神経細胞の取 り込み作用に関する形態学的研究

岡 山医 誌
(1994)
106,
1159∼1170
神 経細胞 の取 り込 み作 用 に関す る形態学 的研 究
-光
学 顕 微 鏡 的 お よ び 電 子 顕 微 鏡 的 研 究-
岡 山大学 医学 部 第一解 剖 学教 室(指 導:佐 々木順 造教 授)
木
村
康
裕
(平成6年9月8日
Key words:取
受稿)
り込 み作用,神 経 細胞, HRP,鉄,光
学 顕微 鏡,電 子顕微 鏡
て行 く現 象 を利 用 し たHRP神
緒
言
経 投 射 検 索 法 が,
KristenssonとOlsson4,5)さ
神 経 細 胞 は そ の 主 た る 機 能 で あ る情 報 伝 達 の
り導 入 され,神
ら に, LaVail6)に
よ
経 投射 の研 究 が飛躍 的 に進歩 し
面 か ら現 在 ま で数 多 くの 研 究 が な さ れ て きて い
た.こ の 原 理 は, HRPを
る.し
や 神 経 線 維 の 途 中 に 注 入 す る と,神 経 細 胞 に 取
か し な が ら,神 経 細 胞 は 蛋 白合 成 等 の 代
謝 活 動 も盛 ん で,神
経 内分 泌 機 能 に 代 表 さ れ る
り込 ま れ,軸
神 経終 末部 の筋 肉付 近
索 流 に 乗 っ て,逆
行性 に その神 経
よ う な 内 分 泌 機 能 等 も知 られ る よ う に な っ て き
細 胞 体 に 輸 送 さ れ る現 象 を う ま く利 用 して 起 始
て新 た な神 経 細 胞 の 機 能 と して 注 目され て きた1).
細 胞 体 が 同定 さ れ る仕 組 み で あ る.し か し な が
そ の た め,最
ら,こ
近 で は 神 経 細 胞 を神 経 伝 達 機 能 の
み を有 す る神 聖 な 細 胞 とみ な す の で は な く,他
の よ う な物 質 が ど の よ うに して 神 経 細 胞
に 取 り込 ま れ,い か に 軸 索 流 に 乗 っ て 流 れ る か,
の 細 胞 と何 ら変 わ らな い種 々 の 機 能 を 有 す る細
い か に 処 理 され るか,ど
胞 と し て と ら え て 研 究 対 象 とす る よ うに な っ て
の か に つ い て の 研 究 は 少 な い.
き て い る.そ
して,電
子 顕 微 鏡 を 利 用 し形 態 学
の よ うな 影 響 を受 け る
今 回,著 者 は こ の よ う に 神 経 細 胞 に と っ て あ
的 検 索 を し て み る と,神 経 細 胞 と くに そ の 細 胞
ま り毒 性 を示 さ な い物 質 で あ るHRPと,ラ
体 内 で は,ゴ
カ ル を 発 性 し毒 性 の 極 め て 強 い と考 え られ る塩
ル ジ装 置 や 粗 面 小 胞 体 等 の 豊 富 な
細 胞 内 小 器 官 が 認 め られ,機
化 第 二 鉄 の2種
能 的 に は 蛋 白合 成
ジ
類 の物 質 をそれ ぞれ神経 系組 織
が 盛 ん に 行 わ れ て い る.し か も,特 徴 的 に 長 い
に 投 与 し て,神 経 細 胞 内へ の 取 り込 み と そ の 運
神 経 突 起 を有 す る神 経 細 胞 で は そ の 突 起 の 中 を,
命,ま
細 胞 体 と そ の 突 起 の 終 末 部 との 間 で の 物 質 の 盛
顕 微鏡 的 お よび電子 顕微鏡 的 に その形 態学 的特
ん な 動 きが よ く知 られ て い る.す
徴 に つ い て検 討 し た の で 報 告 す る.
な わ ち細 胞 体
た 神 経 細 胞 に 与 え る影 響 に つ い て,光
内 で 作 られ た 代 謝 産 物 が 神 経 突 起 の 中 を 流 れ て
材 料
学
と 方 法
行 く機 構 が 軸 索 流 と し て 注 目 さ れ て き た2).
I.
電 子顕 微鏡 的 に神 経突起 には神 経細 管や神 経
細 糸 が 認 め られ,こ
い る こ とが 証 明 さ れ,こ
性 と逆 行 性 の2つ
の 流 れ の 方 向 か ら順 行
の もの が 良 く知 ら れ て,そ
HRP投
与例
実 験 動 物 と して は ウ ィ ス タ ー 系 雄 ラ ッ ト10匹
の 軸 索 流 を構 造 的 に 支 え て
を 用 い た.ま
の
ずHRP(Type
VI, Sigma)の
褐
色 の 粉 末 を生 理 食 塩 水 に 溶 か して50% HRP溶
液
機 構 も詳 細 に研 究 され 明 らか にされ て きてい る2,3).
一方
,神 経 解 剖 学 で は 神 経 投 射 線 維 連 絡 の 研
を 作 成 した.こ
究 に,西 洋 ワ サ ビの ペ ロ キ シデー ス(Horseradish
ル で麻 酔 し,右 側 の 梨 状 筋 の 下 縁 で 坐 骨 神 経 を
peroxidase,
露 出 し た.ピ
HRP)と
のHRP溶
液 を以下 の方 法 で ラ
ッ ト坐 骨 神 経 に 注 入 し た.ラ
い う酵 素 が こ の 逆 行 性 軸
ッ トを ネ ン ブ タ ー
ンセ ッ トで 坐 骨 神 経 の 神 経 周 膜 を
で き る だ け イ ン タ ク トの 状 態 で 神 経 の み を 挫 滅
索 流 に 乗 っ て 神 経 末 端 よ り神 経 細 胞 体 へ と流 れ
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木
村
康
裕
させ,そ
の 部 位 に ハ ミル トン の マ イ ク ロ シ リン
を 用 い た.ネ
ジ で50%
HRP溶
固 定 装 置 に ラ ッ トの 脳 を 固 定 し た.そ
液 を 注 入 した.こ れ は坐 骨 神 経
ン ブ ター ル で ラ ッ トを麻 酔 し,脳
か らの 外 部 へ の 露 出 を 最 少 に し,神 経 へ の 取 り
イ ク ロ ピペ ッ トを 利 用 し て,ブ
込 み を有 効 に す る た め の 方 法 で あ る,一 方,他
後 方,側
の左 側 の坐骨 神経 に つ いて も同様 に坐 骨神 経 を
挫 滅 させ,マ
イ ク ロ シ リ ン ジ でHRPの
に 生 理 食 塩 水 を 注 入 し,コ
利 用 し た.そ
して,注
代わ り
ン トロ ー ル側 と し て
入 のHRPの
そ の 運 命 を観 察 す る た め,
取 り込 み と
3日,
1週 間 そ し て
方 に1mmさ
の 後,マ
レ グマ よ り1mm
らに 深 さ2mmの
位置のラッ
ト左 大 脳 皮 質 感 覚 運 動 野 に, 0.1M塩
化 第 二鉄 溶
液5μlを5分
時 間,
か け て 注 入 し た.そ
3日 そ し て3週
の 後,投
与3
間後 の それ ぞれ の 時間経
過 を追 っ て 実 験 に 供 した.そ
れ ぞれの 時 間経過
で ラ ッ トを ネ ン ブ ター ル に て 麻 酔 し,左 心 室 よ
2週 間 後 の 時 間 経 過 をお い て 観 察 し た.
り生 理 食 塩 水 で 灌 流 した.そ
組織 化学 的染 色法
ル ム ア ル デ ヒ ドと0.4%グ
の 後,
4%パ
ラホ
ル ター ル ア ル デ ヒ ド混
こ れ らの 実 験 動 物 を前 述 の 経 過 で,そ
れ ぞれ
合 固 定 液 に て さ ら に 灌 流 した.す
ネ ン ブ ター ル で麻 酔 し実 験 に 供 し た.す
ばや く
り出 し,大 脳 皮 質 部 と海 馬 領 域 を 中 心 に 組 織 ブ
開 胸 し て 心 臓 を 露 出 し,カ
テー テ ル を左 心 室 に
後,
1%グ
ル ター ル ア ル デ ヒ ドと1%パ
ム ア ル デ ヒ ドを0.1Mリ
す ば や く取 り 出 し,同
た.そ
の 後, 30%シ
骨神 経 お よび脊髄 を
じ固 定 液 に24時 間 浸 漬 し
ョ糖 リン 酸 緩 衝 液(pH
に 入 れ 保 存 し た.ク
の
ラホ ル
ン酸 緩 衝 液 に 溶 か した 溶
液 で 再 び 灌 流 固定 した.坐
4%パ
ラホル ムア ル デ ヒ ド
溶 液 の 後 固 定 液 に 浸 漬 し た.そ
挿 入 し て,ポ ンプ を使 い ヘ パ リ ン化 し た0.9%の
生 理 食 塩 水 で 灌 流 し,血 液 を 洗 い 流 し た.そ
ロ ッ ク を作 成 して,
7.4)
ラ イ オ ス タ ッ トを利 用 し て
糖 リン 酸 緩 衝 液 に 入 れ,ク
凍 結 切 片 を 作 成 して,そ
組 織化 学 的染 色法
1)
Perlsの
溶 液 に よ る従 来 の 鉄 染 色 法
凍 結 切 片 を 直 接 ゲ ラ チ ン コー トされ た ガ ラ ス
に 載 せ,す
ば や く冷 風 で 乾 燥 させ,以
に 作 成 し た,
3´-ジア ミ ノベ ン チ ジ ン(DAB)を
%塩 酸 との 等 量 混 合 液)に
7.6)に
入 れ, Graham
方 法7)に 準 じてHRPの
and
発 色組 織
化 学 反 応 を行 っ た. 30分 間 反 応 させ,そ
理 食 塩 水 で よ く洗 浄 した.光
の 切 片 を 脱 水 して,エ
学 顕微 鏡的 には こ
ン テ ラ ン に て 封 入 して 観
察 した.
一 方 ,電 顕 的 観 察 の た め に は,こ
れ らの発色
ミウ ム に て 後 固 定 し,ア
酸化オス
セ トン で脱 水 後,エ
ポ
ル トラ ミク ロ トー ム に よ
り準 超 薄 切 片 を作 成 し, HRP陽
経 線 維 部 位 を 同 定 し て,さ
性神 経 細 胞や神
らにそ の部位 のみ の
超 薄 切 片 を作 成 し た 。HRPの
電子 密 度の 高い 反
2%フ
ェ ロ シ ア ン化 カ リ ウ ム と2
入 れ,室
1%中
性 赤 染 色 液 に て3分
そ し て,ア
し た.
Perls+DABの
高感 度鉄 染 色法
従 来 の 方 法 に, 3, 3´-ジア ミ ノベ ン チ ジ ン反 応
を付 け 加 え る 染 色 法 で,従
来 の 方 法 よ り も極 め
て 高 感 度 に 鉄 を検 出 す る こ とが 可 能 に な っ た.
こ の 方 法 はPerls+DABの
高 感 度 鉄 染 色 法8)と
呼 ば れ る.
ま ず,凍
結 切 片 の 載 せ て あ る ス ラ イ ドグ ラ ス
を前 述 のPerlsの
溶 液 に 浸 漬 し,室 温 で30分 間
反 応 させ た.そ
こ れ ら の 切 片 を よ く洗 浄 した.次
後,電
子 染 色 を行 い さ ら に 観 察 し た.
15分 間0.5%
II.塩
化 第二鉄 投 与例
酸 緩 衝 液(pH
実 験 動 物 と してSD系
雄 ラ ッ ト(7-9W)10匹
ンテ ランに封
入 して カ バ ー グ ラ ス を 載 せ 光 学 顕 微 鏡 的 に 観 察
電 子 顕 微 鏡(JEM
観 察 し確 認 し た
温 で40分 間
間 核 染 色 を 施 し た.
ル コー ル で 脱 水 し,エ
応 産 物 を観 察 しや す い よ うに電 子 染 色 を行 わ ず,
100-CX)で
下 の液 に
溶 液(使 用 直 前
反 応 さ せ た.そ の後,蒸 留 水 で よ く洗 浄 し た 後,
2)
組 織 化 学 的 染 色 を 施 した 切 片 を1%四
ン 樹 脂 に 包 埋 し た.ウ
の後 生
ョ
に 供 し た.
衝 液 に 浸 漬 し た.凍 結 切 片 を過 酸 化 水 素 水 と3,
Karnovskyの
15%シ
ラ イ オ ス タ ッ トに て
浸 漬 して 鉄 反 応 させ た. Perlsの
酸 緩 衝 液(pH
の 後,
れぞ れの組 織化 学染 色
厚 さ80∼120μmの 凍 結 切 片 を作 成 して,リ ン酸 緩
含 む ト リス 塩
ば や く脳 を取
の 後,脱
DABと1%過
7.4)に
イ オン化 した蒸留 水 で
い で,切
片を
酸 化 水 素 を含 む リン
浸 漬 した.そ
の 後,再
び
脱 イ オ ン化 した 蒸 留 水 で30分 程 度 よ く洗 浄 した.
神 経 細 胞の取 り込 み作 用 の形 態学 的研 究
そ して,そ
の 切 片 を ス ラ イ ドグ ラ ス の 上 に載 せ
大 で 観 察 す る と,核
乾 燥 させ た後,
2%中
性 赤染 色液 に てカ ウ ンタ
HRP陽
ー 染 色 を し,エ
ン テ ラ ン で 透 徹 して カ バ ー グ ラ
1d).
ス を 載 せ 光 学 顕 微 鏡 的 に 観 察 し た.
電 子 顕 微 鏡 的 検 索 に は,鉄
2.電
を投 与 さ れ た ラ ッ
1161
の 周 囲 に褐 色 の顆 粒 状 の
性 物 質 が 集 積 して い るの が 認 め られ た(図
子顕 微鏡 的 所見
脊 髄 前 角 部 に お け る坐 骨 神 経 の 起 始 細 胞 に つ
トを ネ ン ブ タ ー ル で 麻 酔 し,す ば や く開 胸 し て
い て 詳 細 に 観 察 し た.脊 髄 前 角 に お い てHRP陽
左 心 室 よ りポ ン プ を利 用 して 生 理 食 塩 水 を灌 流
性 細 胞 を 含 ん で い る エ ポ ン プ ロ ッ クか ら準 超 薄
し て 血 液 を洗 い 流 し, 4%パ
切 片 を作 成 して,ト
ド と0.4%グ
ラホル ムアル デ ヒ
ル ター ル ア ル デ ヒ ドの 混 合 固 定 液 に
て さ ら に 灌 流 固 定 した.そ
の 後,す
ば や く脳 を
ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 を施 し
光 学 顕 微 鏡 で 観 察 し た の が 図2aで
図 か ら もHRP陽
あ る.こ の
性 物 質 が核 の 周 囲 に 集 ま っ て
取 り出 し,海 馬 領 域 を 中心 に 組 織 ブ ロ ッ ク を作
い るの が よ くわ か る.坐 骨 神 経 に 投 与 さ れ 逆 行
成 した.こ
性 に 流 れ て きたHRPは,電
れ ら の 組 織 ブ ロ ッ ク を4%パ
ラホル
ム ア ル デ ヒ ド液 で さ らに12時 間 固定 し た.次
で,
1%四
い
酸 化 オ ス ミウ ム に て 後 固 定 し た.そ
子 顕微 鏡的 に は電
子 密 度 の 高 い 物 質 と して 検 索 で き た.そ
して電
子 顕 微 鏡 的 に も こ れ ら の 物 質 は核 の 周 辺 に 多 く
し て,ア セ トン で 脱 水 しエ ポ ン 樹 脂 に 包 埋 した.
集 ま り,電 子 密 度 の 高 い ラ イ ソ ゾ ー ム と し て観
ウ ル トラ ミ ク ロ トー ム に よ り超 薄 切 片 を作 成 し
察 さ れ た(図2b).こ
て,電
大 で観 察 し た の が 図2cで
子 顕 微 鏡(JEM
100-CX)で
結
I.
HRP投
1.光
観 察 した.
に 認 め ら れ な か っ た.そ
投与 した坐骨神 経
与 さ れ たHRPが
外か
らに神経 突起 内
を逆 行 性 に 輸 送 さ れ て い るの が よ くわ か る(図
ン トロ ー ル 側 の 坐 骨 神 経 で は,そ
のよ
う に 褐 色 に 染 ま っ た神 経 線 維 は 認 め ら れ な か っ
坐 骨 神 経 の 中 枢 側 へ 行 っ た とこ ろ
の 途 中 の 像 で あ る が,HRP投
与 部 位 か ら離 れ た
部 位 で も,神 経 突 起 の 中 に 褐 色 に 染 ま っ たHRP
陽 性 神 経 線 維 が 認 め られ,中
枢 側へ と流れ てい
髄 に お け る坐 骨 神 経 の 起 始 細 胞
坐 骨 神 経 の 起 始 細 胞 が 存 在 す る所 属 レベ ル で
の 脊 髄 神 経 節 や 脊 髄 前 角 に は,多
性 神 経 細 胞 が 認 め ら れ た.図1cは
現 れ たHRP陽
数 のHRP陽
脊髄 前角 に
性 神 経 細 胞 で あ る.坐 骨 神 経 を
処 理 され,投
与 後2週
間 目 の 例 で は これ らの 物
質 は 消 失 して し ま う こ とが 電 顕 的 に確 認 さ れ た.
II.塩 化 第 二 鉄 投 与 例
1.光
学顕微 鏡 的所 見
投 与 部 位 の 大 脳 皮 質 を,投 与 後3時
る と,鉄 投 与 部 位 に の み 限 局 して 青 色 に鉄 が 染
め 出 され て き て い る.し か し,そ の 周 辺 部 の 大 脳
皮 質 に は 陽 性 反 応 は 認 め ら れ な い.(図3a).
一方
,高 感 度 鉄 染 色 法 で検 索 し た例 で は,鉄
そ れ 以 外 に も投 与 部 位 の 周 辺 部 の 大 脳 皮 質,脳
梁 さ ら に は 海 馬 領 域 へ もハ レー 状 に 陽 性 反 応 が
認 め られ,鉄
染 色 の 感 度 が 増 して い る の が よ く
わ か る(図3b).
さ ら に 強 拡 大 で 詳 細 に 観 察 した の が,図4で
あ る.図4aは
性 に な っ て 現 れ て き て い る 。 一 方,反
質 運 動 野 の もの で あ る.鉄
対 側 のそ
性 神 経 細 胞 を認 め る こ
れ ら のHRP陽
従 来 の鉄 染 色 法 を施 し た 大 脳 皮
強 陽 性 に 染 色 さ れ,そ
性 神 経 細 胞 を強 拡
投 与 部 位 は,青
色に
の 周 辺 部 位 に は 多 くの 神
経 細 胞 が 認 め ら れ る が,鉄
とは な か っ た.
さ ら に,こ
間 とい う
極 く早 期 に つ い て 従 来 の 鉄 染 色 法 で検 索 して み
形 成 して い る 大 型 の 運 動 神 経 細 胞 が 特 異 的 に 陽
れ ら に は 決 し てHRP陽
れ らの 電 子 密
投 与 部 位 は も ち ろん の こ と褐 色 に 強 力 に 染 ま り,
る こ とが わ か る.
(B)脊
して,こ
度 の 高 い物 質 は 細 胞 体 内 の ラ イ ソ ゾ ー ム に 吸 収
性神 経線 維 が波
ら神 経 突 起 内 に 取 り込 ま れ,さ
た.図1bは
取 り込 ん
の 融 解 や ピ ク ノー シ ス 等 の 細 胞 変 性 所 見 は 一 向
褐 色 に 染 め 出 さ れ たHRP陽
1a).コ
イ ソゾー ム
だ こ れ ら の 神 経 細 胞 体 は 時 間 が 経 過 して も,核
学顕 微鏡 的所 見
打 つ よ うに 認 め られ,投
あ る.ラ
に は 膜 状 の もの が 認 め られ た. HRPを
果
与例
(A) HRPを
れ ら の もの を さ ら に 強 拡
陽性 の 部位 や鉄 染 色
陽 性 の 神 経 細 胞 は 認 め ら れ な い.図4bは
高感
1162
木
村
康
裕
図1 HRP投
与例 の光 学 顕 微鏡 的所 見
1a 坐 骨 神 経 のHRP投
与 部 位 の光 学 顕 微 鏡 像(×140),褐
認 め られ, HRPが
1b 色 のHRP陽
坐 骨 神 経 の 中枢 側 の 途 中 の部 位 の 光 学 顕微 鏡 像(×250),
色 に 染 まっ たHRP陽
性 神 経 線 維 が 波 打 つ よ うに
取 り込 まれ て い る.
HRP投
与 部位 か ら離 れ た部位 で も,褐
性 神 経 線 維 が 認 め られ る.
1c
HRP投
与 側 の脊 髄 横 断 切 片 の光 学 顕 微 鏡 像(×120),脊
が 多 く認 め られ る.
1d
HRP陽
性 前 角 細 胞 の 強拡 大 光 学 顕微 鏡像(×350),
核 の 周 りに褐 色 の 顆 粒 状 のHRP陽
HRP陽
髄 前 角 部 にHRP陽
性 の大 型 神 経細 胞
性 細 胞 を強拡 大 で観 察 し てみ る と,
性 物 質 が 集 積 して い るの が認 め られ る.
神経 細 胞の 取 り込み 作用 の形 態学 的研 究
図2 HRP投
1163
与 例 の 電子 顕 微 鏡 的所 見 N:核
2a
HRP陽
2b
(×1000), HRP陽
性 物 質 が核 の周 囲 に 集 ま って い る.
HRP陽
性 前 角 細胞 の電 子 顕微 鏡 像(×6400),
HRP陽
性 物 質 は 電子 密 度 の 高 い ラ イ ソゾー ム と
性 前 角 細 胞 の エ ポ ンプ ロ ッ クか らの 準超 薄 切 片 の光 学 顕微 鏡 像(ト ル イ ジ ン ブル ー 染 色)
2c
HRP陽
して 観 察 され る.
性 前 角 細 胞 の 強拡 大 電 子 顕微 鏡 像(×28000),ラ イ ソ ゾー ムに は,膜状 の もの が認 め られ る.
1164
木
村
図3 塩 化 第 二鉄 投 与 例 の 弱 拡大 光 学 顕 微 鏡 的所 見 康
裕
C:大
脳 皮 質 H:海
馬
3a 通常 の鉄 染 色 法 に よ る光 学 顕微 鏡 像(×19),鉄 投 与 部位 に 限局 して,青 色 に鉄 が 染 め 出 され て き
て い る.そ の 周 辺部 の大 脳 皮 質 に は,陽 性 反 応 は認 め られ な い.
3b 高感 度 鉄 染 色 法 に よ る光 学 顕微 鏡 像(×19),鉄
投 与 部位 は もち ろん の こ と褐 色 に強 力 に染 ま り,
そ れ 以外 に も投 与部 位 周 辺 部 の大 脳 皮 質,脳 梁 さ ら に は海 馬領 域 へ もハ レー状 に陽 性 反 応が 認 め ら
れ,鉄 染 色 の 感 度 が増 して い るのが よ くわ か る.
度鉄 染色 法 で観察 した もの であ る.鉄 投 与部位
脳 梁部 は 強 く染 色 され,そ の 腹側 部 には褐 色 の
は褐 色 に強 く染 色 され てい る.さ らに その周 辺
ドッ ト状 の鉄 反応 陽性 物質 が 観察 され た.ま た,
部の 大脳 皮質 に は,ド ッ ト状 の褐 色 の反 応物 質
多 くの 錐体 細 胞層 を構 成 す る神経 細 胞が 特異 的
が認 め られ,ま た褐 色の 反応 物質 を取 り込 んだ
に鉄反 応 陽性 物質 を取 り込 ん でい た.こ れ らの
神 経 細胞 も多 く観 察 され た.海 馬領域 に つ いて
錐体 細 胞 はや や細 く変 形 し,変 性 を思 わせ る所
高感 度鉄 染色 法 で観察 したの が,図4cで
見 を呈 して いた.
あ る.
神 経細 胞 の取 り込 み作用 の 形態 学的研 究
1165
図4 塩 化 第 二鉄 投 与 例 の 強拡 大 光 学 顕微 鏡 的 所 見 C:大 脳 皮質 P:海 馬領 域 の錐 体 細 胞 層
4a 大脳 皮 質 の 投 与部 位 周 辺 部 の光 学 顕微 鏡 像(×100)(従 来 の鉄 染 色 法 に よ る),鉄 投与 部 位 は 強 陽
性 に染 ま り,そ の 周辺 部 位 に は 多 くの 神 経細 胞が 観 察 され るが,鉄 染 色陽 性 所 見 は認 め られ な い.
4b 大 脳 皮 質 の 投 与部 位 周 辺部 の光 学 顕微 鏡 像(×160)(高
感度 鉄 染 色 法 に よ る),鉄 投 与 部 位 は褐 色
に強 く染 まっ て い る.そ の 周 辺部 には ドッ ト状 の 褐 色 の反 応 物 質が 認 め られ,そ れ を取 り込 ん だ神
4c 経 細 胞 も多 く観 察 され る.
海 馬 領 域 で の高 感 度 鉄染 色 法 に よ る光 学 顕 微 鏡像(×100),脳
梁 部 は 強 く染 色 され,そ の 腹側 部 に
は 褐 色 の ドッ ト状 の鉄 反応 陽 性物 質 が 観察 され,錐 体 細 胞 層に は鉄 反 応 陽性 物 質 を取 り込 んだ神 経
細 胞 が 多 く認 られ る.
1166
木
村
康
裕
図5 塩 化 第 二鉄 投 与 例 の 海 馬領 域 錐 体 細 胞 層 で の電 子 顕微 鏡 的所 見 N:核
5a 正常 ラ ッ トの 錐体 細 胞の 電 子 顕微 鏡 像(×11000),明
る く丸 い形 の 細 胞 で,核 は円 形 で 明 る く,細
5b 胞体 内 に は細 胞 内小 器 官 が よ く発達 して,活 発 な代 謝機 能 を行 って い るこ とが想 像 され る.
鉄 投 与 ラ ッ トの錐 体 細 胞 の 電 子 顕微 鏡 像(×12000),核 は凝 集 して,細 胞体 内 は構 造 物 が 一様 に な
5c 正 常 ラ ッ ト錐 体 細 胞 層 で の神 経 膠 細 胞 の電 子顕 微 鏡 像(×11000),細
って しま っ てお り,細 胞 内小 器 官 の 発達 は認 め られ ない,
胞 内 に は特 徴 的 に グ リオフ ィ
ラ メ ン トが 豊 富 に 認 め られ る.
5d 鉄 投 与 ラ ッ トの錐 体 細 胞 層 での 神 経 膠 細 胞 の電 子 顕 微 鏡 像(×11000),神
し,グ リオ フ ィ ラ メ ン ト以外 に 多 くの ラ イ ソゾー ムが 認 め られ る.
経 膠 細 胞 自体 が や や 肥 大
神 経 細胞 の取 り込 み作 用 の形 態学 的研 究
2.電
子顕微 鏡 的所 見
HRPが
海 馬 領 域 に 存 在 す る神 経 細 胞 と神 経 膠 細 胞 の
2種 類 の 細 胞 に つ い て,錐
察 した.図5aは
体 細 胞層 を中心 に観
正 常 の 錐 体 細 胞 で あ る が,明
る く丸 い 形 の 細 胞 で,核
は円形 で細 胞体 内 には
多 くの 細 胞 内小 器 官 が よ く発 達 し て,活
発 な代
1167
逆 行 性 に 輸 送 され る こ とが 明 らか に な っ
た2).
電 子 顕 微 鏡 的 に は, HRPを
含 む ライ ソゾー ム
が 核 の 周 辺 に 集 合 し て 行 き,取 り込 ま れ たHRP
が2週
間 で ラ イ ソ ゾー ム で 吸 収 処 理 さ れ て,完
全 に 消 失 し て し ま っ て い た.こ
の 際,ラ
イ ソゾ
謝 機 能 を行 っ て い る こ とが 想 像 され る.神 経 細
ー ム に は 特 徴 的 に ク リス タ や 膜 状 の 構 造 物 が よ
胞 以 外 に も神 経 膠 細 胞 が 存 在 して お り,や や 小
く観 察 さ れ た.こ
型 の 細 胞 で 細 胞 体 内 に は グ リア特 有 の 線 維(グ
す る時の神 経 周膜や 神経 内膜の破 壊産 物 に よ る
リ オ フ ィ ラ メ ン ト)が 豊 富 に 認 め ら れ,核
る い(図5c).鉄
は明
れ は 坐 骨 神 経 にHRPを
もの で あ る か も知 れ な い.従
来,神
投与
経伝達 物質
投 与 例 で,錐 体 細 胞 を観 察 す
に放射 線性 物質 で ラベ ル した ものや神 経伝 達物
る と,ほ
とん ど変 性 の 見 ら れ な い 神 経 細 胞 も あ
質 と構 造 的 に よ く似 た 物 質 を 投 与 す る と容 易 に
る が,多
くの 神 経 細 胞 の 核 は 融 解,ピ
神 経 終 末 か ら こ れ らの 物 質 が 取 り込 ま れ る こ と
ス を呈 し て,明
ク ノー シ
ら か で な く,そ の 細 胞 体 内 は 構
が 知 られ て い た. HRP以
外 に もEvans
blueの
造 物 が 一 様 に な っ て し ま っ て お り,細 胞 内 小 器
よ う な 蛍 光 色 素 や コバ ル トな どの 重 金 属 を 注 入
官 の 発 達 は 認 め ら れ な い.ま
して,神
い物 質 が 多数 認 め られ,細
た,電
子密 度の 高
胞 体 内 に 取 り込 ま れ
た鉄 が 細 胞 体 内 で は こ の よ う な形 を呈 し て い る
と思 わ れ た(図5b).
経 細 胞 内 に 取 り込 ませ て 神 経 投 射 経 路
を検 索 す る 方 法 も あ る9,10).
しか し,こ れ らの 方 法 の 中 で 最 も取 り込 み 作
用 の 効 率 の 良 い の がHRPで
鉄 投 与 例 の 神 経 膠 細 胞 は,そ
の数 が反応 性 に
あ る. HRPに
関 し
て は 低 分 子 量 の 糖 蛋 白 とい う こ と が 一 番 取 り込
増 加 し て お り,神 経 膠 細 胞 自体 もや や 肥 大 し,
み を有 利 に して い る理 由 で は な い か と思 わ れ る.
グ リオ フ ィ ラ メ ン ト以 外 に 多 くの ラ イ ソ ゾ ー ム
しか も光 学 顕 微 鏡 の み で しか 検 索 で き な い蛍 光
が 認 め ら れ た(図5d).
色 素 に 比 較 して,HRPは
考
察
神 経 細 胞 は 前 述 の よ うに,種
る細 胞 で あ り,決
光 学 顕 微 鏡 の み な らず
そ の 陽 性 細 胞 の 超 微 細 構 造 を電 子 顕 微 鏡 的 に 検
索 可 能 で あ り,極 め て 有 効 な 物 質 で あ る.ま た,
々 の 機 能 を有 す
して 情 報 の 伝 達 と い う1つ の
HRPを
取 り込 ん だ 神 経 細 胞 に は核 の 融 解 や ピ ク
ノー シ ス 等,変
性 を思 わ せ る所 見 が な く全 く影
響 を受 け て い な い こ と も 明 ら か と な っ た.こ
の
神 経 伝 達 物 質 な ど種 々 の 物 質 を合 成 して 神 経 終
こ とは,従
達
末 へ 順 行 性 に 輸 送 す るの み な らず,外
物 質 を盛 ん に 合 成 す る 能 力 を残 し て 研 究 で き る
機 能 の み を有 す る もの で は な い.神
種 々 の 物 質 を 取 り込 み,細
経 細胞体 で
部か らも
胞 体 へ 逆 行 性 に輸 送
点 で,伝
来 の 神 経 細 胞 の 活 動 す な わ ち,伝
達 物 質 の 同 定 と投 射 経 路 の 同 定 とが ダ
し,し か も そ こ で 処 理 す る とい う一 般 的 な能 力
ブ ル 染 色 法 で も可 能 と な り極 め て 有 能 な 研 究 方
を も兼 ね 備 え た 細 胞 で あ る こ とが 明 ら か に な っ
法 とな る条 件 を満 た す も の と思 わ れ た10).
一方
,鉄 は 強 力 な ラ ジ カ ル 発 生 物 質 で,生
た. HRPを
坐 骨 神 経 に 投 与 した 理 由 は, ① 坐 骨
神 経 は 簡 単 に 露 出 で き,容 易 にHRPを
投与 す
る こ とが 可 能 で あ る, ② 大 変 長 い経 路 を経 て,
決 ま っ た脊 髄 レベ ル の脊 髄 神 経 節 や 脊 髄 前 角 部
化
学 的 に 鉄 イ オ ン を 脳 内 に 投 与 す る こ と で,フ リ
ー ラ ジ カ ル が 発 生 して.OHな
どの活性 酸素 種
(Reactive
Oxygen
Species;
ROS)が
活発 に
に起 始 細 胞 が 存 在 す る, ③ 左 右 交 叉 す る こ とが
産 生 さ れ る事 が 証 明 さ れ て い る11).そ して 脳 内 出
な い 等 で,実
血 に 伴 い 赤 血 球 よ り遊 離 し た ヘ モ グ ロ ビ ンや そ
験 経 路 と し て極 め て 適 切 で あ る と
考 え られ た.坐
間 後 に, HRPで
骨 神 経 にHRPを
投 与 して12時
ラ ベ ル さ れ た 神 経 細 胞 が,坐 骨
の 中 に 存 在 す る鉄 イ オ ン の 神 経 細 胞 傷 害 へ の 可
能 性 お よ び そ の 関 与 様 式 に 関 し て,脳
浮 腫や 外
神 経 に所 属 す る 脊 髄 神 経 節 や 脊 髄 前 角 部 に 認 め
傷 て ん か ん の 成 因 の 機 序 の 解 明 か ら注 目 さ れ て
ら れ,坐
い る12).血球 か ら遊 離 し た 鉄 イ オ ン(Fe2+あ
骨 神 経 の 軸 索 内 を か な りの ス ピー ドで
るい
1168
木
はFe3+)は
組 織 内 に 存 在 す る過 酸 化 水 素 と反 応
してROSが
に,こ
村
発 生 す る と考 え ら れ て い る.さ
れ ら のROSは
ら
脳 内の神 経 細胞 に極 め て
康
裕
の が 観 察 さ れ た.坐
骨 神 経 が 入 る脊 髄 レベ ル の
脊 髄 神 経 節 細 胞 や 脊 髄 前 角 細 胞 に は,多
HRP陽
数 の
性 神 経 細 胞 が 認 め ら れ た.こ れ らHRP
多 く存 在 し,容 易 に 酸 化 され 易 い 不 飽 和 脂 肪 酸
陽 性 神 経 細 胞 を 電 顕 的 に 検 索 す る と,電 子 密 度
を 過 酸 化 す る こ とで,細
の 高 い 物 質 が 核 の 周 辺 に 多 く集 ま り,電 子 密 度
胞膜傷 害 の 直接 原因 と
な る.そ の 結 果,神 経 細 胞 の 機 能 傷 害 を起 こ し,
の 高 い ラ イ ソ ゾー ム と して も観 察 で き た.経
て ん か ん 焦 点 形 成 へ と導 く と考 え ら れ て い る.
を お い て 観 察 した が,神
実 際,ラ
め られ な か っ た.そ
ッ トや マ ウ スの 大 脳 皮 質 に 鉄 イ オ ン を
少 量 投 与 す る こ と で,極
め て 早 期 か ら電 気 的 放
さ れ, HRP投
れ る こ とが よ く知 ら れ て い る11-14).そ の た め 毒
こ とが 確 認 され た.
の 直接 的影響
し て,こ
れ らの電子 密度 の
高 い物質 は細 胞体 内の ラ イ ソゾー ムに吸 収処 理
電 が 生 じ,て ん か ん モ デ ル の 実 験 動 物 が 形 成 さ
性 を 示 す 鉄 イ オ ン に 関 して は,そ
過
経細 胞 の変 性所 見 は認
一方
与 後2週
間 目 に は 消 失 して し ま う
,鉄 投 与 例 で は 光 顕 的 に 投 与 後3時
間 と
の た め に神 経 細 胞 が 変 性 す る も の と考 え られ 易
い う極 く早 期 に従 来 の 鉄 染 色 法 で 検 索 して み る
い が,本
実 験 よ り鉄 が ま ず 神 経 細 胞 に 取 り込 ま
と,投 与 し た 部 位 に の み 限 局 して 認 め られ た.
れ て,神
経 細 胞 体 が 変 性 す る 可 能 性 も考 え ら れ
た.本
研 究 に お い て は,毒
性 の 強い鉄 イオ ンで
しか し な が ら高 感 度 鉄 染 色 法 を行 っ た 例 で は,
鉄 投 与 部 位 は もち ろ ん の こ と,投 与 部 位 の 周 辺
も神 経 細 胞 が 取 り込 む こ とが 明 ら か に な っ た.
部 で も鉄 陽 性 の 所 見 を示 し,鉄
神 経 細 胞 は 有 利 な 物 質 の み を選 択 的 に 取 り込 む
認 め ら れ た.鉄
の で は な く,鉄 を 取 り込 ん だ 神 経 細 胞 は 強 く傷
域 の 錐 体 細 胞 層 を電 顕 的 に 観 察 す る と,神 経 細
害 を 受 け る こ と が 電 顕 的 に 明 らか に さ れ た が,
一部 の神 経細 胞 では
,充 分 に 神 経 細 胞 の 活 動 を
胞 は 極 端 な 変 性 像 を 呈 して き た.神
維 持 し て い る が,鉄
の細 胞体 内に は電子 密度 の 高 い物質 が 多数認 め
を取 り込 ん だ こ とで,異
常
つ い て は,そ
放 電 す る 能 力 を持 っ て い る も の の 可 能 性 が 考 え
ら れ た.こ
られ た.
膠 細 胞 が,特
て ん か ん 焦 点 の神 経 細 胞 の 形 態 学 的 特 徴 に つ
陽性 神経 細胞 が
投 与 部 位 か ら少 し離 れ た 海 馬 領
経膠 細胞 に
の数 が 反 応 性 に 増 加 して お り,そ
の よ う な 変 性 を示 す 神 経 細 胞 と神 経
に 海 馬 領 域 に 多 く認 め ら れ た.
取 り込 ま れ たHRPは
神 経 細 胞 に 対 して は 毒
い て は よ くわ か っ て い な い の が 現 状 で あ る.鉄
性 を示 さず,ラ イ ソ ゾ ー ム に よ っ て処 理 さ れ た.
を 取 り込 ん で は い る が,そ
そ の 理 由 に はHRP自
の神 経 細 胞の核 の癒
体 が糖 蛋 白であ るため取
合 や ピ ク ノー シ ス 等 の 変 性 を 疑 わせ る所 見 が な
り込 み 易 く,処 理 され 易 い こ とが 考 え ら れ た.
く,充 分 に 神 経 細 胞 と し て 機 能 す る もの が 異 常
一方
放 電 をす る こ と で,て
接 的 影 響 の た め に 神 経 細 胞 が 変 性 す る も の と考
ん か ん 焦 点 を形 成 す る 可
能 性 も あ る と考 え ら れ た.
結
は 強 力 な ラ ジ カ ル 産 生 物 質 で,そ
え られ 易 い が,本
も考 え ら れ た.ま
神 経 細 胞 に と っ て あ ま り毒 性 を 示 さ な い 物 質
peroxidase(HRP)と,
の直
実 験 よ り鉄 が ま ず 神 経 細 胞 に
取 り込 ま れ た 後,神
論
で あ るHorseradish
,鉄
経 細 胞 を 変 性 させ る 可 能 性
た,鉄
が 異 常 放 電 を し て,て
を含 む こ とで神 経細 胞
ん かん の焦 点形 成 に関 与
して い る の で は な い か と も考 え られ た.
ラ ジ カ ル を発 生 し毒 性 の 極 め て 強 い と考 え ら れ
る塩 化 第 二 鉄 の2種
類 の物 質 をそれ ぞれ神 経 組
織 内 に 投 与 し て,神
経 細 胞 内 へ の 取 り込 み とそ
の 運 命,ま
た 神 経 細 胞 に 与 え る影 響 等 に つ い て
光 学 顕 微 鏡 的 お よ び 電 子 顕 微 鏡 的 に,そ
の形 態
学 的 特 徴 に つ い て検 討 し て 次 の 結 果 を得 た.
坐 骨 神 経 で は, HRPが
れ て,軸
神 経 突 起 内 に 取 り込 ま
索 流 に 乗 っ て 逆 行 性 に 輸 送 され て い る
稿 を終 え るに 当 た り,長 年 ご指 導 い た だ い た故 大
塚長 康教 授,ま
た実 験指 導,原 稿 の ご校 閲 を い ただ
い た佐 々 木順 造 教 授,水 川公 直 元 講 師,苅 田成 人技
官 ほ か解 剖 学教 室 第一 講 座 の 諸 兄姉 に深 甚 な感 謝 の
意 を表 し ます.
神 経 細胞 の取 り込 み作 用 の形態 学 的研 究
文
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: Light
and
村
on the
electron
康
uptake
nerve
cells
investigations
of Anatomy,
University
Okayama
(Director:
of the
KIMURA
Department
Horseradish
function
microscopical
Yasuhiro
Okayama
裕
Medical School,
700, Japan
Prof.
J. Sasaki)
peroxidase (HRP) was applied to the rat sciatic nerve and the uptake, retro
grade transport and interneuronal fate of HRP were examined by light and electron micros
copy. Furthermore, FeCl3 which is very toxic to the nervous system was also applied into the
rat cerebral sensory motor cortex and examined with Perls iron staining and Perls+DAB
high sensitive iron staining methods for light microscopy. After the injection of iron into the
rat sensory-motor
cortex, the ultrastructual
morphological
effects on the neurons and glia
cells in the hippocampus were also examined by electron microscopy.
The HRP labeled neurons of the spinal ganglia and spinal anterior
motor neurons were
observed within 12 hours after application of HRP into the sciatic nerve.
brown granules were accumulated in the perinuclear
ules appeared to be multivesicular
regions.
The HRP positive
Ultrastructurally,
and lysosomal bodies in the perinuclear
these gran
regions.
These
granules were degraded by the lysosomal system disappearing 2 weeks after the injection.
In the cases of FeCl3 injection, many neurons which existed in the vicinity of the injected
area also showed iron uptake. These neurons contained abundant small brown materials in the
cytoplasm.
Ultrastructurally,
the pyramidal neurons showed the degenerated
nuclei were pyknotic and the cytoplasmatic
materials
were amorphous.
changes, the
In the neurons which
showed iron uptake, a cause of the epileptic abnormal discharge, there were no degenerative
findings. These neurons probably showed the abnormal
induced the epileptic seizures in the iron-induced
excitation and seizure discharge and
epileptic rats models.