家族性筋萎縮性側索硬化症 におけ るCu/Zn superoxide

609
家 族 性 筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症 に お け るCu/Zn
dismutase遺
superoxide
伝 子 変 異 に 関 す る研 究
新潟大学脳研究所神経内科学部門(主 任:辻
中
野
亮
省次)
一
Missense Mutation in Cu/Zn Superoxide
Familial Amyotrophic Lateral
Dismutase
Sclerosis
Gene in
Ryoichi NAKANO
Department of Neurology, Brain Research Institute,
Niigata University, Niigata
(Director: Prof . Shoji TSUJI)
Several missense mutations
been reported
as a putative
sclerosis (FALS).
in Cu/Zn superoxide dismutase gene (SOD1) have recently
cause of chromosome-21q-linked
I discovered
a novel missense mutation
in exon 1 (GCC to ACC) in two FALS patients
familial amyotrophic
(substitution
from one Japanese
FALS family.
mutations were found in 17 sporadic ALS, 2 ALS of Guam or 7 Parkinson-dementia
of Guam.
The enzyme activity of recombinant
Cu/Zn
superoxide
lateral
of Thr for Ala4)
dismutase
No
complex
(SOD) with
the Ala4 to Thr mutation was significantly reduced in the expression system in E. coli.
In
this system, the recombinant protein is produced as a fusion protein connected by a histidinerich polypeptide containing
20 amino acid residues.
system in insect cells using baculovirus,
the mutant
expressed as high enzyme activity as wild-type SOD.
of SOD with Ala4 to Thr mutation
On the other hand, in the expression
is disrupted
SOD, which was nonfused
protein,
These results suggest that the stability
especially if it is expressed
as the fusion
protein. Autopsy was carried out for one of the two patients, and the pathological findings
were typical for FALS with posterior column involvement.
These results raise the possibility
that mutation
key words:
of the SOD1 is responsible for FALS with broader pathological involvement.
familial amyotrophic
missense
lateral sclerosis,
free radical,
Cu/Zn superoxide dismutase,
mutation
家 族 性 筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症,フ
リ ー ラ ジ カ ル,ス
ー パ ー オ キ シ ドジ ス ム タ ー ゼ,ミ
ス
セ ソス変 異
Reprint
requests
Department
Institute,
to:
Ryoichi
of Neurology,
Niigata
Asahimachi-dori
951, JAPAN.
NAKANO,
Brain
University,
1, Niigata
City,
Research
別刷請求先:〒951新
潟市旭町通1番 町
新潟 大学 脳研 究所神経 内科学 部門
中野 亮 一
61
(
I
新潟 医学 会雑誌
1. は
じ め
第1
08巻
第 8号
平成 6年 8月
3. 実 験 方 法
に
筋萎縮性側索硬化症 (
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言二九
㌦
に病因は不 明であ る. ALS は一般 には遺伝歴 はな く,
列 を決定 す る方法 を採用 した.患者の 白血球 または凍結
孤発性 の疾患 であ るが,数%は家族性 に発症 し,家族性
組織 よ りゲ ノム DNA を常法 に従 い単離 した後 ,S
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更 に用いた
発例と同様 に錐体路 と脊髄 前角 を
こ病変が限局 され る群 と,
オ リゴヌク レオチ ド
プ ライマ-は発表 されているヒ ト S
ODl
こ畑 こ加 工 て後索.C1
こ
I
r
kL
,柱, 脊髄 小脳路 に も変性 を
認 め る群 (いわゆ る後索塾怠
り に表別 され る.本症 の部の家系は欝21
染色体長腕 を
こ連鎖す ることが証 明 されて
CACAAGCCTCC-3';エ クソン2:5すべ二
AGCCTGGG
いたが, ここには避頗 しない家系 も存在 し FALS は
遺伝学的 を
こ屯不均- な疾患群であ ることが明 らかに され
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こ数種類の ミスセ ンス兼愛鼎 を発展した書
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CU.
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装置 を,ポ リメラゼは同社の Amp
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qを涌いた.托 R
の S(
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)活性 は正常 ハ約400
b程 度 に低 ドして い る二.
i
,
の条件は最初 に変性9
4℃ 2分 を行 った後,変性朗 ℃ 且分予
が明 らかとな ったため5
)
,soD3の ミスセ ンス庶変異が
第21
番染色体長腕 に連鎖す る FAi
J
S の病因で あ ると考
2℃ 6分 の反応 を行 った. PCR 産物 は 3%低融点
後 に7
えられるに至った.しかしSODlの異変 を有す る FALS
の臨床像,病理学的所見は明らかに されてお らず, また
孤発倒し
り.
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uSや Al
J
S;
｣関連 した疾患 におけ る S()
r
)
変異の有無などを
こついては不明な点が多い中
本研究ではF
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uJ
Sおよび j
uJ
SF
難抄も畝におし､
て､
W)
I
)
I
変異の有無を検討し,それにより本邦の FALS 家系 に
発見された,これまでには報告のない新たな SODl変
異について臨鼠 病理学的所見をまとめ声さらに変異 SOD
の活性についてリコソビナソト SOD を作製 して検 討
,
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F
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産物 をテ ンプ レ- 卜と して,蛍 光 肝王
TC) ラベル した
プ ライマ- (
宝酒造 を
こて合成)を伺 い, サイ クル シ- ク
エ ソス法 にて直接 シ- タエソ又を行 った. サ イクル シ-
(
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2
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b
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(
)
I
)
1点変異の
2. 実 験 対
確認
象
S
ODl変異の検索 については互 いに関連のない F
ALS
8家 系 9症 例 ,孤 発 ALS 1
7胤
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ODlの ユ タソソ iを上記
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王
Hで
のプライマーを開 いて PCR にて増幅 した後,Ha
消化 した.消化産物 を
32p
で ラベル して 1
2%変性 ポ リ
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cx 7例 を対象
ア ク リル ア ミ ドゲル上 を電気泳動 した後, オ- トラジオ
と した. FALS の 8家系 はいずれ も連鎖解 析 は行 われ
グラフ ィ… を行った .
ていない家系であ る.
3) リコンビナント SOt
)発現ベ クターの構築
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ヒ トの野生型 SOD に対す る c
中野 :家族性筋萎縮性側索硬化症 を
こおけ る Cu/Zn s
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遺伝子変異に関する研究
(
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D掴鋸 を含む プラス ミド DNA (
pUCt
a
c
SOD,宇部
611
ラ右 ゲ- シ ョソした. このプラス ミド DNA 鳥 相 )杏
工業株式会社 より供与)をテンプ レ-卜と して野生型 SOD
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て 宿 主昆虫
にて作製 した. セ ソスプ ライマ- (
野生型 :5㌧TACA
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7℃で 4- 5日間培養 し,
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)は ATG の
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パキ ュロウイルスを含む培養上清 をプラー クア ッ屯イに
く'
ト -卜二
J卜
∴ノを 含む位 軒に設定 し.新 たに i
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(
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(
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用 い, 4個の組み替 え体 を S
DSPAGE を
こて選別 した.
識部位 を付加 した顎 ア ンチセ ンスプライマー (
5'
ぺ二
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l沌xl
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6
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これ らの リコソビナン トバキュロウイルスを Sf
TAGACTGCAGGTCGAC針 3㌦
に感染 させ.1
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り下流側 に設定 した.PCR 産物 を Ne
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1mM上 ZnCl
2
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消化 し アガロ- スゲル電気泳動 にて精製 した後,発現
(
lmM)の存 在下 あ るいは非存在下 にて 3日間培養 し
湘 x臥 5分間の遠心で細胞を集め,4℃下で 2,
5
た.5,
エ ソダ部位 に ライゲ- シ 三
言ソした. この ように して作製
した野生型 SOD 発現ベクタ- (
p
En統SOD)
,変異 SOD
砕 した.22,
00
0×凱 1
5分間遠心 し,上清 を開いて SOD
発現ベ クタ- (
p
ETmt
SOD)では, リコンビナン ト SOD
活性 を前記の方法 にて測定 した.本 システムで作製 した
はア ミノ末端 に ヒスチジン
月こ富む2
0
個 のア ミノ酸 よ りな
リコソ ビナ ソ ト SOD は融合蛋 白では な く,余分 な ア
るポ リペプチ ドが付加 した融合蛋 白と して産生 され る.
ミj酸 は含 まない.
i) リコンビナ ン ト SOr
)の作製 と SOT
)活性
4. 結
の測定
宿主大腸菌 [
BL21(
DE3),
N ov agen
]を p
ETwt
SOD
あるいは p
Ermt
SOD にて形質転換 し,CuCま
2日mM),
果
l) L
<(
)
I
)
L変異
本邦 のFALS l家 系 , 2症例 に これ まで には報告 の
ZnC1
2(
1mM)の存在下 あ るいは非存在下で 3mlの
ない新 たな ミスセ ソス変異 を発見 した9).瓢発 の ALS,
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培 養液 中 て 培 養 した. l
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1mM)を添加後 ,ih 培養 を
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には変異 は認 め られ なか った.発見 され た変異 (
覧CC
続けて リコソビナ ソ ト蛋 白の産生 を誘導 した.大腸菌 を
?&CC)は SODlのエ タソソ まに存在 し, この変異 に
5,
00
0×g, 5分間 の遠心 で紫蘭 L,超音波処理 を
こて細
よ り4番 ア ラニ ンが ス レオニ ン監置換 (
Aユ
a
適うT
hr
)す
jル ア ミ ドゲル電気泳
胞 を破砕 した後 ,SDS-ポ リプ タ f
0
例を
こついて
る ミスセ ソス変異であ った. また正常対 照3
SDS-PAGE)を行 い リコンビナ ン ト SOD の産生
動 (
認 早.
1
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1
I
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r変異は認ム
一
才
いなか 一
･
､た.
調べた結果では AlaJ
5mM リン
を確認 した. 蜜た同様 に集薗 した菌体 を 2.
2) Ha(
1
1
1
1制限酵素断片長 多型による変異の確
0
0/
′
t古 宇沸 し,超音波 処
酸r
JIl
t
T∴溶液 H)
ト
iT.
･
1
11
0分間 (4℃)加 えて細胞 を破砕 した観 2,
0
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理を1
3
線 問遠心 し,得 られた上清を用いて
発見 された変異によりユタソylの 3か所の Ha
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I
H制
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限酵素認識部位の うち車乗の 且か所 が消失す るため, こ
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T)法丁 により SOl
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く 産物 を F
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1で
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活性 を測定 した.
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)
) SOD r
D.
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VA を組み込んだバキ ュロウイJ
L
･
ス
.
ペクターの構築 と昆虫細胞での リコンビナ ン
ト SOD の発現
pETwt
SOD あ るいは pETmt
SOD の構築 と同様の
消化 し.そし
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制限酵素断 片長 多型 L
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1
-級). 2症例 と も変異 の存在及 びヘテ ロ接 合体 で あ る
二王が確認 された L
Fi
g.卜bl.
:
i
) Al
計1
-Thr変異 を有する症例の臨床所見
方法 に よ り野生型 あ るいは変異 SOD に対す る c
DNA
を纏.
み込 んだバキ ュロウイル スベ クターを構築 した,野
5月) に左下肢の筋萎縮 と筋力低下で発症 した.神経学
生型 あ るいは変異 SOD に対 す る c
DNA を PCR に
的 には
て増 幅 し, 盈o
RIと 退
勤mHIで消化後, バキュロウイ
縮 を認れ
3
9
3,Nova
留en)に
ルス トラソスフ ァーベ クター (
pVL1
萎縮筋 に神経原性変化 を認めた.その後左上肢夕次 いで
左 卜肢に限局 した筋萎縮.筋 力低下 と線維 束轡
左膝菱腔反射 が消失 していた.針筋電 図では
61
2
新潟医学会雑誌
窮ま
08番
第 8腎
平成 6年 8月
右上下肢 に も鷹萎縮 が出現 し,急速 を
こ悪化 した. また左
f
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肢 に明 :
'
かた知覚鈍麻 を認めた.約 1
0かノ
りハ経過 て呼
Eミ
H
吸不全 のため死亡,剖検 が行 われた,
H
H
症例 2 (
Fi
g.2)は2
7才の男性 で,21才時 日987年
8月)に左下肢の線維束轡観 鷹力低下にて発症 した.旦
湘
67bp
24bp 25bp
年 2月新潟大学神経 内科 を
こ入院.神経学的には左下肢全
(
H:
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HS
i
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o)
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_筋 力低 下. 両側膝 蓋腫 反射 し
1
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亡進, 上I
J
'
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手 袋 靴 下 塾 の 知 覚 鈍 麻
爵電 園では四肢厳 を
こ神
を認めた.針
経 原 性 愛 育ヒ を 認 め た . そ
の後厳萎
J
.
現
縮 が右上 下肢 に もf
i
し. 急 速 に 進 行
全.球 麻碑 も出.
現 し.
悪 化 し た た 入'
1 19と
;
9 隼 :
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L.
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した . I
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呼吸 小
り人
年
1)
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]両側眼球運動制限が,
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J
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現. 9月に 甘 完全 外 眼 gf
J
'
蘇峰
工呼吸器 が装着 され
6Bbp
経 管 栄 養 が 開 始 さ れ た . 1990
とたった.また 1
9
9
0隼 と
‖十Lり尿失 禁机 七現 した. 1991
(
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lには対 光反射,捷 t
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反射 と も消失 した . 検 査 所 見
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肉眼的 には脊髄前板 と脊髄前角 の萎縮 を認めた.発願
では舌下神経 核.顔面神経核,広範 左脊髄 前恥 ･
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り著 明左脱 落 を認め (
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い
患者で は変 異 プ レル 由 来 の 49bp の バ ン ドを
認める.
ヽ- :
::
2
Fi
g2 Al
L
l
J･
r
nl
r蜜艶を有す る FALS 家 系ハ′
家系L
乳 黒塗は発症且
中野 :家族性筋萎縮性 側索 硬 化症 に お け る (
.
二
u･
Zns
uper
oxi
dedi
s
mL
I
t
a
S
e
適伝子 変異に関 す る研 究
(
Fi
g.4
d上
61
3
脊髄 ′
｣
＼
脳路 の著 明 な変 性 を認 め, いわ ゆ
5) 大腸 菌お よび昆 虫細胞の発現系で作製 した リ
コンビナン ト S
OI
)の SDSIPAGF
.
pだrl
繭 を周 いた BL21(
DEB)の発現系 お よびパキ ュ
21の発現 糸で作製 した りニ
iンビ
L
lr
1
7仁′
しスを用いた Sr
ナン ト S
ODは S
DS
PAG王
二にて発現が確認 された (
F
i
g.
5
㌦
6) リコンビナン ト S
(
)
D の活性
大腸 菌 の発現 糸で作 製 した野 生 型 の
SOI
′
) で は 大腸
SOD
菌の培 養液 中 i
こ Cu,T
J
n を添 加 Lなか った場 合の
活性 (
1
1
6.
6±2
2.
2uni
t
s.
,
mg.n-3
)は低かったが.CuC1
2
(
1n
l
M上 ZI
I
Cl
ヱ(
1mMl を添 加 Lた場 合は S
OD 活性
は十分 に発現 し (
2
92
8.
0±1
5
O.
9uni
t
smg,n-3㌦ 非
21
0.
0±2
0.
Ouni
t
s;
mg,
では Cu,Zn 添 加時 で も活性 (
n-3)は非添 加時(
7
)活MI
_(
7
3.
6±2
2.
6uni
t
s.
mg､n-3)
Fi
g3 症 例 2の頭部 CT.前頭葉, 側頭葉 に定
質萎縮 を認 め る.
に比 べて約 3倍に しか増 加 しなか った (
Fi
g.6
-a)
.良
虫細胞 L
T
)発現 系で作製 した野 生型
SOD 活性 は Cu,Zn
Fi
g 4 症 例 1♂)病坪組織 像.
a.C6 頚敵 前角(
I
)
萎縮.前 角 ･側索 L
J
)i:
1
-りン染色性 の低下 を認め る. (
Kl
uver
-Ba
r
r
er
a染
色, ×5.
3)
ら.L3前角 .著名 な神 経 細胞 の脱落 と グ リオ- シス,残存運 動 ニ ュ- ロ ソ内 の Lewy 小体
様L
T
)
封 入体 を認 L
t
T
'る. t
r
I
emと
1
t
.
OX)
･
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i
I
けいS
i
n 染色, x1
6
01
emat
oxyl
iI
十eOS
i
n 染 色,×1
6
0)
C.L2腰髄 . 後索 の 変性 を認め る. けi
j 胸敵 Cl
ar
ke柱 神経柵胞L
T
)
著 名な脱落 を認 め る. L
He1
1
1
a
t
(
)
Xyl
i
什e
OS
i
n 染 色.×1
6
0)
d.Thl
･
61
4
Fi
g5 りコンビナ ン ト S(
)
D の SDSェ
PAGE.
a.大 腸菌 の発現 糸. 矢 印 は り:
コンビナ ン ト S
OD を示 す. 他は大腸 菌蛋 白.
- :I
PTG 誘導 前.+ :I
P'
l
t
G 誘導 後.
b.昆 虫細 胞 の発現 糸. 矢 印は りコンビ十 ン ト SOr
) を示 す. 他 は昆 虫細 胞蛋
白.
中野 :家族性 筋萎縮性 側索 硬化症i
･
こおける CuZns
up
er
oxi
(
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mut
L
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S
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遺 伝 1･
変異 を
こ関す る研究
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1
5
0
0
0
3
い i
二は約 1
1
倍に L界 してお (
)
,野 生型
ul
l
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t
smg.n-･
(
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]
つSOl
)とはば同等の活性を示 した (
Fi
g.6
-b上
ここに報告 した変異を合札
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U⊃
■
音
5. 考
察
これ までに FALS にお
>I
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6
種板し
1
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I
)
I奪取が報苦 されているがl
甘9.
1
0'
.
いて 1
QO S
)
チ最 も頻度の高い
互いに閑適のない 8家系で見つか り5
変異であった.奪回発見 した変異はこれ とは異なるもの
であるが,興味深い ことにやは り Al
a壕を置換す る ミス
セ ンス変異で.
ある. 二L
T
)AI
L
I
1は 多くL
り生物種で よ く保
日,soD の活性部位 か らは遠 く離れて
存 されているが1
∴∴ ･
.
一
･
･
.
__+
Wi
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｣A
⊥
cu
(
%/
M
Z
)
u
C'
2 お り活性その ものに直接影響す ることは考えに くい.
l
a
L
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T
h
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t
a
n
t
SOD は等価 な 2つのサ ブユ ニ ヅ 葦
､よ りな る 2盈体
(
ho
mo
d
i
me
r
)と して存在 し1
2
)
,各々のサブユニ ッ トは
8本の逆平行 β鎖 と 3つのループよりな る 将状の構盈
すなわち 針 ミレル構造 を構成 している13). 1つのサブ
0
∩
)
0
nが 1個ずつ存在 し,4つの Hi
s
ユニ ッ トには Cu と Z
残基 に配位 された Cu が基質であ る 02
胤 との反応部
位きすなわち触媒部位 となり, これを取 り囲む 2つのル-
いる.Al
a格に限 らず これ までに報告 された ミスセ ソス
0
0
6
St
!
Un.
A)
!
^!
1
3VOOS
BL
U,J
0
0
8
プとともに活性部位 を形成 している.Zn は直接活性 に
OD の構造維持 に必要 と考 え られて
は関与 しないが,S
kiら1
0
)の報告 した Hi
s
4
6
-Ar
g変異 を除い
変異は Ao
こ
ていずれ も Cu を配位す るア ミノ酸 を含む活性部位 を
ぼ存在せず,む しろ S
OD の Pバ レル構造の安定性 や
2盈体形成 に重要なア ミノ酸 に相当 していることから,
OD の安定性 を減 じるこ
これ らの ミスセ ソス変異は S
とによ り S
OD 活性 を低下 させ ると考 え られ る.De
ng
ら5) は, エクソソ 1の A且
a碩
-va
l変異 を含む 6穫餅の
;+ .
Cu
Cl
2!
'
ZuCl
2
Al
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Gl
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1
1
1
8･
Gl
l
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球 か ら SOD を粗糖製 して活性 を測定 し, いずれの変
h
) について も正常(
'
)約!
l
O0
6に活性 が低 卜してい
異 SOL
Fi
g6 り二
Eンビ十 ン ト S
OD L
T
Mi
モ性.
a1,
Tl
l
r変 艶 SOr
)につい
ることを明 ｢
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-:Cu
Cl
ヱZn
(
.
T
l
2非添加.
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l
a
や
V
a
lが疎水性
丁
ミ/
酸であるのi
こ対 して
ては,
+ :Cu
C1
2
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I
C1
2添:
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単位は u
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a.大腸菌の発現系.
b.昆虫細胞の発現系.
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0.
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1.
1uni
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･
.
■
mg,r
1
-4)に比較 して添
よりも強 い構造変化が生 じている可能性 もある.泰症の
変異は he
t
e
r
o
z
yg
o
t
eであ り正常のア リルか らは正常の
SOD サブユニ ッ トが作 られるため患者赤血球から SOD
を鰐製 して活性測定 した場合,変化があ ったと して も軽
9
4
8.
8±1
7
5.
7uni
t
s
/
'
mg.n-4)は1
0
倍に_
l
二
昇し
加時 (
S(
)
i
)を作製 して活性測定 を行 一
･
:
,た.Al
こ
1
1
-Thr変取 ■
]
±4.
6uni
t
s
.
･
.
mg.n-41に比較 して添加時 (
8
8
8.
8±1
5
ニ
i
.
2
6ま
6
新潟 医学会 雑誌
第1
0
8巻
第 8号
平成 6年 8月
活性 その もの には直接 は影響 しないが, 融合蚤由の形 で
養関 西小 千谷業容院神経 内科
産生 され た場 合. 著明 に蛋 白畳 が減 少 し,SOT
)L
り活性
明先 ′
仁 取 手協 同美容院 神経 内科
も低下 していることか ら,特 に融合蛋 白においては SOD
武蔵野 F
l赤病院 神経 内科
を著 しく不安定化 してい ることが考 え られ る.実際 の患
齢科大学 神経 内科
石川厚先生,斎藤 正
新 谷間三先 生 .
土 谷邦秋 先生. 東 京
医
科
塩 尻俊明先生の 各先 生方 に感謝
)
1
) も安定 性 L
T
)低 ドに よ り,結 果的 に活 性
者(
:
T
l変異 S(
UCt
a
e
SOl
) を提 供 して 卜さ一
､
いた します. また p
が低下 して い ることが予想 され る,
た宇 部 工業株式 会社 に感 謝 いた t
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吏
∵｢.
参
あ る とい う報 告 且
0)が あ る以 外 は, SOD の変 輿 塾 と臨
考
文
献
床型､病理 と叫 閑適 i
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即上
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かに さ頼 .
こい左い. ここに示
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6.
例で
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運動
障害, 自立神経障害 な どを認 め,瓢発例 の ALS と
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なるより広い病変分布 を示 した.剖検 が行 われた例
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で は 病理学的を
こぼ典型的 な後索 型
F弧 S の所見 を認 め
た8).FALS は不均-な疾患 群 で あ るが,SOD 変 異 が
こぼ後索 型 を
こ対応 して い
病 因で ある FALS は病理学 的 を
る可能性 があ り,今後 多数例 で の解析 が必要 で あ る｡ ま
7
)付 L
.
1
5打 は A13.1 ･
Thr変 異を持 ･)二㌔
.
二
た.症 例 コし
が確認 され てい るが現在 は発症 してお らず,今後憐 豪 に
経過 を観察 す る必要 があ るがタ この ことは FALS の 発
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索 した限 りで は SODl変 異 は発 見 されず ,第21
番漁 色
体 に連鎖 してい る FALS とは病 因は異 な ると考 え られ
る. これ らの疾患 の原因 が プ リ- ラジカルの処理機磯 の
異常 に関連 してい るかど うかを
こついては今後 多面 的 な検
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こあた り,御指導,御 校閲 を賜 わ り
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感謝 申 し上げ ます. ま
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終始御指導 いただいた佐藤修 二講師,大塚 畏助 手 ,
新潟 脳研究 所実験 神経病理J
羊部 門
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生阿房弘教授.
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藤 胴 的逸 講師 に深 く御 礼申 し上げ ます. また検 体L
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生,新潟市民病院神経 内科
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村建 司助 教授,大阪大学 生 化学講桓
大西洋 司先生, 山輝元
義先生,佐藤 晶先生,信楽 園病院神経 内科
先生,小宅 陸郎党生,下越病院神経 内科
発生,水原郷病院神経 内科
堀 川椀
川上 明男
永 井博子先生, 国立療
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中野 :家族性筋 萎 縮性側索硬化症 におけ る CuZns
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平成 6年 3月 竣 日受 付 )