ｃｏｌｉｓｔｉｍｅｔｈａｔｅ ｓｏｄｉ ｕｍ）、および硫酸コリスチン）、抗ウイルス薬（例えば、インターェロンα、β、また はγ、ジドブジン、塩酸アマンタジン、リバビリン、およびアシクロビル）、抗菌薬（例 えば、セファゾリンナトリウム、セフラジン、セファクロール、セファピリンナトリウム 、セフチゾキシムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフォテタン２ナトリウム、 セフロキシムｅアゾチル（ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ ｅ ａｚｏｔｉｌ）、セフォタキシム ナトリウム、セファドロキシル一水和物、セファレキシン、セファロチンナトリウム、塩 酸セファレキシン一水和物、セファマンドール・ナファート、セフォキシチンナトリウム 、セフォニシドナトリウム、セフォラニド、セファドロキシル、セフラジン、およびセフ ロキシムナトリウムなどのセファロスポリン、アンピシリン、アモキシシリン、ペニシリ 50 (16) JP 2008-524992 A 2008.7.17 ンＧベンザチン、シクラシリン、アンピシリンナトリウム、ペニシリンＧカリウム、ペニ シリンＶカリウム、ピペラシリンナトリウム、オキサシリンナトリウム、塩酸バカンピシ リン、クロキサシリンナトリウム、チカルシリン２ナトリウム、アゾシリンナトリウム、 カルベニシリンインダニルナトリウム、ペニシリンＧプロカイン、メチシリンナトリウム 、およびナフシリンナトリウムなどのペニシリン、エチルコハク酸エリスロマイシン、エ リスロマイシン、エリスロマイシン・エストレート、ラクトビオン酸エリスロマイシン、 ステアリン酸エリスロマイシン、およびエチルコハク酸エリスロマイシンなどのエリスロ マイシン、および塩酸テトラサイクリン、ドキシサイクリン・ハイクラート、および塩酸 ミノサイクリンなどのテトラサイクリン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン）、抗 感染薬（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）、気管支拡張薬（例えば、塩酸エピネフリン、硫酸メタ 10 プロテレノール、硫酸テルブタリン、イソエタリン、イソエタリン・メシラート、塩酸イ ソエタリン、ビトルテロルメシラート（ｂｉｔｏｌｔｅｒｏｌｍｅｓｙｌａｔｅ）、塩酸 イソプロテレノール、硫酸テルブタリン、酒石酸水素エピネフリン、硫酸メタプロテレノ ール、エピネフリン、および酒石酸水素エピネフリンなどの交感神経刺激薬、臭化イプラ トロピウムなどの抗コリン薬、アミノフィリン、ジフィリン（ｄｙｐｈｙｌｌｉｎｅ）、 硫酸メタプロテレノール、およびアミノフィリンなどのキサンチン、クロモグリク酸ナト リウムなどの肥満細胞安定薬、ステロイド化合物およびホルモン（例えば、ダナゾール、 テストステロン・シピオネート、フルオキシメステロン、エチルテストステロン、テスト ステロン・エナテート（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｅｎａｔｈａｔｅ）、メチルテスト ステロン、フルオキシメステロン、およびテストステロン・シピオネートなどのアンドロ 20 ゲン、エストラジオール、エストロピペート、抱合エストロゲンなどのエストロゲン、酢 酸メトキシプロゲステロン、および酢酸ノルエチンドロンなどのプロゲスチン、トリアム シノロン、ベタメタゾン、リン酸ベタメタゾンナトリウム、デキサメタゾン、リン酸デキ サメタゾンナトリウム、酢酸デキサメタゾンプレドニゾン、酢酸メチルプレドニゾロン懸 濁液、トリアムシノロン・アセトニド、メチルプレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナ トリウム、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリ ウム、トリアムシノロンヘキシアセトニド、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンシピオ ネート、プレドニゾロン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸パラメタゾン、テブト酸プレド ニゾロン、酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、およびコハク酸ヒド ロコルチゾンナトリウムなどのコルチコステロイド、およびレボチロキシンナトリウムな 30 どの甲状腺ホルモン）、血糖降下薬（例えば、グリブリド、クロルプロパミド、トルブタ ミド、およびトラザミド）、脂質低下薬（例えば、クロフィブラート、デキストロサイロ キシン・ナトリウム、プロブコール、プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔｉｔｉｎ）、アト ルバスタチン、ロバスタチン、およびナイアシン）、抗潰瘍薬／逆流防止薬（例えば、フ ァモチジン、シメチジン、および塩酸ラニチジン）、制嘔吐剤／制吐薬（例えば、塩酸メ クリジン、ナビロン、プロクロルペラジン、ジメンヒドリナート、塩酸プロメタジン、チ エチルペラジン、およびスコポラミン）、および油溶性ビタミンを含む。これらの溶解性 が低い化合物の代謝物は、本発明の方法により産生することができる。 【００４７】 微生物 40 生体内変換を成功させるために適した微生物は、前記親化合物を代謝させる能力を有す るシトクロムＰ４５０酵素などの微生物酵素の有無に基づき選択することができる。生体 内変換法に有用と考えられる微生物は、シトクロムＰ４５０活性を有する細菌、真菌、お よび放線菌などである。これらの酵素を有する生物は、ＩＳＡ２４７投与後の血液または 尿に認められる代謝物と生体内変換または微生物変換試料を用いた場合に認められる代謝 物を比較することで、経験的に同定することができる。例えば、ＣＹＰ３Ａ４は、テスト ステロンを水酸化することで６β−ヒドロキシテストステロンを産生する能力により特徴 付けられるヒトＰ４５０酵素である。前記酵素はクロトリマゾールおよびナリンゲニンな どの化合物により阻害される。これはカルバマゼピン、フェノバルビタール、およびリフ ァンピンにより誘導される。シトクロムＰ４５０活性を有する酵素を発現し、増殖培地で 50 (17) JP 2008-524992 A 2008.7.17 増殖する微生物は、テストステロンを前記培地に導入するときに６β−ヒドロキシテスト ステロンを産生するはずであり、この産生は既知の阻害薬および誘導薬の影響を受けるは ずである。ＣＹＰ３Ａ４によって代謝される他の基質には、例えば、アセトアミノフェン 、ジアゼパム、テオフィリン、ワルファリン、タキソール、およびニフェジピンを含む。 同様に、これらの化合物が微生物を含む培地に導入されると、前記微生物が前記酵素を発 現している場合、前記基質を代謝するはずである。 【００４８】 既知の解明された酵素は、既知の解明された活性を有するものである。代謝化合物の構 造を既知の酵素活性と比較することで、前記化合物の代謝活性を有する酵素を同定するこ とが可能である。前記同定された酵素の有無について、微生物をスクリーニングすること 10 も可能である。そのため、本発明の一観点では、生体内変換系での使用に適した微生物を 同定する方法を提供しており、前記方法は、ａ）代謝される化合物の構造を既知の酵素活 性と比較する工程と、ｂ）望みの酵素活性を発現した酵素を同定する工程と、ｃ）前記同 定された酵素を発現した微生物を同定する工程と、ｄ）生体内変換処理に前記同定された 酵素を発現した微生物を使用し、前記化合物の代謝物を作成する工程とを有する。この方 法を用いることで、化合物の代謝物を産生するために有用と考えられる微生物を同定する ことができる。 【００４９】 或いは、遺伝子配列データを用い、微生物の遺伝子配列と、例えばＣＹＰ３Ａ４などの シトクロム酵素をコードした既知の哺乳類遺伝子の配列とを比較することで、有用と考え 20 られる微生物を同定することができる。適当な遺伝子配列を有し、適切な条件で増殖させ た微生物は、目標酵素を発現しているはずである。対照化合物に加え、特定のヒトＰ４５ ０酵素を阻害または誘導する化合物は、両方の系で検討することができる。 【００５０】 特定のシトクロム酵素によって代謝されることが知られている薬物には、（１）ＣＹＰ １Ａ２により分解されるアセトアミノフェン、芳香族アミン、カフェイン、エストラジオ ール、イミプラミン、フェナセチン、テオフィリン、およびワルファリン、（２）ＣＹＰ ２Ｄ６により分解されるアミトリプチリン、ブフロロール（ｂｕｆｕｒｏｌｏｌ）、カプ トプリル、クロゼピン（ｃｌｏｚｅｐｉｎｅ）、デブリソキン（ｄｅｂｒｉｓｏｐｕｉｎ ｅ）、フレカイニド、フルオキセチン、ハロペリドール、メトプロロール、メキシレチン 30 、スパルテイン、チモロール、トモキセチン、プロプラノロール、およびコデイン、（３ ）ＣＹＰ３Ａ４により分解されるアセトアミノフェン、ジアゼパム、アミオダロン、ベン ズフェタミン、カルバマゼピン（ｃａｒｂｅｍａｚｅｐｉｎｅ）、シクロスポリン、ジギ トキシン、ジルチアゼム、エリスロマイシン、エトポシド（ｅｔｏｐｉｓｉｄｅ）、フル タミド、イミプラミン、リドカイン、ロラチジン、ニフェジピン、ミダゾラム、レチノイ ン酸、ステロイド、タモキシフェン、タキソール、テルフェナジン、ＴＨＣ、ベラパミル 、およびワルファリンを含む。 【００５１】 ＣＹＰ３Ａ４酵素を発現し、生体内変換法に有用と考えられる微生物には、Ａｃｔｉｎ ｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．（例えば、ＡＴＣＣ番号５３７７１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ 40 ｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（例えば、ＡＴＣＣ １３２７３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐ ｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ（例えば、ＡＴＣＣ番号１１６３５）、およびＳｔｒｅｐｔ ｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔｏｎｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ番号３９１１６）を含むが、これだけ に限らない。シトクロムＰ４５０酵素を発現することができる他の有用な微生物には、Ａ ｍｙｃｏｌａｔａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ番号３５２０４）、Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ番号１５４３６） 、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｏｒａ ｈｉｒｓｕｔｅ（例えば、ＡＴＣＣ番号２０５０ １）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖａｎｄｕｌａｅ（例えば、ＡＴＣＣ番号５５２ ０９）、Ｓｔｒｅｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ（例えば、ＡＴＣＣ番号１ ０７６２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ（例えば、ＡＴＣＣ番号２８８ 50 (18) JP 2008-524992 A 2008.7.17 ９３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ番号５５０６０）、 およびＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ（例えば、ＡＴＣＣ番号３３１８）、Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例えば、ＡＴＣＣ番号２０１３７また はＡＴＣＣ番号６４６６７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（例えば、Ａ ＴＣＣ番号３２３５３）、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖａ ｒ． ｅｌｅｇａｎｓ（例えば、ＡＴＣＣ番号３６１１２）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｔｏ ｌｏｎｉｆｅｒ（例えば、ＡＴＣＣ番号６２２７ｂ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｐｉｃｏｌａ （例えば、ＡＴＣＣ番号９６１３４）、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｒｅｎｅｕｓ（例えば、 ＡＴＣＣ番号ＭＹＡ−７２７、ＭＹＡ−７２６、ＭＹＡ−７２８、ＭＹＡ−７２９、ＭＹ Ａ−７３０、ＭＹＡ−７３１）を含む。 10 【００５２】 適切な培養時間、培養条件、抽出および精製法の選択は、当業者に周知である。選択し た微生物の増殖は、例えば炭素および窒素などの栄養素、緩衝系、および微量元素を含む 適切な増殖培地を利用し、増殖を促すｐＨ、温度、および給気条件を利用し、当業者が達 成することができる。典型的な炭素供給源には、グルコース、マルトース、デキストリン 、でんぷん、ラクトース、スクロース、糖蜜、大豆油などを含む。適切な窒素供給源には 、大豆ミール、綿実ミール、魚粉、酵母、酵母エキス、ペプトン、米ぬか、肉エキス、硝 酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどを含む。リン酸塩、塩化ナトリウム、炭酸カルシ ウムなどの無機塩類を添加することもできる。前記微生物の増殖ステージによって、異な る増殖培地を使用することもある。 20 【００５３】 Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ（例えば、ＡＴＣＣ １１ ６３５）、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｏｒａ ｈｉｒｓｕｔｅ（例えば、ＡＴＣＣ ２ ０５０１）、Ａｍｙｃｏｌａｔａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ ３５ ２０４）によるシクロスポリンおよびシクロスポリン誘導体の生物変換での使用に適した 、微生物を増殖させるための典型的な条件および培地は、Ｃｏｒｃｏｎａｎ，Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４３：４８７−４９８（１９７５）、米国特許第５ ，１２４，２５８号、第６，０４３，０６４号、および第６，３３１，６２２号明細書に 提供されている。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．（例えば、ＡＴＣＣ番号５３７７１ ）の増殖条件は、米国特許第５，２７０，１８７号明細書に例示されている。 30 【００５４】 微生物によるマクロライドのその水酸化および／または脱メチル化代謝物への生物変換 のための典型的な増殖条件には、１）米国特許第５，２６８，３７０号に例示され、Ａｃ ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ｓｐ．（Ｍｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＭＡ ６４７４；ＡＴＣＣ番号５３８２８）を用いた、Ｌ−６７９，９３４（ＦＫ−５０ ６）からその代謝物Ｌ−６８３，５１９への脱メチル化について開示された増殖条件、お よび２）米国特許第５，２０２，２５８号に提供された増殖条件を用いた、Ａｃｔｉｎｏ ｐｌａｎｅｓ ｓｐ．（ＡＴＣＣ番号５３７７１）によるＬ−６７９，９３４からＬ−６ ８２，９９３またはＬ−６８３，５９０からＬ−６８３，７４２への脱メチル化を含む。 Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐｐ． ＡＴＣＣ ５３７７１、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌ 40 ｙｓｐｏｒａ ｅｒｔｈｙｒｅａｅ ＡＴＣＣ １１６５３、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖａｎｄｕｌａｅ ＡＴＣＣ ５５２０９、Ｓｔｒｅｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏ ｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ １０７６２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ ＡＴＣＣ ２８８９３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ ＡＴＣＣ ５５０６０ 、およびＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ ＡＴＣＣ ３３１８を用い、ラパマイ シンの水酸化代謝物（例えば、２４−ＯＨラパマイシン）および／または脱メチル化代謝 物（例えば、３９−Ｏ−脱メチル化ラパマイシン）を産生することができる（Ｋｕｈｎｔ ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ ２１：４０５−４１２）。 【００５５】 50 (19) JP 2008-524992 A 2008.7.17 界面活性剤 本発明の方法の実施形態での使用に適した界面活性剤は、微生物の増殖環境に導入する 前の加圧滅菌処理に耐えることができる。適切な界面活性剤は生体適合性界面活性剤であ り、これだけに限らないが、例えばＰＥＧ ３００、ＰＥＧ ４００、ＰＥＧ ６００（ ＢＡＳＦのルトロール（登録商標）Ｅ ３００、ルトロール（登録商標）Ｅ ４００、ル トロール（登録商標）Ｅ ６００、ルトロール（登録商標）Ｆ １２７、およびルトロー ル（登録商標）Ｆ ６８としても知られる）といったポリエチレングリコールなどの非イ オン性界面活性剤、ラブラゾール（登録商標）（Ｇａｔｔｅ Ｆｏｓｓｅ、フランスＣｅ ｄｅｘ）などのカプリロカプロイルマクロゴール−８グリセリド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標 ）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録 10 商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０Ｋ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８１、およびＴｗ ｅｅｎ（登録商標）８５（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｂ ｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ． （ウィスコンシン州Ｍｉｗａｕｋｅｅ）より入手）などのポリオキシエチレンソルビタン 脂肪酸エステル、グリセリン（ＢＤＨ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、オンタリオ州Ｔ ｏｒｏｎｔｏ）、ヒマシ油（Ｗｉｌｅｒ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ、オン タリオ州Ｌｏｎｄｏｎ）、ミリスチン酸イソプロピル（Ｗｉｌｅｒ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ Ｌｔｄ、オンタリオ州Ｌｏｎｄｏｎ）、クレモホール（登録商標）ＥＬ（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ ｓ（登録商標）Ｆ１２７およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）Ｌ１０８（ＢＡＳＦ）な 20 どのポロキサマーを含む。その他の使用できる界面活性剤には、チロキサポール［４−（ １，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノールポリマーとホルムアルデヒドおよびオ キシラン］などの潤滑剤または乳化剤として作用することができる界面活性剤、ＢＡＳＦ のクレモホール（登録商標）Ａ２５、クレモホール（登録商標）Ａ６、クレモホール（登 録商標）ＥＬ、クレモホール（登録商標）ＥＬＰ、クレモホール（登録商標）ＲＨおよび Ｒｈｏｎｅ Ｐｏｕｌｅｎｃ ＣｏのＡｌｋａｍｕｌｓ ＥＬ６２０などのポリエトキシ ル化ヒマシ油、ＨＣＯ−４０などのポリエトキシル化硬化ヒマシ油、およびポリエチレン ９ヒマシ油を含む。 【００５６】 使用できる他の界面活性剤には、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、およびポ 30 リソルベート８０、クレモホール（登録商標）ＲＨ、ポロキサマー、Ｐｌｕｏｎｉｃｓ Ｌ１０、Ｌ３１、Ｌ３５、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｌ４４、Ｌ６１、Ｌ６２、Ｌ６３、Ｌ７２、 Ｌ８１、Ｌ１０１、Ｌ１２１、Ｌ１２２、ＰＥＧ ２０アーモンドグリセリド、ＰＥＧ ２０トウモロコシグリセリドなどを含む。適当な界面活性剤には、アルキルグルコシド、 アルキルマルトシド、アルキルチオグリコシド、ラウリルマクロゴールグリコシド、ポリ オキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェノール、ポリオキシ エチレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールグリセロール脂肪酸エステ ル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、ポリグリセロール脂 肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリド、ポリオキシエチレンステロール、ポリオ キシエチレン植物油、ポリオキシエチレン硬化植物油、ポリオキシエチレンアルキルエー 40 テル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールグリセロール脂 肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−ポ リオキシプロピレンブロック共重合体、ポリグリセロール脂肪酸エステル、ポリオキシエ チレングリセリド、ポリオキシエチレン植物油、ポリオキシエチレン硬化植物油、ＰＥＧ −１０ラウレート、ＰＥＧ−１２ラウレート、ＰＥＧ−２０ラウレート、ＰＥＧ−３２ラ ウレート、ＰＥＧ−３２ジラウレート、ＰＥＧ−１２オレアート、ＰＥＧ−１５オレアー ト、ＰＥＧ−２０オレアート、ＰＥＧ−２０ジオレアート、ＰＥＧ−３２オレアート、Ｐ ＥＧ−２００オレアート、ＰＥＧ−４００オレアート、ＰＥＧ−１５ステアレート、ＰＥ Ｇ−３２ジステアレート、ＰＥＧ−４０ステアレート、ＰＥＧ−１００ステアレート、Ｐ ＥＧ−２０ジラウレート、ＰＥＧ−２５グリセリルトリオレアート、ＰＥＧ−３２ジオレ 50 (20) JP 2008-524992 A 2008.7.17 アート、ＰＥＧ−２０グリセリルラウレート、ＰＥＧ−３０グリセリルラウレート、ＰＥ Ｇ−２０グリセリルステアレート、ＰＥＧ−２０グリセリルオレアート、ＰＥＧ−３０グ リセリルオレアート、ＰＥＧ−３０グリセリルラウレート、ＰＥＧ−４０グリセリルラウ レート、ＰＥＧ−４０パーム核油、ＰＥＧ−５０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ−４０ヒマシ油、 ＰＥＧ−３５ヒマシ油、ＰＥＧ−６０ヒマシ油、ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ−６ ０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ−６０トウモロコシ油、ＰＥＧ−６カプレート／カプロン酸グリ セリド、ＰＥＧ−８カプレート／カプロン酸グリセリド、ポリグリセリル−１０ラウレー ト、ＰＥＧ−３０コレステロール、ＰＥＧ−２５フィトステロール、ＰＥＧ−３０大豆ス テロール、ＰＥＧ−２０トリオレート、ＰＥＧ−４０ソルビタンオレアート、ＰＥＧ−８ ０ソルビタンラウレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＰＯＥ−９ラウリ 10 ルエーテル、ＰＯＥ−２３ラウリルエーテル、ＰＯＥ−１０オレイルエーテル、ＰＯＥ− ２０オレイルエーテル、ＰＯＥ−２０ステアリルエーテル、トコフェリルＰＥＧ−１００ コハク酸塩、ＰＥＧ−２４コレステロール、ポリグリセリル−１０オレアート、スクロー スモノステアレート、スクロースモノラウレート、スクロースモノパルミテート、ＰＥＧ １０−１００ノニルフェノール類、ポロキサマーのＰＥＧ １５−１００オクチルフェ ノール類、ＰＥＧ−３５ヒマシ油、ＰＥＧ−４０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ−６０トウモロコ シ油、ＰＥＧ−２５グリセリルトリオレート、ＰＥＧ−６カプレート／カプロン酸グリセ リド、ＰＥＧ−８カプレート／カプロン酸グリセリド、ポリソルベート２０、ポリソルベ ート８０、トコフェリルＰＥＧ−１０００コハク酸塩、およびポロキサマーのＰＥＧ−２ ４コレステロールなどポリオールの反応混合物も含む。さらに、アーモンドオイル、ババ 20 ス油、ボラージオイル、ブラックカラント種子油、キャノーラ油、ココナッツ油、トウモ ロコシ油、綿実油、月見草油、ブドウの種から取った油、ラッカセイ油、からし油、オリ ーブオイル、パーム油、パーム核油、ピーナッツ油、菜種油、ベニバナ油、ゴマ油、サメ 肝油、大豆油、ひまわり油、硬化ヒマシ油、硬化ココナッツ油、硬化パーム油、硬化大豆 油、硬化植物油、硬化綿実油およびヒマシ油、半硬化大豆油、大豆油、グリセリルトリカ プロエート、グリセリルトリカプリレート、グリセリルトリカプレート、グリセリルトリ ウンデカノエート、グリセリルトリラウレート、グリセリルトリオレート、グリセリルト リリノレート、グリセリルトリリノレネート、グリセリルトリカプリレート／カプレート 、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ラウレート、グリセリルトリカプリレート ／カプレート／リノレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ステアレート、 30 飽和ポリグリコール化グリセリド、リノール酸グリセリド、カプリル酸／カプリン酸グリ セリドなどのオイルを使用することもできる。さらに、界面活性剤および／またはオイル および／またはアルコールの混合物を使用することもできる。 【００５７】 本発明のいくつかの実施形態では、活発に増殖している微生物培養液に添加する前に、 選択した親油性生体異物をアルカノールおよび適切な非イオン性界面活性剤と混合する。 前記親化合物をアルコールと混合する場合、前記アルコールはエタノールとすることがで きる。さらに適切なアルコールには、メタノール、イソプロパノール、１−プロパノール 、および当該分野で周知の他の適切なアルコールを含む。 【００５８】 40 溶媒 本発明のいくつかの実施例では、前記生体異物化合物を微生物培養液に添加する前に、 溶媒と混合する。前記溶媒は、前記生体異物化合物と混合する前に、殺菌されることもあ る。選択的に、界面活性剤も前記生体異物化合物−溶媒混合物に添加される。本発明に適 した溶媒は、前記微生物の増殖および代謝を抑制しない、いかなる溶媒とすることもでき る。前記溶媒は、非極性、非プロトン性極性、またはプロトン性極性とすることができる 。例えば、前記溶媒には、ベンゼン、トルエン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサンなどの炭 化水素系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチルｔ −ブチルエーテル、ジメトキシエタン、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエー テル系溶媒、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノールなどのアル 50 (21) JP 2008-524992 A 2008.7.17 コール、塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１−トリクロロエタンなどのハロゲン含 有溶媒、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルホスホロトリアミ ドなどの他の溶媒を含む。前記溶媒はＤＭＳＯではないことが好ましい。 【００５９】 以下の実施例は本発明を説明するために提供され、いかなる方法でも、本発明の範囲を 制限するものとして解釈されない。本発明は、特にその好適な実施形態を参照して示され 、説明されるものであるが、添付の請求項で定義された本発明の観点と範囲から逸脱せず に、本発明に様々な形態および詳細の変更を加えることができることは、当業者が理解す ることとする。 【００６０】 10 実施例 以下の実施例では、次の略語は次の意味を有する。定義されていない略語は、一般に受 け入れられた意味を有する。 ℃＝摂氏温度 ｈｒ＝時間 ｍｉｎ＝分 ｓｅｃまたはＳ＝秒 μＭ＝マイクロモル ｍＭ＝ミリモル Ｍ＝モル濃度 20 ｍｌ＝ミリリットル μｌ＝マイクロリットル ｍｇ＝ミリグラム μｇ＝マイクログラム ｍｏｌ＝モル ｐｍｏｌ＝ピコモル ＡＴＣＣ＝アメリカンタイプカルチャーコレクション ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水 ＣＳＡ＝シクロスポリンＡ ＴＤＭ＝治療量モニタリング 30 ＬＣ＝液体クロマトグラフィー ＭＳ＝質量分析 ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール 一般的な材料および方法 液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の条件 液体クロマトグラフィー（ＬＣまたはＨＰＬＣ）では、長鎖炭化水素基を多孔質シリカ 基質に化学的に結合することで形成された固定相を有するカラム、つまりＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ８、２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ分析カラム（Ｗａｔｅｒｓ ｃ ａｔ＃ ＷＡＴ ２００６２４）と、Ｐｅｒｉｓｏｒｂ ＲＰ−８（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ Ｃ−６０１）を充填したガードカラム２×２０ｍｍ（ Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ Ｃ−１３０Ｂ）を使用した。前記 ＬＣプログラムで利用された溶媒の割合と流速を表２に示す。 【００６１】 40 (22) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【表２】 10 【００６２】 質量分析（ＭＳ）の条件 質量分析では、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ３０００（分析ソフトウェアｖ１．２）機を用いた。ランタイムは１５分、注入量は５μ Ｌ、ガードカラム温度および分析カラム温度は６０℃とした。手動設定は以下の通りであ る。ターボイオンスプレーは８０００、ターボイオンスプレー水平設定は＋４、ターボイ オンスプレー外側設定は１０とした。前記Ｓｃｉｅｘ機は、表３に示したパラメーターで 設定した。 【００６３】 20 (23) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【表３】 10 20 30 【００６４】 表４は、イオンおよびイオン特異的な機器設定を示している。 【００６５】 (24) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【表４】 10 【実施例１】 【００６６】 全血からのＩＳＡ２４７代謝物の調整 ＩＳＡ２４７（シス：トランスＩＳＡ２４７の５０：５０混合物）投与後のヒトから全 血を採取した。ｔｅｒｔブチル−メチル−エーテル（またはメチルｔｅｒｔブチルエーテ 20 ル、ＭＴＢＥ）を用い、全血からＩＳＡ２４７およびその代謝物を抽出し、乾燥、エタノ ールに再溶解した。２ｍＬのＭＴＢＥ（ｃａｔ．Ｎｏ．７００１−２；Ｃａｌｅｄｏｎ） を２００ｕＬの血液に添加し、１０分間振盪、２分間テーブルトップ型遠心分離機で遠心 分離させた。上部のＭＴＢＥ層を除去し、真空濃縮した。この残渣を２００ｕＬのメタノ ールに再溶解した。ミクロソーム試料および生体内変換試料の抽出と同様、胆汁と尿の抽 出を行うことができる。抽出したら、代謝物をＨＰＬＣ−ＭＳ、ＮＭＲ、または本分野で 既知の他の方法により特徴付けることができる。図３は、一般的な材料および方法で説明 した通りに行われたＬＣ−ＭＳの結果を示している。全血のＩＳＡ２４７代謝物には主に ３群あり、ジオール、水酸化、脱メチル化代謝物である。 【実施例２】 30 【００６７】 イヌ肝ミクロソーム試料によるＩＳＡ２４７代謝物の産生 イヌミクロソームの調整 イヌ肝ミクロソームは以下の方法で調整した。肝臓を取り出した後、１．１５％塩化カ リウム（ＫＣｌ）で灌流し、小片に角切りにし（約２５ｇ）、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナ イザーを用い、１５，０００ｒｐｍで３∼５分、大きな塊が冷却した粉砕用緩衝液（０． １Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ７．４、４℃、緩衝液：肝臓の比１：１）中に分解するまで粉砕 することでホモジネートを生成し、これには肝ミクロソームなどの膜結合性細胞小器官が 含まれた。前記粒子状物質から上清をデカント後、前記上清を９０分間、１００，０００ ×ｇで遠心分離し、ペレットと上清を得た。タンパク質含有量は、Ｌｏｗｒｙのタンパク 40 質測定により決定した。このミクロソーム試料のタンパク質濃度は約２３．２ｍｇ／ｍＬ であった。酵素活性の損失を避けるため、ミクロソームを４．０または６．０ｍＬずつ− ８０℃で保存し、凍結融解の繰り返しを避けた。 【００６８】 以下の成分を２５７ｍＬ三角フラスコに徐々に加えた。５７．３ｍｇのＮＡＤＰ、２５ ４ｍｇのグルコース−６−リン酸、および２３．０ｍｇのＮＡＤＰＨを６．０ｍＬのリン 酸緩衝液（ｐＨ ７．４に調整）に添加した。次に、２．０ｍＬの５．０ｍＭ ＭｇＣｌ 、および６．０ｍＬのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（１０単位／ｍＬ、ＣＡ ＬＢＩＯＣＨＥＭ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏから入手可能、Ｃａｔ．Ｎｏ． ３４６７７４）を前記溶液に添加した。最後に、１０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４ 50 (25) JP 2008-524992 A 2008.7.17 ）を添加した。前述の通り調整した用量６ｍＬのイヌ肝ミクロソームを前記フラスコに添 加した後、ＩＳＡ２４７を添加し、環境を制御した恒温器／振盪器で３７℃、２時間、２ ５０ｒｐｍにて培養した。２時間の時点で、５００μＬの２Ｍ ＨＣｌを添加し、前記反 応を停止した。 【００６９】 次に、この方法で産生される代謝物を有機溶媒で抽出し、さらに高圧液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ）で分離した。前記代謝物は、さらにエレクトロスプレー質量分析（Ｍ Ｓ）およびＮＭＲで特徴を決定した。得られた代謝物のプロフィール（データは示されて いない）は、ヒト全血と同等であった。しかし、前記イヌミクロソームのジオールははる かに少なかった。 10 【実施例３】 【００７０】 Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａを用いた生体内変換による ＩＳＡ２４７代謝物の産生 この実施例では、ヒトシトクロムＰ４５０ミクロソーム酵素に相当する微生物の酵素を 含む微生物を利用した生体内変換系と、前記微生物の活発な増殖に適した培地について説 明する。前記生体内変換系に添加する前に、水に難溶性の親化合物をエタノールおよび界 面活性剤と混合した。この実施例では、ＩＳＡ２４７のエタノール溶液をＴＷＥＥＮ（登 録商標）４０と混合し、次にＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｅｒａｅ ａ（ＡＴＣＣ １１６３５）を含む生体内変換系に添加した。 20 【００７１】 開始培養液は以下の通り調整した。酵母エキス４ｇ／Ｌ、麦芽エキス１０ｇ／Ｌ、デキ ストロース４ｇ／Ｌ、および寒天２ｇ／Ｌを含む、ＩＳＰ２斜面培養の試験管１５本（１ ６×２６ｍｍ、各６ｍｌ）を調整した。これらの成分を最高１リットルの脱塩水中で混合 し、必要に応じてＮａＯＨでｐＨを７に中和した。前記培地は３０分間１００℃で滅菌し た。前記試験管は使用するまで４℃で保存した。各斜面培地にＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｖ ｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ（ＡＴＣＣ番号１１６３５）を播種した。播種した斜面 培地を滅菌条件下、室温で３週間培養した。 【００７２】 前培養液を第Ｉ相培地に移した。第Ｉ相培地は１０ｇ／Ｌデキストリン、１ｇ／Ｌグル 30 コース、３ｇ／Ｌ牛肉エキス、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、およ び４００ｍｇ／Ｌリン酸カリウムで調整した。これらの成分を最高１リットルの脱塩水中 で混合し、必要に応じてＮａＯＨでｐＨを７に中和し、２つのバッフル付き２５０ｍＬ培 養フラスコそれぞれに５０ｍＬずつ入れた。前記培地は３０分間１００℃で滅菌した。Ｓ ａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａを含む斜面培地試験管に、前記 培地５ｍＬを入れた。前記斜面培地表面の細胞をこすり落とし、前記懸濁液２．５ｍＬを 各フラスコに入れた。前記フラスコを２７℃でＬａｂｌｉｎｅ恒温器に入れ、２５０ｒｐ ｍで３日間（７２時間）振盪した。 【００７３】 第Ｉ相フラスコの内容物を３３００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をデカントするこ 40 とで、第Ｉ相培地から第ＩＩ相培地にＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈ ｒａｅａを移し、ペレットを得た。５ｍＬの第ＩＩ相培地を前記ペレットに添加し、前記 試験管をボルテックス、次に３３００ｒｐｍで４分間遠心分離した。前記上清を再びデカ ントした。前記ペレットは第ＩＩ相培地に再懸濁した。前記懸濁液をバッフル付き培養フ ラスコ中、第ＩＩ相培地５０ｍＬに添加した。 【００７４】 第ＩＩ相培地には、１０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ酵母エキス、１ｇ／Ｌ牛肉エキス 、および１１．６ｇ／Ｌの３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液を 含めた。これらの成分は１リットルまでの脱イオン水に混合し、次に５０ｍＬを２つのバ ッフル付き培養フラスコ（２５０ｍＬ）に分配した。５Ｍ ＮａＯＨでｐＨを７．０に調 50 (26) JP 2008-524992 A 2008.7.17 節後、前記培地を３０分間１００℃で加圧滅菌処理し、その後冷却した。ＴＷＥＥＮ（登 録商標）４０はＩＳＡ２４７およびエタノールと混合する前に加圧滅菌処理した。 【００７５】 ＩＳＡ２４７（ＥおよびＺ異性体の約５０／５０混合物４ｍｇ）を９５％エタノール（ ０．１ｍｌ）に溶解し、次に０．４ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）４０（ポリオキシエチ レンソルビタンモノパルミテート、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１５０４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉ ｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）と混合した。前記親化合物−界面活性剤の混合物は 、次に前記第ＩＩ相培地中、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ に添加した。ゼロ時間のサンプルを入手、凍結した。各フラスコのキャップを閉め、２７ ℃でＩｎｎｏｖａ恒温器に入れ、１７０ｒｐｍで振盪しながら、１２０時間培養した。 10 【００７６】 第２のサンプルは前記第ＩＩ相培地から入手した。前記ゼロ時間のサンプルおよび前記 第２のサンプルは、ｔｅｒｔ−ブチル−メチルエーテル（ｃａｔ．Ｎｏ．７００１−２、 Ｃａｌｅｄｏｎ）により抽出した。前記抽出代謝物をメタノール（ＨＰＬＣグレード）に 再溶解し、前述のＬＣ−ＭＳで分析した。図４に示す通り、この方法で得られた代謝物プ ロフィールは、ヒト全血から得られた代謝物プロフィールと同等である（実施例１を参照 ）。前記生体内変換混合物を分析した際、７種類の代謝化合物があることが分かり、それ はＩＭ４ｎ（アミノ酸−４でＮ−脱メチル化されたＩＳＡ２４７代謝物）、ＩＭ９（アミ ノ酸−９で水酸化されたＩＳＡ２４７代謝物）、ＩＭ４（アミノ酸−４で水酸化されたＩ ＳＡ２４７代謝物）、ＩＭ１−ｃ−１（表１参照）、ＩＭ１−ｄ−１（表１）、ＩＭ１− 20 ｄ−２（表１）、ＩＭ１−ｄ−３（表１）であった。従って、ヒトの血液において明らか となったＩＳＡ２４７の代謝物８種類中７種類が、この生体内変換系で産生された。 【実施例４】 【００７７】 Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａを用いた生体内変換におい て前記界面活性剤を変化させる影響 様々な界面活性剤の影響を検討するため、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒ ｙｔｈｒａｅａ（ＡＴＣＣ番号１１６３５）の活発に増殖する第ＩＩ相培養液を前述の通 り調整した。エタノール（０．３３ｍｌ）中ＩＳＡ２４７（５６ｍｇ、ＥおよびＺ異性体 の５０／５０混合物）を含む試験管７本を調整した。界面活性剤（試験管１本につき０． 30 ６７ｍｌ）を以下の通り、各試験管に添加した。 試験管１−ＰＥＧ ４００（ポリエチレングリコール４００、Ｃａｒｂｏｗａｘ−Ｆｉｓ ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州ＦａｉｒＬｏｎｎ）； 試験管２−ヒマシ油（Ｗｉｌｅｒ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ、オンタリオ 州Ｌｏｎｄｏｎ）； 試験管３−ミリスチン酸イソプロピル（Ｗｉｌｅｒ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌ ｔｄ、オンタリオ州Ｌｏｎｄｏｎ）； 試験管４−グリセリン（ＢＤＨ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、オンタリオ州Ｔｏｒｏ ｎｔｏ、ロット番号１２０３４３／７３８６５）； 試験管５−クレモホール（登録商標）ＥＬ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州 40 Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）； 試験管６−ラブラゾール（登録商標）（Ｇａｔｔｅ Ｆｏｓｓｅ、フランスＣｅｄｅｘ） ；および 試験管７−ＴＷＥＥＮ（登録商標）４ （Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ ａｎｙ Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）。 【００７８】 前記親化合物−界面活性剤混合物を活発に増殖しているＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐ ｏｒａ培養液に添加し、ゼロ時間のサンプルを採取した。２７℃で振盪しながら５日間培 養後、サンプルを入手、抽出し、前記代謝物を実施例４に示す通り定量した。図３および ４に示したものと同等なＨＰＬＣピークの曲線下面積は、存在する代謝物量の指標として 50 (27) JP 2008-524992 A 2008.7.17 測定した。前記ＨＰＬＣピークは、ＩＭ４ｎと同定されたＮ−脱メチル化代謝物１種類、 ＩＭ４およびＩＭ９と同定された水酸化代謝物２種類、ＩＭ１−ｃ−１と同定された環状 代謝物１種類、およびジオール代謝物３種類、つまり、ＩＭ１−ｄ−１、ＩＭ１−ｄ−２ 、およびＩＭ１−ｄ−３と同定された前記ＩＳＡ２４７化合物の１アミノ酸で形成された ジオールに対応した（表１を参照）。７種類の前記界面活性剤は、前記生体内変換試料の 代謝物産生を亢進させる活性が、すべて等価ではなかった。図５に示す通り、前記生体内 変換試料にグリセリンまたはＰＥＧ ４００を添加すると、産生される代謝物の量が大き く増加した。しかし、ヒマシ油、ミリスチン酸イソプロピル、クレモホール（登録商標） 、ラブラゾール（登録商標）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０すべてを添加すると、界面活 性剤なしの試料中での代謝物産生よりも、前記生体内変換試料中での代謝物の産生が増加 10 した（図示せず）。 【実施例５】 【００７９】 様々な微生物を用いた生体内変換 様々な微生物がＩＳＡ２４７からのＩＳＡ２４７代謝物産生について評価され、これに はＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ Ｍｉｃｒｏｆｕｎｇａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ（ＵＡ ＭＨ）９１９１、ＡＴＣＣ １２０１７）、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎ ｕｌａｔａ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ（ＵＡＭＨ ７３７０、ＡＴＣＣ ３６１１２） 、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖａｒ． ｂｌａｋｅｓｌｅｅｎａ（ 20 ＵＡＭＨ ８７１８、ＡＴＣＣ ８６８８ａ）、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈ ｉｎｕｌａｔａ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ（ＵＡＭＨ ７３６９、ＡＴＣＣ ２６２６ ９）、Ｂｅａｕｖａｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ（ＵＡＭＨ ８７１７、ＡＴＣＣ ７１５ ９）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ（ＡＴＣＣ ５３８２８）、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ ｓ ｓｐ．（ＡＴＣＣ ５３７７１）、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌ ａｔａ（ＵＡＭＨ ４１４４、ＡＴＣＣ ３６１９０）、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ（ＵＡＭＨ ７３６８、ＡＴＣＣ ９２４６）、Ｃｕｎｎｉｎｇ ｈａｍｅｌｌａ ｂａｉｎｉｅｒｅ（ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）（ＵＡＭＨ ４１４５、Ａ ＴＣＣ ９２４４）、およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ （ＡＴＣＣ １１６３５）が含まれる。 30 【００８０】 これらの微生物について、代謝物の変換収率（産生された既知のＩＳＡ２４７代謝物の 量）および代謝多様性（産生された異なるＩＳＡ２４７代謝物の数）をスクリーニングし た。前記微生物は第Ｉ相で増殖させ、第ＩＩ相でＩＳＡ２４７とともに培養した。ＩＳＡ ２４７を前記発酵培地に添加後、前記培地からサンプルを採取し、ヒトの標準的なＩＳＡ ２４７代謝物プロフィールと対比してＬＣ−ＭＳで分析し、回収した代謝物を同定および 定量した。９６時間の生体内変換サイクルで各菌株を一次検査した後、改良された培地組 成を選択するため、代謝物の変換と代謝多様性が最も高い組み合わせの菌株２種類を、異 なる培地組成を持つ第ＩＩＩ相培地で再度検討した。 【００８１】 40 第Ｉ相／第ＩＩ相の方法 検討した各微生物は、培養液特異的な寒天斜面培地で管理した。汚染を避けるため、す べての斜面培地は１ヵ月前に調整した。調整した寒天培地は１２３℃および分圧３６０ｍ ｍＨｇで５８分間加圧滅菌処理し、若干冷却し、６ｍＬを滅菌した１６×１２５ｍｍ培養 管に正確に量った。前記寒天を前記培養管に入れた後、前記培養管を斜面に置いて斜面培 地を作り、前記寒天が固まるまで冷却、ラベルを付け、２７℃で１∼２週間培養した。Ａ ＴＣＣ １１６３５およびＡＴＣＣ ５３７７１は、ＩＳＰ寒天（０．４％酵母エキス、 １％麦芽エキス、０．４％デキストロース、および２％粒状寒天）を用いて胞子形成した 。ＡＴＣＣ ５３８２８、ＵＡＭＨ ８７１７、およびＵＡＭＨ ８７１８は、ジャガイ モデキストロース寒天（ＰＤＡ、蒸留水中３．９％）を用いて胞子形成した。ＵＡＭＨ 50 (28) JP 2008-524992 A 2008.7.17 ４１４５、ＵＡＭＨ ７３６９、ＵＡＭＨ ７３７０、およびＵＡＭＨ ９１９１は、穀 類斜面培地（１０％混合穀類、乾燥、好ましくは乳児用栄養物、２％粒状寒天。前記穀類 は滅菌の前後で混合し、前記穀類が凝集し、前記斜面培地で寒天の分配が不十分になるの を防ぐ）で胞子形成した。２週間培養後、各微生物を微生物特異的な寒天に播種し、２７ ℃に戻した。前記斜面培地が完全にコロニーで覆われてから、前記斜面培地はできれば第 Ｉ相で直ちに使用するか、必要であれば４℃に保存した。 【００８２】 その後、２ｍＬの滅菌第Ｉ相培地（ＩＳＰ種培養液を含む。１％デキストリン、１％グ ルコース、０．２７％牛肉エキス、１％酵母エキス、０．００４％硫酸マグネシウム、お よび０．０３６％二リン酸カリウム、ｐＨ ７．０）を、検討対象の微生物を含む原料斜 10 面培地に添加した。滅菌接種ループを用い、前記コロニーを取り除き、ボルテックスした 後、得られた懸濁液を、滅菌した２５０ｍＬのバッフル付き培養フラスコに含まれる、５ ０ｍＬの滅菌第Ｉ相培地に添加した。各フラスコは９６時間培養し、バイオマスを増加さ せてから、第ＩＩ相でＩＳＡ２４７を添加した。 【００８３】 第ＩＩ相に移すバイオマス（生物量）を調整するため、前記細胞を十分に洗い、第Ｉ相 の残渣を取り除いた。第Ｉ相の内容物を無菌的に５０ｍＬ遠心分離用円錐管に移し、５分 間３３００ｒｐｍで遠心分離し、デカントして上清を取り除いた。前記細胞は過剰な第Ｉ Ｉ相培地５ｍＬ（３．６５％ ＭＯＰＳ、０．３１％酵母エキス、３．１４％グルコース 、および０．３１％牛肉エキス、ｐＨ ７．０）で洗い、再度３３００ｒｐｍで５分間遠 20 心分離し、その後、前記上清をデカントし、調整直後の第ＩＩ相培地５ｍＬを添加した。 前記得られた混合物を十分ボルテックスし、無菌条件下、２５０ｍＬのバッフル付き培養 フラスコに入った５０ｍＬの無菌第ＩＩ相培地に定量的に移した。ＩＳＡ２４７の一部（ ０．５ｍＬ、５６ｍｇ／ｍＬのＩＳＡ２４７（主にトランス型）の３３．７５％エタノー ル（９５％）：６６．２５％グリセロール溶液）を前記培地に添加し、前記混合物を激し く振盪した。一定分量のサンプルを採取し（０．５ｍＬ、９６時間の第ＩＩ相発酵中、１ ２時間間隔で採取）、ＬＣ−ＭＳ分析まで−８０℃で保存した。９６時間後に発酵を修了 した。 【００８４】 第ＩＩＩ相 30 第ＩＩＩ相では、ＡＴＣＣ ５３７７１およびＡＴＣＣ １１６３５株を種培養液とし て培地Ｃ（２％グルコース、２％デンプン、０．５％酵母エキス、２％大豆タンパク質、 ０．３２％ ＣａＣＯ３、０．２５％ ＮａＣｌ）において９６時間培養した後、個別の 同型試験で、無菌的に培地３（２％グリセロール、０．５％ペプトン、０．５％酵母エキ ス、０．２％牛肉エキス、０．１％（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．１％ ＣａＣＯ３、０． ３％ ＮａＣｌ、０．０３％ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、ｐＨ ７．０）または培地１６（ ２％グルコース、１％グリセリン、１％ペプトン、１％肉エキス、２％大豆タンパク質、 ０．５％ ＣａＣＯ３、０．５％ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．０）に移した。前記発酵培地の 粘性が一貫しているため、ＬＣ−ＭＳのサンプルを採取する場合は注意した。 【００８５】 40 (29) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【表５】 10 【００８６】 ＬＣ−ＭＳによる代謝物分析 −８０℃で保存したサンプルを解凍し、１６×１０ｍｍの培養管にラベルを付け、分析 するサンプルを示した。０．５ｍＬの各サンプルから２００μＬずつ取り除き、内部標準 20 として２５ｕＬの１ｍｇ／ｍＬＣｓＡ（シクロスポリンＡ）溶液を添加した。２ｍＬのＨ ＰＬＣ−グレードメタノールを各サンプルに添加し、前記サンプルにキャップを付け、２ ０分間振盪した。前記サンプルは３３００ｒｐｍで１分４５秒間遠心分離した。前記上清 を清潔でラベルを付けた１６×１０ｍｍ培養管にデカントし、減圧濃縮し、有機溶媒を除 去した。乾燥し、前記代謝物と親薬物を含む層を２００μＬのＨＰＬＣ−グレードメタノ ールに再溶解し、前記サンプルは定量的にオートサンプラーバイアルに移した。サンプル を１５分間脱イオン水と０．０１％酢酸／酢酸ナトリウムで測定し、１２分間ｍ−ＴＢＥ （メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）およびＨＰＬＣ−グレードメタノールを増量した勾 配を開始した。 【００８７】 30 図６は、ヒト参加者からプールしたサンプルの典型的な代謝物について、質量分析シグ ナルと保持時間を対比したグラフである。表６は、認められたイオン質量、対応する定量 可能なＩＳＡ２４７代謝物、およその保持時間をまとめている。定量されたイオン質量は 、１２２３、１２３７、１２３９、１２５３、１２５５、１２６７、および１２７１など であった。ここでは２つのジオール（ＩＭ１−ｄ−１およびＩＭ１−ｄ−４）が検出され たが、実施例１では３つのジオール（ＩＭ１−ｄ−１、ＩＭ１−ｄ−２、およびＩＭ１− ｄ−３）が検出された点に注意すること。この相違の理由は、ＩＳＡ２４７のトランス体 はＩＭ１−ｄ−１およびＩＭ１−ｄ−４に代謝されるが、ＩＳＡ２４７のシス体はＩＭ１ −ｄ−２およびＩＭ１−ｄ−３に代謝されるためである。実施例１で使用された親化合物 はシス：トランスの５０：５０混合物であり、この実施例の親化合物は主にトランス−Ｉ ＳＡ２４７であったため、前記代謝プロフィールは前記ジオールと異なっていた。 【００８８】 40 (30) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【表６】 10 【００８９】 相対変換率（％）は、検出された定量化可能な各代謝物のピーク曲線下面積（ＡＵＣ） と内部ＣｓＡ標準の曲線下面積の比から、以下の式により計算した。 変換率（％）＝（代謝物ＡＵＣ）／（ＣｓＡ内部標準ＡＵＣ）×１００ 結果 生体内変換９６時間後の代謝多様性を表７にまとめた。チェックマークは、定量可能な 20 量の代謝物が産生されたことを示している。表８は、検討された各微生物が産生した各代 謝物の量を示している。 【００９０】 【表７】 30 【００９１】 40 (31) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【表８】 10 20 【００９２】 従って、本実験で検討した微生物の中では、ＡＴＣＣ １１６３５が最も大きな変換率 と代謝多様性を示した。ＡＴＣＣ １１６３５サンプルでは、既知のヒトＩＳＡ２４７代 謝物８種類が検出された。ＵＡＭＨ ４１４５は８種類中６種類の代謝物を産生した。大 量のＩＭ４ｎを発生させる（６．６６％）という固有の能力があるため、研究室で使用さ れることが多いＡＴＣＣ ５３７７１は、８種類中５種類のヒト代謝物を産生した。ＡＴ ＣＣ ５３８２８は８種類中４種類の代謝物を産生し、これらの代謝物産生はそれぞれ少 30 量であったが、まれな代謝物１２３９が産生された。ＵＡＭＨ ７３６９およびＵＡＭＨ ７３７０は、それぞれ４種類の代謝物を産生した。ＵＡＭＨ ９１９１およびＵＡＭＨ ８７１８は、それぞれ６種類の代謝物を産生した。ＵＡＭＨ ８７１７は３種類の代謝 物を産生した。 【００９３】 微生物の選択において考察される別の要因は、ＩＳＡ２４７には「まれな」代謝物があ るという点であった。「まれである」とは、ＩＭ１−ｄ−４、１２３９、および１２５５ などＡＴＣＣ １１６３５が大量に産生しない代謝物と定義される。ＩＭ１−ｄ−４はＡ ＴＣＣ １１６３５、ＵＡＭＨ ８７１７、およびＵＡＭＨ ９１９１に存在するが、Ａ ＴＣＣ １１６３５により最も大量に産生された。微生物株ＡＴＣＣ １１６３５、ＡＴ 40 ＣＣ ５３７７１、ＡＴＣＣ ５３８２８、ＵＡＭＨ ７３７０、ＵＡＭＨ ８７１７、 ＵＡＭＨ ８７１８、ＵＡＭＨ ９１９１はすべて１２３９を産生した。最も大量に産生 する微生物はＵＡＭＨ ８７１７であった。イオン１２５５に対応する代謝物は、ＡＴＣ Ｃ １１６３５、ＵＡＭＨ ４１４５、ＡＴＣＣ ５３７７１、ＵＡＭＨ ８７１７によ り産生され、変換率が最も高いのはＡＴＣＣ １１６３５であった。 【００９４】 この実験の第ＩＩＩ相では、ＡＴＣＣ １１６３５およびＡＴＣＣ ５３７７１が培地 ３および培地１６で培養され、前記培地の効果を比較した。図７は、ＡＴＣＣ １１６３ ５の結果を示している。培地３および培地１６は、ＩＭ１−ｄ−１、ＩＭ１−ｄ−４、お よびＩＭ１−ｃ−１を除き、各代謝物を同量ずつ産生した。ＩＭ１−ｄ−１の産生は培地 50 (32) JP 2008-524992 A 2008.7.17 ３で減少し、培地１６では検出可能なレベルで存在していなかった。ＩＭ１−ｄ−４の産 生は培地３および培地１６のいずれにおいても減少した。ＩＭ１−ｃ−１の産生は培地３ で１０％増加した。図８は、ＡＴＣＣ ５３７７１中のＩＳＡ２４７代謝物の産生におけ る、培地組成の影響を示したグラフである。ＩＭ１−ｄ−１はＩＳＰ２培地を用いた場合 にのみ検出され、ＩＭ９およびＩＭ４は培地３および培地１６を用いた場合にのみ検出さ れた。ＩＭ１−ｄ−４を除き、ほとんどの前記代謝物は培地３および培地１６を用いるこ とで増量した。従って、前記微生物の増殖培地を変更し、生体内変換の作用を最適化する ことができる。 【実施例６】 【００９５】 10 Ｂｅａｕｖａｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａを用いた生体内変換における界面活性剤と溶媒 の影響 実施例５では、Ｂｅａｕｖａｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ（ＵＡＭＨ ８７１７）のみが わずかにＩＳＡ２４７代謝物を産生した。界面活性剤または溶媒によって産生プロフィー ルを変化させることができるか否かを検討するため、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） およびＴＷＥＥＮ（登録商標）４０を（実施例５で使用した）グリセロールと比較した。 ０．５ｍＬの５６ｍｇ／ｍＬ ＩＳＡ２４７溶液（３３．７５％エタノール中（９５％） 、グリセロールの代わりに６６．２５％ ＤＭＳＯまたはＴＷＥＥＮ（登録商標）４０） を５０ｍＬの培地に添加した。同じ第Ｉ相および第ＩＩ相培地と実施例の方法を用いた。 【００９６】 20 図９に示す通り、界面活性剤としてグリセロールを使用すると、ＩＭ１−ｄ−４、１２ ３９、および１２５５が形成し、ＤＭＳＯではＩＭ１−ｄ−１、ＩＭ４ｎ、ＩＭ４が形成 し、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０ではＩＭ１−ｄ−１、ＩＭ１−ｄ−４、１２５５、ＩＭ ４ｎ、ＩＭ９、およびＩＭ４が形成した。変換量も劇的に変化した。結果的に、生体内変 換結果は、前記親化合物を到達させるために使用される溶媒または界面活性剤を変更する ことで最適化することができ、当業者が特定の溶媒、界面活性剤、培地を選択し、代謝物 の組み合わせに含まれる特定の代謝物の産生を増加させることができる。 【００９７】 本明細書で引用された文献、特許、特許出願書類はすべて、それぞれ個別の文献、特許 出願書類、または特許が具体的かつ個別にそのまま参考文献として組み込まれることが示 30 されている場合と同程度に、本明細書でそのまま参考文献として組み込まれている。 【００９８】 本発明の多数の実施例について述べてきた。それにもかかわらず、本発明の観点と範囲 から逸脱せずに様々な修正を加えることができることは、理解されるものとする。 【図面の簡単な説明】 【００９９】 【図１】図１は、ＩＳＡ２４７の構造を示すものである。ＩＳＡ２４７のアミノ酸残基が 数で示されている。ギリシャ文字は、アミノ酸１の炭素の位置を示している。 【図２】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、ＩＳＡ２４７分子のトランス（Ｅ−）およびシ ス（Ｚ−）異性体の構造を提供するものである。 40 【図３】図３は、シス：トランスＩＳＡ２４７の５０：５０混合物を投与された被験者の ヒト全血から単離した、ＩＳＡ２４７代謝物のプロフィールを示したＨＰＬＣスキャンで ある。 【図４】図４は、実施例４で説明した生体内変換法により単離したＩＳＡ２４７代謝物の プロフィールを示したＨＰＬＣスキャンである。 【図５】図５は、生体内変換系において、異なる界面活性剤がＩＳＡ２４７代謝物の産生 に与える影響を示したグラフである。 【図６】図６は、主にＩＳＡ２４７のトランス異性体を含むＩＳＡ２４７製剤を投与され た被験者の、ヒト全血から単離したＩＳＡ２４７代謝物のＬＣ−ＭＳプロフィールを示し ている。 50 (33) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【図７】図７および８は、それぞれ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．（ＡＴＣＣ ５ ３７７１）およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ（ＡＴＣＣ １１６３５）による、ＩＳＡ２４７代謝物の産生に対する培地３および培地１６の影響 を比較したものである。 【図８】図７および８は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．（ＡＴＣＣ ５３７７１） およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ（ＡＴＣＣ １１６３ ５）それぞれによる、ＩＳＡ２４７代謝物の産生に対する培地３および培地１６の影響を 比較したものである。 【図９】図９は、Ｂｅａｕｖａｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａによるＩＳＡ２４７代謝物の産 生に対する異なる溶媒および界面活性剤の影響を示したものである。 【図１】 【図２】 10 (34) 【図３】 【図４】 【図５】 【図６】 JP 2008-524992 A 2008.7.17 (35) 【図７】 【図９】 【図８】 JP 2008-524992 A 2008.7.17 (36) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【手続補正書】 【提出日】平成20年5月21日(2008.5.21) 【手続補正１】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】０００６ 【補正方法】変更 【補正の内容】 【０００６】 生体異物が高い親油性である、つまり大規模発酵法に用いる水性培養液に非常に溶け にくい場合は、大量の代謝物を産生することが特に困難となる可能性がある。従って、効 率的に大量な不溶性生体異物の代謝物を産生する方法が必要である。 この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日 以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。 【特許文献１】中国特許出願第１４８３８１５号明細書 【特許文献２】カナダ特許出願第２３９０５７２号明細書 【非特許文献１】ＫＥＩＨＬＭＡＮＮ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏ ｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｙｓｅｎｅ ｔｏ ｔｒａｎｓ−１， ２−ｄｉｈｙｄｒ ｏｘｙ−１， ２−ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｒｙｓｅｎｅ ｂｙ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ．"， Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６，Ｖｏｌ．４２， Ｎｏ． ６， ｐｐ． ６０４−６０８； 【非特許文献２】ＵＲＬＡＣＨＥＲ ａｎｄ ＳＣＨＭＩＤ，"Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒ ｍａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐ４５０ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅ ｎａｓｅｓ．"， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ，１ Ｄｅｃ． ２００２， ｖｏｌ． １３， Ｎｏ． ６， ｐｐ． ５５７−５ ６４； 【非特許文献３】ＹＯＵ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ＤＤＴ ｂｉｏｔｒａ ｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ： ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｌｏｗ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｒｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．"， Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ， １９９６，Ｖｏｌ．３２， Ｎ ｏ．１１， ｐｐ．２２６９−２２８４ (37) JP 2008-524992 A 2008.7.17 【国際調査報告】 10 20 30 40 (38) JP 2008-524992 A 2008.7.17 10 20 30 40 (39) JP 2008-524992 A 2008.7.17 10 20 30 40 (40) JP 2008-524992 A 2008.7.17 10 20 30 40 (41) JP 2008-524992 A 2008.7.17 フロントページの続き (81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM), EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF, BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO, CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LC,LK,L R,LS,LT,LU,LV,LY,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,SY ,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW (72)発明者 トレパニール、ダニエル、ジェー． カナダ国、ティー６アール ３イー１ アルバータ、エドモントン、ハスウェル プレイス １４ １７ Ｆターム(参考) 4B063 QA06 QA18 QQ05 QQ23 QR03 QR74 4B064 AG37 CA03 CC03 CD20 CE10 DA01 10