GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定

LAAN-C-XX031
島津アプリケーションノート No.30（食品）
Intensity
%
100
0
100
200
300
400
m/z
Food
50
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
岡村 嘉之
Y.OKAMURA
芝本繁明
S.SHIBAMOTO
1.はじめに
脂肪酸は鎖状炭化水素の末端にカルボキシル基
肪酸の総炭素数および二重結合の数と位置の確認
を持つ化合物で，炭素数の多い脂肪酸は高級脂肪
は非常に重要で，これには GC/MS によるマススペ
酸と呼ばれています（高級脂肪酸の定義は炭素数 6
クトルの解析が有効です。
個以上や 12 個以上と諸説あります）。また，不飽和
脂肪酸の総炭素数と二重結合の数は，その脂肪
結合をもつ脂肪酸は不飽和脂肪酸と呼ばれます。
酸メチルエステルの GC/MS による分子イオンから
天然物の場合，不飽和結合の多くは二重結合であ
決定できます。脂肪酸メチルエステルの多くは NIST
り，その位置や数の違いにより多くの異性体が存在
などのマススペクトルライブラリ集に登録されており
します。それらは化粧品や工業製品などにも使用さ
GC/MS によるシミラリティ検索によって定性可能で
れています。
す。しかし，シミラリティ検索による定性で二重結合
不飽和脂肪酸は炭素数や二重結合の数と位置に
位置の情報を得ることはできません。
よって生体内での役割が異なることから，不飽和脂
分析計測事業部 応用技術部
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
1
Application Note No.30
GC/MS による二重結合位置の決定は，ピロリジド
1)
件や適用範囲を検討され，簡便で適用範囲の広い不
2)
飽和脂肪酸の二重結合位置決定方法を確立されま
やピコリニルエステル などの各種誘導体化法が古
した
くから知られています。これらの誘導体化法では，
4,5)
。
GC/MS により化合物の分子イオンが検出でき，さら
本アプリケーションノートでは，山本先生ご指導の
に炭化水素鎖の C-C 結合が開裂して生じるフラグメ
もと行った，GC/MS による二硫化ジメチル付加法を
ントイオンが検出されます。このフラグメントイオンは
利用する不飽和脂肪酸の二重結合位置決定法を報
14u の差で検出されますが，二重結合部分でのフラ
告します。
グメントイオンの差は 12u となり，この部分を解析す
1) Andersson,B.A. and Holman,R.T. Lipids, 9,
ることで，二重結合の位置を決定することができま
185-190 (1974).
す。
3)
2) William W. Christie,
Francis が発表した一価不飽和脂肪酸に二硫化
Susan B. Johnson
ジメチルを付加させる方法は，得られるマススペクト
Elizabeth Y. Brechany,
and
Ralph T. Holman,
Lipids, 21, 657-661 (1986).
ルが単純であり，二重結合位置を示すフラグメントイ
オンの強度比も高いことから，容易に二重結合位置
3) G.W.Francis,Chem.Phys.Lipids,29,369(1981)
の解析が可能です。
4) 芝原，山本ら, 油化学, 34, Vol. 8, 618, (1985)
5) 山本，芝原ら, 油化学, 40, Vol. 6, 497, (1991)
大阪府立大学 芝原 章先生，山本公平先生は，
この解析方法に着目し，二硫化ジメチル付加反応条
2.実験
ガスクロマトグラフィーで脂肪酸を分析する場合，高
今回のアプリケーションノートでは，メチルエステル
級脂肪酸は誘導体化して分析することが一般的です。
誘導体化を行った後，二重結合位置決定のための誘
誘導体化することにより化合物の極性を下げて揮発性
導体化を行いました。
二重結合位置決定を容易に行うことができる二硫化
を高めることで，より高感度で安定した分析を行うこと
が可能となります。
ジメチル付加法による結果と，古くから二重結合位置
誘導体化法としてはアルキル化が一般的で，メチル
決定法として用いられているピロリジン誘導体化法に
エステルもしくはエチルエステル誘導体化が行われま
よる結果を比較しました。
す。アルキル化は，GC/MS で分子イオンが明確に検
出される点においても有効な誘導体化法です。
2-1.測定成分と試料調製
今回の検討では，二重結合位置が判明している試
表 1 に測定成分を示しました。二重結合位置はカル
薬を購入し試料としました。炭素数 18 個で二重結合
ボキシル基の炭素から数えた表記としました。比較と
の数が 1 個（モノエン）と 2 個（ジエン）の不飽和脂肪酸
して炭素数 18 の飽和脂肪酸であるステアリン酸につ
について測定し，モノエンについては二重結合位置が
いても測定しました。各単一成分試料と全種類混合
異なる２種類と，それらの cis 体，trans 体を測定しまし
試料をそれぞれ調製して測定を行いました。
た。
表 1 測定成分
成分名
二重結合数
二重結合位置
幾何異性
略式表記
ステアリン酸
0
-
-
18:0
オレイン酸
1
9
cis
18:1(9)c
エライジン酸
1
9
trans
18:1(9)t
cis-バクセン酸
1
11
cis
18:1(11)c
trans-バクセン酸
1
11
trans
18:1(11)t
リノール酸
2
9,12
cis,cis
18:2(9,12)cc
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
2
Application Note No.30
2.誘導体化と分析条件
表 1 に示したステアリン酸以外の各標準品をメタノー
今回の検討では標準試料を使用したため，誘導体
ルで溶解して 100g/L 溶液を，ステアリン酸は 10g/L を
化処理後の精製操作は行いませんでした。食品や生
調製して各標準原液としました。各種メチルエステル化
体試料などの実試料を対象とした場合は，目的に応じ
試料は，各標準原液 1mg をメチルエステル化して調製
た精製操作が必要と考えられます。食品関連試料を対
しました。
象とした二硫化ジメチル付加での精製工程の一例を含
ピロリジン誘導体化と二硫化ジメチル付加には，メチ
んだ前処理フローを図 3-2 に示しました 1)。
ルエステル化試料 50µg を使用しました。図 1～3 に各
1) Akira Shibahara , Kouhei Yamamoto , Akemi Kinosita ,
処理のフローを示しました。誘導体化の器具は，ネジ口
Barbara L. Anderson , J. Am. Oil Chem. Soc. , 85 , 93-94
試験管を使用しました。
(2008)
ネジ口試験管に各標準原液1mgを採取
━━
━━
━━
━━
━━
━━
14%三フッ化ホウ素/メタノール溶液1.5mL
100℃，5分間加熱後冷却
飽和塩化ナトリウム水 8mL
ヘキサン2mLで4回抽出
無水硫酸ナトリウムにて脱水
濃縮
ヘキサン1mLに定容 (1000mg/L)
ネジ口試験管に脂肪酸メチルエステル試料50µg
━━ ピロリジン1mL,酢酸0.1mLに溶解
━━ 100℃，1時間加熱後冷却
━━ 過剰なピロリジンを窒素気流下，50℃にて
━━
━━
━━
━━
ヘキサン1mLに定容 (50mg/L)
図2 ピロリジン誘導体化フロー
図1 脂肪酸メチルエステル誘導体化フロー
ネジ口試験管に脂肪酸メチルエステル試料50µg
━━ ヨウ素/二硫化ジメチル（13g/L）0.1mL
━━ 35℃，30分間振とう
━━ チオ硫酸ナトリウム飽和水を
ヨウ素の色が消えるまで添加
━━ 10%エーテル/ヘキサンで抽出
（1mLで4回抽出を行い，計4mLを得ます）
━━ 無水硫酸ナトリウムにて脱水
━━ 乾固
ヘキサン1mLに定容 (50mg/L)
図3-1 二硫化ジメチル付加法フロー
蒸発させる
エーテル/ヘキサン(1:1)8mLに溶解
4mL蒸留水で3回洗浄
無水硫酸ナトリウムにて脱水
乾固
ネジ口試験管に脂肪酸メチルエステル試料50µg
━ ヨウ素/二硫化ジメチル（13g/L）0.1mL
━ 35℃，30分間振とう
━ Extrelut®NT ※充填カラム
━
━
━
━
(チオ硫酸ナトリウム飽和水を添加しておく)
※ Extrelut®NTはMerck Chemical社の製品です
試料を負荷
10%エーテル/ヘキサンで抽出
（1mLで4回抽出を行い，計4mLを得ます）
無水硫酸ナトリウムにて脱水
乾固
ヘキサン1mLに定容 (50mg/L)
図3-2 二硫化ジメチル付加法フロー(精製工程あり）
各処理とも最終溶液は，1mL に定容しました。
エステル化試料では最終溶液中の各脂肪酸濃度が
ピロリジン誘導体化と二硫化ジメチル付加では最終
1000mg/L となるため，ヘキサンで 50mg/L に希釈して
溶液中の各脂肪酸濃度は 50mg/L となります。メチル
測定しました。GC/MS 分析条件を表 2 に示しました。
表2 分析条件
ガスクロマトグラフ質量分析計
: GCMS-QP2010 Plus
装置
: EI
イオン化法
: Rtx-5MS (内径0.25 mm，長さ30 m，膜厚0.25 μm)
カラム
: 100℃－7℃/分－300℃（10分）
カラム温度
気化室温度 : 250℃
キャリアガス : He （線速度一定モード 45cm/秒)
注入モード
スプリット比
インターフェース温度
イオン源温度
スキャンモード
: スプリット
: 20：1
: 280℃
: 250℃
: m/z 45～450
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
3
Application Note No.30
3.メチルエステル試料測定結果
図 4 に各種メチルエステル化試料（混合試料と各単
ライジン酸メチルは溶出位置が近く，分離が不十分で
一成分）のTIC クロマトグラムと，目的成分付近の部分
あるため，混合試料の TIC クロマトグラムでは単一ピ
クロマトグラムを示しました。cis-バクセン酸メチルとエ
ークとなっています。
(x10,000,000)
TIC
cis-バクセン酸メチル
1.50
エライジン酸メチル
trans-バクセン酸メチル
ステアリン酸メチル
1.25
1.00
(x10,000,000)
オレイン酸メチル
リノール酸メチル
TIC
0.75
0.50
1.0
0.25
0.00
17.0
17.5
脂肪酸メチルエステル(混合試料と単一成分)のTIC部分クロマトグラム
混合試料メチルエステル
0.5
リノール酸メチルエステル
オレイン酸メチルエステル
エライジン酸メチルエステル
cis-バクセン酸メチルエステル
trans-バクセン酸メチルエステル
ステアリン酸メチルエステル
0.0
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
図4 脂肪酸メチルエステル(混合試料と単一成分)のTICクロマトグラム
各単一成分の標準試料で検出されたピークのマス
クトルを示しています。その他の成分のマススペクトル
スペクトルを図 5 に示しました。各成分とも分子イオン
は類似していますが，リノール酸メチルは二重結合の
が検出され，飽和脂肪酸メチルエステルであるステア
数が 2 個であるため分子イオンが異なります。
リン酸メチルは他の成分とは異なる特徴的なマススペ
Intensity
%
74
100
Intensity
% 67
81
100
ステアリン酸メチル
55
87
50
50
55
143
0
50
100
150
リノール酸メチル
95
109
199
200
255
250
298
300
350
400
m/z
450
0
50
220
100
150
200
262 294
250
300
350
400
450
m/z
図5 脂肪酸メチルエステルのマススペクトル
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
4
Application Note No.30
同一炭素数のモノエンであるオレイン酸メチルとエ
ペクトルから二重結合位置の情報を得ることは困難で
ライジン酸メチル，cis-バクセン酸メチルと trans-バク
した。
セン酸メチルは，マススペクトルはほぼ同じで，マスス
Intensity
% 55
100
Intensity
% 55
100
オレイン酸メチル
97
50
222
264
0
100
97
50
111
50
150
200
250
Intensity
% 55
100
111
296
300
350
400
m/z
450
50
150
200
250
Intensity
% 55
100
cis-バクセン酸メチル
296
300
350
400
m/z
450
trans-バクセン酸メチル
69
50
97
111
222
0
50
100
264
222
0
69
50
エライジン酸メチル
69
69
100
150
200
264
250
97
111
296
300
350
400
m/z
450
50
100
264
222
0
150
200
250
296
300
350
400
m/z
450
図5 脂肪酸メチルエステルのマススペクトル（づづき）
図 6 に混合試料の各分子イオンの m/z でのクロマト
は，別種のカラムによる分離が必須となります。
一般的に脂肪酸メチルエステルの異性体分離には
グラムを示しました。
cis- バクセン酸メチルとエライジン酸メチルは，二重
強極性カラムが有効ですが，今回の測定ではピロリジ
結合位置と cis 体，trans 体という違いがあるものの，こ
ン誘導体化と二硫化ジメチル付加による分子量増加に
の測定で使用したカラムではピーク分離できませんで
伴って，高温分析が必要となるため 5%フェニル系の微
した。これらは分子量が同一でマススペクトルもほぼ同
極性カラムを使用しており，本分析条件での分離は困
じであるため，マススペクトルを用いたピーク分離も行
難となっています。
なうことはできません。これらを個別に同定するために
(x10,000,000)
cis-バクセン酸メチル
1.25
trans-バクセン酸メチル
エライジン酸メチル
ステアリン酸メチル
1.00
(x10,000,000)
0.75
1.00
0.50
0.75
0.25
オレイン酸メチル
リノール酸メチル
0.00
0.50
17.0
17.5
脂肪酸メチルエステル(混合試料)の部分クロマトグラム
TICクロマトグラム
0.25
m/z 294 クロマトグラム (100倍)
m/z 296 クロマトグラム (100倍)
m/z 298 クロマトグラム (20倍)
0.00
15.0
16.0
17.0
18.0
19.0
20.0
21.0
22.0
23.0
24.0
25.0
26.0
27.0
28.0
図6 脂肪酸メチルエステル(混合試料)のクロマトグラム
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
5
Application Note No.30
4.ピロリジン誘導体化による不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
不飽和脂肪酸二重結合位置の決定方法として古く
成分のピークは近接しており，混合試料では幾つかの
から用いられてきたピロリジン誘導体化を行い，図 7 に
成分は不完全分離となっています。単一成分の測定結
混合試料と単一成分のピロリジン誘導体に共通して検
果により保持時間を確認し，各成分のマススペクトル
出される m/z 113 でのクロマトグラムを示しました。各
から二重結合位置を決定しました。
(x1,000,000)
3.0
trans-バクセン酸ピロリジド
ステアリン酸ピロリジド
cis-バクセン酸ピロリジド
2.5
エライジン酸ピロリジド
2.0
オレイン酸ピロリジド
1.5
リノール酸
ピロリジド
(x1,000,000)
m/z 113
1.0
2.0
0.5
1.5
0.0
24.5
1.0
25.0
脂肪酸ピロリジド(混合試料と単一成分)の部分クロマトグラム
25.5
混合試料ピロリジド
リノール酸ピロリジド
オレイン酸ピロリジド
エライジン酸ピロリジド
cis-バクセン酸ピロリジド
trans-バクセン酸ピロリジド
ステアリン酸ピロリジド
0.5
0.0
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
図7 脂肪酸ピロリジド(混合試料と単一成分)のクロマトグラム
ステアリン酸ピロリジドに二重結合はありませんが，
フラグメントイオンは，分子式に示した位置での開裂に
比較として図 8 に解析結果を示しました。左側に全体マ
よるものです。二重結合が存在すると m/z の差が 12u
ススペクトル，右側に解析使用範囲の部分マススペクト
となる箇所が出現することになり，二重結合位置が決
ルを示しました。部分マススペクトルの 14u ずつ異なる
定できます。
Intensity
%
100
113
Intensity
%
200
14
マススペクトル(m/z 45～450)
部分マススペクトル(m/z 135～350)
(
238 266 294
200
322
17
18
337
300
294
15
16
266
308
12
280
238
11
13
14
0
400 m/z
10
252
224
182
150
210
196
196 210 224 238 252 266 280 294 308
250
5
1
3
2
4
168
300
337
322
m/z
350
O
154
6
8
14 14 14 14 14 14 14 14 14
200
182
7
9
14
(
(
(
(
(
(
(
(
(
154
5570 98 126
140 168
100
168
(
0
14 14
(
(
100
50
140
N
140
図8 ステアリン酸ピロリジド
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
6
Application Note No.30
オレイン酸ピロリジドとエライジン酸ピロリジドの二重結合位置決定
オレイン酸ピロリジドの解析結果を図 9 に，エライジ
中に，赤字で示した m/z の差が 12u となっている箇所
ン酸ピロリジドの解析結果を図 10 に示しました。オレイ
がありました。ピロリジンが結合した炭素から数えて 9
ン酸，エライジン酸は共にカルボン酸炭素から数えて 9
番目と 10 番目となるこの箇所は，二重結合がなければ
番目に二重結合があるモノエンで，オレイン酸は cis 体，
エライジン酸は trans 体の異性体です。ピロリジン誘導
m/z 210 が検出されるはずですが，この位置に二重結
合があるため m/z 208 となっています。この結果から
体はカルボン酸とピロリジンが酸アミド結合した化合物
C18:1(9)と二重結合位置を確認することができました。
です。
図 9，図 10 に示したスペクトルはほぼ同じパターンで
図 9,10 のマススペクトルから分子イオンは m/z 335
あり，マススペクトルから cis 体と trans 体を判別するこ
であり，同一炭素数の飽和脂肪酸であるステアリン酸
とはできませんが，試料に含まれる成分が 18:1(9)だけ
ピロリジドの分子イオンが m/z 337 であることから炭素
であれば，cis 体と trans 体がクロマトグラム上で分離し
数 18 で二重結合数が 1 個の不飽和脂肪酸であること
ているため同定可能です。
がわかります。部分スペクトルではフラグメントイオンの
Intensity
%
100
113
Intensity
%
200
14
マススペクトル(m/z 45～450)
300
292
264
236
16
14
12
10
17
11
250
13
278
15
306
196
150
208
320
18
0
400 m/z
5
222
196
168
4
14 14 14 14
264 278 292
306 320
335
300
m/z 350
O
1
3
6
236 250
250
154
7
8
208 222
200
182
9
14 14 14
(
(
(
(
200
12 14
(
(
(
100
154
335
236 264 292
182
(
(
182
14
168
98
140
0
140
(
55 72
100
(
(
(
126
50
部分マススペクトル(m/z 135～350)
14 14
2
N
140
図9 オレイン酸ピロリジド
Intensity
%
100
113
Intensity
%
200
マススペクトル(m/z 45～450)
200
300
320
17
18
292
306
14
264
278
0
400 m/z
236
11
13
15
16
154
335
236 264 292
12
182
250
10
222
8
200
182
7
196
250
168
1
3
4
335
300
m/z 350
O
154
5
6
14 14 14
14 14 14 14
236 250
222
264
208
196
278 292 306
320
150
208
9
12 14
(
(
(
(
100
182
168
(
(
(
140
14 14
(
(
98
14
(
100 140
(
(
0
55 72
(
126
50
部分マススペクトル(m/z 135～350)
14
140
2
N
図10 エライジン酸ピロリジド
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
7
Application Note No.30
cis-バクセン酸ピロリジドとtrans-バクセン酸ピロリジドの二重結合位置決定
cis- バクセン酸ピロリジド解析結果を図 11 に，
trans-バクセン酸ピロリジド解析結果を図 12 に示しま
ピロリジンが結合した炭素から数えて 11 番目が二重
した。バクセン酸はカルボン酸炭素から数えて 11 番
C18:1(11)と確認することができました。
結合位置であ ることがわかります。この結果から
目に二重結合があるモノエンです。
同一炭素数で二重結合位置が異なる化合物ですが
m/z 335 であり，炭素数が 18 個で二重結合数が 1
マススペクトルの解析によって二重結合位置を確認
個の不飽和脂肪酸であることがわかります。部分マ
できました。同様の解析を行うことにより，二重結合
ススペクトルには赤字で示した m/z 差が 12u となって
位置が不明な脂肪酸の二重結合位置を決定するこ
いる箇所があり，m/z 236 が検出されていることから，
とが可能です。
Intensity
%
100
113
Intensity
%
200
マススペクトル(m/z 45～450)
72 98
0
100
140 168
278 306 335
210
100
200
320
292
264
16
14
12
18
17
236
11
200
182
9
250
150
210
10
13
278
15
306
0
400 m/z
300
14 14 14
335
14 14 14
14 14 14
14 14
12 14
140
168
264 278
182 196 210
292
154
306 320
224 236 250
7
168
1
3
4
300
m/z 350
O
5
196
250
154
6
8
224
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
126
55
部分マススペクトル(m/z 135～350)
(
(
(
50
バクセン酸は，前出のオレイン酸，エライジン酸と
図 11，12 のマススペクトルから分子イ オンは
N
2
140
図11 cis-バクセン酸ピロリジド
Intensity
%
100
113
Intensity
%
200
マススペクトル(m/z 45～450)
部分マススペクトル(m/z 135～350)
14
(
(
(
140 168
100
278 306 335
210
200
300
0
400 m/z
150
200
(
(
72 98
14 14
335
14 14 14
14 14 14 12
14 14
14
140
168
264 278
182 196 210
292 306
154
224 236 250
320
(
(
(
(
(
55
100
(
(
0
126
(
50
250
300
m/z 350
O
320
17
18
292
15
16
264
306
12
278
210
9
10
250
224
182
7
11
13
14
236
154
5
6
8
196
168
1
3
2
4
N
140
図12 trans-バクセン酸ピロリジド
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
8
Application Note No.30
リノール酸ピロリジドの二重結合位置決定
箇所あり，m/z 208 が検出されていることからピロリジ
リノール酸ピロリジド解析結果を図 13 に示しました。
リノール酸はカルボン酸炭素から数えて 9 番目と 12
ンが結合した炭素から数えて 9 番目と，m/z 248 が検
番目に二重結合があり，両二重結合とも cis 体のジエ
出されていることから 12 番目に二重結合があることが
ン酸です。
わかりました。この結果から C18:1(9,12)と確認するこ
図 13 のマススペクトルから分子イオンは m/z 333
とができました。
であり，炭素数が 18 個で二重結合数が 2 個の不飽和
二重結合の数が 2 個の不飽和脂肪酸においても，
脂肪酸であることがわかります。部分マススペクトル
同様の解析で二重結合位置の決定が可能です。
には，赤字で示した m/z の差が 12u である箇所が二
Intensity
%
100
113
126
部分マススペクトル(m/z 135～350)
14
14 14 14
14 14
333
12
100 140
14 14 14 14 14
168 182 12 222
154
236
196 208
248 262 276 290 304 318
0
150
200
250
300
m/z 350
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
98
(
0
マススペクトル(m/z 45～450)
(
50 55 72
Intensity
%
200
140 168
100
222
200
17
333
300
318
18
262 290
290
262
13
15
16
400 m/z
12
14
304
236
276
208
10
11
248
182
9
7
222
5
6
8
196
O
154
168
1
3
2
4
N
140
図13 リノール酸ピロリジド
ピロリジン誘導体混合試料
ここまで単一成分のピロリジン誘導体化物分析結果
位置情報が得られた m/z 208，236，248 のクロマトグ
を用いて二重結合位置決定を行いました。一般的に
ラムを示しました。各成分ピークは完全分離せず重複
食品や生体など実試料の場合には，複数の脂肪酸成
していることから，近接した成分で二重結合位置決定
分が含まれています。ここでは複数成分が同時に検
可能なマススペクトルを得ることは困難です。
出された場合の解析について示します。
図 14 に混合試料のクロマトグラムを示し，ピロリジド
ピロリジン誘導体化法では，目的成分を完全に分離
可能な分析条件の設定が必要となります。
固有の m/z 113 以外に，各単一成分解析で二重結合
3.0
(x1,000,000)
trans-バクセン酸ピロリジド
ステアリン酸ピロリジド
cis-バクセン酸ピロリジド
2.5
エライジン酸ピロリジド
2.0
オレイン酸ピロリジド
1.5
リノール酸
ピロリジド
m/z 113クロマトグラム
1.0
m/z 208クロマトグラム (30倍)
m/z 236クロマトグラム (20倍)
0.5
m/z 248クロマトグラム (50倍)
0.0
24.5
25.0
25.5
図14 脂肪酸ピロリジド混合試料拡大クロマトグラム
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
9
Application Note No.30
5.二硫化ジメチル付加による不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
脂肪酸の二重結合位置を容易に決定可能な方法とし
TIC クロマトグラムを示しました。混合試料はステアリン
て，二硫化ジメチル付加法があります。二硫化ジメチル
酸を含んでおり，ステアリン酸メチルエステルのほか未
は二重結合部分に付加するため，飽和脂肪酸であるス
反応の脂肪酸メチルエステルが検出されます。飽和脂
テアリン酸メチルは，溶出時間，マススペクトルに変化は
肪酸を多く含む試料中の，微量不飽和脂肪酸を分析対
ありません。
象とする場合に有効な誘導体化法といえます。
図 15 に混合試料とステアリン酸以外の各単一成分の
(x1,000,000)
TIC
9.0
cis-バクセン酸メチル二硫化ジメチル付加物
エライジン酸メチル二硫化ジメチル付加物
8.0
trans-バクセン酸メチル二硫化ジメチル付加物
7.0
オレイン酸メチル二硫化ジメチル付加物
6.0
リノール酸メチル二硫化ジメチル付加物
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
23.5
8.0
24.0
24.5
25.0
25.5
脂肪酸メチル二硫化ジメチル付加物(混合試料と単一成分)の部分クロマトグラム
26.0
(x1,000,000)
TIC
未反応脂肪酸メチルエステル
7.0
6.0
5.0
4.0
脂肪酸メチル二硫化ジメチル付加物（混合資料）
3.0
リノール酸メチル二硫化ジメチル付加物
オレイン酸メチル二硫化ジメチル付加物
2.0
エライジン酸メチル二硫化ジメチル付加物
1.0
cis-バクセン酸メチル二硫化ジメチル付加物
trans-バクセン酸メチル二硫化ジメチル付加物
0.0
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
図15 脂肪酸メチル二硫化ジメチル付加物(混合試料と単一成分)のクロマトグラム
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
10
Application Note No.30
二硫化ジメチル付加物によるオレイン酸とエライジン酸の二重結合位置決定
オレイン酸メチル二硫化ジメチル付加物の解析結
れたイオンで他よりも強く検出されています。この分析
果を図 16 に示し，エライジン酸メチル二硫化ジメチル
結果から 18:1(9)と決定できました。また，m/z 185 は
付加物の解析結果を図 17 に示しました。炭素数 18 個
m/z 217 のフラグメントイオンから CH3OH が脱離して
のモノエンメチルエステルに二硫化ジメチルが付加し
32 減少したイオンです。
た化合物の分子イオン m/z 390 が検出されています。
二硫化ジメチル付加物のマススペクトルには，開裂
この反応では，メチルチオ基は二重結合の存在す
したカルボン酸メチル側のフラグメントイオンから 32u
る炭素に付加していて，この炭素間で開裂したイオン
減少した m/z も特異的に検出されることから，二重結
が検出されます。m/z 217 と m/z 173 は，カルボン酸
合位置の決定にはこれら 3 種の m/z 値を解析に用い
炭素から数えて 9 番目と 10 番目の炭素にそれぞれメ
ます。
チルチオ基が付加し，この位置での開裂により検出さ
Intensity
% 55
100
217
173
87
137
50
185
109
390
0
100
200
300
173
(換算表A)
H3CS
18
16
17
14
15
12
13
10
400
217
(換算表B)
O
SCH3
9
11
7
5
8
m/z
6
3
4
1
2
O
図16 二硫化ジメチル付加物によるオレイン酸二重結合位置決定
Intensity
% 55
100
173
87
217
137
50
185
109
390
0
100
200
300
217
(換算表B)
SCH3
173
(換算表A)
17
18
15
16
13
14
11
400
10
9
12
7
8
O
5
6
m/z
3
4
1
2
O
SCH3
図17 二硫化ジメチル付加物によるエライジン酸二重結合位置決定
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
11
Application Note No.30
モノエン酸換算表
二硫化ジメチル付加による二重結合位置決定の解
A,B,C の m/z が検出された場合の二重結合位置を
析には 3 種の m/z を用いて行いますが，その相対強度
表の両端に示しました。Δはカルボン酸メチル側のカ
が高いことから解析も容易です。炭素数 18 個のモノエ
ルボン酸 C=O 結合を持つ炭素から数えた場合の二重
ン酸に関しては，表 3 に示した換算表を利用することで，
結合位置，ωは炭化水素末端側の炭素から数えた場
二重結合位置決定はさらに容易となります。
合の二重結合位置を示しました。本アプリケーションノ
開裂した C-C 結合から炭化水素側のフラグメントイ
オン m/z を A，カルボン酸メチル側のフラグメントイオン
m/z を B とし，C は B から CH3OH が脱離して 32u 減少
したフラグメントイオン m/z を示しました。
ートでの表記 C18:1(9)における括弧内に示した二重結
合位置はΔの値となっています。
参考として表 4 に炭素数 16 個のモノエン酸換算表，
表 5 に炭素数 20 個のモノエン酸換算表を示しました。
表3 C18モノエン酸二重結合位置決定換算表
M.W. 390
m/z
Δ
ω
A
B
C(B-32u)
4
243
147
115
14
5
229
161
129
13
6
215
175
143
12
7
201
189
157
11
8
187
203
171
10
9
173
217
185
9
10
159
231
199
8
11
145
245
213
7
12
131
259
227
6
13
117
273
241
5
14
103
287
255
4
15
89
301
269
3
16
75
315
283
2
表4 C16モノエン酸二重結合位置決定換算表
M.W. 362
m/z
Δ
ω
A
B
C(B-32u)
215
147
115
4
12
201
161
129
5
11
187
175
143
6
10
173
189
157
7
9
159
203
171
8
8
145
217
185
9
7
131
231
199
10
6
117
245
213
11
5
103
259
227
12
4
89
273
241
13
3
75
287
255
14
2
表5 C20モノエン酸二重結合位置決定換算表
M.W. 418
m/z
Δ
ω
A
B
C(B-32u)
271
147
115
4
16
257
161
129
5
15
243
175
143
6
14
229
189
157
7
13
215
203
171
8
12
201
217
185
9
11
187
231
199
10
10
173
245
213
11
9
159
259
227
12
8
145
273
241
13
7
131
287
255
14
6
117
301
269
15
5
103
315
283
16
4
17
18
89
75
329
343
297
311
3
2
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
12
Application Note No.30
二硫化ジメチル付加物によるcis-,trans-バクセン酸の二重結合位置決定
cis-,trans-バクセン酸メチル二硫化ジメチル付加物
チルエステルの二硫化ジメチル付加物であることがわ
の解析結果を図 18，図 19 に示しました。分子イオン
かります。m/z 145，245，213 が検出されており，表 3
m/z 390 が検出されているので，C18 モノエン脂肪酸メ
から C18:1(11)と決定することができました。
Intensity
% 55
100
69
50
145
245
97
213
390
0
100
200
145
(換算表A)
H3CS
18
16
17
m/z
400
O
SCH3
14
15
300
245
(換算表B)
12
11
13
9
10
7
8
5
6
3
4
1
O
2
図18 二硫化ジメチル付加物によるcis-バクセン酸二重結合位置決定
Intensity
% 55
100
69
50
145
245
97
213
390
0
100
200
18
15
16
13
400
245
(換算表B)
SCH3
145
(換算表A)
17
300
12
11
14
9
10
O
7
8
m/z
5
6
3
4
1
2
O
SCH3
図19 二硫化ジメチル付加物によるtrans-バクセン酸二重結合位置決定
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
13
Application Note No.30
二硫化ジメチル付加物によるリノール酸の二重結合位置決定
リノール酸メチル二硫化ジメチル付加物の解析結果
裂したフラグメントイオンです。炭素数 18 のモノエンで
を図 20 に示しました。リノール酸メチルへの二硫化ジメ
あれば，検出されるのは m/z 173 と m/z 217 であり，
チルの付加は，2 箇所の二重結合に同時には付加せ
m/z 171 の炭化水素末端側にもう一つの二重結合が
ず，一方の二重結合のみに付加します。二重結合が１
あることがわかります。
個残存するため分子イオンは C18:1 脂肪酸メチル二硫
図 20-2 に示したマススペクトルで検出された m/z
化ジメチル付加物の分子イオン m/z 390 より 2u 少な
131 と m/z 257 は，カルボン酸メチル側から数えて 12
い m/z 388 となり，図 20 では m/z 388 が検出されて
番目と 13 番目にメチルチオ基が付加し，この位置で開
います。
裂したフラグメントイオンです。同様に m/z 257 のカル
図 20-1 に示したマススペクトルで検出された m/z
ボン酸メチル側に二重結合があることがわかります。
171 と m/z 217 は，カルボン酸メチル側から数えて 9
以 上 の こ と か ら ， 二 重 結 合 位 置 が 9,12 で あ る
番目と 10 番目にメチルチオ基が付加し，この位置で開
18:2(9,12)と決定することができました。
Intensity
%
67
100
55
95
50
109 137
293
171 185 217
325 340
0
100
200
300
15
13
16
12
10
14
m/z
O
SCH3
H3CS
17
400
217
171
18
388
9
11
7
8
5
6
3
4
1
2
O
図20-1 二硫化ジメチル付加物によるリノール酸二重結合位置決定(Δ9)
Intensity
%
61
100
131
293
83
50
340
177
123
159
217
325
257
388
0
100
200
15
16
13
14
m/z
O
SCH3
H3CS
17
400
257
131
18
300
12
10
11
9
7
8
5
6
3
4
1
2
O
図20-2 二硫化ジメチル付加物によるリノール酸二重結合位置決定(Δ12)
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
14
Application Note No.30
リノール酸メチル二硫化ジメチル付加物では，2 成分
ジエン酸の解析では，検出される m/z がモノエン酸ほ
のマススペクトルから解析を行いましたが，今回の分析
ど明確ではありません。ジエン酸，トリエン酸などの高度
条件で得られる TIC クロマトグラムで 2 成分は単一ピー
不飽和脂肪酸の二重結合位置を決定する場合には，そ
クになっています。図 21 に解析に用いた 4 種のフラグメ
れらが混合物の場合は，TLC や Ag イオン固相抽出管 6)
ントイオンによるクロマトグラムを示しました。
を用いて分画し，部分還元によりモノエン酸を得ます 5)。
二重結合位置の違いによるピークトップ位置の違い
得られたモノエン酸の二重結合位置を決定して，元の多
が確認できたため，スペクトル減算を用いて互いのピー
価不飽和脂肪酸の二重結合位置を決定します。この方
クによる影響を軽減し，図 20-1,図 20-2 の各成分のマス
法を併用することで多価不飽和脂肪酸の二重結合位置
スペクトルを解析しました。図 21 に両成分の中間となる
の決定結果を確実にすることができます。
ＴＩＣクロマトグラムのピークトップでのマススペクトルを示
6) SUPELCO Technical Report, Discovery Ag-Ion SPE
しました。
このマススペクトルで m/z 131，257，171，217，185
for FAME Fractionation and Cis/Trans Separation,
が検出されていることから，18:2(9,12)と決定することが
http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Supel
できます。
co/Bulletin/t406062.Par.0001.File.tmp/t406062.pdf
Intensity
%
100 109
75
2.5
137
131
149
(x1,000,000)
217
50
171185
25
0
100
2.0
1.5
293
150
200
340
257
261
250
325
300
350 m/z 400
図20-2
図20-1
1.0
TICクロマトグラム
m/z 257クロマトグラム (200倍)
0.5
m/z 131クロマトグラム(30倍)
m/z 217クロマトグラム (70倍)
0.0
24.3
m/z 171クロマトグラム (70倍)
24.4
24.5
24.6
24.7
図21 リノール酸メチル二硫化ジメチル付加物のクロマトグラムとマススペクトル
GC/MSによる不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
15
Application Note No.30
二硫化ジメチル付加物混合試料
ピロリジン誘導体化法は，分離不十分な混合試料
な 2 成分が 1 本のピークとなっている部分もありますが
において各成分の定性は困難ですが，二硫化ジメチル
表 3 に示した各成分の特徴的な m/z を用いたクロマト
付加法は，分離不十分な混合試料においても二重結
グラムを描くことで，他成分の影響を受けずに個々の
合位置の決定が可能です。
成分を検出できます。cis 体,trans 体も分離できることか
図 22 は二硫化ジメチル付加法による混合試料のク
ら，二重結合位置決定だけでなく，異性体の同定も可
ロマトグラムです。TIC クロマトグラムでは分離不十分
能です。
7,000,000
TICクロマトグラム
cis-バクセン酸メチル二硫化ジメチル付加物
エライジン酸メチル二硫化ジメチル付加物
trans-バクセン酸メチル二硫化ジメチル付加物
オレイン酸メチル二硫化ジメチル付加物
リノール酸メチル二硫化ジメチル付加物
5,000
m/z 257
m/z 257クロマトグラム
リノール酸メチル二硫化ジメチル付加物
140,000
m/z 217クロマトグラム
エライジン酸メチル二硫化ジメチル付加物
オレイン酸メチル二硫化ジメチル付加物
リノール酸メチル二硫化ジメチル付加物
240,000
m/z 245クロマトグラム
cis-バクセン酸メチル二硫化ジメチル付加物
trans-バクセン酸メチル二硫化ジメチル付加物
23.50
23.75
24.00
24.25
24.50
24.75
25.00
25.25
25.50
25.75
26.00
図22 脂肪酸メチル二硫化ジメチル付加物(混合試料)クロマトグラム
6.まとめ
GC/MS による不飽和脂肪酸の二重結合位置決定
とができます。また，混合試料でクロマトグラムによる分
方法として，ピロリジン誘導体化法と二硫化ジメチル付
離が不十分であっても各成分のピークが検出でき， cis
加法を示しました。二硫化ジメチル付加物による二重結
体,trans 体の異性体同定にも有効な方法です。
合位置決定法は，マススペクトルの開裂が単純で二重
結合位置の決定に用いる m/z が見つけ易く，さらに換
これらの特徴から脂肪酸の組成比や個々の脂肪酸
の定量値も高い精度で得ることができます。
算表を用いることで，簡単に二重結合位置を決定するこ
初版発行 2012年3月
＊本資料は発行時の情報に基づいて作成されており，予告なく改訂することがあります。
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